Absztrakt

Cistanche tubulosa(Schenk) A Wightot, az Orobanchaceae családból származó, értékes élelmiszer-gyógyszer homológ gyógynövényt széles körben termesztik Kína déli részén, Hszincsiangban. Fő bioaktív fenil-etanol-glikozid-összetevői,echinakozidésakteozid (verbaszkozid), többféle farmakológiai hatást fejt ki, beleértve az antioxidáns, gyulladásgátló és immunszabályozást. A nem szabványosított hagyományos feldolgozási eljárások gyakran jelentős veszteségeket okoznak ezekben az alapvető hatóanyagokban, korlátozva a gyógyászati ​​és funkcionális élelmiszerek alkalmazását.Cistanche tubulosafőzet darabok. Ennek a kutatásnak a célja a modern feldolgozási paraméterek optimalizálása volt a frissenCistanche tubulosaszeletekre, hogy maximalizálja az akteozid és echinakozid visszanyerését, és tovább tisztázza az antioxidáns-stressz és gyulladásgátló bioaktivitást, valamint az optimálisan feldolgozott főzetdarabok mögöttes molekuláris mechanizmusát sejtszinten.

Egytényezős kísérleteket végeztek a szeletvastagság, a gőzölés időtartama és a kemencében való szárítási hőmérséklet megfelelő tartományainak szűrésére. Egy háromtényezős, háromszintű Box-Behnken válaszfelületi módszertant alkalmaztak a többtényezős interakciós modellek létrehozására, az akteozid és echinakozid tartalmat kettős értékelési mutatóként használva. Ezt követően lipopoliszachariddal (LPS) stimulált RAW264.7 egér makrofág sejtmodellt építettek a lipidperoxidáció és az akut gyulladásos károsodás szimulálására. Számos biokémiai vizsgálatot végeztek, beleértve az MTT-t, a ROS fluoreszcens detektálást, az ELISA-t és a Western blot-ot, hogy felmérjék az antioxidáns-stressz hatékonyságát és feltárják a jelátviteli útvonalakat.

A kísérleti eredmények alapján az optimális feldolgozási paramétereket a 0,6 cm-es szeletvastagság, 6 perces gőzölő kezelés és 57 fokos szárítási hőmérséklet határozza meg. Ilyen gyakorlati feldolgozási körülmények között a mért akteozid és echinakozid tartalom 7,25 %-ot, illetve 31,62 %-ot ért el, ami jó konzisztenciát mutat az elméleti előrejelzési értékekkel. A sejtalapú vizsgálatok kimutatták, hogy az optimálisan feldolgozottCistanche tubulosaA főzetdarabos kivonatok jelentősen csökkentették a nitrogén-monoxid (NO) és malondialdehid (MDA) koncentrációját az LPS-fertőzött RAW264.7 makrofágokban. Eközben jelentősen megemelte a szuperoxid-diszmutáz (SOD), kataláz (CAT), laktát-dehidrogenáz (LDH) intracelluláris antioxidáns enzimaktivitását, valamint megnövekedett glutation (GSH) tartalmat. A gyulladást elősegítő mediátorok, köztük a TNF-, IL-1 és IL-6 szekréciós szintje szintén csökkent dózisfüggő módon. A Western-blot kimutatás ezt igazoltaCistanche tubulosaA kivonatok visszatartották a kulcsfontosságú fehérjék túlzott foszforilációját a p38/AKT/JNK/NF-κB jelátviteli kaszkádokon belül.

Összefoglalva, ez az optimalizált modern feldolgozási protokoll hatékonyan javítja a jellegzetes fenil-etanoid glikozidok (akteozid és echinakozid) hozamátCistanche tubulosafőzet darabok. A feldolgozott növényi anyagok kiemelkedő antioxidáns-stressz és gyulladásgátló hatást fejtenek ki az LPS-indukált makrofág-sérülési modellben, amelynek farmakológiai mechanizmusa részben a p38/AKT/JNK/NF-κB gyulladásos jelátviteli tengely túlzott aktiválódásának gátlásán keresztül valósul meg. Ez a munka megbízható műszaki paramétereket biztosít a szabványosított ipari gyártáshoz, és kísérleti támogatást nyújt az antioxidáns funkcionális élelmiszerek fejlesztéséhez.Cistanche tubulosa.

Kulcsszavak: Cistanche tubulosa; főzetdarab-feldolgozási technológia; akteozid; echinakozid; antioxidatív stressz; RAW264.7 makrofág; p38/AKT/JNK/NF‑κB jelátviteli útvonal

1. Bevezetés

Cistanche tubulosa(Schenk) A Wight az Orobanchaceae családba tartozik, húsos pikkelyes szára a hivatalos gyógyászati ​​rész. Ezt a sivatagi gyógynövényt nagyrészt Kínában, Hszincsiang száraz déli részén ültetik. A hagyományos kínai gyógynövénygyakorlatbanCistanche tubulosaklasszikus tonizáló gyógynövényként szolgál dokumentált terápiás funkcióival: tonizálja a vese-yangot, pótolja az esszencia-vért és lazítja a bélmozgást. Klinikailag az ágyék és a térd fájdalmának-gyengeségének, a veseelégtelenség okozta meddőségnek és a bélszárazság okozta székrekedésnek enyhítésére alkalmazzák.

A feniletanoid glikozidok a legkritikusabb bioaktív markerekCistanche tubulosa. A Kínai Gyógyszerkönyv előírja, hogy a minősített gyógyászati ​​anyagok esetében az echinakozid és az akteozid teljes tartalma nem lehet kevesebb 1,50 %-nál. Mindazonáltal a jelenlegi mainstream gyártásCistanche tubulosaA főzetdarabok még mindig az ősi kézi munkafolyamatokat követik: friss nyers fűszernövény áztatása, alapos nedvesítés, szeletelés és természetes szárítás vagy borgőzölés. Ezekből a hagyományos megközelítésekből hiányoznak a pontos mennyiségi műszaki előírások. A fenil-etanoid-glikozidok termikus instabilitása gyakran az aktív összetevők súlyos lebomlásához vezet a feldolgozás során, ami rontja a végtermék minőségét és korlátozza a nagy léptékű, jó minőségű termelést. Jelenleg csak korlátozott számú kutatás kombinálja egyszerre a feldolgozási technológia optimalizálását a biológiai aktivitás validálásával; a legtöbb tanulmány pusztán a kémiai összetevők tartalmát észleli, a sejtfunkciók ellenőrzése nélkül, így hézagokat hoz létre az ipari átalakulás előtt. Google for....

Az oxidatív stressz számos krónikus anyagcsere- és gyulladásos betegség központi patológiás kiváltója. A reaktív oxigén fajok (ROS) túlzott felhalmozódása megzavarja a redox homeosztázist, tovább provokálva a makrofágok túlzott aktiválódását és a masszív gyulladásgátló citokin felszabadulását, ördögi kört képezve az oxidáció és a gyulladás között. A meglévő farmakológiai vizsgálatok ezt bizonyítottákCistanche- a fenil-etanoid-glikozidok antioxidáns és gyulladásgátló tulajdonságokkal rendelkeznek. Korábbi állatkísérletek bizonyítottákCistanche tubulosaAz összes glikozid javította a májkárosodást szepszis rágcsálómodellekben azáltal, hogy aktiválta a Nrf2/HO-1 antioxidáns jelátvitelt. -ból izolált lignán-glikozid komponensekCistanche tubulosamérsékelheti az LPS által kiváltott gyulladásos válaszokat a PI3K/AKT útvonal modulálásával a RAW264.7 makrofágokban. Nem vizsgálták azonban szisztematikusan, hogy az újonnan optimalizált feldolgozási körülmények között előállított főzetdarabok megőrzik-e erős antioxidáns-stressz biológiai aktivitásukat. A konkrét molekuláris szabályozó mechanizmus még mélyebb feltárást igényel.

Az LPS-stimulált RAW264.7 makrofág egy jól elfogadott in vitro gyulladás-oxidatív károsodás modell, amelyet széles körben alkalmaznak a természetes termékek antioxidáns és gyulladásgátló hatásainak értékelésére. Ebben a tanulmányban először egyfaktoros szűrést hajtunk végre, majd a Box-Behnken válaszfelület optimalizálását, hogy szabványos szeletelés-gőzölés-szárítás műszaki paramétereket kapjunk, amelyek magas akteozid és echinakozid hozamot céloznak meg. Az optimalizált főzetdarabos termékek beszerzése után gyógynövénykivonatokat készítünk, és alkalmazzuk az LPS által kiváltott RAW264.7 sejtsérülési modellt. Számos kísérleti platformot használnak, beleértve az oxidatív-stressz-biokémiai marker mérést, a citokin ELISA kvantifikációt és a Western-blot útvonalelemzést az antioxidatív-stressz hatékonyság és a jelátviteli mechanizmus tisztázására. Ez a kutatás gyakorlati folyamatparamétereket kínál a kiváló minőségű kísérleti méretű gyártáshozCistanche tubulosastabil antioxidáns-stressz aktivitású főzetdarabok, és kísérleti alapot teremtenek a Xinjiangból származó funkcionális élelmiszerek és étrend-kiegészítő termékek későbbi fejlesztéséhezCistanche tubulosaerőforrás.

2. Anyagok és módszerek

2.1 Nyersanyagok, reagensek és eszközök

FrissCistanche tubulosahúsos szárakat ősszel betakarítottak a kínai Hszincsiang Ujgur Autonóm Területből, Hotanból. A RAW264.7 egér monocita-makrofág leukémia sejtvonalat a Procell Life Science & Technology Co., Ltd.-től (Wuhan, Kína) vásároltuk. A kromatográfiás minőségű acetonitrilt és a metanolt a Merck (Németország) szállította. Az echinakozidot és az akteozidot (több mint 98%-os tisztaság) a Peking North Weiye Metrológiai Technológiai Kutatóintézettől szerezték be. A dimetil-szulfoxidot (DMSO) a Sigma-VETEC-től (USA) vásárolták. A DMEM magas glükóztartalmú táptalaj, a BCA összfehérje vizsgálati készlet a Thermo Fisher Scientific (USA) termékei voltak. A magzati szarvasmarha-szérumot (FBS) a BI-tól (Izrael) vásároltuk. A penicillin-sztreptomicin kettős antitest oldat a HyClone-tól (USA) származott. A NO, MDA, SOD, CAT, GSH kereskedelmi tesztkészleteit a Beyotime Biotechnology-tól (Sanghaj, Kína) szereztük be. LDH detektáló készlet és lipopoliszacharid (LPS,E. coli055:B5) a Solarbio-tól (Peking, Kína) szereztük be.

A kulcsfontosságú laboratóriumi műszerek közé tartozott a Shimadzu nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) rendszer, a LabTech rotációs elpárologtató, a lengő típusú, nagy sebességű kínai fűszernövény porlasztó, a termosztatikus szórószárító sütő, a gőzölős berendezés, a BioTek SYNERGY-H1 többmódusú mikrolemez-olvasó, a FA1204t24R elektronikus kiegyensúlyozó frigerer24. centrifuga, BSC-1300IIA2 biológiai biztonsági szekrény és BDS200-PH fordított optikai mikroszkóp.

2.2 Egytényezős feldolgozási kísérletek

FrissCistanche tubulosahúsos szárakat különböző vastagságú (0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm, 1,2 cm) szeletekre vágtuk. A szeleteket különböző ideig gőzöltük (3 perc, 6 perc, 9 perc, 12 perc, 15 perc, 18 perc, 21 perc). Ezt követően az anyagokat különböző hőmérsékleti gradiensek mellett szárítottuk (környezeti 25 fok, 40 fok, 50 fok, 60 fok, 70 fok, 80 fok). A teljesen megszáradt főzetdarab-mintákat porítottuk, és 40 mesh-es szitán szitáltuk a későbbi HPLC-komponensek mennyiségi meghatározásához.

2.3. Az akteozid- és echinakozid-tartalom meghatározása

A mintaoldat előkészítése: Mérjünk be pontosan 1,0 g porított főzetdarabport egy dugós Erlenmeyer-lombikba. Pontosan adjon hozzá 100 ml 50%-os metanolos oldatot. Végezzen 30 perces áztatást, majd 40 perces ultrahangos extrakciót. Lehűlés után töltse fel az oldószer tömegveszteségét 50%-os metanollal, keverje el egyenletesen és hagyja statikus ülepedést. A felülúszót 0,22 μm-es mikroporózus membránon szűrtük a HPLC injekcióhoz.

Referencia-standard oldat készítése: Pontosan mérjünk le megfelelő mennyiségű akteozid és echinakozid referenciaanyagot, oldjuk fel 50 %-os metanollal mérőlombikban, készítsünk soros gradiens standard oldatokat, szűrjük le 0,22 μm-es szűrőmembránnal.

Kromatográfiás elrendezés: COSMOSIL C18 analitikai oszlop; mobilfázisú rendszer: A mobilfázis: 0,1%-os vizes foszforsav oldat; B mozgófázis: acetonitril. A detektálási hullámhosszt 330 nm-re állítottuk be; oszlop hőmérséklete 35 fok; áramlási sebesség 1 ml/perc. Az akteozid és echinakozid tartalom kvantitatív kiszámítására külső standard módszert alkalmaztunk. Átfogó értékelési pontszám=(echinakozid tartalom × 50 %) + (akteozid tartalom × 50 %). Az átfogó pontszámok összetett értékelési mutatóként szolgáltak a feldolgozási állapot teljesítményéhez.

2.4 Box-Behnken Response-Surface kísérleti tervezés

Az egytényezős kísérleti eredmények alapján a Design-Expert 13.0 szoftvert használtuk a Box-Behnken háromtényezős, háromszintű kísérleti elrendezés megvalósításához. Független változóként a szeletvastagságot (X₁, cm), a gőzölési-kezelési időt (X2, min), a szárítási hőmérsékletet (X3, fok) választottuk ki. Az akteozid-tartalom (Y1, %) és az echinakozid-tartalom (Y2, %) válaszérték volt. Tizenhét kísérleti csoportot végeztek. A nulla szintet minden faktorhoz az egytényezős tesztek során nyert optimális paraméter szerint választottuk ki. A válaszfelületi kísérletek befejezése után a modell varianciaanalízise, ​​a 3D-válaszfelületi ábrázolás és a feltétel-előrejelzés befejeződött. Gyakorlati verifikációs kísérleteket végeztem, miután az elméleti előrejelzett paramétereket a működőképes tényleges termelési értékekhez igazították.

2.5 Sejttenyésztés és minta-előkészítés

A főzetdarabos alapanyagot optimalizált feldolgozási körülmények között gyártották. A gyógynövényport a fent említett minta-előkészítési protokoll szerint extraháltuk, rotációs bepárlással koncentráltuk, és vákuumszárítással szilárd kivonatport kaptunk. A törzsoldatot úgy állítottuk elő, hogy az extraktumport DMSO-ban feloldottuk, majd teljes DMEM táptalajjal (amely 10% FBS-t és 1% penicillin-sztreptomicint tartalmazott) tovább hígítottuk sejtkísérletekhez; A végső DMSO munkakoncentrációt 0,1% (v/v) alatt tartottuk. A RAW264.7 makrofágokat DMEM komplett tápközegben tenyésztettük 37 fokos, 5% CO₂ párásítású inkubátorkörnyezetben.

2.6 MTT citotoxicitási vizsgálat

A RAW264.7 sejteket 96 lyukú mikrolemezekre oltottuk 8 × 10⁴ sejt/ml sejtsűrűséggel. A kísérleti csoportok közé tartozott az oldószeres kontrollcsoport (0,1% DMSO táptalaj), az LPS-modellcsoport (végső LPS-koncentráció 1 ug/ml) és a többszörösCistanche tubulosakivonat koncentrációs csoportok (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/ml). A gyógynövénymintával 2 órás előinkubálás után LPS-t (végső koncentráció 1 ug/ml) adtunk minden csoporthoz, kivéve az oldószeres kontrollcsoportot. Az inkubálást 24 órán át folytattuk. Ezután MTT-reagenst (5 mg/ml) adtunk hozzá, és 4 órán át inkubáltuk. Dobja el a felülúszót, adjon hozzá 150 μL DMSO-t lyukanként, rázza 37 fokon 15 percig. A 490 nm-es hullámhosszon mért abszorbanciaértéket mikrolemez-leolvasóval olvastuk le, és kiszámítottuk a sejttúlélési arányt. A biztonságos munkakoncentráció-tartományt az utólagos funkcionális tesztekhez határozták meg.

2.7 Intracelluláris ROS mérés

A RAW264.7 makrofágokat hatlyukú lemezekre oltottuk be lyukanként 4 × 105 sejt sűrűséggel. A sejtek adherenciája után csoportosító kezelést végeztünk: oldószeres kontrollcsoport, LPS-modell csoport és CT-kivonattal kezelt csoportok (12,5, 25, 50, 100 ug/ml). 2 órás mintával végzett előkezelés után 1 ug/ml LPS-t adtunk hozzá, kivéve az oldószer-kontroll csoportot, és 24 órán át inkubáljuk. Az intracelluláris ROS szintet fluoreszcens szonda betöltési módszerrel detektáltuk a kit utasításai szerint. A fluoreszcens intenzitást fluoreszcens mikrolemez-leolvasóval mértük (gerjesztés 488 nm, emisszió 525 nm).

2.8 NO, MDA, SOD, CAT, LDH és GSH kimutatása

A megfelelő sejtkezelés után a sejttenyészet felülúszóját Griess-reakciót alkalmazva gyűjtöttük össze NO méréshez. A megtapadt sejteket előhűtött PBS-sel mostuk, jégen lizáltuk, a sejtlizátum felülúszót centrifugálás után gyűjtöttük össze (10 000 r/perc, 4 fok, 5 perc). A BCA kit minden mintában meghatározta a teljes fehérjekoncentrációt. Az MDA, GSH és az SOD, CAT, LDH enzimatikus aktivitás-indikátorok tartalmát szigorúan a kit használati útmutatója szerint vizsgálták.

2.9 A gyulladást elősegítő citokinek ELISA meghatározása

A RAW264.7 sejtek minta-előkezelést és LPS-stimulációt kaptak összesen 16 órán keresztül. A sejttenyészet felülúszóját összegyűjtöttük és centrifugáltuk. A TNF-, IL-1, IL-6-koncentrációkat a felülúszóban kereskedelmi forgalomban lévő ELISA-készletekkel határozták meg.

2.10 Western-blot elemzés

45 perces LPS és minta együttes inkubáció után a RAW264.7 sejteket proteáz-foszfatáz inhibitor koktéllal kiegészített RIPA lízispufferrel lizáltuk. A sejtlizátumot 10 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 4 fok alatt 5 percig. A BCA kit mennyiségileg meghatározta a teljes fehérje koncentrációt. A mintafehérjéket (sávonként 50 ug) 100 fokos fémfürdőn 5 percig denaturáltuk. Az SDS-PAGE gélelektroforézis elválasztotta a célfehérjéket, amelyeket azután PVDF membránokra vittek át. A membránokat 1 órán keresztül blokkoltuk 5%-os sovány tejes TBST-oldattal. A p38-at, p-p38-at, AKT-t, p-AKT-t, JNK-t, p-JNK-t, NF-κB p65-öt, p-NF-κB p65-öt és GAPDH-t célzó elsődleges antitesteket egy éjszakán át 4 fokon inkubáltuk. A TBST mosás után a megfelelő másodlagos antitesteket szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk. Ismételt mosás után ECL ultraérzékeny kemilumineszcens reagenst alkalmaztunk a fehérjesávos képalkotáshoz. A relatív foszforiláció-fehérje expressziós szint értékelésére sávos szürkeárnyalatos kvantitatív elemzést hajtottak végre.

2.11 Statisztikai elemzés

A GraphPad Prism 8.0.2 szoftvert a statisztikai számításokhoz és a grafikonok készítéséhez használtuk. A kísérleti kvantitatív adatok eredményeit átlag ± szórásban fejeztük ki (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). A csoportok közötti összehasonlításhoz egyutas ANOVA-t, majd post-hoc többszörös összehasonlító teszteket alkalmaztak. \\(P<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Kísérleti eredmények

3.1 Az egytényezős kísérletek eredményei

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0,4 cm) gátolja a belső anyag felszabadulását, csökkentve a végső kimutatható komponens tartalmát. Rögzített gőzölési idő (10 perc) és szárítási hőmérséklet (60 fok) mellett a 0,4 cm-es szeletvastagság érte el a legmagasabb átfogó értékelési pontszámot.

A gőzölési kezelés időtartamának eredménye: ha a szelet vastagságát 0,4 cm-re rögzítettük, és a szárítási hőmérsékletet 60 fokon tartottuk, az elégtelen gőzölési idő nem tudta kellőképpen tönkretenni a növényi sejtszerkezetet, így a hatóanyagok nehezen oldódtak ki. Ha a gőzölési idő meghaladta a 6 percet, a túlgőzölés károsította a növényi szöveteket, és az echinakozid és az akteozid lebomlását idézte elő. Ezért előzetesen 6 percet jelöltek meg előnyös gőzölési feldolgozási időtartamnak.

A sütőben szárítási hőmérséklet gradiens kísérletekhez: 0,4 cm szeletvastagságot és 6 perces gőzölési időt rögzítettünk. Az összetevők mennyisége a szárítási hőmérséklet emelkedésével emelkedett bizonyos tartományon belül. Miután a szárítási hőmérséklet meghaladta a 60 fokot, a magas hőmérsékletű termikus bomlás a célanyag-tartalom jelentős csökkenését okozta. Ezért a 60 fokot választották kezdeti optimális szárítási hőmérsékleti feltételnek a reakciófelület későbbi optimalizálásához.

3.2 Box-Behnken Response-Surface Optimization and Verification

A Box-Behnken kísérleti futtatások tizenhét csoportja készült el a tervezési mátrix szerint. A varianciaanalízis eredményei azt mutatták, hogy mind az akteozid, mind az echinakozid tartalom regressziós modelljei statisztikai szignifikanciát értek el (\\(P<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >szelet vastagság.

A modell matematikai számítással az elméleti optimális feldolgozási paraméterek a következők voltak: szeletvastagság 0,600 cm, gőzölési-kezelési idő 5,685 perc, szárítási hőmérséklet 57,009 fok. A tényleges ipari működési megvalósíthatóságot figyelembe véve a paramétereket 0,6 cm szeletvastagságra, párolási időre 6 percre, szárítási hőmérsékletre 57 fokra állítottuk be. Három párhuzamos validációs kísérletet végeztünk. Ilyen gyakorlati körülmények között a mért akteozid tartalom 7,25 %, az echinakozid tartalom elérte a 31,62 %-ot. A mért értékek és az elméleti előrejelzés közötti eltérés 5% alatt maradt, bizonyítva, hogy ez a válaszfelület-modell megbízható és alkalmazható a valós főzetdarab-gyártás irányítására.

3.3 Optimalizált-feldolgozott citotoxicitási szűréseCistanche tubulosaKivonat RAW264.7 cellákban

Az MTT citotoxicitási eredményei azt mutatták, hogy a 0-100 ug/ml közötti kivonatkoncentráció nem fejtett ki nyilvánvaló toxikus hatást a RAW264.7 makrofágokra, sőt enyhe sejtproliferációt elősegítő tendenciát mutatott. Amikor a kezelési koncentráció 200 ug/ml-re és 400 ug/ml-re emelkedett, a sejtek túlélési aránya jelentősen csökkent az oldószeres kontrollcsoporthoz képest, ami koncentrációfüggő citotoxicitást mutat. Ezért a 12,5 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml, 100 ug/ml koncentráció-gradienseket választották biztonságos munkakoncentrációként a későbbi oxidatív stresszel és gyulladással kapcsolatos sejtvizsgálatokhoz.

3.4 Cistanche tubulosaKivonja a csökkentett intracelluláris ROS-szintet az LPS-stimulált makrofágokból

Az oldószeres kontrollcsoporthoz képest az LPS-modell csoport intracelluláris ROS fluoreszcens intenzitása rendkívül szignifikánsan megnőtt (\\(P)<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration Cistanche tubulosakivonat, az intracelluláris ROS felhalmozódás dózisfüggő módon csökkent. Mindegyik gyógyszeres csoportban statisztikailag szignifikánsan csökkent a ROS az LPS-modell csoporthoz képest (\\(P)<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 Hatások a NO és MDA tartalomra

A NO klasszikus gyulladásos mediátorként szolgál, amelyet aktivált makrofágok bocsátanak ki. Az MDA egy aranystandard biomarker, amely a lipid-peroxidáció oxidatív károsodását tükrözi. Az oldószeres kontrollcsoporthoz képest az LPS-stimuláció jelentősen megemelte a NO- és MDA-tartalmat a RAW264.7 sejtekben (\\(P)<0.001\)). Different dosages of Cistanche tubulosaAz extraktum kezelés jelentősen csökkentheti az NO koncentrációt. Az MDA mutató esetében: 12,5 ug/ml csoport nem eredményezett statisztikailag szignifikáns javulást; A 25-100 ug/ml koncentrációjú csoportokban megfigyelhetően csökkent az MDA szint (\\(P<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Az antioxidánsokkal kapcsolatos biokémiai indikátorokra gyakorolt ​​hatások: SOD, CAT, LDH, GSH

LPS-fertőzést követően az intracelluláris SOD, CAT, LDH enzimaktivitás, valamint a GSH-tartalom meredeken csökkent az oldószeres kontrollcsoporthoz képest (\\(P)<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed Cistanche tubulosaA főzetdarabos kivonatok helyreállíthatják a sejt endogén antioxidáns védekező képességét az LPS által kiváltott oxidatív sértésekkel szemben.

3.7 A gyulladást elősegítő citokin TNF-, IL-1, IL-6 felszabadulást gátló hatása

Az ELISA kimutatási eredmények azt mutatták, hogy az LPS-stimuláció erősen elősegítette a TNF-, IL-1, IL-6 szekrécióját a RAW264.7 makrofágokból (\\(P)<0.001\)). With the increase of Cistanche tubulosaAz extraktum kezelési koncentrációjának függvényében e három kulcsfontosságú gyulladáskeltő citokin felszabadulási mennyisége fokozatosan elnyomott, egyértelmű dózis-válasz összefüggést mutatva. Megerősítette, hogy a gyógynövénykivonat erős gyulladáscsökkentő funkciót fejt ki azáltal, hogy gátolja az aktivált makrofágokból származó gyulladást elősegítő citokin szekréciót.

3.8 A p38/AKT/JNK/NF-κB jelátviteli útvonal foszforilációjának szabályozása

A Western-blot kísérleti adatok azt mutatták, hogy a p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK és p-NF-κB/NF-κB aránya szignifikánsan megemelkedett az LPS-modell-csoportban az oldószer-kontroll-csoporthoz képest (\\(P)<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage Cistanche tubulosaAz extrakciós beavatkozás jelentősen csökkentette a p-p38/p38 és a p-JNK/JNK arányt (\\(P)<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that Cistanche tubulosaA főzetdarab-kivonat enyhítette az oxidatív-gyulladásos sérüléseket a p38/AKT/JNK/NF-κB jelátviteli hálózat hiperfoszforilációs aktiválásának elnyomásával.

4. Vita

A kínai gyógyszerkönyvben rögzített hagyományos feldolgozási követelményekCistanche tubulosafőként a szennyeződések eltávolítását, mosást, nedvesítést, szeletelést és szárítást foglalják magukban, a szeletvastagság, a gőzölés időtartama és a szárítási hőmérséklet pontos számszerű paraméterei nélkül. A nem szabványos kézi feldolgozás nagy minőségi ingadozást okoz a kereskedelmi forgalomban kapható főzetdarabkák esetében. A feniletanoid-glikozidok (echinakozid és akteozid) termikusan labilis bioaktív vegyületek. A nem megfelelő fűtési idő vagy hőmérséklet kémiai bomlást vált ki, és csökkenti a gyógyászati ​​értéket. Egytényezős kísérleteink kimutatták, hogy mind az elégtelen és túlzott gőzölés, mind a túl magas szárítási hőmérséklet a glikozid célkomponensek elvesztését okozza. A további Box-Behnken többtényezős optimalizálás gyakorlati gyártási paramétereket eredményezett: szeletvastagság 0,6 cm, gőzölés 6 perc, szárítás 57 fok. Ilyen körülmények között az akteozid- és echinakozid-tartalom elérte a 7,25%-ot és a 31,62%-ot, ami jóval meghaladja a gyógyszerkönyvben meghatározott minimális minőségi küszöböt. Ez az optimalizált protokoll megvalósítható mennyiségi műszaki referenciákat biztosít a hszincsiangi eredetű szabványos ipari feldolgozáshozCistanche tubulosa.

Az oxidatív stressz és a gyulladás szorosan összefüggő kóros folyamatok. A felesleges ROS lipidperoxidációt indukál, és MDA-t termel, amely tovább aktiválja a veleszületett immunmakrofágokat. Az aktivált makrofágok bőséges NO-t és többszörös pro-inflammatorikus citokint választanak ki, amelyek megfordítva erősítik az intracelluláris ROS-termelést, önerősítő oxidatív-gyulladásos ördögi kört képezve. A természetes növényi eredetű antioxidáns anyagok megtörhetik ezt a kóros hurkot az endogén antioxidáns enzimrendszer megemelésével és a gyulladásos jelátvitel visszaszorításával. Ebben az in vitro vizsgálatban optimálisan feldolgozvaCistanche tubulosaA főzetdarabos kivonatok csökkentették a ROS-, NO- és MDA-szinteket, miközben fokozták az LPS-stimulált RAW264.7 makrofágok SOD-, CAT-, LDH-aktivitását és GSH-tartalmát. Ezzel egyidejűleg gátolta a TNF-, IL-1, IL-6 pro-inflammatorikus-citokin-szekréciót, integrált antioxidatív-stressz és gyulladásgátló képességet bizonyítva.

A mitogén által aktivált protein-kináz család molekulái, a p38, a JNK, valamint az AKT és az NF-κB központi jelátviteli csomópontot alkotnak, közvetítve a makrofágok gyulladásos-oxidatív válaszait. Az LPS-stimuláció hatására az upstream jel kiváltja a p38, JNK és AKT foszforilációs aktivációját, ami szekvenciálisan elősegíti az NF-κB p65 alegység foszforilációját és a nukleáris transzlokációt. Az aktivált NF-κB transzkripciós faktorként működik, és nagy mennyiségű proinflammatorikus citokin és oxidatív stresszel kapcsolatos gének transzkripcióját indítja el. Western-blot eredményeink ezt mutattákCistanche tubulosaA kivonat elnyomhatja a p38, JNK, AKT és NF-κB p65 foszforilációját. Ebből arra következtetünk, hogy antioxidáns-stressz és gyulladásgátló bioaktivitása legalább részben a p38/AKT/JNK/NF-κB jelátviteli tengely túlzott aktiválásának blokkolásával érhető el.

A jelenlegi kutatásban számos korlát van. Minden funkcionális ellenőrzés az in vitro sejttenyészet szintjére korlátozódik. További állatmodell in vivo kísérletek szükségesek az optimalizált főzetdarabok in vivo farmakodinamikai teljesítményének igazolására. Ezenkívül ez a tanulmány a főzetdarabokból származó teljes vegyes kivonatot vette át, így nem tudjuk megkülönböztetni az echinakozid, az akteozid és más kisebb másodlagos metabolitok egyéni hozzájárulását. Az utólagos kutatások monomer vegyületeket izolálhatnak, hogy összehasonlítsák a megfelelő antioxidáns-stressz hatékonyságot, és elvégezzék a kompatibilitási hatás vizsgálatát. Ennek ellenére jelen munkánk továbbra is gyakorlati feldolgozási technológiai paramétereket és előzetes mechanikai bizonyítékokat szolgáltat a fejlesztéshezCistanche tubulosa- kapcsolódó egészségügyi termékek.

5. Következtetés

Összefoglalva, a Box-Behnken válaszfelületi módszerrel optimalizált korszerűsített feldolgozási munkafolyamat (szeletvastagság 0,6 cm, gőzölés 6 perc, szárítási hőmérséklet 57 fok) jelentősen növelheti az akteozid és echinakozid tartalmátCistanche tubulosafőzet darabok. Az ezekből az optimálisan feldolgozott gyógynövényszeletekből készült kivonatok kiemelkedő antioxidáns-stressz- és gyulladásgátló hatást fejtenek ki az LPS által kiváltott RAW264.7 makrofág-károsodás ellen. A mögöttes mechanizmus az intracelluláris antioxidáns-védelmi rendszer helyreállításával és a p38/AKT/JNK/NF-κB gyulladásos jelátviteli útvonal túlzott aktiválódásának gátlásával korrelál. Ez a tanulmány szilárd kísérleti alapot biztosít a szabványosított ipari termeléshez és a funkcionális élelmiszerek hasznosításáhozCistanche tubulosaerőforrás.

Hivatkozások

Lin J, Yu H, Zhao Y és mtsai. Az echinakozid kinyerése aCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight és májkárosodást védő hatásának vizsgálata szepszis patkányokban. Food Sci Technol, 2023, 43:e010523.

Guo J, Tang S, Miao Y és mtsai. A lignán glikozidok gyulladáscsökkentő hatásaCistanche tubulosaLPS/IFN-indukált RAW264.7 makrofág sejtekből származik a PI3K/AKT útvonalon keresztül. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2021, 22(10):1380-1391.

Rani V, Deep G, Singh RK és társai. Oxidatív stressz és anyagcserezavarok: Patogenezis és terápiás stratégiák. Élettudományok, 2016, 148:183-193.

Park JH, Kim JH, Jang S I. A dise-necionil-cisz-khellakton gyulladásgátló hatása LPS-stimulált RAW264.7 sejtekben és gátló hatása az oldható epoxid-hidrolázra. Heliyon, 2023, 9(10):e21032.

Chung YC, Song S J. Az izobavachin enyhíti a lipopoliszacharidok által kiváltott gyulladásos válaszokat a makrofágokban azáltal, hogy elnyomja a MAPK és NF-κB jelátviteli útvonalakat. Journal of Ethnopharmacology, 2024,321:117501.

He X, Li Y, Deng B. A PI3K/AKT jelátviteli út gyulladásban, sejthalálban és gliaheg képződésében traumás gerincvelő-sérülés után. Cell Proliferation, 2022, 55(9):e13275.