3-A daganatba beszűrődő limfocitákon lévő adrenerg receptor fenntartja az IFN- -függő PD-L1 expressziót, és rontja a daganatellenes immunitást neuroblasztómában

A neuroblasztóma (NB) egy heterogén extracranialis daganat, amely gyermekkorban fordul elő. Az NB-daganatok megkülönböztető jellemzője a neuroendokrin képességük katekolamin-szekrécióra, ami viszont az -adrenerg receptorok ligálásán keresztül befolyásolhatja a tumor mikrokörnyezetének (TME) különböző jelátviteli útvonalait. Korábban kimutatták, hogy az NB tumorsejteken az 3-adrenerg receptor (3- AR) specifikus antagonizmusa befolyásolta a tumor növekedését és progresszióját. Itt az NB rágcsáló szingenikus modelljében azt a célt tűztük ki magunk elé, hogy megvizsgáljuk, hogy az 3-AR moduláció befolyásolta-e a gazdaszervezet immunrendszerének tumorellenes válaszát. Az eredmények azt mutatták, hogy az 3-AR antagonizmus az immunválasz reaktiválásához vezet, részben a PD-1/PD-L1 jelátviteli tengely érintettségétől függően. Valójában a 3- AR blokád a tumor-infiltráló limfocitákon (TIL-ek) csökkentette az IFN-szekréció képességét, ami viszont csökkentette a TIL-ek infiltrációja által okozott PD-L1 expressziót az NB tumorsejteken. További vizsgálatok, NB-s betegek genomiális elemzésén keresztül azt mutatták, hogy a magas ADRB3 génexpresszió rosszabb klinikai eredményekkel korrelál az alacsony expressziós csoporthoz képest, és hogy az ADRB3 génexpresszió különböző immunrendszeri utakat érint. Összességében az eredmények azt mutatják, hogy az 3-AR az NB TME-ben képes modulálni a tumor és a gazdaszervezet immunrendszere közötti kölcsönhatást, és antagonizmusa több pro-tumorális jelátviteli útvonalat érint.

Grafikai absztrakt

BEVEZETÉS

A neuroblasztóma (NB) összetett és heterogén betegség, és az első életévben diagnosztizált rák leggyakoribb típusa. Az NB egy neuroendokrin daganat, amely a neurális taréj elkötelezett prekurzor sejtjeiből származik a szimpatikus idegrendszer (SNS) fejlődése során. Ez a jellegzetes eredet határozza meg a daganat lokalizációját, amely általában a mellékvesében és/vagy a szimpatikus ganglionokban fordul elő [1]. Az NB klinikai viselkedése nagyon változatos, a spontán visszafejlődő daganatoktól a többiig, amelyek rezisztenssé váltak minden rendelkezésre álló terápiára, beleértve az intenzív kemoterápiát, a műtétet, a sugárterápiát, az autológ őssejt-transzplantációt és a retinoidok (13-cisz-retinoid) kezelését. sav) [2]. Ezért ezekre a nem reagáló daganatokra alternatív terápiás célpontokra van szükség. Az immunkontrollpont-gátlókon (ICI) alapuló immunterápia a legígéretesebb stratégia számos szolid tumor esetében [3]. Többek között a programozott halál ligandum-1/programozott halál-1 (PD-L1/PD-1) jelátviteli tengely rontja az effektor T-sejtek immunitását és fokozza a tumorsejtek immuntoleranciáját, ami kulcsfontosságú. szerepe a daganatellenes válaszok gyengítésében egér- és humánrákokban egyaránt [4, 5]. Míg azonban már számos tanulmány vizsgálta a PD-1/PD-L1 jelátvitel hátterében álló mechanizmusokat felnőttkori rákban, a gyermekkori daganatokról keveset tudunk. Az SNS és az immunrendszer közötti összetett áthallás a katekolamin felszabaduláson és az -adrenerg receptorok aktiválásán keresztül számos daganatban képes meghatározni a tumor progressziójának sorsát [6]. Ez különösen igaz lehet az NB-s betegekre, akiknél a katekolaminok emelkedett szintje a rosszindulatú daganat súlyosságát tükrözi [7]. Az 3-adrenerg receptor (3-AR) altípust a közelmúltban a rák kritikus szabályozójaként azonosították [8–10]. Különösen expressziója és aktiválása, mind a tumor mikrokörnyezet (TME) tumor- és stromasejtjein, pro-tumorális jelátviteli útvonalakat váltott ki, amelyek a tumor progressziójáért felelősek különböző preklinikai modellekben [11–14]. Itt az NB szingenikus egérmodelljében kimutattuk, hogy a 3-AR a tumor-infiltráló limfocitákon (TIL-eken) fenntart egy IFN- --függő PD-L1-upregulációt a tumorsejteken, ami viszont egy immunszuppresszív TME felelős a tumor szökéséért. Ezenkívül az 3-AR antagonizmus növelte az immunreaktív CD8+, a természetes gyilkos (NK) és a dendritikus sejtek (DC) számát, és csökkentette az immunszuppresszív szabályozó sejtek számát. T-sejtek (Treg) és mieloid eredetű szupresszorsejtek (MDSC) a TME-ben. Ezen túlmenően egy Kaplan–Meier-analízis kimutatta, hogy a magas ADRB3 génexpresszió az NB-betegek rossz túlélésével jár együtt, és az NB-expresszió különböző elérhető nyilvános adatkészleteinek elemzése szignifikáns korrelációt tárt fel az ADRB3 génexpressziós szintje és a betegséggel kapcsolatos jelátviteli útvonalakban részt vevő gének között. az immunrendszer/tumor kölcsönhatás.

A cistanche tubulosa-Antitumor előnyei

MÓD

Sejttenyésztés

A neuro-2A rágcsáló NB rákos sejteket az ATCC-től (CCL-131) szereztük be, és 10% FBS-sel, 2 mM L-glutaminnal, 100 U·ml-1 penicillinnel és 100 µl kiegészített DMEM-ben növesztettük. ug·ml−1 sztreptomicin 37 fokos vízzel telített, 5% CO2 atmoszférában. A neuro-2a sejteket rutinszerűen tesztelték mikoplazma-szennyeződésre.

Tumor szingenikus egérmodell

4 hetes nőstény NCI A/JCr egereket a Charles River Laboratories-tól (Frederick) vásároltunk. A neuro-2a sejteket (N2A) szubkután ültettük be A/J recipiens egerekbe úgy, hogy 1 × 106 sejtet injektáltunk 100 ul PBS-ben a jobb szárnyba. Amikor az N2A sejtek tapintható daganatot képeztek (körülbelül 8 nap), megkezdődtek a kezelések. Az SR59230A (Tocris Bioscience) és a vivőanyag (fiziológiás oldat), a 8. és a 12. napon pedig a PD-L1 antitest (InVivoMAb anti-egér PD-L1 (B7-xhH1) #BE0101) kezelését naponta kétszer végeztük. , Bio X Cell) és izotípus kontroll (InVivoMAb patkány IgG2b izotípus kontroll # BE0090, Bio X Cell). Az IgG2b izotípus kontroll beadása ugyanazokat az eredményeket produkálta, mint a vivőanyagok, így az ábrákon csak a hordozó állapota látható. Az SR59230A-t 10 mg/kg fiziológiás oldatban adtuk be intraperitoneálisan (ip); 250 µg PD-L1-et adtunk be ip 100 µl InVivoPure™ pH 6,5 hígítópufferben (#IP0065); 250 µg IgG2b izotípus kontroll egeret juttattunk be ip 100 µl InVivoPure™ pH 7,0 hígítópufferben (#IP0070). Az FTY720-zal (#6176, Tocris Biotechne) végzett kezelést 2 mg/kg per os (po) dózisban adtuk be a 6. naptól. A tumor növekedési sebességét a tumor tömegének kaliberrel történő mérésével értékeltük, és a tumor tömegének térfogatát térfogatként számítottuk ki {{ 41}} [(hossz × szélesség)2 /2]. Az egereket 8 napos kezelés után leöltük.

Western blot analízis

A sejteket összegyűjtöttük és proteáz inhibitor koktélt tartalmazó RIPA pufferben lizáltuk. A mennyiségi meghatározás után 20 ug összfehérjét használtunk fel SDS-PAGE és WB elemzés elvégzésére. A PVDF membránokat egy éjszakán át inkubáltuk az anti-PD-L1 (ab238697, Abcam), foszfo-CREB (ab32096, Abcam), CREB (ab32515, Abcam), p-PKA // (sc- 32968, Santa) elsődleges antitestekkel. Cruz Biotechnology), -aktin (sc-1615, Santa Cruz Biotechnology), 3-AR (ab94506, Abcam) 4 fokon, majd specifikus másodlagos antitestekkel 1 órán át szobahőmérsékleten. Az antitestek specifikus fehérjékhez való kötődését Clarity Western ECL Substrate (Bio-Rad) segítségével detektáltuk, és a képeket a Chemidoc Imaging System (Biorad®) segítségével készítettük. A kvantitatív elemzésekhez ImageJ szoftvert használtunk, és a sávok jelintenzitását a kontrollértékekhez viszonyított többszörös növekedésben fejeztük ki.

Ko-tenyésztés a PD-L1 citofluorimetriás vizsgálathoz

A tumorsejteket MW24-re oltottuk (45,000 sejt/lyuk), és 24 óra elteltével együtt tenyésztettük limfocitákkal, amelyeket 2 napig hordozóval vagy SR59230A-val (T2) előkezelt egerek TDLN-eiből nyertünk. oltási arány 1:10 (tumor/limfociták). A teljes inkubációs periódus (48 óra) végén a limfocitákat a kotenyészet tápközegével együtt gyengéd pipettázással eltávolítottuk, majd a tumorsejteket tripszinezéssel leválasztottuk, és anti-PD-L1 antitesttel (CD274 antitest) jelöltük meg. {17}}, eBioscience™) citofluorimetriás kvantifikációhoz. A megfestett sejteket MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer-en (Miltenyi Biotec, Gladbach, Németország) vettük fel, és az adatokat Flowlogic szoftverrel (Miltenyi Biotec, Gladbach, Németország) dolgoztuk fel.

Ko-kultúra PD-L1 immunfluoreszcenciához és IFN-kvantifikációhoz

A tumorsejteket mikroszkóp tárgylemezekre oltottuk (20,{1}} sejt/lyuk) a Nunc Lab-Tek kamra 4. tárgylemezén, és 24 óra elteltével együtt tenyésztettük limfocitákkal, amelyeket 2 napig hordozóval kezelt egerek TDLN-eiből nyertünk. vagy SR59230A (T2), 1:10 oltási arányban (tumor/limfociták). 48 óra elteltével a tápközegben lévő limfocitákat gyengéd pipettázással összegyűjtöttük, majd centrifugálással eldobtuk; felülúszót használtunk az IFN mennyiségi meghatározására a Luminex xMAP technológián keresztül a gyártó utasításai szerint. Röviden, az IFN mennyiségi meghatározását az együtttenyésztő tápközegben Bio-Plex Pro Mouse Cytokine IFN-Set (#171G5017M, Bio-Rad) segítségével végeztük, és az adatokat MAGPIX System-en (Luminex, Texas, USA) gyűjtöttük. Az elemzést a Bio-Plex Manager™ szoftverrel (BIO-RAD, California, USA) végeztük. Ehelyett mikroszkóp tárgylemezeken lévő tumorsejteket használtunk a PDL1 immunfluoreszcencia vizsgálat elvégzésére az alábbiak szerint. Az immunfluoreszcencia analízishez a sejteket 3%-os paraformaldehidben fixáltuk PBS-ben 20 percig. A permeabilizálást Tween-20 0,5% PBS-ben tartalmazó oldat hozzáadásával értük el 30 percig szobahőmérsékleten. A sejteket ezután 3%-os BSA-ban blokkoltuk 1 órán át, és 2 órán át inkubáltuk PD-L1 elleni primer antitesttel (ab238697, Abcam). Ezt követően, PBS-ben történő mosás után, a lemezeket Alexafluor 488 másodlagos antitesttel inkubáltuk 1 órán át. A képeket fluoreszcens mikroszkóppal (DMi8 - Leica microsystems) készítettük.

Kínai gyógynövény-cisztanche növény-Antitumor

limfociták siRNS elektroporációja 1- 2- és 3-AR elnémításhoz

A TDLN-ekből nyert limfocitákat siRNS-ekkel transzfektáltuk szelektív 1- (SASI_Mm01_00090154, szekvencia: GUGAUCGUGGCCAUCGCCA, Merck), 2- (SASI_Mm{) {5}}, sorrend: CCAAGUUCGAGCGACUACA, Merck) és 3-AR (SASI_Mm01_00145466, sorrend: CAGUGGACGUGCUCUGUGU, Merck) elnémítás. Röviden, limfocitákat elektroporáltunk siRNS-ekkel (100 nM) a 4D-Nucleofector X Unit (Lonza) és a P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Kit (V4XP{16}}, Lonza) segítségével. Végrehajtottuk az egér T-sejt elektroporációjára specifikus DN-100 programot. Az elektroporációt követően a limfocitákat TexMACS tápközegben (130-097-196, Miltenyi Biotec) tenyésztettük 24 órán át, majd 48 órán át N2A tumorsejtekkel együtt tenyésztettük, a korábban leírtak szerint a PD-L1 mennyiségi meghatározásához. A limfocitákban az AR-csillapítás hatékonyságát digitális csepp-PCR-rel értékeltük az alábbiak szerint.

Digitális csepp PCR az -ARs mRNS mennyiségi meghatározásához

Az RNS-t reverz átírással végeztük iScript Advanced cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) segítségével. A ddPCR-t ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) (Bio-Rad) segítségével végeztük a gyártási utasítások szerint, QX200 rendszeren (Bio-Rad) és C1000 Touch Thermal Cycler-en (Bio-Rad). A használt tesztek a következők: Adrb3-FAM (dMmuCPE5088688), Adrb2-FAM (dMmuCPE5089938), Adrb1-FAM (dMmuCPE5100184), Rps18-HEX (dMmuCPE47). A ddPCR adatokat QuantaSoft™ szoftverrel (1.7.4-es verzió, Bio-Rad) elemeztük.

RNS-szekvenálás

A kimetszett daganatokat RLT pufferbe (Qiagen) helyeztük, és mechanikusan homogenizáltuk gentleMACS Octo Disssociator-ral (Miltenyi Biotec, Glad bach, Németország) gentleMACS M Tubes (Miltenyi Biotec, Gladbach, Németország) segítségével. A teljes RNS extrakciót az RNeasy Plus Mini kittel (Qiagen) végeztük, követve a gyártó utasításait. Az RNS mennyiségi meghatározását NanoDrop 2000/2000c spektrofotométerrel (ThermoFisher) és Qubit RNA High Sensitivity (HS) (ThermoFisher) is végeztük. Az RNS integritását Agilent RNA 6000 Pico Kit segítségével értékeltük ki Agilent Bioanalyzer készüléken, és kizártunk minden olyan mintát, amelynek RNS integritási száma (RIN) kisebb, mint 6,00. A könyvtár előkészítése a TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold Kit (Illumina) segítségével történt a gyártó utasításai szerint, 500 ng teljes RNS kezdeti bevitelével. A könyvtár minőségét egy Agilent DNA 7500 kittel értékeltük Agilent Bioanalyzer készüléken, majd a könyvtár mennyiségi meghatározását 1X dsDNS High Sensitivity (HS) (ThermoFisher) alkalmazásával végeztük. A könyvtárakat NextSeq 550 Sequencing System-en (Illumina) szekvenáltuk NextSeq 500/550 v2.5 (150 ciklus) High Output Reagent Kits (Illumina) segítségével. A futtatásokat 2 × 76 bp konfigurációval végeztük.

mRNS mennyiségi meghatározása és transzkriptomikai elemzések

Az átiratok mennyiségi meghatározásához a Salmon (1.5.1-es verzió) térképezés alapú módot, valamint a mus musculus GRCm38.98 referencia-transzkriptumát használtuk. Az eredményül kapott qf fájlokat az R statisztikai nyelvvel elemeztük. A tximport csomagot használtuk az R-ben lévő adatok importálására, az átiratokat pedig az AnnotationDbi csomaggal és az org.Mm.eg.db adatbázissal zsugorította a génekre. Végül a statisztikai elemzéseket DESeq2-vel végeztük. Túldúsítási elemzést (ORA) hajtottunk végre a ClusterProfiler csomag segítségével a GO: BP adatbázis lekérdezésére, az eredményül kapott statisztikai elemzésekkel a megváltozott celluláris útvonalak kimutatására. A dúsítási elemzéshez szükséges gének kiválasztásához a log2FC küszöböt 0.5-re (| log2FC|⋝ 0.5), a módosított p-értéket pedig 0-ra állítottuk.{101} {17}}5. Az eredmények 0,05-ös p-értékkel történő szűrése után 45 statisztikailag deregulált folyamatot kerestünk le a GO: BP adatbázis alapján tesztelt 15158 folyamat közül.

Luminex citokinek mennyiségi meghatározása

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Az egereket 2 napos, SR59230A, PD-L1 és SR59230A + PD-L1 hordozóval végzett kezelés (T2) után leöltük, és a tumor tömegét ollóval kimetszettük, majd Bio-Plex Cell lysis kit (BIO-RAD, California) segítségével homogenizáltuk. , USA) és a gentleMACS Octo Disssociator (Miltenyi Biotec, Németország). A tumorlizátumokat ezután a Luminex xMAP technológián alapuló Bio-Plex Pro™ tesztekkel (BIO-RAD, California, USA) teszteltük citokinkoncentrációjukra. IFN-, TNF-, IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IL-1 és IL-1 szintek (pg/ml ) a gyártó utasításai szerint mérték. Az adatokat a MAGPIX rendszeren (Luminex, Texas, USA) gyűjtöttük, és az elemzést a Bio-Plex Manager™ szoftverrel (BIO-RAD, California, USA) végeztük.

Áramlási citometrikus elemzés

Áramlási citometriás analízist végeztünk a tumorsejteken és a tumor mikrokörnyezet immunsejt-alpopulációin az alábbiak szerint. Röviden, a daganatokat a Tumor dissociation kit egérrel (#130-096-730, Miltenyi Biotec) homogenizáltuk, és a tumorba infiltráló limfocitákat izoláltuk a teljes sejtszuszpenzióból CD45 (TIL) MicroBeads egérrel (#130-110- 618, Miltenyi Biotec) vagy CD8 (TIL) MicroBeads egér (#130-116-478, Miltenyi Biotec) a Pro Separator (Miltenyi Biotec) automatikán keresztül a gyártó utasításai szerint. A sejteket ezután inkubáltuk és megfestettük a különböző fluorokrómmal konjugált antitestek különböző megfelelően hígított kombinációival (1. kiegészítő táblázat). A megfestett sejteket MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer (Miltenyi Biotec®) segítségével analizáltuk, és az adatokat Flowlogic szoftverrel (Miltenyi Biotec®) dolgoztuk fel.

A sejtek és szövetek immunfluoreszcenciája

Az egérdaganat tömegének immunfluoreszcenciás analízisét az alábbiak szerint végeztük. A mintákat gyorsan kivágtuk, pufferolt 4%-os formaldehidben fixáltuk 24 órán át, és paraffinba ágyaztuk. A mintákból 5 μm vastag szövettani metszeteket vágtunk ki, paraffinmentesítettük, és 1 0 percig forraltuk nátrium-citrát pufferben (10 mM, pH 6,0; Bio-Optica) az antigén kinyerése érdekében, majd egy éjszakán át 4 fokon immunfestettük elsődlegesen. antitestek (anti-PD-L1, ab238697, Abcam; anti-- 3-AR, ab94506, Abcam; anti-CD4, 14-9766-82, eBioscience; anti-CD8, 14-0808-82, eBioscience; DBH, ab209487, Abcam). Az immunreakciót a másodlagos antitestekkel, Alexa Fluor 488- konjugált IgG vagy Alexa Fluor 594- konjugált IgG (1:350; Jackson Laboratory) inkubálásával tárták fel. A 4,6-diamidino-2-fenilindollal (DAPI) végzett ellenfestés után a reprezentatív képeket egy Olympus BX63 mikroszkóppal készítettük, amely a CellSens Dimension Imaging Software 1.6-os verziójához (Olympus) volt kapcsolva. Az immunfluoreszcens festést az ImageJ szoftveren (NIH, USA) keresztül értékeltük, mivel a kérdéses fehérje fluoreszcencia intenzitását a DAPI értékekre normalizáltuk.

A cistanche tubulosa-Antitumor előnyei

Kaplan–Meier és génkorrelációs elemzés NB-s betegekben

Az ADRB3 gén korrelációja a CD80, CTLA4, CD276, CD226, CD40LG, 4-1BBL immunellenőrző pont génjeivel, valamint korreláció az NB-s betegek teljes (OS) és eseménymentes túlélési (EFS) valószínűsége és az ARDB3 szintje között Az mRNS expresszióját 649 NB minta génexpressziós profiljával végeztük, amelyeket 44 K oligonukleotid microarray-ekkel generáltak. A profilokat és a klinikai adatokat az R2: genomikus elemzési és vizualizációs platformról (http://r2.amc.nl) kértük le (Kocak, egyéni ag44kcwolf, n=649 eset). Az eloszlás utolsó kvartilisét használták a Kaplan–Meier analízisben a magas és az alacsony ADRB3 génexpresszió expressziós határértékeként.

Statisztika

A statisztikai analízist GraphPad Prism (GraphPad, San Diego, CA, USA) segítségével végeztük egy- vagy kétirányú varianciaanalízissel (ANOVA), majd Bonferroni post-hoc teszttel vagy páratlan tanulói t-teszttel. Az in vivo kísérletekhez ugyanazon az állatmodellen végzett korábbi vizsgálatok szerint [12] csoportonként legalább 6 egérre volt szükség a 80%-os teljesítmény garantálásához. Az értékeket átlag ± SEM formában adjuk meg. A szignifikanciát akkor vették figyelembe, amikor P<0.05 and described in each figure legend. Allocation concealment was performed using a randomization procedure (http:// www.randomizer.org/).

EREDMÉNYEK

3-Az AR antagonizmus csökkenti a PD-L1 expresszióját NB-t hordozó A/J egerek tumorsejtjeiben

A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a PD-1/PD-L1 jelátvitel az NB-ben kulcsfontosságú mechanizmust jelent az immunfelügyelet korlátozásában, és hogy a PD-L1 expressziója korrelál a tumormarkerek magas szintjével [15, 16]. Figyelembe véve ezeket és korábbi adatainkat, amelyek azt mutatják, hogy az 3-AR-blokád képes immunkompetens TME-t kiváltani melanomát hordozó egerekben [13], kíváncsiak voltunk, vajon NB-daganatban az 3-AR Az antagonizmus a PD-L1 jelátviteli érintettségétől függően immunválasz aktiválódásához vezethet. Az 3-AR antagonista, az SR59230A beadása az NB egér szingenikus modelljében nagyobb mértékben csökkentette a tumor növekedését, mint egy anti-PD-L1 antitest mAb (PD-L1) kezelés, de nem figyeltek meg szinergikus hatást. amikor az egereket mindkét gyógyszerrel kezelték (1A, B ábra). Annak vizsgálatára, hogy az SR59230A beadása által kiváltott daganatellenes hatás részben a PD-L1 expressziós moduláción alapult, megvizsgáltuk a PD-L1 expressziós szintjét NB-t hordozó egerek TME-jében. Érdekes módon az immunfluoreszcencia (1C. ábra) és a Western blot analízis (1D. ábra) rágcsáló tumor tömegére azt mutatta, hogy a PD-L1 expressziója csökkent az 3-AR antagonistával kezelt egerek TME-jében a hordozó állapothoz képest. Mivel kiterjedt irodalmi adatok azt mutatták, hogy a TME-ben a rákos sejtek mellett a stromasejtek, például az antigénprezentáló sejtek (APC-k) az MDSC, a DC-k és a makrofágok a PD-L1 fő forrásai [17–20], tovább folytatjuk. megvizsgálta, hogy a TME-ben hol volt hatással a PD-L1 expressziós szintre az 3-AR blokád után. A citofluorometrikus vizsgálat kimutatta, hogy az 3-AR antagonizmus csökkentette a PD-L1 expresszióját a tumorsejtekben (1E. ábra), miközben növelte expressziós szintjét a DC-kben és a makrofágokban (1F, G. ábra). Az MDSC populációban nem figyeltek meg változást (1H. ábra). Ezek az első eredmények azt mutatják, hogy az 3-AR blokád jelentős tumorellenes aktivitást fejtett ki NB-t hordozó egerek szingenikus modelljében, és hogy a PDL1 antitest egyidejű alkalmazása nem váltott ki tumorellenes szinergikus hatást. Érdekes módon az 3-AR farmakológiai antagonizmus modulálta a PDL1 expressziós szintjét a TME-ben, ami arra utal, hogy a PD-L1 jelátvitel szerepet játszik az 3-AR blokád által kiváltott tumorellenes hatásban.

1. ábra SR59230A és PD-L1 kezelések hatása a tumornövekedésre és a PD-L1 expressziójára NB tumort hordozó egerekben

3-Az AR antagonizmusa és a PD-L1 beadása immunreaktív TME-t stimulál a NB-ben

Annak vizsgálatára, hogy az NB tumorsejtekben az 3-AR antagonizmust követően megfigyelt csökkent PD-L1 expresszió vajon vezetett-e immunreaktivációhoz TME-ben, először a perforin számát PD-1+CD{ {4}} sejt az SR59230A-, PD-L1- vagy SR59203A + PD-L1- kezelt egerek tumortömegében a vivőanyaghoz képest (4A. és B. ábra). Ezen túlmenően egy Ki67 festési vizsgálat olyan tendenciát mutatott, amely a CD8+ T-sejtek fokozott proliferációját jelzi az 3-AR antagonistával vagy PD-L1 antitesttel kezelt egerek NB-daganataiban, még akkor is, ha nem érte el jelentős mértékben. különbségek (4C. ábra). Végül a citokinek mérése kimutatta a PDL1-kezelt egerek tumortömegében a tumorellenes hatást kifejtő citokinek (például TNF-, IFN- és IL{24}}) megnövekedett szintjét, valamint az immunszuppresszív citokin IL-10 csökkenése. Meglepő módon az 3-AR antagonistával kezelt NB-t hordozó egerekben a TNF- és IL-6 növekedését, valamint az IL-10 szintjének csökkenését figyeltük meg, az immun- reaktív állapot, amit a T-sejtek jellemzői sugallnak, de az IFN-szint csökkent (4D. ábra). A többi vizsgált citokin (GMCSF, IL-2, IL-1 és IL-1) között nem találtunk szignifikáns különbséget. Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy az 3-AR antagonizmus kiváltja a gazdaszervezet immunválaszát az NB-t hordozó egerek TME-jében, ugyanazokat a hatásokat követve, mint a PD-L1 antitest beadása után. Különösen a CD8+ citotoxikus funkcióit erősítette mind az SR59230A, mind a PD-L1. Nem figyeltek meg szinergikus hatásokat, amikor az 3-AR antagonistát a PD-L1 antitesttel együtt adták, ami megerősíti, hogy az 3-AR blokád által kiváltott immunreaktiváció, legalábbis részben, a PD-L1 jelátviteltől függ. útvonal érintettsége.

2. ábra Az SR59230A és a PD-L1 immunreaktív TME-t stimulálnak az NB-ben

3. ábra Immunellenőrző pontok expressziója limfocitákon TME-ben és TDLN-ben 3-AR antagonizmus és PD-L1 beadása után

4 3-Ábra: Az AR-blokád CD8-funkciókat vált ki, és szabályozza az immuncitokinek szekrécióját a TME-ben.

3-A tumorba infiltráló limfocitákon az AR modulálja az IFN-szekréciót és befolyásolja a PD-L1 expresszióját NB tumorsejteken

A PD-L1 tumorsejteken történő expresszióját több tényező is kiválthatja, de többek között a TNF- és az IFN- jelentik a fő citokinek, amelyek képesek növelni a PD-L1 szintet különböző daganatokban [23]. Az NB tumormodellünkben az 3-AR/PD-L1 keresztbeszélgetés hátterében álló jelátvitel további tisztázása érdekében először in vitro vizsgáltuk a PD-L1 expresszióját N2A tumorsejteken TNF- és IFN-kezelést követően. Az eredmények azt mutatták, hogy a PD-L1 expressziója fokozódott a 48 órán át IFN-nel kezelt NB-sejtekben, de nem TNF-vel. Ezenkívül az N2A tumorsejtek előkezelése az 3-AR antagonista SR59230A-val nem volt képes megszüntetni az IFN-kezelés által okozott megnövekedett PDL1 expressziót (5A. ábra). Figyelembe véve, hogy az irodalmi adatok szerint a TIL-ek az IFN- fő sejtes forrása az adaptív immunválasz során [24], és eredményeink azt mutatták, hogy az 3-AR moduláció N2A tumorsejteken nem befolyásolta az IFN- -függő PD-t. -L1 expresszió, arra voltunk kíváncsiak, hogy a TIL-eken bekövetkezett 3-AR moduláció felelős-e a megváltozott IFN-szekrécióért, ami viszont befolyásolta a PD-L1 expresszióját a tumorsejteken. Hipotézisünk bizonyítására NB-t hordozó egerek TDLN-jéből nyert limfocitákat izoláltuk, amelyeket hordozóval vagy SR59230A-val kezeltünk, és in vitro együtt tenyésztettünk tumorsejtekkel. Az immunfluoreszcencia és az áramlási citometria analízis megerősítette, hogy az 3- AR antagonistával kezelt NB-t hordozó egerekből gyűjtött limfociták csökkentették a PD-L1 expressziót kiváltó képességüket N2A sejteken a kezeletlen limfocitákhoz képest (5B, D ábra). Ezenkívül az IFN-szint mérése az együtttenyésztési tápközegben megerősítette, hogy az SR50230A-val kezelt egerekből gyűjtött limfociták részben elvesztették IFN-szekréciós képességüket, amikor NB-tumorsejtekkel együtt tenyésztették őket (5C. ábra). Korábban már kimutatták, hogy az 3-AR számos szövetben kapcsolódhat Gs fehérjéhez, és aktiválása a cAMP/PKA jelátviteli útvonal aktiválásához vezet [25]. Ugyanakkor a vizsgálatok igazolták a ciklikus AMP-reszponzív elem kötődés (CREB) kritikus szerepét az IFN- pozitív transzkripciós szabályozójaként a T-sejtekben [25–27]. Ezekből a megfigyelésekből kiindulva megvizsgáltuk, hogy a cAMP/PKA/CREB jelátviteli út részt vett-e az 3-AR-függő IFN-szekrécióban TIL-ekben. Az eredmények azt mutatták, hogy a CD8+ TIL-ek 3-AR antagonizmusa csökkentette a PKA /PKA alegységek és a CREB foszforilációját, ami az IFN-expresszió csökkenéséhez vezetett a CD8+ TIL-ekben (kiegészítő 1A ábra). , B). Ezek az eredmények megerősítették, hogy az 3-AR képes fenntartani az IFN-transzkripciót az NB TIL-eiben a cAMP/PKA/CREB jelátviteli útvonal kiváltásával. Másrészt az immunszuppresszív citokin IL-10 csökkent az SR59230A-val kezelt egerek Treg-jében a hordozóhoz képest (kiegészítő 1C. ábra), ami megerősíti az NB TME immunreaktivitását 3-AR antagonista kezelés után NB-t hordozó egerek esetében. Az SR59230A antagonizmus 3-AR altípusra kifejtett szelektív hatásának megerősítésére ko-tenyésztési vizsgálatot végeztünk siRNS-sel elhallgatott limfocitákon a 1-, 2- és 3-AR esetében. altípusok. Az eredmények azt mutatták, hogy az 3-AR miatt elhallgatott limfociták az -AR altípusok közül részben elvesztették a PD-L1 expressziót indukáló képességüket N2A tumorsejteken a kontrollállapothoz képest (5E. ábra és 1D. kiegészítő ábra). Ezenkívül az 3-AR fehérje expresszióját NB-t hordozó egerek egér limfocitáin a TDLN-ekből nyert limfociták Western blot analízise (kiegészítő 2A ábra) és a CD4+ és CD{{ immunfluoreszcenciája igazolta. 90}} T-sejtek 3-AR-re festve a tumortömeg-metszeteken (kiegészítő 2B. ábra). Korábban kimutattuk, hogy az SR59230A által az N2A tumorsejtekre kifejtett 3- AR specifikus antagonizmusa gátolta az NB növekedését és a tumor progresszióját azáltal, hogy a szárból a tumorsejtek differenciálódási jellemzőire váltott [12]. Eredményeink itt arra utaltak, hogy az 3-AR antagonista beadásának daganatellenes hatása a TIL-ekre kifejtett 3-AR jelátviteli moduláción is alapult, ami viszont a daganatok elleni immunválaszok élénküléséhez vezetett. Ezért tézisünk in vivo alátámasztására FTY720-at adtunk be a T-sejtek TDLN-ekben való megfékezésére és a tumortömegbe való beszűrődésük csökkentésére. Az FTY720 a szfingozin 1-foszfát (S1P) analógja, és beadása az S1P receptor internalizációját és lebomlását idézi elő, így megakadályozza a limfociták kijutását a nyirokcsomókból [28]. A feltételezések szerint az FTY720 előkezelés csökkentette az 3-AR antagonista beadása által kiváltott daganatellenes hatást (5F–H. ábra). Az FTY720 hatékonyságának igazolására a T-sejtek TDLN-ben való visszaszorításában, nyolc napos (T8) kezelés után megmértük a T-sejtek számát a TDLN-ekben. Az eredmények azt mutatták, hogy mind a CD4+, mind a CD8+ sejtek megnövekedtek az FTY720-zal előkezelt egerek TDLN-jében a kezeletlen egerekhez (vivőanyaghoz) képest (2C. kiegészítő ábra). A mi és más korábbi eredményeink szerint, amelyek azt mutatják, hogy az S1P jelátvitel döntő fontosságú az NB-tumorsejtek túlélése szempontjából [12, 29], az FTY720 önmagában történő kezelés is jelentősen csökkentette a tumornövekedést (5F–H. ábra). A vivőanyagból és SR59230A-val kezelt egerekből izolált NB-tumortömegek RNS-szekvenálási analízise 5607 gént azonosított, amelyek közül 267 differenciálisan expresszált gén (DEG), 127 volt szabályozott, és 140 csökkent az SR59230A-val kezelt tumorokban (6A. ábra). A GO: BP adatbázis szerint számos, statisztikailag eltérően expresszálódó gén tartozott az immunrendszerhez kapcsolódó útvonalakba (6B. ábra). Ezenkívül az SR59230A-val kezelt tumorban a PD-L1 mRNS (CD274 gén) downregulációja a hordozó állapothoz viszonyítva, valamint az immunrendszerrel kapcsolatos folyamatokban részt vevő különböző más gének felszabályozása (6C. ábra) megerősítette a korrelációt az 3-AR és az AR között. a fehérjeszinten megfigyelt immun-ellenőrző pont PD-L1. Végül egy 34, NB-vel érintett beteget tartalmazó nyilvános adathalmaz (GSE14880 a GEO archívumból) differenciális génexpressziós elemzése megerősítette, hogy az alacsony ADRB3-expressziót mutató NB-tumortömegek az immunválaszok, a T-sejt-aktiváció és az immuneffektor pozitív szabályozását mutatták. az ADRB3 magas szintjét mutató tumortömeghez képest (6D. ábra). Megjegyzendő, hogy míg különböző rákos megbetegedések esetén a katekolaminok a rákkal összefüggő neuronokon keresztül szabadulnak fel, vagy egyszerűen csak a vérkeringés útján jutnak el a daganatba, addig a katekolaminok és metabolitjaik (HVA, VMA, dopamin) túlzott szintje, amely ennek a rosszindulatú daganatnak az egyedülálló jellemzője, származik. más forrásból. Valójában az NB sejtek sajátos eredetének köszönhetően (a neuronális tajték hibás szimpatikus neuronális differenciálódási sejtjeiből) ezek a daganatok általában maguk is képesek katekolamin kiválasztására. Valójában a mi NB egérmodellünkben a tumortömegeken végzett immunfluoreszcencia azt mutatta, hogy az NB tumorsejtek pozitívak voltak a dopamin-hidroxilázra (DBH) (kiegészítő 3A ábra), amely a noradrenalin szintéziséért felelős enzim, függetlenül a 3- AR expresszió daganaton vagy annak antagonizmusán. Összességében ezek az adatok rávilágítanak az -adrenerg jelátvitel döntő szerepére a gazdaszervezet immunrendszere és a tumor mikrokörnyezete közötti kölcsönhatásban szerepet játszó különböző biológiai folyamatok szabályozásában NB daganatokban. Az 3-AR antagonista beadását követően megfigyelt tumorellenes hatások egér szingenikus modellünkben, legalábbis részben, a tumortömegbe beszűrődő limfocitákon expresszált 3-AR modulációján alapulnak. Konkrétan kimutattuk, hogy az 3-AR szelektív blokkolása a TIL-eken csökkentette az IFN-szekréciót, ami viszont csökkentette a PD-L1 expresszióját az NB tumorsejteken, elősegítve az immunreaktív TME-t.

ábra: 5 3-AR a TIL-eken fenntartja az IFN- -függő PD-L1 expressziót NB tumorsejtekben. A

Az ADRB3 gén expressziója korrelál a rossz prognózissal NB-s betegekben

Egyes tanulmányok azt sugallták, hogy az {{0}}AR mRNS és/vagy fehérje túlzottan expresszálódik, és bizonyos esetekben korrelál a neoplasztikus proliferációval és transzformációval különböző humán rákos megbetegedések esetén [10, 30–32]. Ennek megfelelően a NB szingenikus egérmodelljén kapott preklinikai eredményeink azt mutatták, hogy az 3-AR jelátvitel különböző pro-tumorális folyamatokat képes fenntartani, amelyek elősegítik a tumor növekedését. Ezért annak tesztelésére, hogy az ADRB3 génexpresszió korrelál-e az NB-betegek túlélésével, Kaplan–Meier elemzést végeztünk az R2: Genomics Analysis and Visualization Platformon (http://r2.amc.nl) keresztül, a Kocak adatbázis segítségével, amely magában foglalja a teljes körű információ 649 NB-s beteg klinikai adatairól. Az eredmények azt mutatták, hogy az ADRB3 génexpresszió rossz eredménnyel járt NB-s betegekben. Az ADRB3 gén magas expressziója valóban szignifikánsan összefüggött a csökkent eseménymentességgel (p=3.2e-05) (7A. ábra) és a teljes túléléssel (p=8.4e-0.5) ( 7B ábra) NB-s betegek. Ezenkívül néhány kohorszban végzett génkorrelációs elemzés pozitív korrelációt mutatott ki az ADRB3 és a gátló immunellenőrzési pontok génjei között, mint például a CD80, CTLA4 és CD276, valamint negatív korrelációt az immunrendszert aktiváló immunellenőrző pontok génjeivel, mint például a CD266. CD40 ligandum (CD40LG) és 4-1BB ligand (4-1BBL) (7C. ábra). Összességében a kapott adatok rávilágítanak az ADRB3 génexpresszió negatív korrelációjára az NB-betegek kimenetelével, és megerősítik és megerősítik az 3-AR szerepét, mint olyan molekuláris szereplőt, amely képes tompítani a daganatellenes immunválaszokat több immunellenőrző pont befolyásolásával. jelzőutak.

VITA

Sajátos neurogén eredete óta a katekolamin metabolitok magas szintje jellemzi az NB tumor állapotát [7, 33]. Korábbi munkáink során azt feltételeztük, hogy a TME-ben a katekolamin felszabadulása a rákos sejteket célozhatja meg az -AR-ek aktiválása révén, ami a növekedési hurkot és a rosszindulatú daganatok előrecsatolását váltja ki NB-rákban. Valójában a kísérleti adatok azt mutatták, hogy az 3-AR különböző NB-tumorsejtvonalakon és betegek biopsziáin expresszálódik, és hogy modulációja jelentősen befolyásolta a tumornövekedést az NB szingén egérmodelljében [12]. A tumorsejteken történő -AR-ek expressziója mellett széles körben ismert, hogy az -AR-k a TME legtöbb sejtjének felszínén találhatók, beleértve az immunsejteket is, és hogy az immunsejtekben a katekolaminok -AR-okhoz való ligálása szabályozza mind a veleszületett, mind az adaptív immunitást. [34]. Meg kell jegyezni, hogy míg fiziológiás körülmények között az immunrendszer -adrenerg jelátvitel általi modulálása elősegíti a normális immunválaszt, megváltozott folyamatok esetén az SNS/katekolaminok/ -AR-ek hosszantartó stimulációja káros hatással lehet különböző immunsejtekre, beleértve a limfocitákra [35, 36]. ]. Ezekben a megváltozott állapotokban az adrenerg jelátvitel tartós stimulálása elősegíti a kóros folyamatokat, és többek között a rák progresszióját [37]. A fent említett megfigyelésekből kiindulva tanulmányunk célja annak vizsgálata, hogy az 3-AR antagonizmus által kiváltott daganatellenes hatások NB-daganatokban részben támaszkodhatnak-e a daganatellenes immunitás újjáéledésére, és hogy ez magában foglalhatja-e az immunellenőrző pontok jelátviteli útvonalainak modulálása. A preklinikai vizsgálatok azt sugallják, hogy a PD-L1 expressziója áttétes NB-ben kulcsfontosságú mechanizmust jelent az immunfelügyelet korlátozásában [15], és az anti-PD-L1/PD-1 és anti-CD4 antitestekkel kombinált immunterápia meggyógyítja a szingenikus disszeminált NB-t [15]. 38]. A közelmúltban számos gyermekkori daganatban értékelték a PD-L1 expresszióját, és mindenekelőtt a PD-L1 festődés az NB-s betegek rosszabb túlélésével járt [16, 39]. Ezenkívül kimutatták, hogy a PD-L1-pozitív daganatok gyakrabban helyezkedtek el a mellékvesében, mint a PD-L1-negatív daganatok, és hogy a katekolamin metabolitok (NSE, VMA és HVA) hajlamosak magasabb a PD-L1-pozitív csoportban, mint a PD-L1-negatív csoportban [16].

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Ez a bizonyíték arra utalt, hogy a PD-1/PD-L1 jelátviteli tengely képes szabályozni a tumor immunszökését primer és metasztatikus NB-ben, azonban nem vizsgálták a PD-1/PD- mögött meghúzódó pontos mechanizmusokat. L1 jelzés szabályozás. Annak vizsgálatára, hogy az 3-AR moduláció befolyásolhatja-e a PD-L1 expresszióját az NB-ben, és az ebből következő immunreaktivitást a TME-ben, a szingenikus N2A NB sejtekkel beoltott A/J egereket a 3- AR antagonista SR59230A, egy PD-L1 monoklonális antitest (PD-L1), vagy ezek kombinációja. Először is megfigyeltük, hogy az 3-AR antagonizmus képes volt csökkenteni az NB tumor növekedését és ezzel egyidejűleg a PD-L1 expresszióját az NB-t hordozó egerek TME-jében. Az áramlási citometria kimutatta, hogy az SR59230A-val kezelt egerek tumortömegében megfigyelt csökkent PD-L1 mennyisége leginkább a tumorsejtek csökkent expresszióját tükrözi. Ezzel éles ellentétben a PD-L1 expressziója a DC-ken és a makrofágokon felszabályozott. Számos tudományos bizonyíték támasztja alá, hogy a PD-L1 mind a tumorsejteken, mind az APC-ken található, és képes csillapítani a T-sejt-aktivációt, részben gátolva a tumor elleni hatékony immunreakciót [40]. A közelmúltban végzett vizsgálatok azonban kimutatták, hogy az antigénfelvétel és a tumorantigének T-sejteknek való keresztbemutatása során, ami az adaptív immunitás döntő lépése, a DC-k és a makrofágok felszabályozzák a PD-L1-et, így korlátozzák a T-sejtek túlzott aktiválódását, és megvédik őket a sejtek citotoxikus hatásaitól. T-sejtek [41, 42]. Ezért azt feltételeztük, hogy a PD-L1 csökkent expressziója a tumorsejteken és ezzel egyidejűleg az APC-k növekedése az SR59230A-val kezelt tumortömegben valószínűleg az immunrendszer felerősödését tükrözi a TME-ben. Az eredmények megerősítették a tumorba beszűrődő immunreaktív sejtek (NK, DC-k és CD8+) növekedését, valamint a tumorba beszűrődő immunszuppresszív sejtek (Treg és MDSC) csökkenését. A PD-1 immunellenőrző pont TIL-eken végzett expressziós elemzése szignifikánsan megnövekedett PD-1+CD4+ és PD- 1+CD8+ T-sejtek számát mutatta a TDLN-ekben a tumorfejlődés korai stádiuma (T2) és a PD-1+CD8+ a tumorban az SR59230A, PD-L1 vagy ezek kombinációs kezelésének 8 napos (T8) után a kontrollhoz képest. Növekvő tendenciát figyeltek meg a TIM3-ra vagy LAG3-ra festett CD4+ T-sejtek számában is az SR59230A, PD-L1 kezelések és ezek kombinációja esetén, de nem érték el a statisztikai szignifikanciát. A TIM3-ra vagy LAG3-ra festett CD8+ T-sejtek esetében ehelyett nagy eltérést figyeltünk meg. Míg egyes irodalmi adatok azt sugallják, hogy a PD-1, LAG-3 és TIM-3 expresszáló T-sejtek kimerültek és diszfunkcionálisak [43–45], mások azt mutatták, hogy ezek az immunellenőrző pontok, különösen a PD -1, az aktiválást és az effektor T-sejtek differenciálódását követően is felfelé szabályozzák [46–48], ezért az expresszió önmagában nem tükrözi a kimerült állapotot, inkább ezek a markerek azonosítják a különböző daganatokba beszűrődő autológ tumorreaktív repertoárt [46–48] 49]. Ezzel egyetértésben a tumormodellünkben végzett mélyebb vizsgálatok megerősítették, hogy 3-az AR antagonizmus, mint az anti-PD-L1 mAb-vel végzett kezelés, kiváltotta a CD citotoxikus funkcióit8+, amint azt a PD megnövekedett száma mutatja. Perforinra vagy granzyme B-re festett 1+CD8+ sejtek, ami megerősíti, hogy a tumortömegben található PD1+ TIL-ek funkcionálisan aktívak. Kimutatták, hogy a CD8+ citotoxikus T-sejtek nagymértékű infiltrációja a tumorban pozitív prognózissal korrelál számos rosszindulatú daganatban szenvedő betegeknél, beleértve a melanomát, a fej-nyaki, emlő-, vastagbél-, petefészek-, prosztatarákot és más daganatokat [50]. Egy közelmúltban végzett tanulmány kimutatta, hogy a tumorba beszűrődő T-sejtekben dúsított daganatok jobb klinikai kimenetelűek voltak, függetlenül a daganatok stádiumának meghatározására alkalmazott egyéb jelenlegi mutatóktól [51]. Ezenkívül a legújabb eredmények azt mutatták, hogy a DC- és NK-sejtek jelenléte a tumortömegben pozitívan korrelál mind a T-sejt-infiltrációval, mind az NB-betegek pozitív klinikai kimenetelével [52]. Mindezek a klinikai bizonyítékok megegyeznek preklinikai eredményeinkkel, amelyekben az NK, DC és CD{89}} T-sejtekben dúsított TME, amelyet az 3- AR antagonizmus vagy PD-L1 beadása után figyeltek meg, funkcionálisan képes volt szabályozza az NB tumor növekedését. A gazdaszervezet immunrendszerének daganatokkal szembeni kihívásának egyik alapvető aspektusa a különböző citokinek felszabadulása a TME-ben, amelyek fenntarthatják vagy elhalványíthatják a tumorellenes aktivitást. A citokinek mérése tumorban megerősítette, hogy az SR59230A-val és PD-L{97}}kezelt egerekben az állapot az immunreaktív TME felé tolódott el. Míg azonban a tumorellenes citokinek közül a TNF- és az IL{101}} szintje egyaránt nőtt, az IFN-szint csökkent az 3-AR antagonistával kezelt egerek tumortömegében. Ebből a megfigyelésből kiindulva feltételeztük, hogy az 3-AR jelátvitel modulációja a tumorba beszűrődő T-sejteken, különösen a CD-n és a CD-n{108}} felelős lehet egy megváltozott IFN-ért. szekréciót, ami viszont befolyásolta a PD-L1 expresszióját a tumorsejteken. Az eredmények megerősítették hipotézisünket. A TIL-ekre kifejtett szelektív 3-AR antagonizmus valóban hatástalanná tette ezeket a sejteket a PD-L1 expresszió indukálásában NB tumorsejteken az IFN- szekréció megváltozása miatt, és de facto megakadályozta az adaptív immunrezisztencia kialakulását. A TME-ben az IFN mind pro-tumorigén, mind daganatellenes immunválaszokat szervez, citotoxikus citokinként működik a granzyme B-vel és a perforinnal együtt, hogy eltalálja a daganatsejteket, de beindítja a gátló immunellenőrző pontok szintézisét is, ezáltal stimulálja az immunszuppresszív mechanizmusokat [53]. Az IFN-nek az ellentétes hatásokat kiváltó bimodális szerepe összetett mechanizmusoktól függ, amelyek még nem teljesen ismertek, azonban úgy tűnik, hogy a kiválasztott IFN mennyisége meghatározó a citokin által kiváltott hatások meghatározásában [54]. Ennek megfelelően feltételezzük, hogy modellünkben a TIL-eken kifejtett 3- AR antagonizmus által előidézett IFN-mennyiség csökkenése kedvezett az immunválaszoknak a kontrollállapothoz képest, amelyben a krónikus IFN-expozíció több immunszuppresszív mechanizmust kényszerít ki. Az -AR altípusok közül úgy tűnik, hogy az 2-AR expresszálódik leginkább a különféle immunsejtek felszínén. Meg kell azonban jegyezni, hogy az 3-AR-t, az -AR-k utolsó azonosított tagját tanulmányozták eddig a legkevésbé. Ezért annak igazolására, hogy az SR59230A beadása főként az 3-AR altípust blokkolja, először megvizsgáltuk és megerősítettük az 3-AR fehérje expresszióját a TDLN-ek limfocitáin és a tumorba infiltráló T-sejteken. Kimutattuk az 3-AR fehérje expresszióját tumorba infiltráló CD4+ és CD8+ esetén, majd szelektív 1-, 2- és {{ 140}}Az AR-ok elnémításával megerősítettük a limfocitákon található 3-AR altípus kiemelkedő szerepét az IFN- -függő PD-L1 expresszió szabályozásában az NB tumorsejteken. Megjegyezzük, hogy a különböző szövetekre és sejtmodellekre vonatkozó kiterjedt adatok azt mutatják, hogy míg az 1- és a 2-AR-ok hajlamosabbak a homológ deszenzitizáció jelenségére az endogén katekolaminoknak való hosszan tartó expozíciót követően, a {{147} }Az AR altípusról kiderült, hogy nem, és amikor ennek ellenére egyes cellákban az 3-ARs deszenzibilizáció megtörtént, az kevésbé volt kifejezett, mint az 1- és 2-ARs [ 55]. Ezután azt feltételezzük, hogy az NB-daganatban, amelyet a krónikus katekolaminok expozíció jellemez, a fiziológiailag leginkább kifejezett 2-AR altípus a TIL-eken a deszenzitizációt követően csökkenhet, és fordítva, az 3-AR kiváltja a kulcsfontosságú szerepet játszik a katekolamin-indukált tumort elősegítő hatások közvetítésében. A 3- AR-expresszió pro-tumorális hajlamának humán vizsgálatára végül genetikai elemzést végeztünk 649 NB-s betegen a nyílt hozzáférésű R2: Genomics Analysis and Visualization Platform segítségével. A magas ADRB3 génexpresszió korrelált az NB-s betegek legrosszabb klinikai kimenetelével (teljes és eseménymentes túlélés) az alacsonyabb expresszióhoz képest; továbbá a pozitív ADRB3 gén korrelációja a különböző immunszuppresszív ellenőrző pontokkal, mint például a CD80, CTLA4 és B7-}H3 (CD276), valamint a negatív korreláció az immunaktiváló ellenőrzőpontokkal, mint például a CD266, CD40LG és 4-1 A BBL megerősítette az 3-AR negatív szerepét az NB immunreaktivitásának komplex szabályozásában. Különösen az ADRB3 gén expressziójának pozitív korrelációja az immunszuppresszív ellenőrző pontokkal, mint például a CD276, egy NB-asszociált molekula, amely a nem reagáló NB-variánsokban található, és amely védő szerepet játszik az NK-sejtek által közvetített lízistől [56, 57], vagy a CTLA4-gyel, amelynek gátlása nem volt redundáns a tumorellenes T-sejtek pusztításának fokozásában NB-ben [58], rávilágított az 3-AR jelátvitel azon képességére, hogy fenntartson különböző mechanizmusokat, amelyek elősegítik a tumor immunszökését. Feltételezhetjük, hogy a magas ADRB3 génexpresszió és a különböző immunellenőrző pontok fokozott expressziója közötti összefüggés támaszkodhat az 3-AR azon képességére, amely képes fenntartani azokat a mechanizmusokat, amelyek túlzott aktiválása elősegíti a tumorrezisztencia kialakulását, például a krónikus expozíciót valamilyen pro-nak. - gyulladásos citokinek. Az ellenőrzőpont gátlással kapcsolatos korai tanulmányok NB-ben nem mindig voltak sikeresek. Mind a preklinikai vizsgálati modellekben, mind az embereken a többszörös ICI-t alkalmazó terápiás stratégiákban kapott jobb válaszok arra utaltak, hogy a különböző immunellenőrző pontok megcélzása nem redundáns hatékony daganatellenes megközelítést jelent az NB-ben [58, 59]. Ezután a különböző immunszuppresszív utak megcélzása jelentheti a legjobb terápiás lehetőséget az egycélú terápia tumorrezisztenciájának elkerülésére. Több gyógyszer beadása azonban mindig problémás a súlyos mellékhatások és toxicitás miatt, és nem mindig vezetett a kívánt eredményhez. Ezért az új immun-onkológiai megközelítések kidolgozásához a TME immunpárja komplex hálózatának szabályozásában szerepet játszó molekuláris mechanizmusok mélyebb ismerete szükséges. Ebben az összefüggésben a bemutatott eredmények azt sugallják, hogy az 3-AR célzása az NB TME-ben egy lehetséges megközelítést jelenthet több, nem redundáns pro-tumorális jelátviteli útvonal eléréséhez. Az 3-AR antagonizmus különösen azáltal, hogy mind a gazdaszervezet immunrendszerét érinti, az immunellenőrző pontok együttműködése által kiváltott gát eltávolítása révén, mind a tumorsejtek túlélési útjait, ígéretes stratégiát jelenthet, remélhetőleg terápiás céllal. potenciális NB rosszindulatú daganatok által érintett betegek számára. További vizsgálatokra van szükség a gazdaszervezet immunrendszere és a tumor megfelelője közötti komplex kölcsönhatás hátterében álló további mechanizmusok elmélyítéséhez. Mindazonáltal a megfigyeltek fényében az NB-daganatok TME-jében az -adrenerg jelátvitel vizsgálata érdemes figyelembe venni.

6. ábra Az NB tumor tömegének transzkriptomikus elemzése megerősíti az 3-AR kiemelkedő szerepét az immunrendszerrel kapcsolatos folyamatok befolyásolásában

7. ábra Kaplan–Meier túlélési analízis és immunellenőrzési pontok korrelációja az ADRB3 génexpresszióval NB-s betegekben.

IRODALOM

1. Cheung NK, Dyer MA. Neuroblasztóma: fejlődésbiológia, rák genomika és immunterápia. Nat Rev Rák. 2013;13:397–411.

2. Matthay KK, Maris JM, Gudrun S, Nakagawara A, Mackal CL, Diller L és mások. Neuroblasztóma. Nat Rev Dis Prim. 2016;2:16078.

3. Darvin P, Toor SM, Nair SN, Elkord E. Immune checkpoint inhibitors: legutóbbi fejlődés és potenciális biomarkerek. Exp Mol Med. 2018;50:1–11.

4. Pardoll DM. Az immunellenőrző pontok blokkolása a rák immunterápiájában. Nat Rev Rák. 2012;12:252–64.

5. Zou W, Wolchok JD, Chen L. PD-L1 (B7-H1) és PD-1 blokád a rákterápiában: mechanizmusok, válasz biomarkerek és kombinációk. Sci Transl Med. 2016;8:328rv4.

6. Cole SW, Sood AK. Molekuláris útvonalak: béta-adrenerg jelátvitel a rákban. Clin Cancer Res. 2012;18:1201–6.

7. Strenger V, Kerlb R, Dornbusch HJ, Ladenstein R, Ambros PF, Ambros IM és társai. A vizelet katekolaminok diagnosztikai és prognosztikai hatása neuroblasztómás betegekben. Gyermekkori vérrák. 2007;48:504–9.

8. Huang XE, Hamajima N, Saito T, Matsuo K, Mizutani M, Iwata H stb. A béta2- és a béta3-adrenerg receptor génpolimorfizmusainak lehetséges összefüggése az emlőrákra való fogékonysággal. Breast Cancer Res. 2001;3:264–9.

9. Babol K, Przybylowska K, Lukaszek M, Pertynski T, Blasiak J. An Association between the Trp64Arg polymorphism in the beta3-adrenerg receptor gene and endometrium cancer and obesity. J Exp Clin Cancer Res. 2004;23:669–74.

10. Perrone MG, Notarnicola M, Caruso MG, Tutino V, Scilimati A. A béta3-adrenerg receptor mRNS upregulációja humán vastagbélrákban: előzetes tanulmány. Onkológia. 2008;75:224–9.

11. Magnon C, Hall SJ, Lin J, Xue X, Gerber L, Freedland SJ és mások. Az autonóm idegfejlődés hozzájárul a prosztatarák progressziójához. Tudomány. 2013;341:1236361.

12. Bruno G, Cencetti F, Pini A, Tondo A, Cuzzubbo D, Fontana F és mások. A béta3- adrenoreceptor blokád az SK2/S1P2 moduláción keresztül csökkenti a daganat növekedését és fokozza a neuroblasztómák neuronális differenciálódását. Onkogén. 2020;39:368–84.

13. Calvani M, Bruno G, Dal Monte M, Nassini R, Fontana F, Casini A és mások. béta3 -Adrenoceptor, mint potenciális immunszuppresszor szer melanómában. Br J Pharm. 2019;176:2509–24.

14. Dal Monte M, Casini G, Filippi L, Nicchia MG, Svelto M, Bagnoli P. A béta3-adrenerg receptorok funkcionális részvétele a melanoma növekedésében és vaszkularizációjában. J Mol Med. 2013;91:1407–19.

15. Dondero A, Pastorino F, Della Chiesa M, Corrias MV, Morandi F, Pistoia V és társai. A PDL1 expressziója metasztatikus neuroblasztómában, mint az immunfelügyelet korlátozásának további mechanizmusa. Onkoimmunológia. 2016;5:e1064578.

16. Zuo S, Sho M, Sawai T, Kanehiro H, Maeda K, Yoshida M és mások. A PD-L1 expresszió és a tumor-infiltráló limfociták lehetséges szerepe a neuroblasztómában. Pediatr Surg Int. 2020;36:137–43.

17. Keir ME, Butte MJ, Feeman GJ, Sharpe AH. PD-1 és ligandumai a toleranciában és az immunitásban. Annu Rev Immunol. 2008;26:677–704.

18. Curiel TJ, Wei S, Dong H, Alvarez X, Cheng P, Mottram P és munkatársai. A B7-H1 blokkolása javítja a mieloid dendritesejt által közvetített daganatellenes immunitást. Nat Med. 2003;9:562–7.

19. Wu K, Kryczek I, Cheng L, Zou W, Welling TH. A CD8+ T-sejtek Kupffer-sejtek szuppresszióját humán hepatocelluláris karcinómában a B7-H1/programozott halál-1 kölcsönhatások közvetítik. Cancer Res. 2009;69:8067–75.

20. Kuang DM, Zhao Q, Peng C, Xu J, Zhang JP, Wu C és mások. Az aktivált monociták a hepatocelluláris karcinóma peritumorális sztrómájában elősegítik az immunitást és a betegség progresszióját a PD-L1-en keresztül. J Exp Med. 2009;206:1327–37.

21. Rotte A, Jin JY, Lemaire V. Az immunellenőrzési pontok mechanikus áttekintése a rák immunterápiájában alkalmazott kombinációik racionális tervezésének támogatására. Ann Oncol. 2018;29:71–83.

22. Dammeijer F, van Gulijk M, Mulder EE, Lukkes M, Klaase L, van den Bosch T, et al. A PD-1/PD-L1 ellenőrzőpont korlátozza a T-sejtes immunitást a daganatelvezető nyirokcsomókban. Rákos sejt. 2020;38:685–700. e8.

23. Cha JH, Chan LC, Li CW, Hsu JL, Hung MC. A PD-L1 expresszióját szabályozó mechanizmusok rákban. Mol Cell. 2019;76:359–70.

24. Burke JD, Young HA. IFN-: egy citokin a megfelelő időben, a megfelelő helyen van. Semin Immunol. 2019;43:101280.

25. Schena G, Caplan MJ. Minden, amit mindig is tudni akart az 3-AR*-ról (*, de félt megkérdezni). Sejtek. 2019;8:357.

26. Liu Y, Guo YL, Zhou SJ, Liu F, Du FJ, Zheng XJ és mások. A CREB a gamma-interferon pozitív transzkripciós szabályozója látens, de nem aktív tuberkulózisfertőzésekben. Clin ad Vaccine Immunol. 2010;17:1377–80.

27. Samten B, Townsend JC, Weis SE, Bhoumik A, Klucar P, Shams H és társai. A CREB, ATF és AP-1 transzkripciós faktorok szabályozzák a humán T-sejtek IFN-gamma szekrécióját a mikobakteriális antigénre adott válaszként. J Immunol. 2008;181:2056–64.

28. Matloubian M, Lo CG, Cinamon G, Lesneski MJ, Xu Y, Brinkmann V és társai. A limfociták kilépése a csecsemőmirigyből és a perifériás limfoid szervekből az S1P receptor 1-től függ. Természet. 2004;427:355–60.

29. Li MH, Hla T, Ferrer F. Az FTY720 gátolja a tumornövekedést és fokozza a topotekán tumorszuppresszív hatását neuroblasztómában azáltal, hogy megzavarja a szfingolipid jelátviteli útvonalat. Gyermekkori vérrák. 2013;60:1418–23.

30. Chisholm KM, Chang KW, Truong MT, Kwok S, West RB, Heerema-McKenney AE. béta-adrenerg receptor expresszió érdaganatokban. Mod Pathol. 2012;25:1446–51.

31. Montoya A, Amaya CN, Belmont A, Diab N, Trevino R, Villanueva G és mások. A nem szelektív béta-blokkolók alkalmazása a korai stádiumú emlőrákban csökkent tumorproliferációs indexekkel jár. Oncotarget. 2017;8:6446–60.

32. Rains SL, Amaya CN, Bryan BA. A béta-adrenerg receptorok különböző ráktípusokban expresszálódnak. Oncoscience. 2017;4:95–105.

33. Verly IR, van Kuilenburg ABP, Abeling NGGM, Goorden SMI, Fiocco M, Vaz FM és társai. Katekolaminok profiljai a diagnózis során: Fokozott diagnosztikai érzékenység és összefüggés a biológiai és klinikai jellemzőkkel neuroblasztómás betegekben. Eur J Rák. 2017;72:235–43.

34. Eng JWL, Kokolus KM, Reed CB, Hylander BL, MA WW, Repasky és társai. Egy idegi tumor mikrokörnyezet: az adrenerg stressz hatása a rákos sejtekre, az immunszuppresszió és az immunterápiás válasz. Rák Immunol Immunother. 2014;63:1115–28.

35. Dhabhar FS, McEwen BS. Az akut stressz fokozza, míg a krónikus stressz elnyomja a sejt által közvetített immunitást in vivo: potenciális szerepe a leukocita-kereskedelemben. Brain Behav Immun. 1997;11:286–306.

36. Dhabhar FS. Az immunfunkció stressz által kiváltott fokozása – a stresszhormonok, a leukocita-kereskedelem és a citokinek szerepe. Brain Behav Immun. 2002;16:785–98.

37. Qiao G, Chen M, Bucsek MJ, Repasky EA, Hylander BL. Adrenerg jelátvitel: célozható ellenőrző pont, amely korlátozza a daganatellenes immunválasz kialakulását. Front Immunol. 2018;9:164.

38. Rigo V, Emionite L, Daga A, Astigiano S, Corrias MV, Quintarelli C és mások. Az anti-PDL-1/PD{-1 és anti-CD4 antitestekkel végzett kombinált immunterápia meggyógyítja a szingén disszeminált neuroblasztómát. Sci Rep. 2017;7:14049.

39. Majzner RG, Simon JS, Grosso JF, Martinez D, Pawel BR, Santi M és társai. A programozott death-ligand 1 expresszió és a daganathoz kapcsolódó immunsejtek értékelése gyermekkori rákos szövetekben. Rák. 2017;123:3807–15.

40. Gibbons Johnson RM, Dong H. Az 1. programozott halálligandum (B7-H1) funkcionális expressziója immunsejtek és tumorsejtek által. Front Immunol. 2017;8:961.

41. Peng Q, Qiu X, Zhang Z, Zhang S, Zhang Y, Liang Y és mások. A dendritikus sejteken lévő PD-L1 gyengíti a T-sejt-aktivációt és szabályozza az immunellenőrzőpont blokádra adott választ. Nat Commun. 2020;11:4835.

42. Singhal S, Stadanlick J, Annunziata MJ, Rao AS, Bhojnagarwala PS, O'Brien S és mások. Humán tumorhoz kapcsolódó monociták/makrofágok és a T-sejtes válaszok szabályozása korai stádiumú tüdőrákban. Sci Transl Med. 2019;11:eaat1500.

43. Blackburn SD, Shin H, Haining WN, Zou T, Workman CJ, Polley A és mások. A CD8+ T-sejtek kimerülésének együttes szabályozása több gátló receptor által krónikus vírusfertőzés során. Nat Immunol. 2009;10:29–37.

44. Jin HT, Anderson AC, Tan WG, West EE, Ha SJ, Araki K és társai. Tim-3 és PD-1 együttműködése CD8 T-sejt-kimerülésben krónikus vírusfertőzés során. Proc Natl Acad Sci USA. 2010;107:14733–8.

45. Sakuishi K, Apetoh L, Sullivan JM, Blazar BR, Kuchroo VK, Anderson AC. A Tim-3 és a PD-1 útvonalak megcélzása a T-sejtek kimerültségének visszafordítása és a daganatellenes immunitás helyreállítása érdekében. J Exp Med. 2010;207:2187–94.

46. ​​Agata Y, Kawasaki A, Nishimura H, Ishida Y, Tsubata T, Yagita H és társai. A PD-1 antigén expressziója stimulált egér T- és B-limfociták felszínén. Int Immunol. 1996;8:765–72.

47. Vibhakar R, Juan G, Traganos F, Darzynkiewicz Z, Finger LR. Az emberi programozott halál-1 gén aktiválás által kiváltott expressziója T-limfocitákban. Exp Cell Res. 1997;232:25–8.

48. Freeman GJ, Long AJ, Iwai Y, Bourque K, Chernova T, Nishimura H és mások. A PD-1 immuninhibitor receptor egy új B7 családtag általi bekapcsolása a limfocitaaktiváció negatív szabályozásához vezet. J Exp Med. 2000;192:1027–34.

49. Gros A, Robbins PF, Yao X, Li YF, Turcotte S, Tran E és mások. A PD-1 azonosítja a humán daganatokba beszűrődő, beteg-specifikus CD8(+) tumorreaktív repertoárt. J Clin Invest. 2014;124:2246–59.

50. Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F, Kirilovsky A, Mlecnik B, Lagorce-Pagès C és társai. Az immunsejtek típusa, sűrűsége és elhelyezkedése a humán kolorektális daganatokban előrejelzi a klinikai kimeneteleket. Tudomány. 2006;313:1960–4.

51. Mina M, Boldrini R, Citti A, Románia P, D'Alicandro V, De Ioris M és mások. A tumorba infiltráló T-limfociták javítják a terápiarezisztens neuroblasztóma klinikai kimenetelét. Onkoimmunológia. 2015;4:e1019981.

52. Melaiu O, Chierici M, Lucarini V, Jurman G, Conti LA, De Vito R et al. A tumorba infiltráló dendritikus sejtek és a természetes gyilkos sejtek sejtes és génjei előrevetítik a neuroblasztóma prognózisát. Nat Commun. 2020;11:5992.

53. Jorgovanovic D, Song M, Wang L, Zhang Y. Roles of IFN-gamma in tumor progression and regression: a review. Biomark Res. 2020;8:49.

54. Zhang J. Yin és Yang IFN-gamma kölcsönhatása gyulladásban és autoimmun betegségekben. J Clin Invest. 2007;117:871–3.

55. Okeke K, Angers S, Bouvier M, Michel MC. A béta3 -adrenoreceptorok agonista által kiváltott deszenzitizációja: hol, mikor és hogyan? Br J Pharm. 2019;176:2539–58.

56. Castriconi R, Dondero A, Augugliaro R, Cantoni C, Carnemolla B, Sementa AR és mások. A 4Ig-B7-H3 azonosítása neuroblasztóma-asszociált molekulaként, amely védő szerepet játszik az NK-sejtek által közvetített lízistől. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101:12640–5.