3D veseorganoidok a padról az ágyra történő fordításhoz

Kapcsolatfelvétel: emily.li@wecistanche.com

Navin Gupta és mtsai

Absztrakt

A vesék alapvető szervek, amelyek megszűrik a vért, eltávolítják a vizelethulladékot, miközben fenntartják a folyadék és elektrolit homeosztázist. A jelenlegi hagyományos kutatási modellek, mint például a statikus sejttenyészetek és az állatmodellek, nem elegendőek a bonyolult emberi in vivo helyzet megértéséhez, vagy nem rendelkeznek transzlációs értékkel. Gyorsítanivesekutatás, újszerű kutatási eszközök szükségesek. A legújabb fejlesztések lehetővé tették az indukált pluripotens őssejtek irányított differenciálódását veseorganoidok előállításához.VeseAz organoidok in vitro az emberi vesére hasonlítanak, és alkalmazhatók a regeneratív gyógyászatban, valamint fejlődési, toxicitási és betegségmodellként. Bár a jelenlegi tanulmányok ígéretesnek bizonyultak, továbbra is kihívások maradnak, beleértve az éretlenséget, a korlátozott reprodukálhatóságot, valamint a perfundálható érrendszeri és gyűjtőcsatorna-rendszerek hiányát. Ez az áttekintés áttekintést ad a nefrogenezis jelenlegi értelmezéséről, amely lehetővé tette a vese organoidok létrehozását. Ezután a lehetséges alkalmazásaiveseaz organoidokat tárgyaljuk, majd a jövő perspektíváit. Ez az áttekintés azt javasolja, hogy a vese organoidkutatásának előrehaladását elősegítse a nefrogenezissel kapcsolatos ismereteink gyarapodása és az ígéretes technikák, például az orgona-chip modellek kombinálása.

Kulcsszavak Vese organoid. Őssejtek. Biomérnökség.Nephron

Kattintson ide, ha többet szeretne megtudni a Cistanche for veséről

Bevezetés

A vesék olyan alapvető szervek, amelyek megszűrik a vért, és anyagcsere-hulladékot termelnek, amelyet a vizelettel való kiválasztásra szánnak. A vesék figyelemreméltó plaszticitást mutatnak a vizelet összetételének testreszabásában, a bevitel és a kiválasztás összehangolásában, hogy fenntartsák az oldott anyagok homeosztázisát és a folyadékegyensúlyt. Mivel az emlős vese nem regenerálódó szerv, a funkcionális egységek vagy nefronok elvesztése idővel minden egyedben felhalmozódik [1]. Nagy prevalenciájú szisztémás betegségek, nevezetesen magas vérnyomás és diabetes mellitus, gyógyszeres kezelés vagy hemodinamikai indukálta akutvesesérülés(AKI) és a vese elsődleges betegségei a veseműködés gyors elvesztésének gyakori okai, és a krónikus vesebetegség (CKD) fő etiológiáját jelentik [2]. A CKD szakaszokra oszlik az alapjánvese diszfunkció, amely az oldott anyagok elváltozásait és a folyadékegyensúly felborulását okozza, amely kiterjedt morbiditásért és mortalitásért felelős. Az USA-ban a krónikus vesebetegség prevalenciája 14 százalék [3], éves kezelési költsége 120 milliárd dollár [4], negatívan befolyásolja az életminőséget [5], és előrehaladott stádiumban végstádiumú vesebetegségben csúcsosodik ki. ESRD), amely vesepótló terápia (RRT) szükségességét teszi szükségessé. Az RRT formái közé tartozik a dialízis és a transzplantáció, az előbbi a Medicare költségvetésének 7 százalékát teszi ki [6], az utóbbit pedig a megfelelő szervek kínálata korlátozza [7]. A CKD és az ESRD jelentős terhet jelent az egészségügyi erőforrásokra és költségekre, valamint az e betegségekben szenvedő betegekre [8].

E terhek kezelése érdekében alap- és transzlációs kutatásokat végeztek a következő területekenvese fejlődés, nefrotoxicitási vizsgálat, betegségmodellezés és vese-regeneratív gyógyászat. A hagyományos kutatási eszközök in vitro sejttenyészetből állnak, mind izolált primer vesesejtekből, mind virálisan transzformált immortalizált sejtvonalakból, valamint in vivo állatmodellekből. Noha ezeket az általános modelleket a vese fiziológiájának és patológiájának tanulmányozására használták némi sikerrel, rejlő korlátaik vannak, amelyek hozzájárulhatnak a laboratóriumi vizsgálatok klinikai terápiássá való rossz átültetéséhez [9]. Az in vitro modellek nagyrészt az egysejttípusok elemzésére korlátozódnak, figyelmen kívül hagyva az intercelluláris és környezeti kölcsönhatások hatásait az összetett heterogén szövetekben, például a vesében. Az állatmodelleket, bár a testi rendszereket integrálják, korlátozzák a fajok közötti különbségek, ami nem hűséges következtetéseket eredményez, amelyek nagy idő- és költségráfordítással járnak [10]. Az emberi sejtekben és szövetekben végzett kísérletezés új módszerei szükségesek a hagyományos kutatási technikák korlátainak leküzdéséhez [11].

Mivel az innováció anyja a szükségszerűség, a humán pluripotens őssejteket (hPSC) használó protokollok fejlődése összetett háromdimenziós, többsejtű és szervspecifikus szöveteket hozott létre, amelyeket organoidoknak neveznek. A máj, a tüdő, a szív, a belek és a vese organoidjai lehetővé teszik az emberi szövetekben végzett kísérletezést in vitro [12]. Elméletileg a teljes emberi szómát tartalmazó szövetek nagy léptékben reprodukálhatók a hPSC-k révén, amelyek meghatározzák a pluripotencia és az önmegújulás jellemzőit. A hPSC két típusa a humán embrionális őssejtek (ESC) és az ember által kiváltott pluripotens őssejtek (iPSC). 1998-ban Thomson et al. először írták le a humán blasztocisztákból származó ESC-vonalak létrehozását. Az ESC-k embrionális eredetével kapcsolatos viták megkerülésére 2006-ban Takahashi et al. forradalmian új módszert írt le terminálisan differenciált szomatikus sejtek pluripotenciájának indukálására. Az iPSC-nek nevezett sejtek a Yamanaka faktorok (Oct4, Sox2, Klf4 és c-Myc) transzkripciós aktiválásával jönnek létre [13]. Az etikai kérdések elkerülése mellett az iPSC-k lehetővé teszik a személyre szabott orvosi megközelítést is. Az iPSC-k olyan sejtek korlátlan mennyiségét képviselik, amelyek izogének a szülői szomatikus sejtjeikkel szemben [13]. A természetesen előforduló mutációkat tartalmazó, betegspecifikus iPSC-k felhasználhatók klinikailag releváns betegségmodellek létrehozására emberi szövetekben, különösen olyan körülmények között, amelyekre nem létezik állatmodell. Az öröklődő betegségek modelljeiben a genommal korrigált kontrollok közvetlen kapcsolatot hozhatnak létre a genotípus és a fenotípus között [14]. Az immunkompetens regeneratív gyógyászat megközelítései ömlesztett, szervspecifikus szöveteket alkalmazhatnak a páciens iPSC-jéből, ezzel tagadva az immunszuppresszió szükségességét, és megkerülve a transzplantálható szervek hiányát [15]. A hPSC-k, különösen az iPSC-k transzlációs hasznának kiaknázása forradalmasíthatja a gyógyszerfejlesztés és a szervátültetés területét, ami drámai következményekkel jár az emberi egészségre és betegségekre nézve.

A hPSC-k azon képessége, hogy a test összes sejtjét helyreállítsák, nagy kihívást jelent, különös tekintettel arra, hogyan lehet szabályozni a differenciálódást a specifikus sejt- és szövettípusok felé. Az emlősök organogenezise az irányított differenciálódás archetípusa, a köztes sejttípusok hatékony szekvenciális indukciója, amelyek a szervfejlődés során jelentkeznek [16]. Ezzel szemben a közvetlen újraprogramozás magában foglalja a sejttípus-specifikus transzkripciós faktorok indukálását, megkerülve a köztes sejttípusokat a szomatikus sejt meghatározott célpopuláció felé történő átalakítása során. Jóllehet az egyszerűbb módszertan előnyeit élvezi, a közvetlen újraprogramozás gyakran nem teljes konverziót eredményez a célsejtté a szülői sejt DNS-metilációs profilja és epigenetikája miatt [17]. Még akkor is, ha a közvetlen átprogramozás teljes konverzióval történt, az eredmény valószínűleg egységes sejtpopuláció lesz [18]. Ami a vesét illeti, több mint egy tucat különböző sejttípus járul hozzá a nefron szerkezetéhez és működéséhez in vivo. A nefron helyreállítása szükségessé tenné a közvetlen átprogramozást az összes hozzájáruló sejttípus közös ősére, nevezetesen a nefron progenitor sejtekre, az endothel progenitor sejtekre és a stroma progenitor sejtekre [19]. A natív veséhez hasonló szövetek fejlesztésének szükséges megközelítése az irányított differenciálás, amely módszer a vesefejlődés mélyreható ismeretén alapul. Ebben az áttekintésben kiemeljük azt az alapvető szerepet, amelyet a vesefejlődési biológia játszott a hPSC-eredetű veseorganoidok létrehozásában, röviden kommentáljuk a veseorganoid technológia alkalmazásait, és megvitatjuk azokat a jövőbeli irányokat, amelyek a klinikai fordítás jelenlegi korlátait és kihívásait kezelik.

A vese fejlődése

A vesefejlődés aranystandardként szolgál az irányított differenciálódáshoz, hogy in vitro szövetet állítsanak elő, amely biológiailag leginkább hasonló az in vivo megfelelőjéhez. Az emlősmodelleken végzett több évtizedes fejlődési tanulmányok kimutatták, hogy a Wnt, FGF, retinsav és TGF-/BMP útvonalak szabályozzák a morfogenezist, a szövetmintázatot és a szervi primordia indukcióját [12]. Ezek az útvonalak kritikusak a szövetek iteratív fejlődéséhez a 3 csírarétegen keresztül, beleértve a mezodermából származó vesét is. Az endodermális és ektodermális rétegek között elhelyezkedő mezodermát a hPSC-k (anterior epiblasztok) gastrulációja mintázza a primitív csíkon keresztül, egy átmeneti struktúra, amely meghatározza a fejlődő embrió elülső-hátulsó és mediális-laterális tengelyét [12]. A mezoderma elülső-hátulsó tengelyét a primitív csíkon keresztüli involúció időtartama határozza meg, időlegesen Wnt jelátvitellel, mivel a primitív csíkon keresztül behatoló hPSC-k elölről vándorolnak, hogy kezdetben hozzájáruljanak az elülső struktúrákhoz, majd utána betöltődnek [1]. A mezoderma mediális-laterális tengelyét a rostrocaudális BMP gradiens határozza meg a primitív csíkban, mivel a rostral primitív csíkon keresztül gastrulált hPSC-k (alacsony BMP aktivitás) paraxiális mezodermává, a középső primitív csíkon keresztül (közepes BMP aktivitás) válnak. intermediate mezoderma (IM), és a caudalis primitív csík (magas BMP aktivitás) révén laterális lemezes mezodermává válik [20, 21]. A primitív csíkban a Wnt jel időtartama és a BMP jel foka a mezodermális csíraréteg mintázatának fő meghatározója.

Az emlősök vesefejlődésében 3 nephros szakasz létezik, a pronephros, a mesonephros és a metanephros, amelyek mindegyike a mezodermából származik. Egereken végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a metanephros, amely felnőtt veseként is megmarad, két IM-eredetű szövet, a metanephric mesenchyma (MM) és az ureter bimbó (UB) kölcsönös indukciójából származik [22]. Az MM stromasejtekkel tarkított nephron progenitor sejtekből (NPC-kből) áll, míg az UB a Wolffi-csatornából kilépő maradékként képződik, egy degeneratív struktúraként, amely a primitív mesonephrost a kloákába vezeti [23]. Az MM sapka mezenchimának koncentrált NPC-jei progresszív morfogenezisen mennek keresztül vesszőből S-alakú testekké, amelyek szegmentálisan differenciálódnak összefüggő epiteliális struktúrákká, amelyek a nefront tartalmazzák, nevezetesen podociták, proximális tubulusok, Henle hurok, disztális tubulusok [ és összekötő tubulusok 24–27]. Az egyes nefronok összekötő tubulusai az UB-ból származó elágazó gyűjtőrendszerben konvergálnak a két szövet közötti kölcsönös indukciót követően [28]. Az UB-eredetű Wnt jelátvitel katalizálja az NPC-k mezenchimális-epiteliális átmenetét (MET) a nephron epitheliumba [29], míg az MM-ből származó GDNF jelek a Ret/GFRA1 komplexen keresztül szabályozzák az elágazási morfogenezist [30] (1. ábra).

1. ábra Az emberi vese fejlődése a primitív csíktól az érett nefronig. [1] A primitív csík (PS) a mezodermát, majd az intermedier mezodermát (IM) hozza létre, amelyből a hátsó IM (PIM) és az anterior IM (aIM) megkülönböztethető a korai gasztruláció során. [2] A nephron progenitor sejteket (NPC-ket) és stromasejteket tartalmazó metanephric mesenchyma (MM) a PIM-ből képződik, míg az aIM alkotja a Wolffi-csatornát, amelyből az ureterikus rügy (UB) fejlődik. Az UB az NPC-kkel, a stroma progenitor sejtekkel (SPC) és az endothel progenitor sejtekkel (EPC) kezd elágazódni. Ebben a szakaszban az érrendszer nem szivárog be az NPC populációkba. [3] Ezután az NPC-k vesevezikulumokat fejlesztenek ki, amelyek vessző alakú testet alkotnak, amelyet egy S-alakú test követ. Végül ez a szerkezet kapcsolódik az UB-hez, és érett nefronná válik. A vért a glomerulusban (szürke) szűrik, amely az ultrafiltrátumot a gyűjtőtubulusba (sárga) mozgatja a proximális tubuluson (narancssárga), a Henle-hurkon (kék) és a disztális tubuluson (zöld) keresztül. Az egyes struktúráknak megfelelő markerek vannak megadva.

A vesefejlődés megértésében jelentős áttörés történt 2014-ben, amikor Taguchi et al. váratlanul felfedezték, hogy a T plus MM prekurzorok fejlődési szempontból különböznek az Osr1 plusz UB progenitoroktól [31], vonalkövetési technikákat alkalmazva, megjegyezve, hogy a korábbi munkák az Osr1 és az IM közös ősére utaltak további körülhatárolás nélkül [22]. A fent említett vizsgálatban egy Osr1-GFP egeret használtunk annak meghatározására, hogy az Osr1 különböző időpontokban és különböző helyeken fejeződik ki az IM nephricus zónájában. Szövettani elemzéssel és az OSR1-GFP plusz sejtek szortírozásával/újraaggregálásával a különböző fejlődési szakaszokban a szerzők be tudták mutatni, hogy az elülső IM hozzájárul a mesonephroshoz, a mesonephricushoz (Wolffi-csatorna) és az ureterbimbóhoz (a Wolffian duct), míg a hátsó IM tartalmazza a Six2 plusz Sall1 plusz NPC-ket az MM-ből, amelyek a nefron hámsejtjeivé differenciálódnak. Annak megállapítása, hogy az MM a hátsó IM-ből, az UB pedig az elülső IM-ből származik, valamint a jellegzetes marker kifejezés, útitervet ad a vese-specifikus vonalak specifikus indukciójához, és lehetővé tette az irányított differenciációs protokollokat az MM-eredetű nefron hatékony indukálásához. hám, más IM származékok szennyeződése nélkül. Fontos, hogy a történelmi vizsgálatok azt feltételezték, hogy az egér vesefejlődése tükrözi az emberi nefrogenezist. Az emberi és az egér vesefejlődésének összehasonlítása során a legújabb tanulmányok konvergens és divergens jellemzőket is feltártak, beleértve a lebenyképződést, a progenitor niche szerveződést és a sejttípust meghatározó markerek kifejeződését [32]. Az ilyen vizsgálatok során az emberi vese adatait posztumusz embrionális szövetből nyerték, ami lehetővé teszi a betekintést a kísérletezés helyett. A hPSC-eredetű veseorganoidok megjelenése tesztelhető hipotéziseket tesz lehetővé az emberi vese fejlődésében, a transzlációs alkalmazások között.

3D vese organoidok

A legújabb fejlesztések lehetővé tették a vese organoidok kialakulását humán indukált pluripotens őssejtekből (hiPCS) irányított differenciálódás révén [33], új transzlációs platformot teremtve a gyógyszerfejlesztéshez és a regeneratív gyógyászati ​​technikákhoz. Az organoidok mini in vitro szervek, amelyek önszerveződnek (ős)sejtekből 3D-s mikrokörnyezetben. Nagy hasonlóságot mutatnak in vivo társaikkal a szöveti morfológia, a sejtszám, a proliferáció és a differenciálódás tekintetében [34].

Taguchi et al., miután az emlős vesefejlődés során felvázolta az MM és az UB különböző eredetét, és lépésenkénti megközelítésben visszafelé dolgozott a köztes stádiumok és jellegzetes markerexpressziójuk azonosítása érdekében. irányított differenciációs protokollokat hozott létre az MM-hez mind egér, mind emberi PSC-ben [31]. Pontosabban, az OCT3/4 plusz SOX2 plusz hPSC-kből képződött embriótesteket kiterjesztett Wnt és BMP4 jelátvitelnek vetették alá, hogy indukálják a T plusz CDX2 plusz születőben lévő mezodermát, amely a posterior naszcens mezoderma sejtjeihez járul hozzá. A mezoderma mediális-laterális tengelye a WT1 plusz HOXD11 plusz OSR1 plusz posterior IM felé irányult BMP4, Activin és retinsav egyidejű kezelésével. Ezután alacsony Wnt-t és FGF9-et használtak az OSR1 plusz SIX2 plusz SALL1 plusz WT1 plus NPC-k fejlesztésének támogatására, körülbelül 62 százalékos indukciós hatékonysággal. Míg az NPC-ket egér és humán PSC-kből is létrehozták, az egér embrionális gerincvelővel való együtttenyésztésére volt szükség ahhoz, hogy tovább differenciálják őket proximális tubulusokká, disztális tubulusokká és podocita klaszterekké.

A hESC-ket és a hiPSC-ket egyrétegű tenyészetben egyaránt alkalmazva Morizane et al. leírt egy irányított differenciálási protokollt, amely a 8–9. differenciálási napon akár 90 százalékos hatékonysággal indukálta a SIX2 plusz SALL1 plusz WT1 plusz NPC-ket. Röviden, a kiterjesztett Wnt jelátvitel egy késői primitív csíkot indukált, amelyet aktivinnak vetettek alá, hogy PIM-et képezzen, amely az FGF9-re válaszul NPC-kké differenciálódott. Az NPC-ket ezután háromdimenziós szuszpenziós tenyészetben aggregálták centrifugálással, tranziens CHIR99021 (CHIR) impulzusnak kitéve, hogy szimulálják az UB-eredetű Wnt jelátvitelt, hogy katalizálják a MET-et az NPC-kben, és továbbra is FGF9-nek voltak alávetve, hogy kiterjesszék és fenntartsák a törzs szárát. NPC-rés [35]. A CHIR impulzust követően az MM egy PAX8 plusz LHX1 plusz peritubularis aggregátummá vált át, amely tovább differenciálódott LAM1 plusz vesevezikulummá a 14. differenciálódási napon. A sztochasztikus differenciálódásban (azaz nincs további faktor) a vesevezikulák önmagukban nefronszerűvé formálódtak. összefüggő epitéliumokból álló struktúrák, amelyek több markert hordoznak a podocitákhoz (NPHS1 plusz PODXL plus), a proximális tubulusokhoz (LTL plusz ), a Henle hurokhoz (CDH1 plusz UMOD plus ), a disztális tubulusokhoz (CDH1 plusz UMOD− ) és az összekötő tubulusokhoz ( CDH1 plusz AQP2 plus ) [36].

Freedman et al. más megközelítést alkalmaztak egy egyszerűsített protokoll létrehozására a vese organoidok előállítására. Itt a szerzők szendvics Matrigel-módszert alkalmaztak, hogy 3D-s mikrokörnyezetet biztosítsanak a hPSC-k számára, hogy üreges, magzatvízszerű üregeket körülvevő szferoidokat képezzenek [37]. Az irányított differenciálódás révén ezek a szferoidok kétlépéses protokoll segítségével veseorganoidokká válnak. A kialakult szferoidokat 1,5 napig CHIR-rel kezeltük, majd B27--kiegészített tápközeggel kezeltük. A 10. napon csavarodott, áttetsző, tubuláris organoidok képződtek a mesenchymalis-epiteliális átmenet után. Takato et al. azonosították mind a gyűjtőcsatorna, mind a vese mesenchyma progenitorok fejlődési jellemzőit [38]. Itt a szerzők ezt az információt felhasználták arra, hogy 4 napos CHIR-expozícióval, majd 3 napos FGF9-expozícióval mind a metanefris (a mezonefris) mezenchim, mind az uretikus epitélium kialakulását idézzék elő. Az aggregátumokat ezután 20 napig tenyésztettük, lehetővé téve az első trimeszterben lévő vesének megfelelő organoidok kialakulását. A szerzők a gyűjtőcsatorna jelenlétét GATA3 és ECAD markerek jelenlétével állították. Ezt azonban később megbízhatatlannak értékelték, mivel az MM-ből származó disztális és gyűjtőtubulusok is kifejezhetik ezeket a markereket [39, 40] (2. ábra).

2. ábra Irányított differenciálódási protokollok humán indukált pluripotens őssejt-eredetű veseorganoidok előállítására. Az emberi vese organoidok előállítására szolgáló négy protokoll közötti hasonlóságok és különbségek láthatók. Mindegyik vizualizált protokoll tartalmazza a napokban kifejezett időskálát, az organoid fejlődési szakaszt, valamint az organoidok irányított differenciálódását és érését elősegítő kiegészített tényezőket. Taguchi et al. és Takasato et al. organoidokat eredményezett a Transwell membránokon. Morizane et al. lehetővé tette a vese organoidok létrehozását 96-lyuklemezeken és Freedman et al. Matrigel szendvics megközelítésben

Miután a fenti négy irányított differenciálódási protokollt 2015-ben publikálták, több csoport hasonló megközelítést követett a hPSC-k szekvenciális átalakítására késői primitív csíkokká, PIM-ek, MM-ek, peritubuláris aggregátumok, vesevezikulák és végső soron vese organoidok [41–44]. Wu és mtsai. egysejtes transzkriptomiát végzett összehasonlító elemzésként a Morizane és a Takasato protokollok között, mind egymás ellen, mind az emberi magzati vese (16 hetes terhesség) és felnőtt emberi vese (62-éves, normális állapotú férfi) ellen.vesefunkció). A 26. differenciálódási napon statikus körülmények között értékelve mindkét protokoll éretlen szövetet generált, amelyek mindegyike a felnőtt proximális tubulusok és a podocita transzkripciós faktorok ~20 százalékát fejezte ki [41]. Azonban Tran et al. egysejtes transzkriptomikát alkalmazott a Morizane protokoll segítségével kifejlesztett vese organoidokon, hogy támogassa az organoid eredetű podociták alkalmazását betegségek modellezésére és a szűrési funkció helyreállítására. Az organoidokból származó podociták nagyon hasonló, progresszív transzkripciós profilt mutattak az emberi magzati vesékhez és a transzplantáció során a gazdaszervezet érrendszeréhez, hogy elősegítsék a további érést [42]. Garreta et al. azt találta, hogy a vese organoidjainak transzkripciós profilja a differenciálódás 16. napjára kiterjedt a második trimeszterben élő emberi magzati vesékre is, mivel lágy hidrogélt alkalmaztak a 3D mikrokörnyezet időtartamának meghosszabbítására a sejt-sejt és sejt-mátrix kölcsönhatások elősegítése érdekében [44] . Hasonló differenciálási protokollt követve Low et al. egysejtű RNS szekvenálást (RNAseq) hajtott végre, amely a nephron progenitor sejtek egy alcsoportját azonosította a vese érrendszerének potenciális forrásaként, ami eltér az egérfejlődésre vonatkozó vizsgálatoktól, amelyek a forrást FLK1 plusz endoteliális progenitor sejtekként bizonyítják, amelyek különböznek a vese NPC-itől. MM [45] és részben FOXD1 stroma progenitor sejtekből [46] származik. Ugyanakkor további fontosabb eredmények között szerepelt, hogy a Wnt jelátvitel szabályozza a vaszkularizációt és a proximális és a disztális nefronszegmensek arányát, az organoidok funkcionális érését a beültetés után, valamint az autoszomális recesszív policisztás vesebetegség (ARPKD) modellezését a betegektől származó iPSC-k segítségével [43].

A vese organoidok transzlációs hasznossága

Általánosságban elmondható, hogy a betegségek vagy vegyületek tanulmányozására szolgáló jelenlegi kutatási modellek gyakran csak sejtvizsgálatokra és állatmodellekre korlátozódnak. A cellamodellek könnyen használhatók és nagy számban alkalmazhatók. Ezek azonban gyakran tartalmaznak egysejtvonalakat, és nem képesek felfogni az emberi in vivo vesék összetettségét, például a 3D mikrokörnyezetet és a jelenlévő több sejtet. Ezért a sejtmodellek nem képesek utánozni az in vivo 3D szövetmorfológiát és a heterogén és összetett mikrokörnyezetet. Az összetett in vivo környezet figyelembevétele érdekében az állatmodellek, például az egerek hagyományos kutatási modellek. Ezek a modellek azonban rosszul fordíthatók emberi körülményekre [47, 48]. Az állatok kutatási célú felhasználásával kapcsolatos etikai aggodalmak is nőnek [49, 50]

Ezért olyan új modellekre van szükség, amelyek pontosabban utánozzák az emberi in vivo helyzetet [51].

Az organoidok képesek leküzdeni ezeket a korlátokat, mivel egyedülállóan képesek utánozni az emberek in vivo helyzetét. És mivel az organoidok hiPSC-kből származnak, személyre szabott gyógyászatban is használhatók. Például bizonyos vegyületek (kombinációk) tesztelhetők egy adott személy sejtjeiből származó organoidokkal a toxicitás vagy a hatékonyság tesztelésére. Nagyobb méretű alkalmazások is lehetségesek. Például az organoidok preklinikai modellként használhatók bizonyos vegyületek jellemzőinek meghatározására. Ezen túlmenően megbízható humán betegségmodellek használhatók a klinikai vizsgálatok során, hogy felgyorsítsák a kezelések kidolgozását különösen ritka betegségekre, amelyekben kevés a beteg.

Bár további fejlesztésekre van szükség a teljesen működő vesék in vitro létrehozásához, az eddigi tanulmányok nagy ígéretet mutatnak. Egyes tanulmányok már kimutatták a vese organoidjainak mai alkalmazását. Ezek a veseorganoidok fejlesztései lehetővé teszik a regeneratív gyógyászat (jövőbeni) alkalmazását, valamint fejlődési, toxicitási és betegségmodelleket. Ezen transzlációs alkalmazások közül az organoidokat a regeneratív gyógyászat lehetséges módszereinek tekintik biomérnöki vesék létrehozására, amelyek alternatív terápiákat vezetnek be a dialízis és a veseátültetés mellett (3. ábra). Mivel számos áttekintés számolt be a veseorganoidok publikált transzlációs alkalmazásairól [1, 52–59], ez az áttekintés az őssejtekből származó veseszövet jövőbeli generációjára összpontosít, amely szövettanilag biológiailag hasonló a natív emberi veséhez, hogy megkönnyítse a vese organoidok kutatásának fordítását. a klinikai ellátás befolyásolása felé.

Jelenlegi kihívások és jövőbeli kilátások

A vese erősen vaszkularizált szerv, amely együttesen a perctérfogat 20 százalékát kapja, és naponta akár 180 l vért is kiszűr [60]. Tizenkilenc kilométernyi glomeruláris kapilláris, körülbelül 6000 cm2 felülettel járul hozzá a glomeruláris filtrációs gáthoz (GFB) [61]. A GFB alkotóelemei a fenestrált glomeruláris kapillárisok, a negatív töltésű glomeruláris alapmembrán és a podociták, amelyek a lábnyúlványok között hasított rekeszeket mutatnak [61]. A GFB szerkezete az oldott anyagok mérete és töltése alapján hozza létre funkcióját, a vér szűrését. A glomeruláris filtrációból képződött primitív vizelet a nephron tubulusokba kerül, ahol abszorpciós és szekréciós mechanizmusok révén feldolgozzák. A legfeljebb 180 l szűrlet ~ 99 százaléka felszívódik, és normál körülmények között mindössze 1-2 litert szánnak a vizelettel történő kiválasztásra. Tekintettel a peritubularis kapillárisok jelentős térfogatú reszorpciójára, nem meglepő, hogy több nefron áramlik a közös gyűjtőcsatornákba, amelyek a vesemedence mellett egyesülnek, és magányos uretereket képeznek. Az átfogó szerkezet, a kiterjedt proximális nephron vaszkularizációtól a széles körben elterjedt tubuláris epithelialis-peritubuláris kapilláris ágy kommunikáción át a distalis nephron drenázsig, kritikus szerepet játszik a veseműködésben. A vesék akkor is fenntartanak viszonylag szükséges funkciót, ha kapacitása 20 százalékra csökken, és sok ilyen beteg tünetmentes marad. A 15 százalék alá történő csökkentés azonban gyakran az RRT szükségességét jelenti [62, 63]. A regenerációs képességekkel rendelkező NPC-k az emberben a születés előtt elvesznek, ezért a nefronok nem tudnak újulni. Jelenleg nem állnak rendelkezésre terápiák az elveszett veseműködés pótlására, ezért nagy az igény a regeneratív gyógyászati ​​alkalmazások iránt. Ezenkívül GFB-re van szükség a szűrést befolyásoló betegségek modellezéséhez, a funkcionális tubuláris transzporthoz, amely a toxicitási vizsgálatok és a betegségek modellezéséhez szükséges, valamint az MM-eredetű nefronok és az UB-eredetű gyűjtőcsatornák kombinációja, amelyek szükségesek a vese legtöbb veleszületett anomáliájának modellezéséhez. és húgyutak (CAKUT) [64]. A szervezett vese érrendszer és az elágazó gyűjtőrendszer kialakulása jelentős transzlációs ugrást jelentene a vese organoid technológiájában.

A vese organoid vaszkularizációja

A vese vaszkularizációja két különböző folyamatot foglal magában: a vasculogenezist és az angiogenezist [65]. A vasculogenezisben az érrendszer összeépülése de novo történik, míg az angiogenezis magában foglalja a már meglévő erek elágazását vagy kiterjesztését. A két folyamat kölcsönhatása a nefrogenezis során továbbra is ismeretlen, ennek ellenére a vasculogen vese mikroerek megelőzhetik az angiogén veseartéria kialakulását [65]. Egerekben az MM-nek nincs érrendszere a húgyúti rügyek inváziója során, de a következő napra gazdag kapillárishálózat alakul ki, és ezt követően vaszkularizált glomerulusok képződnek. Ez utóbbit az endothel sejtek valósítják meg, amelyek behatolnak az érhasadékba, hogy egykapilláris hurok stádiumú glomerulusokat képezzenek [66–68]. Eközben a vasculogenic FLK1 plusz endothel progenitor sejtek az MM-ben elszórva hozzájárulnak a gazdag glomeruláris kapilláris hálózathoz [69]. Az MM ex vivo kialakításának irányított differenciálási megközelítéseihez hasonlóan a hPSC-eredetű veseszövet vaszkularizációjának követnie kell az embrionális eredetét, hogy kialakuljon a mintázott, hierarchikus vese érhálózat.

A PIM-eredetű MM kezdeti protokolljaiból kifejlesztett 3D-s veseorganoidok vaszkuláris sejteket tartalmaznak; a glomerulusok azonban nagyrészt vaszkulárisak maradtak, és az erek általános bősége gyenge volt a natív veseszövettel összehasonlítva [70]. Fontos, hogy ezek az érrendszeri érrendszerek utánozzák a korai mikroerek kialakulását a fejlődésbenveseszövet, amely az angiogén veseartéria invázió előtt fordult elő [65]. Alapvető munkájukban Taguchi et al. indukált egér MM-jüket egerekbe ültették át, angiogén gazdaeredetű érrendszerrel, ami megnövekedett glomeruláris kapillárisokat eredményezett. A WT1 plusz podocita klaszterek a PECAM1 plusz erekkel együtt lokalizálódnak, amelyekről a képalkotás során kimutatták, hogy gazda vörösvérsejteket tartalmaznak [31]. A vese organoidok hasonló szubkapszuláris transzplantációját megismételték, ami azt mutatja, hogy az organoidok glomerulusaiban lévő érrendszer tartósan a gazdaszervezettől származik, és egy korai glomeruláris alapmembrán képződik, amely fenestrált endoteliális sejtekből és podocita lábfolyamatokból áll [71]. A veseorganoidok szubkután transzplantációja során kismértékű glomeruláris filtrációról számoltak be, amely a szisztémásan beadott fluoreszcens dextránok tubulusaiban történő intracelluláris kimutatásán alapul, amelyek a glomeruláris szűrletből való felvételt jelzik [72]; mindazonáltal nem zárható ki az apikális felvétel, amelyet a Bowman-kapszula és a proximális tubulus közötti szoros kapcsolatok hiánya tesz lehetővé, vagy a tubuláris fagocita mechanizmusokon keresztül történő bazolaterális felvétel [73]. Munkájukra építve, amelyben a vesekapszula alá transzplantált veseorganoidok a gazdaszervezet által vaszkularizálódnak, és glomeruláris és tubuláris érést mutatnak [71], a közelmúltban van den Berg et al. kifejlesztett egy elegáns in vivo rendszert, amely nagy felbontású többfoton képalkotást alkalmaz a méretszelektív glomeruláris szitálás demonstrálására [74]. Nevezetesen, a fajok közötti kiméra szövetekből képződött vaszkularizált glomerulusok nem tudják leküzdeni az állati rendszerektől való folyamatos függéssel kapcsolatos korlátokat, ideértve a fajok közötti fejlődési és fiziológiai különbségeket, a személyre szabott orvoslási megközelítések jelentős veszteségét, az alacsony áteresztőképességet és a magas költségeket.

A vese organoid vaszkularizációját in vitro érték el, hasonló eredményekkel, mint a transzplantációs kísérletekben. Homan és Gupta és munkatársai a vese organoid és vese-on-a chip technológiák összeházasításával a folyékony mikrokörnyezet in vivo összefoglalására. azt találták, hogy a beágyazott vese organoidokra a chipen alkalmazott fluidic nyírófeszültség elősegítette a koindukált endothel progenitor sejtek expanziójából és differenciálódásából kifejlődött perfuzálható vaszkuláris hálózatok kialakulását. Ezen túlmenően a szerzők kimutatták a tubuláris hámsejtek és podociták fokozott polaritását és érését, amelyek olyan lábfolyamatokat mutatnak meg, amelyek a glomeruláris kapillárisok ütközésekor primitív GBM-et alkotnak [70, 75]. Bár a vese organoidjai szuperfundáltak, ellentétben az érrendszeren belüli áramlással, a fluidikus nyírófeszültség alkalmazása a teljes organoidokon a glomeruláris szűrlet ~ 99 százalékának reabszorpciója során a kompartmentális folyadékeltolódásokból származó intersticiális áramlást szimulálja. Más szavakkal, a tubuláris lumenek térfogatának kb. 99 százaléka áthalad az interstitiumon, és a peritubuláris kapillárisok in vivo újra felszívódnak. Míg a perfundálható érrendszert fluoreszcens szondákkal mutatták ki, a glomeruláris filtrációt nem támasztotta alá a tubuláris lumenekben a fluoreszcencia kimutatása az 500 nm átmérőjű gyöngyök használata miatt, míg a glomeruláris kapillárisokban a fenestrációk átlagos átmérője ~ 70 nm. 76]. Nevezetesen, a rendszerben lévő összes érrendszer a vese organoidjaiból származik angiogén invázió nélkül.

A jelenlegi kihívások leküzdésére szolgáló módszerek közé tartozik az angiogén vaszkuláris hálózatok in vitro összekapcsolása vasculogén vese organoidokkal, hogy lehetővé tegyék a GBM érését funkcionális glomeruláris szűréssel. Számos valószínű oka van annak, amiért még nem történt végleges glomeruláris szűrés a vese-organioid-chip megközelítésekben, ideértve a longitudinális kísérletezés hiányát, a glomeruláris kapillárisokban továbbított korlátozott hidrosztatikus nyomást, a nephron epiteliális éretlenségét és az esszenciális keringés lehetőségét. az embrionális vesefejlődést elősegítő tényezők. Korábban már leírtak in vitro közvetlenül perfundálható angiogén vaszkuláris hálózatokat, amelyek képesek vastag szövetek támogatására vagy beágyazott sejtszerkezetek behatolására a chipen [77, 78]. Az ilyen érrendszer szervoid eredetű mikroerekkel anasztomizálódhat, hogy korlátozza a perfúziót a vaszkuláris kompartmentben, lehetővé téve a jelentős hidrosztatikus nyomás átvitelét a glomeruláris kapillárisokba. Egyéb korlátok orvosolhatók longitudinális vizsgálatok alkalmazásával, embrionális szérummal történő perfundálással és optimális differenciálódási nap organoidok használatával (az érettséget befolyásolva) az ilyen eszközökben. Ha az angiogén érhálózat emberi sejtekből állna, akkor a fajok közötti különbségekkel kapcsolatos korlátozások megkerülnének. Hasonlóképpen, a hPSC-eredetű vérerek alkalmazása, amint azt leírták [79], elősegítené a személyre szabott orvoslási megközelítéseket mind a gyógyszerfejlesztés, mind a regeneratív gyógyászati ​​stratégiák esetében.

Ureterikus rügyképződés

A glomeruláris ultrafiltrátum ex vivo előállítása mérföldkőnek számító felfedezést jelentene az őssejt-eredetű veseszövet transzlációs alkalmazásának megkönnyítésében, ugyanakkor a későbbi vízelvezetéshez gyűjtőrendszerre lenne szükség. Egy dichotóm elágazású gyűjtőcsatorna hálózat egyetlen vese ~ 1 millió nefronjának kimenetét egyetlen ureterhez konvergálja [60]. A gyűjtőcsatornák nemcsak a szűrletet szállítják, hanem a víz-visszaszívásban és az elektrolit egyensúlyban is részt vesznek a különféle transzportereken és csatornákon keresztül a különböző típusú tubuláris hámsejtekben. A gyűjtőcsatornák az ureterbimbó elágazó morfogenezisének termékei, amelyet különböző molekuláris jelek szabályoznak, amelyek in vitro utánozhatók ennek a folyamatnak, beleértve az FGF, GDNF/RET és Wnt jelátviteli útvonalakat [68].

A mikropreparált egér MM és UB vesefejlődési vizsgálatai jelentős betekintést nyújtanak a felnőtt emberi vese korai kialakulásába. Az UB epiteliális struktúráitól elválasztott indukálatlan MM megakadályozza bármelyik szövet érését. Az MM és az UB ex vivo együtttenyésztése azonban képes helyreállítani az egérvesét, ami arra utal, hogy ezek a vese-prekurzor populációk rendelkeznek egy önálló programmal, amely elegendő a vese organogenezisének előmozdításához [80]. Fejlődési szempontból a funkcionális veseszövet hPSC-kből történő in vitro kifejlesztésének optimális módszere valószínűleg magában foglalja az MM és az UB külön indukálását, nagy hatékonysággal és a két különböző populáció együttes tenyésztését.

A korábban leírt differenciációs protokollok túlnyomórészt MM-t generálnak, amely nefron struktúrákká válik. Az UB ductus progenitor sejtek gyűjtésére irányuló irányított differenciálást először 2013-ban publikálták, mielőtt Taguchi felvázolta az MM és az UB eltérő IM eredetét. Xia et al. A hPSC-ket mezodermálisan kötődő szövetté alakította FGF2 és BMP4 használatával 2 napon keresztül, majd UB progenitor sejteket indukált aktivin, BMP2 és retinsav kombinációjával további 2 napig egy kétlépéses differenciálódási protokollban [81, 82]. A hPSC-eredetű UB progenitor sejtek fajok közötti kiméra szövetekké épültek fel, ha embrionális egér MM-mel kombinálják. 2017-ben a génexpressziós profilok elemzésével egérembriók húgyúti rügyfejlődése során Taguchi et al. létrehoztak egy protokollt az MM és az UB szövetek vese organoidjaiba való felvételére egér ESC-k (mESC) segítségével [83]. Ez a protokoll a FACS-szortírozó CXCR4 plusz KIT plusz Wolffian csatorna progenitorokon alapult. A Wolffian-csatorna progenitorok és a mESC-eredetű MM együttes tenyésztése stromális progenitor sejtek jelenlétét követelte meg, hogy újra összeállt organoidokat képezzenek, amelyek magasabb rendű organogenezisen mentek keresztül, hogy nefronokat hozzanak létre, amelyeket egy elágazó ureter epitélium köt össze. Végső soron az eredmények nem replikálódtak a hPSC-ből származó MM-ben és UB-ban az UB-elágazás idő előtti megszűnése miatt, ami a szerzők szerint a stromális progenitorkészlet hiányának tudható be [83]. A humán vese stroma progenitorokhoz való irányított differenciálódása és az elsődleges humán magzati veseszövetekhez való fokozott hozzáférés felismerheti a jelentett hiányos elágazási morfogenezis okát. Ennek ellenére a szükséges sejttípus indukciós hatékonyságának korlátai lehetnek, nevezetesen a proliferáló Ret plusz UB tip sejtek, amelyek felelősek az elágazásért és a distalis nefronok összekötő tubulusaival való szerkezeti kapcsolat kialakításáért [84].

Kevés a hPSC-k UB és származékai felé irányított differenciálási protokollja, a közzétett protokollok pedig korlátokat mutatnak be. Továbbfejlesztett protokollokra van szükség ahhoz, hogy lehetővé tegyék egy gyűjtőcsatorna-hálózat hozzáadását, amely átfogja a nefrontartalmú veseorganoidok egészét. A SIX2 expresszión alapuló NPC-k indukciós hatékonyságának maximalizálásával analóg módon az UB csúcssejtek indukciós hatékonyságának maximalizálása Ret-expresszión alapuló stratégia egyike. Ehhez a vesefejlődés megértésére van szükség. Nevezetesen, az UB a Wolffi-csatorna (más néven mesonephric duct) kiürüléseként képződik, amely az elülső IM-sejtek caudális migrációjából jön létre az urogenitális sinuszon a kloákába, megjegyezve, hogy ezek a sejtek MET-en mennek keresztül. Az UB körforgásos eredete kihívást jelent egy robusztus irányított differenciálási protokoll létrehozásában. Az aIM-ben jelenlévő, Ret-et expresszáló mezenchimális sejtek azonban képesek hozzájárulni az UB-hoz [84], így egy 3-step protokoll átalakíthatja a hPSC-ket korai primitív csíkokká (1. lépés), majd aIM-vé (2. lépés). , majd a Ret plusz UB tip cellákat (3. lépés). Nevezetesen, az NIH ReBuilding a Kidney (RBK) konzorciumának celluláris adattára tartalmaz egy Ret riporter vonalat.

Következtetés

A vese egy figyelemre méltó szerv, amely többek között szabályozza a szervezet víz- és elektrolitháztartását. Ezeknek a folyamatoknak a szabályozási zavara súlyos egészségügyi szövődményekhez vezethet, amelyek nagy társadalmi és gazdasági terhet jelentenek. Az emberi nefrogenezis in vivo megértése révén rávilágítunk arra, hogy ezt a folyamatot in vitro újra leírjuk. A jelenlegi fejlesztések lehetővé tették a hiPSC-eredetű veseorganoidok előállítását. Ezek a vese organoidok az emberi vesére hasonlítanak, és további előnyöket biztosítanak a hagyományos kutatási modellekhez képest. A veseorganoidok alkalmazása magában foglalja a regeneratív gyógyászatot, valamint a fejlődési, toxicitási és betegségmodelleket. Az elmúlt évek fejlődése ellenére a vese-organoidok jobb protokollokat és módosításokat igényelnek a szövetek éréséhez, a perfundálható érrendszerhez és a gyűjtőrendszer integrációjához. Ezután ezeknek a rendszereknek alkalmasnak kell lenniük arra, hogy további értéket nyújtsanak a hagyományos sejt- és állatkutatási modellekhez, vagy akár le is váltsák azokat. Az organoid-generálási protokollok fejlesztése a vesefejlődésről szerzett ismereteink gyarapodása révén, valamint az orgona-chip technológia átvétele megkönnyítheti és felgyorsíthatja a 3D veseorganoidok klinikai felhasználásra való átültetését.

Feladó: '3D-s veseorganoidok a padról az ágyra fordításhoz', készítetteNavin Gupta és mtsai

---J Mol Med (2021) 99:477–487