2.6. A kaszpáz-3 és a kaszpáz-6 kifejezése

A cisztanche glikozidja növelheti az SOD aktivitását a szív- és májszövetekben, és jelentősen csökkentheti az egyes szövetek lipofuscin- és MDA-tartalmát, hatékonyan megkötve a különböző reaktív oxigéngyököket (OH-, H2O₂ stb.) és megvédheti az okozott DNS-károsodást. OH-gyökök által. A Cistanche feniletanoid glikozidok erős szabad gyökfogó képességgel rendelkeznek, nagyobb redukáló képességgel rendelkeznek, mint a C-vitamin, javítják a SOD aktivitását a spermiumszuszpenzióban, csökkentik az MDA-tartalmat, és bizonyos védő hatást fejtenek ki a spermium membrán működésére. A cistanche poliszacharidok fokozhatják a SOD és a GSH-Px aktivitását a D-galaktóz által okozott kísérletileg öregedő egerek eritrocitáiban és tüdőszöveteiben, valamint csökkenthetik a tüdő és a plazma MDA- és kollagéntartalmát, valamint növelhetik az elasztintartalmat. jó eltávolító hatás a DPPH-ra, meghosszabbítja a hipoxia idejét öregedő egerekben, javítja a SOD aktivitását a szérumban, és késlelteti a tüdő fiziológiás degenerációját kísérletileg öregedő egerekben A sejtmorfológiai degenerációval a kísérletek kimutatták, hogy a Cistanche jó antioxidáns képességgel rendelkezik és potenciálisan gyógyszer lehet a bőröregedési betegségek megelőzésére és kezelésére. Ugyanakkor a Cistanche-ban található echinakozid jelentős mértékben képes megkötni a DPPH szabad gyököket, és képes megkötni a reaktív oxigénfajtákat, és megakadályozza a szabad gyökök által kiváltott kollagén lebomlását, valamint jó helyreállító hatással van a timin szabad gyökök anionjainak károsodására.

Kattintson ide, hogy megismerje a Cistanche Tubulosa-t az antioxidánsért

【További információ:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

A TgAPP egerek kaszpáz{{0}} génexpressziójának növekedését mutatták (8C1. ábra, H1), ami szignifikáns és több mint 30 százalékos volt a WT egerek hippocampuszához képest (8H1. ábra; p < 0,05). Ami a kaszpáz-6 expresszióját illeti, nem figyeltek meg különbséget a transzgenikus és nem transzgenikus egerek között (8C2. ábra, H2).

A kvercetin és rutin kezelések statisztikailag szignifikánsan csökkentették a kaszpáz{{0}} mRNS-szintet a hippocampusban (8H1 ábra; p < 0,05), a gátlási százalék körülbelül 17 százalék volt. és 27 százalék a nőstény és a hím egereknél. Az agykéregben szignifikáns különbségeket csak a rutinnal végzett kezelésben figyeltek meg férfiaknál (8C1. ábra; p < 0,05).

A kaszpáz-6, a kvercetin és rutin kezelések nem gyakoroltak statisztikailag szignifikáns hatást a kéregben vagy a hippocampusban (8C2. ábra, H2), bár az utóbbiban a kaszpáz-6 a TgAPP férfiakban csökken (8H2 ábra).

2.7. Gyulladásjelzők

Az IL-1, TNF- és IFN- gyulladásos mediátorok génexpressziójára kapott eredményeket a 9. ábra mutatja.

A TgAPP-ban az IL{{0}} génexpresszió szignifikánsan, körülbelül 20 százalékkal nőtt a kéregben és a hippokampuszban mindkét nemben a WT egerekhez képest (9C1 ábra, H1; p < 0,05). Ami a TNF-t illeti, bár a TgAPP-ban magasabb mRNS-szintek láthatók, ezek nem statisztikailag szignifikánsak WT egerekben (9C2. ábra, H2). Ami az IFN-t illeti, a férfiakban körülbelül 30 százalékkal nőtt az expressziója, ami csak a kéregben volt statisztikailag szignifikáns (9C3. ábra; p < 0,05).

A kvercetinnel és rutinnal végzett kezelések mind a nőstényekben, mind a hímekben csökkentették az IL{{0}} expresszióját az agykéregben és a hippokampuszban a kontroll TgAPP egerekhez képest (9C1 ábra, H1; p < {{8) }},05), hasonló értékeket kaptunk, mint a WT egerek, és különösen alacsonyabbak a hím egerek hippocampuszában (9H1 ábra; p < 0,05).

Mindkét flavonoid kezelés összhatása az IL{{0}} expressziójára nem volt megfigyelhető sem TNF-, sem INF- esetén. Így a TgAPP hímekben a kvercetin kezelés hatására szignifikánsan csökkent a hippocampalis TNF- (9H2. ábra; p < 0,05) és a kérgi IFN-expresszió (9C3. ábra; p < 0,05).

2.8. A degeneráló neuronok és vetületeik felmérése

Nem figyeltek meg a neurodegeneráció jellegzetes jeleit abban az életkorban, amikor a transzgénikus TgAPP egereket tesztelték, összehasonlítva a WT egerekkel, és a kvercetinnel és rutinnal végzett kezelések sem mutattak változást 4 hétig a TgAPP-hoz képest (S1 ábra, kiegészítő adatok).

2.9. Ionotróp glutamát receptorok expressziója

Nem találtunk szignifikáns különbséget a receptor expressziójában, összehasonlítva a kontroll TgAPP egerek és a WT egerek értékeit. Ezen ionotróp receptorok expressziójára sem volt jelentős hatás kvercetin vagy rutin kezelés jelenlétében (S5 táblázat, Kiegészítő adatok).

3. Megbeszélés

Jelen tanulmányunk célja az volt, hogy felmérjük két flavonoid, a kvercetin és a rutin hatását az AD patogenezisének első szakaszaiban, függetlenül attól, hogy milyen hatást gyakorolnak a neurodegenerációra és/vagy a kognitív funkciókra. Az agykéreg és a hippocampus voltak az elemzett agyterületek, mivel ezek a leginkább érintett agyi struktúrák az AD-ben. Figyelembe kell venni, hogy a kvercetint és a rutint a két flavonoid valamelyikét tartalmazó összeállított étrenden keresztül adták be, hogy AD állatmodellben utánozzák az egészséges emberi táplálkozást, amely hatóanyagot tartalmazott.

Különösen a C57B6 egérben lévő APPswe transzgén gyakorolt ​​jelentős hatást a GSH/GSSG arányra, az MDA-szintekre, az antioxidáns enzimkapacitásra, az APP-expresszióra, a BACE1-aktivitásra, valamint a kaszpáz-3 és IL-1 expressziójára. Míg az emberekben az APP mutációk általában tipikus AD-t eredményeznek, ezek túlnyomórészt kizárólag amiloid patológiához kapcsolódnak APP transzgenikus egerekben, és nincs észrevehető neurodegeneráció [14,15], mivel a mi transzgénikus egereinkben, a TgAPP-vel ellentétben nem voltak jellemző jelek. a WT egerek (kiegészítő adatok, S1 ábra). A hippocampalis neuronok 40 -6-diamidino-2- fenil-indollal (DAPI) végzett ellenfestése lehetővé tette a sejtmag morfológiájának megfigyelését, mivel ez a vegyület a nukleinsavak fluoreszcens festéke. Nem figyeltünk meg fragmentált vagy lebenyes magokat, amelyek tipikusan apoptotikusak voltak; a kontroll transzgenikus TgAPP vonal hippocampális szövettani metszeteinek összehasonlítása során sem figyeltünk meg jelentős különbségeket a WT metszetek tekintetében; és a kontroll TgAPP egerek esetében sem tapasztaltunk különbséget a kvercetin és rutin kezelések között.

Az AD biokémiai jellemzőit elemző panelen elsősorban a GSH/GSSG arány meghatározására koncentráltunk a két flavonoid diéta valamelyikén, mivel a GSH szint kimerülése az AD egyik legfontosabb korai biokémiai markere [16,17 ], és patogenezise és a betegség progressziója során figyelték meg. Az agyi GSH-szint [18] és újabban a vér GSH-szintjének [19] mérése ígéretesnek bizonyult az AD korai szakaszának diagnosztikai markereként. Ezenkívül erőfeszítéseket tettek arra is, hogy az endogén GSH-raktárakat önmagukban vagy prekurzoraikkal kiegészítsék [20–22]. Vizsgálatunkban a celluláris redukáló képesség (GSH/GSSG) csökkenését figyelték meg a TgAPP egerekben a WT állatokban, mind a hímekben, mind a nőstényekben, és az agy mindkét területén. Mind a WT, mind a TgAPP egerek kéregében és hippokampuszában a GSH/GSSG arány alacsonyabb volt a hímeknél, mint a nőstényeknél. A kvercetin és rutin étrend szignifikánsan növelte a GSH/GSSG arányt a kezeletlen TgAPP egerekhez képest, és ez a növekedés kifejezettebb volt a hippocampusban. A férfiaknál a kvercetin vagy rutin kezelés hatására a GSH és GSSG szintek, valamint a GSH/GSSG arány változása a redox teljesítmény növekedését illetően szembetűnőbb volt, mint a nőknél. Meghatározásaink eredménye egy fontos alapot tárhat fel a Tg2576 egerek ivarfüggő különbségeinek hátterében egyrészt a makromolekulák oxidatív károsodására való érzékenységben, mivel a glutation rendszer sokoldalú redukálószer több biológiai funkcióban, valamint a megelőző hatásokban. flavonoid diéták fiziológiai állapotának helyreállításában. Amint a beszélgetés során látni fogjuk, a GSH/GSSG arány növekedését állítottuk be fő tengelyként, amely megmagyarázhatja a TgAPP egerekben megfigyelt hatásokat.

A közelmúltban azt javasolták, hogy a GSH/GSSG arány ahelyett, hogy egyszerűen redox pufferként működne, inkább fő szabályozó mechanizmusként működne, lehetővé téve a fehérjék natív konformációjuk és funkcionalitásuk elérését a sejt tiol-diszulfid egyensúlyának szigorú szabályozásával. proteom. Röviden, a glutation rendszer alapvető fontosságú az egészséges proteom megőrzéséhez, ami azt mutatja, hogy a glutation redox homeosztázis megzavarása (azaz genetikailag vagy farmakológiailag) növeli a fehérje aggregációt az autofágia hatékonyságának megzavarása miatt [23]. Ezért a glutation-redox homeosztázis fenntartását célzó stratégiák terápiás potenciállal rendelkezhetnek a fehérje-aggregációval kapcsolatos betegségekben, mint például az AD. A proteom megőrzéséhez szorosan kapcsolódik az ubiquitin-proteaszóma degradációs gépezet, amely részt vesz az AD patogenezisében. A proteaszóma szelektíven lebontja több szubsztrátot, amelyek kulcsfontosságúak a neuronális homeosztázis fenntartásában, beleértve az oxidált és aggregált fehérjék katabolizmusát. A BACE1 ubiquitináción megy keresztül, és bebizonyosodott, hogy az ubiquitin-proteaszóma útvonal blokkolása gátolja a BACE1 lebomlását, következésképpen a BACE1 enzimaktivitás növekedéséhez, a C99 hasítási termék növekedéséhez, valamint az A 1-40 és az A { növekedéséhez vezet. {8}} neuronális és nem neuronális sejtekben [10]. Korábbi tanulmányaink azt találták, hogy mind a flavonoidok, mind a kvercetin, mind a rutin hatással vannak a neuroblasztóma sejtekben a proteaszóma működésének modulálásával kapcsolatos különféle jelátviteli útvonalakra és molekuláris hálózatokra [9]. Ezenkívül kimutatták, hogy a redukált glutationnal (GSH) kiegészített neuronok visszanyerték a proteaszóma aktivitást és csökkentették az aggregátum képződést [11], mivel a proteaszóma funkció redox állapota szabályozott [24]. Ezért a GSH/GSSG arány növekedése, amelyet az állatok kvercetin vagy rutin diéta után tapasztaltak, összhangban van a proteaszóma kvercetin és rutin általi modulációjával, amelyet korábban ex vivo mutattak ki.

Ahogy korábban említettük, a redox egyensúlyhiány erősen oxidatívan módosított fehérjékhez vezet, amelyek hajlamosak felhalmozódni és aggregátumokat létrehozni, ami proteaszóma-károsodáshoz vezet [25]. Így, tekintettel az oxidatív stressz döntő szerepére az AD patogenezisében, az oxidatív stressz biomarkereit, beleértve a lipid-peroxidációt (MDA-szint) és az antioxidáns enzimeket, a kéregben és a hippokampuszban értékelték a TgAPP és WT egerekben. A SOD, a CAT, a GR és a GPx a legfontosabb antioxidáns enzimek, amelyek az oxigén szabad gyökök ellen hatnak és szabályozzák a szabad gyökök anyagcseréjét a szervezetben, és szerepet játszanak a szabad gyökfogó rendszerben, megvédve a szervezet sejtjeit a lipidperoxidációtól. . Vizsgálatunkban az APP túlzott expressziója következtében az antioxidáns enzimaktivitások általános csökkenése volt megfigyelhető TgAPP egerekben a WT egerekhez képest, ami statisztikailag szignifikáns a CAT esetében. A csökkent GSH szintekkel összhangban a lipid-peroxidáció szignifikánsan megnövekedett a TgAPP egerekben. Míg az oxidatív stressz forrása a humán AD-ben rendkívül összetett és többtényezős, az egerekben kialakult amiloid patológia elegendőnek tűnik ahhoz, hogy elindítsa az agyban megnövekedett oxidatív stresszhez vezető kóros folyamatot [26]. A rutinnal kezelt állatoknál nőtt a CAT-aktivitás a kéregben és a GR-aktivitás a hippocampusban, mind a hímeknél, mind a nőstényeknél. Csak a rutinnal kezelt állatok tapasztaltak változást a CAT és a GR génexpressziójában a kéregben és a hippocampusban mind a hímekben, mind a nőstényekben, valamint a GPx-ben a nőstény egerek hippokampuszában. Ebben az összefüggésben számos természetes vegyületről kimutatták, hogy befolyásolja a proteaszóma és a redox szabályozás közötti áthallást. Pontosabban, a kvercetin egy ismert Nrf2 aktivátor [27], amely antioxidáns tulajdonságokat mutat a proteaszóma működésének stimulálásán keresztül, elősegítve a fokozott oxidatív stressz-rezisztenciát és megnövelt sejtek élettartamát [28].

A BACE1 szövetspecifikus expressziója kritikus fontosságú a normál APP feldolgozáshoz, és diszregulációs expressziója szerepet játszhat az AD patogenezisében. A BACE1 túlnyomórészt a hippocampális neuronokban, a kéregben és a kisagy szemcsés rétegében expresszálódik [10]. Meg kell jegyezni, hogy a korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a svéd mutáns APP transzgenikus egerek agyában szignifikánsan megemelkedett az A szint egyensúlyi állapotban [29], ami arra utal, hogy a BACE1 alapvető szerepet játszik az AD patogenezisében az amiloidogén útvonalban, és jó terápiás célpont. AD kezelésére. Vizsgálatunkban a BACE1 aktivitás szignifikáns csökkenését figyeltük meg kvercetin és rutin kezelés hatására, ami hozzájárulhat az A lerakódás csökkenéséhez egerekben. Azzal érvelünk, hogy az enzim, a kvercetin és a rutin BACE1-gátlóinak pusztán működése csökkentheti a BACE1-aktivitást a GSH/GSSG arány növekedésével összefüggésben, a proteaszóma-aktivitás helyreállításának fokozására vonatkozó hipotézis alapján. Ebben az értelemben ismert, hogy a BACE1 inhibitorok célba juttatása az APPswe hasítási helyére (svéd mutáció) még azelőtt megtörténik, hogy az elérné a plazmamembránt, míg az APPwt (vad típusú) egy korai endoszómában kerül feldolgozásra, amely a sejt felszínéről származik. Ezért az APPwt-t hasító BACE1 néha a sejtfelszínen lévő BACE1 inhibitorhoz kötődik az APP feldolgozása előtt, azonban az APPswe-t feldolgozó enzim nem [30]. Ez az oka annak, hogy az APPswe feldolgozás rendellenes lokalizációja jelentősen csökkentheti a kvercetin és a rutin BACE1 gátló hatását. Így inkább azt támasztjuk alá, hogy a BACE aktivitás csökkenése ebben az in vivo modellben nem annyira az enzim gátlásának, hanem a GSH/GSSG arány növekedésének köszönhető. Mindenesetre a csökkent BACE1 aktivitás úgy értelmezhető, mint egy feltételezett kísérlet az -amiloid termelés csökkentésére a TgAPP egerekben. Ami a kvercetin és a rutin legfigyelemreméltóbb hatását illeti a hippocampusban a BACE1 aktivitás csillapítására, érdemes megjegyezni, hogy a kéregben szignifikánsan nagyobb a neuronsűrűség, mint a hippocampusban [31], és a proteaszóma szelektív károsodása AD patológiás fenotípusban a kéreg sebezhetőbb és érintettebb, mint a hippocampus [32].

A kezelések BACE1 enzimaktivitásra gyakorolt ​​hatásának meghatározása után érdeklődtünk a BACE1 enzim expressziójának értékelése iránt. Érdekes módon nem találtak szignifikáns különbséget a BACE1 expressziójában a TgAPP egerek és a WT egerek között, és nem figyeltek meg észrevehető változásokat a kvercetin vagy rutin kezelés során. Ezért úgy tűnik, hogy a BACE1 enzimaktivitás növekedése nem kapcsolódik az expresszió növekedéséhez. Ebben az összefüggésben figyelemre méltó, hogy Apelt et al. [14] a kortikális BACE1 aktivitás növekedését találta Tg2576 egerekben 9 és 13 hónapos kor között, míg a BACE1 fehérje és mRNS expressziós szintje nem változott az életkorral. Ezenkívül bizonyítékokat találtak arra vonatkozóan, hogy a fibrilláris amiloid A 1–42, az oldható amiloid A 1–42 helyett, képes fokozni a BACE1 fehérje expresszióját, és így az amiloid izoformák arányának kismértékű módosítása módosíthatja az amiloid aggregátum konformációit és a sejtkárosodást. 33]. Így az általunk tapasztalt, hogy a BACE1 expressziója nem változott aktivitásának növekedése következtében, az magyarázhatja az oldható amiloid A 1–42 prevalenciáját a fibrilláris amiloid A 1–42 izoformájával szemben a TgAPP egérmodellünkben.

Az APP feldolgozásban részt vevő enzimek génexpressziójának meghatározását követően értékeltük a kvercetin és a rutin hatását az APP nem amiloidogén feldolgozásában szerepet játszó enzim-szekretázra. Az ADAM10-re összpontosítottunk, mivel ez a -szekretáz fiziológiailag legfontosabb konstitutív izoformája. Az ADAM10 ellensúlyozza a neurotoxikus oligomer A plakkok képződését az APP hasítása révén az A doménen belül, így sAPP és C-terminális fragmentumokat (-CTF) termel [34,35]. Bár a vizsgálatunkban az ADAM10 expressziójában tapasztalt változások nem voltak statisztikailag szignifikánsak, az ADAM10 expresszió enyhe csökkenése volt megfigyelhető a TgAPP egerekben a WT egerekhez képest. Elsősorban a rutinkezelés tendenciát mutatott az ADAM10 génexpresszió fokozására mindkét vizsgált agyterületen. Postina és mtsai. [36] kimutatta, hogy egy AD egérmodell hippokampuszában a vad típusú ADAM10 fokozott szabályozása közvetítette az sAPP szekréciót, ami az A plakkok képződésének gátlásához vezetett. A kvercetin hatását alumínium-kloriddal indukált AD patkánymodellben tanulmányozták, amely a hippocampusban a -szekretáz (ADAM10 és ADAM17) szignifikáns növekedését mutatta a kezeletlenekhez képest. Ez azt jelzi, hogy a kvercetin a -szekretáz gének aktiválása révén képes növelni a nem amiloidogén útvonalat [37]. A preklinikai adatok megerősítik azt a hipotézist, hogy az agy sAPP szintjének növelése potenciális stratégia az AD-vel kapcsolatos tünetek javítására és a szinaptikus deficitek enyhítésére. Az ADAM10 és a BACE1 verseng az APP hasításáért, ezért az ADAM10 aktivitás fokozása gátolhatja a neurotoxikus amiloid képződést. Ezenkívül az sAPP megakadályozhatja a stressz JNK-szignalizációs útvonalának aktiválódását, ami az NF-κB által kiváltott foszforilációs aktivitás aktiválásához vezet, ami a proteaszóma lebomlásához vezet [38]. Emiatt a betegséggel összefüggő fehérje aggregátumok képződése és felhalmozódása jelentősen lecsökken, és a sejtes proteaszóma aktivitás fokozódik, ezáltal bizonyítja az sAPP szerepét a proteosztázis szabályozásában [39]. Továbbá kimutatták, hogy az sAPP specifikusan fokozza a glutamát AMPA receptor szintézist és annak forgalmát [40]. Tanulmányunkban azt vizsgáltuk, hogy az ADAM10 expressziójának enyhe növekedése rutinkezelés hatására befolyásolja-e a glutamáterg szinaptikus transzmissziót. Amint az a Kiegészítő adatok részben látható, a kvercetin és rutin diéták során nem figyeltek meg szignifikáns hatást ezen ionotróp receptor expressziójára, talán az ADAM10 expresszió gyenge növekedése miatt, ami nem elegendő az AMPA receptor felszabályozásához (kiegészítő adatok , S2 ábra és S5 táblázat).

Figyelembe kell venni, hogy az in vitro vizsgálatok az ADAM10 szubsztrátok széles skáláját mutatták ki [41], ezért a nem specifikus ADAM10-célzással elért nemkívánatos hatások a rák proliferációjában, sejtadhéziójában és promóciójában fordulhatnak elő. T-sejt/NK-sejt prekurzor és gyulladás stb. [42]. Ennek a korlátozásnak a megkerülésére tanulmányunk egy olyan stratégiát javasol, amely az sAPP fiziológiásabb felszabadulását célozza. Ez a megközelítés egy aktív összetevő (kvercetin vagy rutin) hosszú távú bevitelén alapulhat, amelyet az egészséges emberi táplálkozás során fogyasztanak el. További vizsgálatokra van azonban szükség annak kiderítésére, hogy az ADAM10 növekedése flavonoiddózisfüggő-e, és hogy a lehetséges jótékony hatások meghaladják-e a feltételezett mellékhatásokat.

Ami az APPswe expresszióját illeti, bár a humán APP transzgén beépítése az egér genomba garantálja, hogy az APPswe születésétől kezdve túlzottan expresszálódik, arról számoltak be, hogy az APP mRNS és a fehérje hippocampális szintje jelentős ingadozást mutat az állatok fejlődése során, és akkor a legmagasabb, ha egereket tünetmentes (1-hónapos) és csökkenő, ha teljes tünet jelentkezik [43]. Ennek ellenére az APP expressziója mind a kéregben, mind a hippocampusban szignifikánsan magasabb volt a vizsgálatunkban szereplő WT egerekéhez képest. A kvercetinnel vagy rutinnal végzett további kezelés jelentősen csökkentette az expressziót mind a hím, mind a nőstény egereknél, mindkét agyterületen. Ezek az eredmények összhangban vannak Augustin és munkatársai által közöltekkel. [44], aki a flavonolokban, például kvercetinben gazdag Ginkgo biloba (Egb761) standardizált kivonatát tanulmányozta 4-hónapos nőstény TgAPP egereken, és csökkent APP mRNS- és fehérjeszintet talált. Figyelembe véve, hogy a Tg2576 egerekben az APP transzlációjának felszabályozása a prodromális és a korai tünetekkel járó stádiumban fordul elő [45], valószínű, hogy az APP transzláció kvercetin vagy rutin általi helyreállítása megtörténhetett TgAPP egereinkben, és valószínűleg egy korai szakaszban. tüneti stádiumban, ami az APP, a BACE1 aktivitás és a kaszpáz{10}} aktiváció kortikális és hippocampális szintjének csökkenését eredményezi.

Ezenkívül máshol beszámoltak arról, hogy a Tg2576 egerekben (az idegsejtek elvesztésének hiányában) a kaszpáz-3 aktivációja fokozódik a hippocampusban [46], amint azt tanulmányunkban is kimutattuk, a memóriaromlás kezdetekor. , valamint az extracelluláris amiloid lerakódása előtt a dendrittüskék csökkentése [46]. Bizonyítékok támasztják alá a kaszpázok nem apoptotikus szerepét az idegrendszerben neuronhalál nélkül [47], és a kaszpáz-3 aktivitást a dendrittüskékre lokalizálták, ahol megemelheti a kalcineurin szintjét. Az AMPA-szerű receptorok GluR1 alegységének kalcineurin által kiváltott defoszforilációjáról viszont úgy gondolják, hogy posztszinaptikus diszfunkcióhoz vezet. A transzgenezis következtében a kaszpáz-3 expressziójának értékei megegyeznek más kutatók értékeivel, akik a TgAPP egerek hippokampuszában a kaszpáz-3 expressziójának növekedéséről számoltak be a dendrit tüskék szintjén. [48]. Mivel az APP aminosavszekvenciájában három különálló hasítási helyet tartalmaz a kaszpáz-3 számára, amelyek közül kettő az extracelluláris domén szintjén, egy pedig az APP farok intracelluláris C-terminális részében található [49], ezért hidrolízis Az APP kaszpáz általi felszabadulása-3 megváltoztathatja az APP proteolitikus feldolgozását az amiloidogén útvonal javára [50], ami egy 31 aminosav hosszúságú (C31) citotoxikus C-terminális eredetű peptid felszabadulásához vezet. példa [51]. Ez arra utal, hogy mivel a kaszpáz-3 közvetítheti az APP-ból származó toxikus fragmensek felszabadulását, a kaszpáz-3 kvercetin vagy rutin általi expressziójának csökkentése lehetővé teheti az aggregált fehérje kiürülését. Ezenkívül, ahogy korábban említettük, megvizsgáltuk a kaszpáz-3 expresszió növekedésének és csökkenésének hatását a glutamáterg szinaptikus transzmisszióban a kalcineurin által aktivált kaszpáz-3 azon képessége alapján, hogy defoszforilálja a GluR1 alegységet. AMPA receptorok posztszinaptikus szinten. Ezek a molekuláris módosítások megváltoztatják a glutamáterg szinaptikus transzmissziót és a neuronális plaszticitást a hippocampus dendrittüskék szintjén [48]. Elméletileg a kaszpáz-3 aktivitás farmakológiai gátlása TgAPP egerekben megmentheti az AD-szerű fenotípusokat a szinaptikus kudarcért felelős mechanizmustól. A TgAPP egerünkben tapasztalható kaszpáz{31}} expresszió növekedése ellenére azonban nem találtunk szignifikáns különbséget az AMPA receptor expressziójában a WT egerekéhez képest, amint azt korábban említettük. Előfordulhat, hogy a kaszpáz-3 expressziójának változásai nem eléggé szembetűnőek ahhoz, hogy az AMPA-receptor expressziójában jelentős változásokat idézzenek elő (Kiegészítő adatok, S2 ábra és S5 táblázat).

Ami a kaszpáz-6 expresszió értékeit illeti, nem találtunk szignifikáns különbséget a TgAPP és a WT egerek között. A kaszpáz-6 aktivációját a neuronális stressz fontos közvetítőjeként azonosították, amely a citoszkeletális fontos fehérjéket (Tau és -tubulin) hasítja, így megzavarja a rosszul hajtogatott fehérjék ubiquitin-proteaszóma lebomlását, és számos aktinszabályozó posztszinaptikus sűrűséget. fehérjék [52]. A kaszpáz -6 változatlan expressziója a mi vizsgálatunkban megegyezik a neurodegeneráció jellegzetes jeleinek hiányával abban az életkorban, amikor ezeket a transzgenikus egereket értékelték, összehasonlítva a WT egerekkel (kiegészítő adatok, S1 ábra).

A neuroinflammatorikus mediátorok jelentős növekedését figyelték meg AD-betegekben, főként a szenilis plakkok környékén [53–55]. Az asztrociták a mikroglia és a neuronok GSH fő szállítói. Krónikus gyulladás és oxidatív stressz során az asztrociták mérgező gyulladásos mediátorokat és szabad gyököket szabadítanak fel, felgyorsítva a mikroglia aktiválódását és a neurodegenerációt [56]. Érdemes megjegyezni, hogy a csökkent intracelluláris glutation összefügg a gyulladásos folyamatok, a p38 MAP-kináz, a Jun-N-terminális kináz (JNK), az NF-κB aktivációjával humán mikrogliában és asztrocitákban [57]. Ezzel kapcsolatban úgy döntöttünk, hogy állatmodellünkben számszerűsítjük az IL-1, IFN- és TNF-szinteket, és meghatározzuk a kvercetin és a rutin hatását ezekre. Mint ismeretes, a gyulladás elősegíti az A-peptid és az APP hibás feldolgozását, elősegítve az A-peptid aggregációját, és módosítva az A-reaktivitást [58]. Így tanulmányunkban azt figyeltük meg, hogy a TgAPP egerekben megemelkedett az IL-1, a TNF- és az IFN- gyulladást elősegítő mediátorok mRNS szintje a WT egerekhez képest, ami azt mutatja, hogy az APPswe túlzott expressziója neuro-gyulladásos kaszkádokat indukálhat. molekuláris útvonalak sorozatát váltja ki a gliában és a neuronokban, amelyek aktiválják a gyulladásos választ. A kvercetin és a rutin képes volt gyengíteni az IL-1 génexpressziót mind a férfiakban, mind a nőkben, valamint a vizsgált agyterületeken. Számos bizonyíték támasztja alá a kvercetin központi idegrendszeri szintű gyulladáscsökkentő hatását, mivel gátolhatja az olyan transzkripciós faktorok aktiválódását, mint a nukleáris faktor-kappa B (NF-κB) [59], amely részt vesz az iNOS indukciójában, ill. ezért csökkenti az olyan mediátorok felszabadulását, mint az IL-1, a TNF- és az IFN- [60]. A GSH gyulladásos válaszra gyakorolt ​​hatását illetően meg kell jegyezni, hogy a GSH részt vesz az optimális citokinszint fenntartásában oly módon, hogy a gyulladást elősegítő citokinek (TNF-, IL-1 és IL) expresszióját. -6) megnövekedett a GSH kimerülése miatt, míg a gyulladásgátló citokinek (azaz IL-10) expressziója változatlan maradt. Ez a GSH homeosztázis változás az NF-κB és JNK jelátviteli utak felszabályozása miatt következik be, ami a neuronális sejthalál felé vezető apoptotikus útvonal lehet [61]. Vizsgálatunkban az NF-κB kvercetin és rutin általi leszabályozása elfogadható mechanizmus lehet a GSH/GSSG homeosztázis helyreállítására, és ezáltal a gyulladáskeltő és gyulladásgátló citokinek közötti egyensúly oka. Végül, mivel a BACE1 promoternek van NF-κB kötőhelye, az NF-κB gyulladás által kiváltott aktiválása elősegíti a BACE1 expressziójának fokozását, és ezt követően növeli az A termelést [62]. Így, ha az NF-κB lecsökkent szabályozása következik be kvercetin és rutin diéta során, a BACE1 aktivitás csökkenne a gyulladást elősegítő és nem gyulladásgátló citokinek felszabadulási szabályozása következtében.

4. Anyag és módszer

4.1. Kísérleti állatok

Kísérleti AD állatmodelljeként egy transzgenikus egeret (Tg2576, B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha), amely a humán amiloid prekurzor fehérje (hAPP) svéd kettős mutációját expresszálja [14]. Az egér egy knock-in heterozigóta vonal, amely a humán A PP695 izoformát fejezi ki kettős svéd mutációval (K670N/M671L; Lys670→Asn és Met671→Leu) a hörcsög prionfehérje promoterének szabályozása alatt [63]. Ennek eredményeként ez az egér humán amiloid-prekurzor fehérje (A PP) szintet mutat, hatszor magasabb, mint egy egér A PP szintje. Ezenkívül ez az egér magasabb A 40 és A 42 szintet mutat. Az A lerakódások 9 hónapos korban kezdődnek [63]. A Tg2576 hippokampuszon és kéregen belül az APPswe transzgén expressziója elsősorban neuronális [64].

Negatív kontrollként ugyanabból a kolóniából származó vad típusú (WT) egereket [65,66] használtunk. A Tg2576 (B6; SJL-Tg(APPswe)2576 Kha) egérkolóniát laboratóriumunkban fejlesztettük ki Tg2576 heterozigóta hímekből és vad típusú nőstényekből. A transzgenikus szülőket Dr. Diana Frechilla, a Navarrai Egyetem (Pamplona, ​​Spanyolország) Alkalmazott Orvosi Kutatási Központjának Idegtudományi Osztályától adományozta [67].

Az állatokat egyedileg szellőztetett ketrecekben tartottuk, és 22–24 ◦C-on tartottuk 12-órás fény/sötét ciklusban, 50–60 százalékos páratartalom mellett. Az állatprotokollokat a Madridi Complutense Egyetem Intézményi Állatgondozói és Felhasználási Bizottsága (IACUC) hagyta jóvá, és teljes mértékben összhangban voltak a tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló 2010/63/EU irányelvvel és az állatjóléti spanyol jogszabályokkal ( 53/2013 királyi rendelet, 2013. február 1).

4.2. Az egerek genotipizálási elemzései

A transzgenitást a születést követő 30 napon belül farokbiopsziával határozták meg. Az állatok genotipizálási analízisét PCR-rel végeztük. Tekintettel arra, hogy a Tg2576 (TgAPP) egy heterozigóta vonal, pozitív reakciókontrollként az inszerciós gént (PrP, prionfehérjéből) alkalmaztuk. A genomi DNS-t proteináz K-vel (0,1 µg/µL) emésztett egérfarokból extraháltuk NID pufferben (50 mM KCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50). mM MgCl2, 0,05% zselatin, 0,45% NP-40 és 0,4% Tween 20) 56 ◦C-on 3 órán át, majd összerázzuk. A DNS-fragmenseket izopropanollal kicsaptuk, és 70%-os etanollal mostuk. A DNS-csapadékot feloldottuk 30 µl TE-pufferben (10 mM Tris-1 mM EDTA). A DNS tisztaságát és koncentrációját 260 és 280 nm-en határoztuk meg.

A PrP és APP géneket PCR-rel amplifikáltuk. A transzgenikus egerek szűrésére használt primerek szekvenciái a következők voltak: PrP előre: CCTCTTTGTGACTATGTGGACTGATGTCGG; PrP fordított: GTGGATACCCCCCCCCCAGCCTAGACC; APP fordított: CCAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATG. A PCR reakció lépései a következők voltak: denaturálás 94 °C-on 90 másodpercig, 39 ciklus 60 °C-on 60 másodpercig és 72 °C-on 90 másodpercig, majd végső meghosszabbítás 72 °C-on 7 percig.

Minden esetben figyelembe vettük az APP gén negatív kontrolljait (DNS penészgomba nélkül) és pozitív kontrolljait. A kapott PCR-termékeket elektroforézissel választottuk el 1,5%-os agaróz gélekben 0,5X TBE (Tris-Borate-EDTA, Merck KGaA, Darmstadt, Németország) pufferben 70 V-on (állandó feszültség), majd festéssel leképeztük. GelRed (Millipore).

4.3. Állatkezelések

A 6-7 hetes, 16,2 ± 0,8 g kezdeti testtömegű TgAPP egereket és vad típusú alomtársakat véletlenszerűen a következő négy csoportba soroltuk (n=8/csoport): ( a) Kezeletlen TgAPP; (b) kvercetinnel kezelt TgAPP; (c) rutinnal kezelt TgAPP; és (d) kezeletlen vad típusú. Mivel mind a hím, mind a nőstény egereket tanulmányozták, két csoportot hoztak létre. 45 hetes korukban kezdték el az egereket kvercetinnel vagy rutinnal kezelni 4 hétig.

A kvercetin (3,30,40,5,7-pentahidroxiflavon) és a rutin-hidrát (kvercetin-3-O-rutinozid-hidrát) legalább 95 százalékos tisztaságú volt, és a Sigma–Aldrich cégtől vásárolták. A flavonoidok mindegyikét beépítették egy standard étrendbe (Harlan Ibérica, Barcelona, ​​Spanyolország) 200 ppm koncentrációban, ami 30 mg flavonoid/testtömeg-kg/nap bevitelnek felel meg. A kezeletlen egerek kizárólag a nem kiegészített standard étrendet kapták. Az ad libitum bevitelhez diétát és vizet biztosítottak.

4.4. Agyszövet előkészítése biokémiai és szövettani vizsgálatokhoz

A kezelés végén az egereket egy éjszakán át éheztették, nyaki diszlokációval elaltatták, és az egész agyat gyorsan eltávolították. Az agyat 4 °C-os sóoldattal öblítettük, és óvatosan eltávolítottuk az arachnoid membránt. Ezután a hippocampust és a kéreget izoláltuk. A mintákat azonnal –80 ◦C-on tároltuk a további felhasználásig.

Egyes állatok teljes agyát felhasználták a szövettani metszetek készítéséhez, amelyekhez a nyaki diszlokációval történt elaltatást követően az agyat -80 ◦C-on izopentánba merítve lefagyasztottuk. Közvetlenül ezután egy kriosztátban (Leica CM1850, Nussloch, Németország) készítettük el az agy koronális metszeteit (30 µm vastagság) a szaglóhagymától a kisagyig, egymástól 120 µm távolságra. Az egész eljárást –20 ◦C-on végeztük. A szövettani metszeteket tárgylemezekre gyűjtöttük, és -80 ◦ C-on tartottuk az elemzésig (lásd a Kiegészítő módszereket).

4.5. Glutation

A glutation tesztekhez az agykéreg és a hippocampus mintákat redox-kioltó pufferben, -5 százalékos triklorid-ecetsavban (RQB-5 százalékos TCA) homogenizáltuk (korábban 15 percig jégen buborékoltatva N2-vel) olyan koncentrációban. 25 mg/ml (w/v). A mintákat ultrahanggal 10 másodpercig újraszuszpendáltuk, majd 12, 000 × g-vel centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on, és a felülúszókat összegyűjtöttük.

Ezután a kapott felülúszóban spektrofluorometriás módszereket alkalmaztak a GSH és GSSG szintek meghatározására, Senft és munkatársai által leírt o-ftálaldehid módszerrel. [68]. A GSH és GSSG értékeket biológiai minta hiányában korrigáltuk a spontán reakcióra. Mindkét esetben a felülúszókat 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd a fluoreszcenciát FLUOSTAR mikrolemez-leolvasóval (BMG LABTECH, Ortenberg, Baden-Württemberg, Németország), a gerjesztőszűrőt 360 nm-re (5 nm sávszélesség) határoztuk meg. és az emissziós szűrő 460 nm-re van beállítva (5 nm sávszélesség). A GSH és a GSSG koncentrációját minden mintában az ismert GSH standardokból interpoláltuk. Mind a GSH, mind a GSSG koncentrációját nmol GSH/mg proteinben fejeztük ki, ami lehetővé tette a GSH/GSSG glutation redox arány kiszámítását.

A megmaradt pelleteket vortexeltük, amíg teljesen fel nem oldódott 24{1}} µl 0,1 M NaOH-ban, hogy a fehérjekoncentrációt bicinkoninsav (BCA) módszerrel mérjük, standardként marhaszérum albumint használva.

【További információ:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】