Hálózati farmakológiai tanulmány a Hypericum Japonicum molekuláris mechanizmusairól a kolesztatikus hepatitis kezelésében alfa-naftil-izotiocianát (ANIT) hepatotoxicitási patkánymodellben történő validálással

További információért. kapcsolatba lépnitina.xiang@wecistanche.com

Háttér: Ez a hálózatos farmakológiai vizsgálat a Hypericum japonicum cholestaticus hepatitisre gyakorolt ​​hatásában szerepet játszó aktív vegyületek és molekuláris mechanizmusok azonosítását célozta. Az eredményeket egy alfa-naftil-izotiocianát (ANIT) hepatotoxicitási patkánymodellben validáltuk.

Anyag/Módszerek: A H.japonicum kémiai összetevőit és célpontjait, valamint a korábban cholestaticus hepatitishez társult célgéneket nyilvános adatbázisokból keresték ki. A Cytoscape 3.7.2 szoftverrel hálózatot építettünk ki, a STRING adatbázist és a lehetséges fehérjefunkciókat a bioinformatika nyilvános platformja alapján elemeztük. ANIT-ot alkalmaztak kolesztatikus hepatitis indukálására patkánymodellben 36 Sprague-Dawley patkány felhasználásával, és ezt a modellt használták a 3 dózisú beavatkozás vizsgálatára.kvercetin(alacsony dózisú, 50 mg/kg; közepes dózisú, 100 mg/kg; és nagy dózisú, 200 mg/kg), a H. japonicum fő hatóanyaga. A szérum biokémiai indexek szintjét kereskedelmi készletekkel mérték valamint a máj- és mitokondriális funkció markereinek hírvivő RNS (mRNS) szintjei ésoxidatív stresszvalós idejű reverz transzkripciós-polimeráz láncreakcióval (RT-PCR) mutatták ki.

Eredmények: A H. japonicum fő hatóanyagai a kvercetin, a kaempferol és a tetra-metoxi-luteolin voltak. és fő célpontjaik a prosztaglandin G/H szintáz 2 (PTGS2), a B-sejtes limfóma-2 (BCL2), a koleszterin7-alfa-hidroxiláz (CYP7A1) és a farnezoid X receptor (FXR). A kvercetin beavatkozás elősegítette a cholestaticus hepatitisből való felépülést.

A kutatás eredményei alátámasztják a kvercetin, a kaempferol és a kvercetin szerepével kapcsolatos jövőbeli kutatásokat.

Következtetések: tetra-metoxi-luteolin humán májbetegségben és a PTGS2, BCL2, CYP7A1 és FXR gének szerepe cholestaticus hepatitisben.

Kulcsszavak: Cholestasis, intrahepatikus · Génszabályozó hálózatok · Hypericum · Gyógyászat, hagyományos kínai · Farmakológia · Kvercetin

Háttér

Cholestasisegy klinikai szindróma, amely a kóros epeképződés, -szekréció és -kiválasztás által okozott májelváltozásokkal jár. A cholestaticus májbetegségek szorosan összefüggenek az epesavszintézis és -transzport zavaraival, és gyakran okoznak kolesztatikus májkárosodást, amely végső soron májfibrózissá, cirrhosisba és májelégtelenségbe vezethet [1,2].

A cholestasis a cholestaticus hepatitis és az alfa-naftilizotiocianát (ANIT) által kiváltott kolesztázis egyik fő oka, és végső soron cholestaticus hepatitishez vezethet. Az ANIT egy kémiai toxin, amelyet hepatocelluláris nekrózis, epeúti hiperplázia és májfibrózis indukálására használnak, és amelyet kísérleti állatmodellekben májkárosodás vagy kolesztatikus hepatitis előidézésére használnak. Kutatási vizsgálatok során patkányokba intraperitoneálisan ANIT injekciót adtak a kolesztatikus hepatitis megismétlésére [3-5]. A cholestasis során a májkárosodás kórszövettani jellemzői közé tartozik a májszövet nekrózisa, az epeutak proliferációja, a hidropikus változások,gyulladásés fibrózis. Az állatok ANIT-indukálta cholestasis esetén a májkárosodás plazma biomarkerei, például az alanin-aminotranszferáz (ALD), az aszpartát-aminotranszferáz (AST), az alkalikus foszfatáz és az y-glutamin-il-transzpeptidáz (y-GGT) jelentős emelkedést mutatnak.Oxidatív stresszszintén jelentősen megnövekszik, amit a reaktív oxigénfajták magas szintje, a lipid-peroxidáció, a kimerült glutation tartályok és a máj csökkent szöveti antioxidáns kapacitása bizonyít. Ennél is fontosabb, hogy az ANIT-indukált állatok a mitokondriális dehidrogenáz aktivitás gátlását, a mitokondriális membránpotenciál összeomlását és a mitokondriális duzzanatot mutatják. Az ANIT-indukált kolesztatikus patkányokból származó mitokondriumok fokozott érzékenységet mutatnak a mitokondriális permeabilitási átmeneti pórusok megnyitására és az ATPáz aktivitás csökkenő repolarizációjára. Következésképpen a cholestaticus hepatitis szorosan összefügg a májfunkcióval, az oxidatív stresszel, valamint a mitokondriumok szerkezetével és funkcióival [6,7].

Jelenleg csak néhány gyógyszert, például az urzodezoxikólsavat (UCDA) használnak a betegségek kezelésére.kolesztázis[8,9]; de ezeknek a gyógyszereknek vannak hátrányai, beleértve a gyenge választ, a mellékhatásokat és az alacsony együttműködést. A hagyományos kínai orvoslás azonban hosszú múltra tekint vissza és gazdag klinikai tapasztalattal rendelkezik a májbetegségek, például az intrahepatikus cholestasis kezelésében. A Hypericum japonicum a Hypericum japonicum Thunb szárított teljes füve. Az ex Murrayt, más néven Di-er-Cao-t vagy Tian-ji-Huangot a Qing-dinasztia óta használják sárgaság kezelésére. A H. japonicum funkciója a hő eltávolítása, a nedvesség eltávolítása, a máj megnyugtatása és az epehólyag fokozása, és általánosan alkalmazzák a nedves meleg sárgaság klinikai kezelésére [10]. A H. japonicum kémiai összetétele flavonoidokat, lantanoidokat, kromonglikozidokat, floroglucinol-származékokat és laktonokat tartalmaz. A flavonoidok közül a kvercitrin, az izokvercitrin és a kvercetin-7-O- -l-ramnozid a májvédő hatású összetevők [11]. Ning Wang és munkatársai kimutatták, hogy a H. japonicum vizes kivonatai, beleértve a kvercetint, az izokvercetint és a kvercetint, antihepatotoxikus és kolesztázis-ellenes hatással rendelkeznek szén-tetraklorid által kiváltott hepatitisben és ANIT-indukálta epehólyagban szenvedő kísérleti állatokon [12]. Azonban a H. japonicum mechanizmusai és célpontjai az intrahepatikus cholestasis kezelésében még mindig nem tisztázottak.

Ebben a tanulmányban a hálózati farmakológiát és a farmakológiai kísérleteket kombinálták. Először is, a H.japonicum fő aktív komponenseit és célpontjait in silico azonosították, és felhasználták egy komponens-célhálózat felépítésére[13,14]. A célgének funkcionális dúsítási analízisét végezték el, hogy feltárják a lehetséges terápiás mechanizmusokat a cholestaticus hepatitis kezelésében. Ezt követően az ANIT által kiváltott cholestaticus hepatitis patkánymodelljét használták fel, hogy feltárják a H. japonicum cholestaticus hepatitis kezelésében kifejtett hatásainak hátterében álló mechanizmusokat és májvédő hatásait. Konkrétan a mitokondriális membránpotenciált, a hepatocita apoptózist, az intrahepatikus epesav homeosztázis szabályozását és egyéb útvonalakat vizsgáltuk.

Anyag és módszerek

Vegyszerek és reagensek

H. japonicum Thunb. az ex Murray-t a Kangmei Pharmaceutical Co., Ltd.-től vásárolták (Puning, Kína); -naftil-izotiocianátot (ANIT, 98 százalék) a Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.-től (Sanghaj, Kína) vásárolták;kvercetin(>98.0%)and ursodeoxycholic acid (UCDA,>98 százalékát a Dalian Melone Biology Technology Co., Ltd.-től (Dalian, Kína) vásárolták. Az olívaolajat a Sigma Aldrich Trading Co., Ltd.-től (Sanghaj, Kína) vásároltuk. Malondialdehid (MDA), szuperoxid-diszmutáz (SOD), direkt bilirubin (DBI), összbilirubin (TBIL), teljes epesav (TBA), ALT és AST vizsgálati készletek, valamint glutation-peroxidáz (GSH-Px) készleteket vásároltunk a Nanjing Jiancheng Biomérnöki Intézet (Nanjing, Kína). A Bio-Rad DC fehérje vizsgálati reagens csomagot a Bio-Rad Laboratories (CA, USA) cégtől vásároltuk. A HyPure molekuláris biológiai minőségű vizet, a FastStart Universal SYBR Green Master mixet (Rox) és a RevertAid First Strand cDNS szintézis készletet a Thermo Fishertől vásároltuk. Scientific Co., Ltd. (Sanghaj, Kína). A PTGS2, B-sejtes limfóma-2(BCL2), koleszterin 7-alfa-hidroxiláz (CYP7A1), farnezoid X receptor (FXR), interleukin-1 béta(L{{) elleni primerek 13}}B), és a tumor nekrózis faktor-alfát (TNF-o) a Service bio Technology Co., Ltd.-től (Wuhan, Kína) vásároltuk. Az összes többi vegyszer és reagens analitikai minőségű vagy magasabb minőségű volt, és kereskedelmi forrásokból vásárolták.

Állatok

A 180–220 g tömegű hím Sprague-Dawley patkányokat a Southam Medical University Center for Experimental Animals-tól (SCXK(YUE)2018-0085) vásároltuk. A patkányokat ketrecekben helyeztük el, ad libitum táplálékkal és vízzel, és minden kísérlet előtt 1 hétig akklimatizáltuk őket a laboratóriumban. Az állatokkal és gondozással kapcsolatos összes eljárást jóváhagyta a Guangzhou Orvosi Egyetem Oktatási és Kutatási Osztályának Emberi és Állati Tantárgyak Felhasználásával Foglalkozó Bizottsága. Az állatigazolvány száma 44002100016560 volt.

A H.japonicum komponenseinek és célpontjainak átvilágítása

A "Di-er-cao" keresési kulcsszót választva a H.japonicum kémiai összetevőit és kapcsolódó célpontjait kerestük a Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology adatbázisban, amely értékes platform a kínai gyógynövény-gyógyszerek rendszerfarmakológiai kutatásához és egy a gyógyszerek, a célpontok és a betegségek közötti hálózati kapcsolatok adatbázisa [15]. A célpontoknak megfelelő génneveket az UniPort tudásbázisból, a fehérjék funkcionális információinak gyűjtésére szolgáló központi csomópontból kaptuk[16]. A szervezetet „embernek” választották.

Terápiás célelőrejelzés és hálózatépítés

A "cholestaticus hepatitis" kulcsszót használták a fehérje célpontok és a megfelelő génnevek megszerzéséhez a cholestaticus hepatitishez a GeneCards adatbázisban, amely számtalan adatforrásból automatikusan bányász és integrálja az emberi génközpontú információkat [17]. Az "ajándékok 230" jelzésű célpontokat választottuk ki a kolesztatikus hepatitis terápiás célpontjaiként. A cholestaticus hepatitis kezelésére szolgáló H. japonicum potenciális célpontjainak meghatározásához a gyógyszer célpontjait és a betegség célpontjait a "génnév" szerint kereszteztük. A Cytoscape 3.7.2 szoftvert [18] használtuk a komponens-target hálózat felépítésére, a hálózati elemző funkciót pedig a hálózati topológia paramétereinek elemzésére.

Célfehérje kölcsönhatás elemzése

A H.japonicum és a cholestaticus hepatitis metszéspontjait importáltuk a String adatbázisba, amely direkt (fizikai) és közvetett (funkcionális) protein-protein interakciókat (PPI) képes feltárni [19]. Nagy biztonsággal (0.9), mint szűrési feltétellel, eltávolítva az izolált célpontokat, és a fajt emberként határozták meg, létrehoztak egy PPI-hálózatot. A fenti adatok Cytoscape-be történő importálása után a cytoHubba beépülő modulban található Maximal Clique Centrality (MCC) elemzési módszert alkalmaztuk a PPI hálózat kulcsfontosságú szabályozási célpontjainak elemzésére.

Célfunkció- és útvonalgazdagítási elemzés

A célfehérje gének biológiai folyamatainak és jelátviteli útvonalainak további megértése érdekében a H. japonicum által okozott kolesztatikus hepatitis kezelésének célpontjait bevitték a Metascape-be, egy hatékony génannotáció-elemző eszközbe[20]. A faj az emberre korlátozódott, és P<0.01 was="" set="" as="" the="" significance="" threshold.="" gene="" ontology="" (go)="" functional="" annotation="" and="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes="" (kegg)pathway="" enrichment="" analyses="" were="" carried="" out,="" and="" the="" first="" 20="" cluster="" analysis="" results="" were="" drawn="" into="" a="" bar="" chart="" for="" visual="" processing="" using="" the="" omicshare="" tools,="" a="" free="" online="" platform="" for="" data="" analysis="" and="" detailed="" implementation="" process,="" as="" shown="" in="" figure="">

A kvercetin terápiás hatásai ANIT által kiváltott patkány kolesztatikus hepatitisre

Harminchat hím Sprague-Dawley patkányt véletlenszerűen 6 csoportra osztottak (csoportonként n =6): a csoport 7 napon keresztül lokálisan kapott vak vivőanyagot, majd az 5. napon olívaolajat (2 ml/ttkg) ip. ; A ll csoport 7 napig szóban üres vivőanyagot kapott; A II. csoportot orálisan kezelték UCDA-val (50 mg/testtömeg-kg) 7 napon keresztül; Az V. csoportot orálisan kezelték nagy dózisú kvercetinnel (Que H; 200 mg/ttkg) 7 napon keresztül; Az V. csoportot orálisan közepes dózisú kvercetinnel (QueM; 100 mg/ttkg) kezelték 7 napon keresztül; és a VI. csoportot orálisan kezelték alacsony dózisú kvercetinnel (Quel, 50 mg/ttkg) 7 napon keresztül. Az Il-VIl csoportba tartozó patkányok ANIT-olívaolaj-oldatot (100 mg/kg, ip, 2 ml/ttkg) kaptak 2 órával az UCDA vagy kvercetin beadása után az 5. napon. A modell- és kontrollcsoportokat orálisan kezelték egy üres oldószer naponta [21,22].

Negyvennyolc órával az utolsó ANIT beadása után az állatokat érzéstelenítéssel, ip injekcióval (100 mg/kg pentobarbitál) elaltattuk. Vért vettünk a hasi aortából biokémiai értékelés céljából. A májat azonnal eltávolították és lemérték. A máj nagy részét gyorsan lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, a fennmaradó szövetet pedig 4 százalékos paraformaldehidben fixáltuk, feldolgoztuk és paraffinba ágyaztuk szövettani vizsgálat céljából hematoxilin és eozin (H&E) festés után. A májkárosodást az ALT, AST, DBIL, TBIL, TBA és andy-GGT szintjei alapján értékelték ki Chemray 240 Automatic Biochemical Analyzer (Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd., Shenzhen, Kína) segítségével. Az MDA, GSH-Px és SOD szintjét kereskedelmi készletek segítségével értékelték ki a gyártó utasításai szerint, a szövettani értékelést és pontozást pedig szabványos kritériumok szerint végezte el a vizsgálatra vak patológus. A valós idejű reverz transzkripciós-polimeráz láncreakció (RT-PCR) elemzéshez a májszövetet gyorsan lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és -80 fokon tároltuk az elemzésig.

A PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, Il-1 és TNF-mRNS-ek elemzése RT-PCR-rel

A teljes RNS-t a májszövetekből vontuk ki TRlzol segítségével, a gyártó utasításai szerint (Service bio, Wuhan, Kína). A teljes RNS (10 μLl) cDNS-vé íródott át. A GAPDH, PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, TNF- és IL-1 PCR reakciói (20 ul) 2 μL cDNA-t tartalmaztak ,2μL 2,5 μM primer, 10μLgPCR keverék és 6 μL ddH,O. A reakciókat 65 fokon 10 percig, majd 42 fokon 60 percig inkubáltuk, és 72 fokon 15 percig leállítottuk. A PCR primer szekvenciák az 1. táblázatban vannak felsorolva. Az RT-PCR reakciókat a következőképpen végeztük: előciklusos szakasz 95 °C-on 10 percig, majd 40 ciklus denaturizálás 95 °C-on 30 másodpercig, majd annealing 60 °C-on. 60 másodpercig. Az olvadási görbe 65° és 95° között volt, 0,3°C/15 s felfutási sebességgel. A fluoreszcenciát minden egyes hígítási lépés végén mértük, és az olvadási görbéket figyeltük a PCR-termékek specifitásának megerősítésére. A 2-一CT módszert használták a PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, IL-1B és TNF-mRNS-ek mRNS expressziós szintjének meghatározására a GAPDH kontrollgénhez viszonyítva.

Statisztikai analízis

Minden adatot átlag±standard deviációban (SD) fejeztünk ki. A statisztikai elemzést GraphPad Prism 8 segítségével végeztük.

3.0(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Az adatokat egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük, majd a Dunnett-teszttel.<0.05 was="" considered="" statistically="">

Eredmények

A H.japonicum összetevői és céljai

A H. japonicum összetevőinek teljes körű vizsgálata érdekében nem határoztuk meg szűrési kritériumként a farmakokinetikai paramétereket, úgymint az orális biohasznosulás és a gyógyszerszerűség. A TCMSP adatbázison keresztül 49 aktív komponenst és 499 megfelelő célpontot kaptunk a H. japonicumból. Az ismétlődések eltávolítása és a nevek Uniprot általi javítása után 269 cél maradt meg. A H.japonicum aktív komponenseit és a paraméterinformációkat a 2. táblázat tartalmazza.

A H.japonicum célpontjai a cholestaticus hepatitis kezelésében

A GeneCards adatbázisban 682 cholestaticus hepatitis célpontját szűrték ki. Végül 93 célpontot kaptunk, amelyek összefüggésbe hozhatók a cholestaticus hepatitis H. japonicum kezelésével az aktív komponensek és a betegség célpontjainak keresztezésével (2. ábra).

Összetett célhálózat

A H. japonicum komponens-célhálózata a cholestaticus hepatitis kezelésében 115 csomóból és 175 élből állt, amelyekből 22 hatszögletű csomópont képviselte az aktív komponenseket és 93 V alakú csomópont képviselte a célpontokat (3. ábra).

A csomópontok mérete és átlátszósága fok szerint lett beállítva. Minél magasabb a fokérték, annál nagyobb a csomópont, és minél sötétebb a szín, annál nagyobb a kapcsolat és a fontosság. Amint az eredményekből kiderül, a H. japonicum többkomponensű és több célpontot is tartalmazott; azaz egy vegyület több célponttal kölcsönhatásba lép, és különböző vegyületek lépnek kölcsönhatásba ugyanazzal a célponttal. A hálózati topológia paraméterei szerint, mint például a fok, a közöttiség és a közelség, a fő aktív komponensek a kvercetin, a kempferol és a tet-rametoxiluteolin (3. táblázat), a fő célpontok pedig a PTGS2, a nitrogén-monoxid-szintáz (NOS3) voltak. peroxiszóma proliferatív aktivált receptor gamma (PPARG), dipeptidil-peptidáz V (DPP4), BCL2 és TNF (4. táblázat).

PPI hálózat

93 gyógyszer-betegség kereszteződési célpont interakcióját elemeztük a STRING adatbázis segítségével. Nagy megbízhatóságot (0.9) állítottunk be, az elszigetelt célpontokat elrejtették, és egy 81 célpontból és 299 interakciós linkből álló PPI-hálózatot kaptunk (4A. ábra). A cytoHubba MCC algoritmusát alkalmazva a PPI hálózat 10 legfontosabb szabályozó célpontja a TNF, IL6, IL1B, CXCL8, IL10, CCL2, ICAM1, NFKB1, NFKBIA és MYC (4B. ábra).

Célfunkció és útvonal gazdagítása

A terápiás célpontok GO funkcionális annotációját és KEGG útvonal-dúsító elemzését a Metascape segítségével végeztük. Összesen 1899 GO elemet kaptunk, ebből 41 tétel a sejtösszetételre, 105 elem a molekuláris funkcióra és 1753 elem a biológiai folyamatokra. A fő biológiai folyamatok és sejtkomponensek, amelyekben a H. japonicum részt vett, többek között a lipopoliszacharidra adott válaszok, a citokin által közvetített jelátvitel, az apoptotikus jelátvitel, a membrán raft (5A, 5B ábra) és a molekuláris funkciók, beleértve a citokinreceptor-kötést, a transzkripciós faktor kötődést és a szerint. -típusú endopeptidáz aktivitás (5C. ábra). Összesen 146 KEGG jelátviteli útvonalat elemeztek, amelyek közül a legfigyelemreméltóbbak az AGE-RAGE és a TNF jelátviteli útvonalak, valamint a hepatitis B, az arginin bioszintézis és az epeszekréció. (5D. ábra).

A kvercetin védett az ANIT által kiváltott kolesztatikus hepatitis ellen patkányokban

Az intrahepatikus cholestasis patkánymodellben a kvercetin helyreállította a máj/testtömeg arányt epehólyaggal járó májkárosodásban (6. ábra). A szérum ALT, AST, DBIL, TBIL, TBA és Y-GGT, amelyeket az intrahepatikus epeutak proliferációjának és a májsejt-károsodással összefüggő cholestasis értékelésére használtunk, drasztikusan megemelkedett a modellpatkányokban. Ezzel szemben a kvercetin dózisfüggően csökkentette a szérum ALT-, AST-, DBIL-, TBIL-, TBA- és GGT-szinteket. Hasonlóképpen, a kvercetin kezelés javította az ANIT által kiváltott máj oxidatív stresszt, növelte a szérum SOD és GSH-Px szintet, és csökkentette az MDA szintet (7. ábra).

A H&E festéssel végzett szövettani értékelések közvetlen bizonyítékot szolgáltattak a kvercetin megelőző és terápiás hatásáról az ANIT által kiváltott intrahepatikus kolesztázisra. A H&E festés azt mutatta, hogy a kontrollcsoport májszövete normális mikrostruktúrát mutatott, a májlebenyek tiszták, a májsejtkábel pedig tiszta és rendezett, kóros morfológiai változások nélkül. Ezzel szemben az ANIT-tel kezelt májmetszetek elmosódott májlebeny-struktúrát, májzsinór-rendellenességet, májduzzanatot, hiperémiát és nekrózist mutattak (8A. ábra). A kvercetin azonban szignifikánsan csökkentette a májpusztulás mértékét és a gyulladásos sejtek infiltrációját, ami dózis-hatás összefüggést mutat. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a kvercetin védett az ANIT által kiváltott májkárosodás ellen, amely patkányok intrahepatikus kolesztázisából ered.

Kvercetin által védett PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR I-1B és TNF-mRNS expresszió

A kvercetin hepatocitákra gyakorolt ​​védőhatásának további értékelésére ANIT-indukált intrahepatikus cholestaticus májkárosodásban szenvedő patkányokban a PTGS2, BCL2, CYP7A1, FXR, IL-1 és TNF-mRNS-szintjét RT-PCR segítségével mértük. A 8B. ábrán látható, hogy a kontroll egerekkel összehasonlítva a PTGS2, CYP7A1, IL-1 és a TNF-szint felfelé volt szabályozva az ANIT modellcsoportban, de a BCL2 és az FXR csökkent. Azonban kvercetin (50 100 és 200 mg/kg dózisban) és UCDA beadása

szignifikánsan, 44,4 százalékkal csökkentette a PTGS2, CYP7A1, IL-1 és TNF-mRNS expresszióját (P<><><0.05), and=""><0.05), respectively,="" and="" increased="" the="" expression="" of="" bcl2="" and="" fxr="" mrna="" by="" 92.9%="" and=""><0.01), respectively,="" was="" the="" anit="" model="" group.="" these="" results="" showed="" that="" quercetin="" could="" protect="" hepatocytes="" by="" accelerating="" the="" excretion="" and="" transport="" of="" bile="" acids,="" maintaining="" the="" mitochondrial="" membrane="" potential="" of="" hepatocytes,="" and="" inhibiting="">

Vita

Összességében egy ANIT-indukált patkánymodellt alkalmaztunk, amely kimutatta, hogy a H.japonicum cholestaticus hepatitis kezelésére alkalmas. Hálózati farmakológiai és farmakodinamikai kísérletek tisztázták a H. japonicum hatását és molekuláris mechanizmusát a cholestaticus hepatitis kezelésében, és elméleti alapot biztosítottak a gyógynövény további kutatásához és klinikai alkalmazásához.

A H. japonicum fő kémiai összetevői többek között a flavonoidok [23], a phloroglucinol származékok és a dipeptidek [11]. Puthur és munkatársai megállapították, hogy a H. japon-icum acetonos kivonat IC50 értéke ascites sejteken 29,30 ug/ml, eredményeik jó daganatellenes aktivitást mutatnak in vitro, és hogy a H. japonicum metanolos kivonatai szinergikus hatást fejtenek ki egyes kulcsenzimek gátlásával. Kísérleteik során kiderült, hogy a H. japonicum különféle biológiai aktivitásokkal rendelkezik, amelyek további vizsgálatot igényelnek [24,25]. A modern farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a H. ja-ponicum kivonat számos biológiai hatással rendelkezik, beleértve a májvédő, antioxidáns,gyulladáscsökkentő, és daganatellenes hatások.A H.japonicum és fő komponensei védelmet nyújtanak a szén-tetraklorid által kiváltott hepatitis, az ANIT által kiváltott cholestasis és a kacsa hepatitis A vírusellenes aktivitása ellen, valamint javítják a májfunkciót és az oxidatív károsodást[12,26]. Az izokvercitrin és a kver-cetin 7-ramnozid a fő aktív hepatoprotektív összetevők [11,27]. A jelen tanulmány kimutatta, hogy a kvercetin, a H.japonicum fő összetevője csökkentheti az ANIT által kiváltott hepatocita degenerációt és nekrózist, valamint csökkentheti a májkárosodás mértékét. A H&E eredmények tovább erősítették a kvercetin kolesztatikus hepatitis elleni védő hatását.

Jelen tanulmányunkban a hálózati farmakológiai kutatásokat kombináltuk állatfarmakológiai kísérletekkel. Elsőként a H. japonicum fő aktív komponenseit és célpontjait szűrtük a cholestaticus hepatitis kezelésében. Ezután felépítettünk egy "komponens-cél" hálózatot, és elemeztük a célpontok funkcionális gazdagodását, hogy feltárjuk a cholestaticus hepatitis elleni terápiás hatás lehetséges mechanizmusát. Végül állatkísérletekkel ellenőriztük ezeket a célpontokat és molekuláris mechanizmusokat. Az általunk megfigyelt intrahepatikus cholestasis biokémiai mutatói és kóros jellemzői összhangban voltak a humán betegségekkel, alátámasztva a cholestaticus hepatitis patkánymodelljének klinikai jelentőségét.

Az epesav szérumszintjét kulcsfontosságú bizonyítéknak tekintik az intrahepatikus cholestasis rendellenességek és az ebből eredő májkárosodás klinikai diagnózisában. Az intrahepatikus cholestasis az epe és a májműködés normális kiválasztódásának akadályozásához vezet

enzimek, ami a szérum TBIL, DBIL és TBA növekedését eredményezte, és kimutattuk, hogy a kvercetin megfordította az ANIT által kiváltott epesav szabályozási zavart. Ezenkívül a kvercetin jelentősen csökkentette az AST, ALT és y-GGT szérumszintjét, amelyek drámaian megemelkedtek a hepatociták degenerációja és nekrózisa, valamint a hepatocita membrán károsodása miatt.

A lipid-peroxidáció az ANIT által kiváltott cholestaticus hepatitis egyik fontos kóros mechanizmusa, amely májsejtkárosodást okoz |28-30]. A szervezet oxidatív stresszének szintje a cholestaticus hepatitis súlyosságát tükrözi, ezért a lipid-peroxid szintjének felmérésére használt GSH-Px, SOD és MDA fontos indikátorok. A jelen vizsgálatban minden kvercetin adagoló csoport szignifikánsan csökkent MDA-t mutatott, megnövekedett SOD és GSH-Px aktivitással. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a májsejtek károsodásának kvercetin általi enyhítése a szabad gyökök megkötésével, a lipidperoxidáció gátlásával és a lipid-peroxidok termelésének csökkentésével járt együtt.

A hálózati farmakológiai eredmények azt mutatták, hogy a H. japonicum által okozott cholestaticus hepatitis kezelésének fő célpontjai a PTGS2, NOS3, PPARG, DPP4, BCL2 és TNF. A jelen vizsgálatban 5 célpont, a PTGS2, BCL2, TNF-, FXR és CYP7A1. amelyek cholestaticus hepatitishez, májfibrózishoz és májkárosodáshoz kapcsolódnak, molekuláris szintű kutatásra választották ki. A PTGS2, más néven ciklooxigenáz 2, az NF-KB útvonal downstream molekulája [31,32]. A PTGS2 részt vesz a gyulladások kialakulásában a sejtproliferáció elősegítésével, a sejt apoptózisának gátlásával, az angiogenezis elősegítésével és az immunműködés gátlásával. A TNF- fontos gyulladásos mediátor, amely részt vesz a kolesztázis folyamatában. Vizsgálatunkban a PTGS2, a TNF-fehérje és az mRNS expressziós szintje az ANIT-indukált cholestaticus májkárosodás modell patkányok májszöveteiben megemelkedett, ami arra utal, hogy a PTGS2 túlzott expressziója elősegítheti az akut májkárosodást és a májkárosodás kialakulását. kolesztázis.

A BCL2 egy fehérje, amely gátolja a sejt apoptózisát. Megakadályozza az oxidatív károsodást és a sejtkomponensek DNS-fragmentációját, és szabályozza az antioxidáns folyamatokat [33]. Emellett javítja a mitokondriális membránpotenciált és gátolja a citokróm C és az apoptózist indukáló faktorok mitokondriális felszabadulását azáltal, hogy befolyásolja a sejtmembrán transzportot, ezáltal gátolja a májsejtek apoptózisát és egyéb hatásokat [34,35].

Az FXR egy epesavreceptor, amely szabályozza az epesav homeosztázisát a májban [36]. Egy kis heterodimer chaperon által közvetített negatív visszacsatolási szabályozáson keresztül gátolja a CYP7A1 epesavszintézis-sebesség-korlátozó enzim aktivitását, és csökkenti az epesav szintézisét. Ugyanakkor az FXR képes fokozni a BSEP és MRP2 transzporterek expresszióját a hepatocita epevezeték oldalmembránján, felgyorsítva az epesavak kiválasztását és transzportját a májsejtek védelme érdekében [37,38].

Eredményeink azt mutatták, hogy a modellpatkányok nagy mennyiségű kólsav-pangást mutatnak az ANIT hatására, ami az FXR expresszió csökkenéséhez és ennek következtében a CYP7A1 expressziójának növekedéséhez vezet. Ezenkívül az FXR csökkent expressziója csökkentette az általa szabályozott downstream BSEP és MRP2 gének expresszióját. A kvercetin beavatkozás szignifikánsan helyreállította az FXR expressziós szintjét patkánymáj szöveteiben, és szabályozta downstream gének CYP7A1, BSEP és MRP2 expresszióját a modellcsoporttal ellentétes irányban. A tanulmány eredményei összhangban vannak a korábbi kutatási következtetésekkel.

Az ANIT által kiváltott cholestaticus hepatitis olyan biokémiai és kóros elváltozásokkal jár, amelyek hasonlóak az emberekéhez. Az egyetlen ANIT-kezelés kóros folyamata azonban jelen tanulmányban rövid volt, korlátozva a kutatást, amely általában hosszabb, 48-72 órás kísérleti időszakot igényel. Az ANIT többszöri szakaszos beadásával ez a hátrány kiküszöbölhető. A hagyományos kínai orvoslás hálózati farmakológiája a gyógyászati ​​anyagokban található kémiai összetételeket veszi kutatási tárgynak; a hagyományos kínai orvoslás gyógyszerhatékonyságában szerepet játszó kémiai anyagok azonban nem feltétlenül egyetlen komponensből állnak, mert a hatásos anyag lehet farmakodinámiás komponensek csoportja. Mivel a hagyományos kínai orvoslásban az anyagok célpontjai és útjai általában ismertek, az új mechanizmusok felfedezésének korlátai vannak. A jövőben a mesterséges intelligencia algoritmusait kombinálni lehet a hálózati farmakológiával, hogy átfogóbb és objektívebb információkat szerezzenek.

Következtetések

Összefoglalva, az olyan hatóanyagok segítségével, mint a kvercetin, a H. japonicum képes aktiválni az FXR-t, gátolni a CYP7A1-et, csökkenteni az epesav szintézisét a májsejtekben, és fokozni az epesav extrahepatikus kiválasztódását. Ezenkívül szabályozhatja a BCL2-t a mitokondriális membránpotenciál javítása érdekében, gátolja a hepatocita apoptózist és szabályozza az epesav homeosztázisát a májban. Továbbá a PTGS2, IL-1 és TNF- expressziójának gátlásával megzavarhatja a gyulladásos választ. Röviden, a hálózat farmakológiai elemzése szerint a kvercetin, a kaempferol és a tetra-metoxi-luteolin a H. japonicum fő hatóanyagai a cholestaticus hepatitis enyhítésében. A tanulmány eredményei alátámaszthatják a kvercetin, a kaempferol és a tetra-metoxiluteolin szerepét az emberi májbetegségben, valamint a PTGS2, BCL2, CYP7A1 és FXR gének szerepét a kolesztatikus hepatitisben.