Egy új Netrin{0}}eredetű peptid fokozza a neuronális halál elleni védelmet, és enyhíti az intracerebrális vérzést egerekben 1. rész

Absztrakt:

Beszámoltak arról, hogy a Netrin{0}} részt vesz a központi idegrendszer sérülését követő idegvédelemben. Azonban a Netrin-1 minimális funkcionális tartománya, amely megőrizheti az euróvédelmet, de elkerülheti a Netrin fő mellékhatásait, továbbra is megfoghatatlan.

A központi idegrendszer az egyik legfontosabb idegrendszer az emberi szervezetben, amely irányítja az emberek gondolkodását, érzéseit és cselekedeteit. A központi idegrendszer károsodása az emberek memóriáját is érinti. De ne aggódjon, tehetünk néhány pozitív módszert a memória helyreállítására.

Először is meg kell értenie a memóriakárosodás hatását. A központi idegrendszer károsodása hatással lehet az emberek kognitív képességeire, gondolkodási folyamataira és figyelmére, amelyek mindegyike közvetlenül befolyásolja az emberek memóriáját. Ezenkívül a központi idegrendszer károsodása érzelmi instabilitást is okozhat, ami hajlamosabbá teszi az embereket a pánikra, szorongásra és depresszióra, ezáltal befolyásolja a memória helyreállítását.

Bár a központi idegrendszer károsodása okozhat negatív hatásokat, tehetünk néhány pozitív intézkedést a memória helyreállítása érdekében. Először is kipróbálhatunk néhány kognitív tréninget, például olvasást, írást és rejtvényfejtést. Ezek a tevékenységek serkenthetik az agyat új neuronok termelésére, és segíthetik az agyat új emlékek és gondolkodásmódok felépítésében.

Másodszor, bizonyos fizikai gyakorlatokkal is elősegíthetjük a memória helyreállítását. Tanulmányok kimutatták, hogy a megfelelő testmozgás serkentheti az agyat új neuronok és neuronális kapcsolatok létrehozására, és elősegítheti az új információk agy feldolgozását. Ez az oka annak, hogy egyesek futás vagy séta közben hirtelen jó ötlettel állnak elő, vagy megoldanak egy nehéz problémát.

Végül figyelmet kell fordítanunk a helyes táplálkozásnak a memóriában betöltött szerepére. Az agy normál működéséhez szükség van néhány szükséges tápanyagra, például fehérjére, vitaminokra és nyomelemekre. Ha ételeinkből hiányoznak ezek a tápanyagok, az befolyásolja a memóriánkat és a gondolkodási képességünket. Ezért válasszunk étrendünkben néhány, ezekben a tápanyagokban gazdag élelmiszereket, mint például a hal, a sovány hús, a zöldségek és a gyümölcsök.

Röviden, a központi idegrendszer károsodása bizonyos hatással lesz az emberek memóriájára, de elősegíthetjük a memória helyreállítását megfelelő kognitív edzéssel, testmozgással és étrend-szabályozással. Remélem, mindenki pozitívan tud szembenézni az élet kihívásaival, megőrzi az optimista hozzáállást, és törekszik az egészséges központi idegrendszer és a jó memória helyreállítására. Látható, hogy javítanunk kell a memórián, a Cistanche pedig jelentősen javíthatja a memóriát, mert a Cistanche egy hagyományos kínai orvoslás, számos egyedi hatással, amelyek közül az egyik a memória javítása. A Cistanche hatékonyságát a benne található különféle hatóanyagok jelentik, beleértve a csersavat, poliszacharidokat, flavonoid glikozidokat stb., amelyek számos módon elősegíthetik az agy egészségét.

Kattintson a Tudás gombra a rövid távú memória javításához

Itt a Netrin-10 EGF3 doménjéből (407–422. aminosavak) származó E1 peptid europrotektív hatását vizsgáltuk. Úgy találtuk, hogy kölcsönhatásba lép a deletált kolorektális karcinómával (DCC), hogy aktiválja a fokális adhéziós kináz foszforilációt, amely neuroprotektív hatást mutat.

Az E1 peptid beadása javítani tudta a funkcionális helyreállítást a csökkent apoptózis révén az intracerebrális vérzés (ICH) kísérleti egérmodelljében.

Összefoglalva, feltárjuk a Netrin-1 funkcionális szekvenciáját, amely részt vesz az ICH utáni helyreállítási folyamatban, és azonosítjuk az ICH kezelésére szolgáló peptidjelölteket.

Kulcsszavak: intracerebralis vérzés; hemin; neuroprotekció; Netrin-1; peptid.

1. Bevezetés

Az intracerebrális vérzés (ICH) egy pusztító stroke-altípus, magas mortalitási és morbiditási rátával [1–3], amely az agyi vérerek rendellenes megrepedésével jár [4,5].

A hematómák műtéti eltávolítása előnyös a vérzéscsillapítás elérése és a koponyaűri nyomás csökkentése érdekében [6]. A visszamaradó hematikus maradványok és vérbomlási termékek azonban továbbra is elősegíthetik az ICH utáni másodlagos agysérülést, idegi károsodást indukálva és késleltetve a funkcionális helyreállítást [7–9].

Így a másodlagos agysérülés által kiváltott neuronális károsodást célzó hatékony stratégiák kidolgozása előnyös lenne a stroke kezelésében. A Netrin-1 az egyik legjobban tanulmányozott fehérje, amely receptoraival való kölcsönhatáson keresztül szabályozza az axonális irányítást és a szinaptogenezist [10–12] kolorektális rákban (DCC) és UNC5H-ban (koordinálatlan-5 homológ) törölve, hogy aktiválja a sejtek túlélését, differenciálódását és proliferációját [13–15].

A receptorok haláljelet indukálnak az apoptózis közvetítésére, ha a Netrin{0}} hiányzik [16]. Ismeretes, hogy a Netrin-1 kötődése DCC-vel a DCC dimerizációját eredményezi, és beindítja a fokális adhéziós kináz (FAK) tirozin 861 foszforilációját, ami neuritkinövést és axonális irányítást indukál [17,18].

A Netrin-1 DCC-vel való kötődése magában foglalja a Netrin-1 EGF3 doménjét és a DCC FN5 doménjét a Netrin-1 jelátviteli útvonal aktiválásában [19,20]. Nemrég kimutatták, hogy a Netrin{7}} neuroprotektív hatást fejt ki az ischaemiás régiókban [21].

A szérum Netrin{0}} expressziós szintje, amely gátolja a sejtapoptózist és elősegíti az idegsejtek regenerálódását, pozitívan korrelál a beteg ischaemiás stroke-ból való felépülésével [22,23].

Érdekes módon a Netrin{0}}-t kiválasztó csontvelői mezenchimális őssejtek transzplantációja a sérült patkány ülőidegbe beindítja az axonok regenerálódását [24] és csökkenti a motoros neuronok pusztulását [25]. A Netrin-1 fehérje sztereotaxikus injekciója a kamrákba a DCC/APPL1/AKT jelátvitel aktiválásával csökkenti az idegsejtek pusztulását subarachnoidális vérzés után [26].

A Netrin-1 EGF3 doménjéből (423–433. aminosavak) származó polipeptid jelentősen aktiválja az ERK foszforilációját, és elősegíti az NO termelődését, aminek kardioprotektív hatása van [27,28]. A Netrin-1-t azonban a daganatképződés potenciális biomarkereként azonosították [29–31], mivel a Netrin-1 státusz szabályozása többféle szöveti eredetű rák esetében is megtalálható [32].

Amikor a Netrin-1 a DCC-hez vagy az Unc5H-hoz kötődik, a receptorok pozitív jelet adnak át, ami túléléshez, gyulladáshoz, angiogenezishez és antiapoptózishoz vezet, ami viszont szabályozza a daganatképződést [31].

Ezért nagyon fontos azonosítani a Netrin-1 minimális funkcionális doménjét, amely megőrizheti az idegrendszer védelmét és elkerülheti a Netrin-1 fő mellékhatásait. Itt azt találtuk, hogy az E1 peptid (407–422. amely a Netrin-1 EGF3 doménjéből származik, kölcsönhatásba lép a DCC-vel, hogy megvédje a neuronokat a hemin által kiváltott toxicitástól.

Az ICH egerek kísérleti modelljében az E1 peptid alkalmazása javította a funkcionális helyreállítást, amint azt viselkedési tesztekkel határozták meg. Ezenkívül az E1 peptid megakadályozhatja a neuronok degenerálódását az ICH után.

Ezen eredmények alapján azonosítottuk a Netrin-1 funkcionális szekvenciáját, amely részt vesz az ICH utáni felépülésben, és megállapítottuk, hogy ez a peptid felhasználható ICH kezelésére.

2. Eredmények

2.1. Az EGF3 tartomány kritikus fontosságú a Netrin-DCC kölcsönhatás szempontjából

A Netrin-1 egy VI-doménből, három EGF-ismétlődésből és egy C-terminális doménből áll [33]. A humán Netrin-1/DCC komplex kristályszerkezete feltárja, hogy a Netrin-1 EGF3 domén kulcsfontosságú a Netrin-1/DCC kölcsönhatás szempontjából, az EGF1 és EGF2 domének viszont nem [34].

A kulcsfontosságú aminosavak (His407, Gln442 vagy Gln443) mutagenezise az EGF3 doménben teljesen megzavarta a Netrin-1/DCC kötődést [19]. EGF1/2 domének szükségesek ahhoz, hogy a vonzó jelzést taszító jelzéssé váltsák, amikor az Unc5 és a DCC együtt létezik [20].

Így először létrehoztunk teljes hosszúságú és EGF3-deletált (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1 konstrukciókat (1A ábra), és ezeket a konstrukciókat átmenetileg expresszáltuk tenyésztett HEK293T sejtekben a GSTpulldown céljára. .

A kötődést azoknál a konstrukcióknál figyelték meg, amelyek a Netrin-1-t expresszálták, de a Netrin-1(∆407–443)-t nem (1C. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az EGF3 407–443. aminosavakat tartalmazó doménje felelős a Netrin-1 és a DCC közötti kölcsönhatásért. Az EGF3 domén Netrin-DCC-ben betöltött szerepének vizsgálatához először tisztítottuk a myc-taggedNetrin{12-t. }} vagy csonka Netrin-1 (∆407–443) (1B. ábra).

Ezután a HEK293T sejteket DCC cDNS-t hordozó plazmiddal transzfektáltuk, és Netrin-1 fehérjével inkubáltuk, majd a Netrin-1 kötődését immunfestéssel értékeltük.

Azt találtuk, hogy a teljes hosszúságú Netrin-1, de a csonkolt Netrin-1 képes kötődni a DCC-hez a plazmamembránon (1D. ábra). Annak meghatározására, hogy az EGF3 domén kölcsönhatásba léphet-e a DCC-vel, létrehoztunk egy GST-EGF3 konstrukciót, amely lebontja a DCC-t túltermelő lizált sejteket. Megfigyeltük a DCC specifikus kötődését GST-EGF3-mal (1E. ábra).

Ezenkívül szintetizáltuk a FITC-vel jelölt EGF3 peptidet, és megerősítettük, hogy a teljes hosszúságú Netrin-1-hoz hasonlóan képes kötődni a DCC-hez a plazmamembránon (1F. ábra). Összességében adataink azt mutatják, hogy az EGF3 domén felelős a Netrin-1 és a DCC közötti kölcsönhatásért.

2.2. Az EGF3 domén a Netrin downstream útvonalainak foszforilációját indukálja-1

A Netrin{0}} és a DCC kölcsönhatása több jelátviteli útvonalat aktivál, beleértve a FAK-ot, az SFK-t és az ERK-t [16,35]. A fokális adhéziós kináz (FAK) az egyik legfontosabb tirozinfoszforilációs tevékenység, amely a Netrin-1/DCC jelátvitelhez kapcsolódik.

A netrin-1 aktiválja a FAK-foszforilációt és az Src család protein-tirozin-kinázainak (SFK-k) foszforilációját [17]. Mind a FAK, mind az SFK jelátviteli útvonalak kulcsszerepet játszanak az idegrendszer fejlődési szakaszában és a sérülések helyreállításában [36,37]. Ezenkívül a Netrin-1 aktiválhatja az extracelluláris szignál által szabályozott kinázt-1/2 (ERK1/2), amely a mitogen-aktivált proteinkináz (MAPK) útvonal működését közvetíti [38–40].

Annak vizsgálatára, hogy az EGF3 domén kritikus fontosságú-e a downstream jelátviteli utak aktiválása szempontjából a Netrin-1 DCC-hez való kötődése révén, először megvizsgáltuk az EGF3 domén hatását a FAK tirozin 861 foszforilációjára (2A. ábra). . Azt találtuk, hogy az EGF3 deléciója gátolta a FAK foszforilációját a tenyésztett kérgi neuronokban (2B, C ábra), így megerősítve az EGF3 alapvető szerepét a Netrin-1 jelátviteli útvonalban.

Ezután a tenyésztett kérgi neuronokat GST-EGF3 fúziós fehérjével stimuláltuk 20 percig, és a Western blotting tovább erősítette, hogy a GST-EGF3 fúziós fehérjével végzett kezelés FAK, ERK és SFK foszforilációt indukált (2D-G ábra).

Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Netrin-1 EGF3 doménje potensstimulátorként működik a downstream jelátviteli útvonalak aktiválásában.

1. ábra. A Netrin-1 EGF3 tartománya a Netrin-1/DCC interakció kritikus régiója. (A) A Netrin-1konstrukciók illusztrációi. A Netrin-1 konstrukciók a Netrin-1 teljes hosszúságúak, a Netrin-1-(∆407–443) és a GST-EGF3. (B) A tisztított Netrin-1-(∆407–443)-Myc/His mennyiségét a BSA standard görbével való összehasonlítással határoztuk meg. (C) A lehúzható frakció immunoblotja a GST-DCC FN5 domén fúziós fehérjével és önmagában a GST-vel. (D) 293T-sejteket expresszáló Flag-DCC immunfluoreszcens képei, amelyeket kontroll tápközeggel, Netrin-1-myc/his-szel és Netrin-1-(∆407–443)-Myc/his-szel 30 percig inkubáltunk, és a kvantitatív elemzés. Skála, 10 µm. (E) A pull-down frakció immunoblotja a GST-EGF3 fúziós fehérjével és a GST-vel. (F) Kontroll tápközeggel és FITC-vel jelölt Pep EGF3-mal 30 percig inkubált Flag-DCC-t expresszáló 293T-sejtek immunfluoreszcens képei, valamint a kvantitatív elemzés. Skála, 10 µm.

2. ábra: Az EGF3 domén aktiválja a Netrin-1 downstream útvonalait. (A) Kísérleti eljárás. (B) A kérgi neuronokat (E17 és DIV3) Netrin-1, Netrin-1-(∆407–443) vagy kontroll tápközeggel stimuláltuk 20 percig. A sejtlizátumokat anti-p-FAK{12}} antitesttel inkubáltuk a Netrin-1 aktivitás megerősítésére. (C) A Western blot eredmények kvantitatív analízise a (B) részben látható. n=3. (D) A kérgi neuronokat (DIV3) 1,5 µM GST-vel (+), 1,5 µM GST-EGF3 fúziós fehérjével (+) vagy 1,5 µMNetrin-1 (+) tápközeggel kezeltük 20 percig. A sejtlizátumokat anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 és anti-p-ERK-202/204-vel inkubáltuk.(E–G) A nyugati sejtek kvantitatív elemzése blot eredmények láthatók (D). n=3. Az adatokat átlag ± SEM formában adjuk meg. Az ábrán látható összes statisztikai elemzéshez egyutas ANOVA-t használtunk (* p < 0,05, ** p < 0,01; ns, nem szignifikáns). Az adatelemzés részletei az S1 kiegészítő táblázatban láthatók.

2.3 Az E1 és E2 peptid kölcsönhatásba lép a DCC-vel, hogy aktiválja a Netrin downstream jelátviteli útvonalát-1

Amint azt korábban leírtuk, a Netrin-1 EGF3 doménjéből (423–433. aminosavak) származó kis peptid ERK foszforilációt indukált [27]. Megszintetizáltuk az E1 (407–422. oldalláncok) és E2 (423–433. oldalláncok) peptideket, amelyek a Netrin-1 EGF3 doménjéből származnak (3A. ábra).

Azt találtuk, hogy az E1 peptid inkubálása dózisfüggő módon növelte a foszforilált FAK és SFK (3B, D, E ábra) szintjét a tenyészetben, de nem változtatta meg a foszforilált ERK szintjét (3B, F ábra).

A peptidE1-től eltérően az E2 peptid nemcsak a FAK tirozin foszforilációját (3C, G ábra) és az SFK tirozin foszforilációját indukálta (3C, H ábra), hanem az ERK tirozin foszforilációját is indukálta (I. ábra) a corns, corns neuronkultúrában.

A kontroll peptidnek (Pep Ctrl) nem volt kimutatható hatása a FAK, SFK és ERK tirozin foszforilációjára (S1 ábra). Továbbá megfigyeltük, hogy az E1 peptid által kiváltott FAK jelátviteli útvonal komponenseinek foszforilációja időfüggő (ábra). S2). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az E1 és E2 a Netrin-1 minimális funkcionális peptidjei.

3. ábra. Az EGF3 domén minimális szekvenciái aktiválják a Netrin-1 downstream útvonalait. (A) A peptidek illusztrációi. (B) A kérgi neuronokat (DIV3) az E1 peptid gradiens koncentrációival stimuláltuk. A sejtlizátumokat anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 és anti-p-ERK-202/204-gyel inkubáltuk. (C) A tenyésztett kérgi neuronokat az E2 peptid gradiens koncentrációjával kezeltük.

A lizátumokat összegyűjtöttük és a jelzett antitestekkel inkubáltuk a FAK, SFK és ERK foszforilációjának mérésére. (D-F) Az E1 peptid által neuronokban indukált FAK, SFK és ERK foszforiláció mértékének mennyiségi meghatározását a (B) mutatja. n=3. (G–I) Az E2 peptid által kiváltott FAK, SFK és ERK foszforiláció mértékének mennyiségi meghatározása a (C) részben látható. n=3. (J) A DCC vad típusú és homozigóta mutantembrióiból származó kérgi neuronokat Netrin-1 vagy Netrin-1- eredetű peptidekkel stimuláltuk, és lizáltuk.

A kapott lizátumokat immunblotnak vetettük alá. (K) A FAK PY{{0}} és a DCC szintjének mennyiségi meghatározását DCC mutáns neuronokban a (J) mutatja. n=3. Az adatokat átlag ± SEM-ként adjuk meg. Az ábrán látható összes statisztikai elemzéshez egyutas ANOVA-t használtunk (* p < 0,05;ns, nem szignifikáns). Az adatelemzés részletei az S1 kiegészítő táblázatban láthatók.

Annak megállapítására, hogy a FAK jelátviteli útvonal aktiválása DCC-függő-e, megmértük a FAK tirozin foszforilációjának mértékét, amelyet ezen peptidek indukáltak DCC+/+ és DCC−/− neuronokban. Azt találtuk, hogy az E1 és E2 peptidek sem indukálták a FAK foszforilációját a DCC-/- neuronokban (3J, K ábra).

Azt is megállapítottuk, hogy a szintetizált N-terminálisan Flag-címkézett E1 és E2 peptidek (Flag-E1 és Flag-E2) közvetlenül kötődnek a DCCFN5 doménhez (S3. ábra).

2.4. Az E1 peptid megvédi a neuronokat a hemin által kiváltott sejthaláltól in vitro

Az E1 peptid neuronális károsodásával szembeni védelme érdekében Hemin-indukálható toxicitási reakciót alkalmaztunk az intracerebrális vérzés utáni másodlagos agysérülés utánzására [41,42].

A tenyésztett GnRH-t expresszáló neuronális sejteket (NLT) [43–45] különböző koncentrációjú és időtartamú heminnel inkubáltuk. Az NLT-sejtek inkubálása a mediális halálos dózisban (60 µM) a sejtek túlélési arányának időfüggő csökkenését eredményezte, ami arra utal, hogy a hemint a neuronok felvették és metabolizálták (S4 ábra).

Annak vizsgálatára, hogy a Netrin{0}} és a DCC expressziója reagál-e a hemin által kiváltott neuronális sejthalálra, tenyésztett NLT sejteket inkubáltunk heminnel különböző időtartamokig. A Western blot eredmények azt mutatták, hogy a Netrin-1 és a DCC expressziós szintjei szignifikánsan megemelkedtek a hemin inkubáció után 6 órával, majd fokozatosan csökkentek (4A, B ábra).

Annak vizsgálatára, hogy az E1 és E2 peptidek képesek voltak-e gyengíteni a hemin által kiváltott neuronhalált, CCK-8 vizsgálatot végeztünk Netrin-1, PepCtrl, E1 és E2 peptidekkel.

Azt találtuk, hogy ezeknek a peptideknek nincs kimutatható hatása a sejtek életképességére (4C. ábra és S5. ábra). A Pep Ctrl-vel és peptidE2-vel végzett inkubációhoz képest az E1 peptid és a Netrin{4}} enyhítette a hemin által kiváltott neuronhalált (4D. ábra). Calcein-AM-mel és PI-vel is festettük az élő és elhalt sejteket.

Az eredmények azt mutatták, hogy mind a Netrin{0}}, mind az E1 peptid védett a hemin által kiváltott halállal szemben in vitro (4E–G ábra). Ezenkívül 1,5 µM E1 peptid enyhítette a hemin által kiváltott halált az elsődleges tenyésztett neuronokban (4H, I. ábra). Összességében ezek az eredmények azt mutatták, hogy az E1 peptid megvédi a neuronokat a hemin által kiváltott sejthaláltól.

2.5. A Netrin-1-E1 származékos peptid elősegíti az ICH utáni funkcionális helyreállítást

Annak vizsgálatára, hogy a Netrin-1-ból származó E1 peptid fontos szerepet játszik-e a vérzéses stroke utáni infunkcionális felépülésben, kísérleti ICH modellt hoztunk létre úgy, hogy tintával kevert kollagenázt fecskendeztünk a striatumba (S6A ábra).

Három nap elteltével az agyszelet képeit mutatták be, hogy tintával nyomon követhessék az injekció pozícióját és a kollagén-fejlődés mennyiségét (S6B, C ábra). A striatális vérzéses egerek agysérülése miatt gyengeséget mutattak az azonos oldali oldalon (S7A–C ábra).

Az ICH-t követő striatumban a hematóma látható volt a sóoldat injekciójához képest (S7D ábra). A perihematomális kéregben a Netrin-1 és a DCC relatív fehérjeszintje megemelkedett ICH egerekben a kontroll egerekhez képest a 2. napon, és a Netrin-1 még mindig szignifikánsan magasabb volt a 3. napon, ami azt jelzi, hogy a Netrin-1 fontos az agysérülés gyógyulásához (S7E, F ábra).

Ezután FITC-jelölt TAT-peptid E1 (FITC-Pep TE1), amely hozzáadta az E1 peptid N-terminálisának TAT-szekvenciáját, injektáltuk az ICH egerekbe, és kimutatták, hogy a FITC-Pep TE1 átjut a vér-agy gáton. S8 ábra).

Az ICH és a kontroll egereket intraperitoneálisan injektáltuk peptiddel (12 mg/kg) naponta vagy azonos térfogatú sóoldattal (5A. ábra). Azt találtuk, hogy a TE1 peptiddel történő beadás javította a túlélési arányt és megmentette a testtömeg-hibákat az ICH után (5B, C ábra).

Azt is megállapítottuk, hogy az egyenlő arányú tintával nyomon követett kollagenáz-fejlődési mennyiség minden csoportban hasonló volt, megerősítve, hogy a kollagenáz standard ICH-modellje reprodukálható intrastriatális hematómákat eredményezett (5D. ábra). A TE1 peptid javította az ICH egerek viselkedési pontszámait a szalageltávolítási tesztben (5E. ábra). ) és hengervizsgálat (5F. ábra).

Ahogy az várható volt, a TE1 peptid csökkentette az infarktus mennyiségét az ICH után (5G. ábra, H). Összességében ezek az eredmények arra utalnak, hogy az E1 peptid képes volt csökkenteni a hematóma térfogatát és javítani a funkcionális helyreállítást az ICH egérmodelljében.

4. ábra. Az E1 peptid in vitro javítja a hemin által kiváltott sejthalált. (A) Netrin-1 és DCC Western-blotja Heminnek (60 µM) kitett tenyésztett NLT-sejtekben. (B) A Western-blot-eredmények kvantitatív elemzését az (A) mutatja. n=3. (C) A CCK-8 vizsgálatok azt mutatták, hogy a peptidsorozatok nem változtatták meg a sejtek életképességét. n=4. (D) Az 1,5 µM Pep E1 megőrizte az NLT-sejtek életképességét, ha jóval heminnel való érintkezés után adtuk hozzá (60 µM). n=4. (E) Élő (zöld)/halott (piros) NLT-sejtek vizsgálata heminnel (60 µM, 6 óra). Skála, 50 µm. (F, G) Az élő/halott vizsgálat kvantitatív elemzése (E). n=9. A (H) CCK-8vizsgálatok kimutatták, hogy a Pep E1 csökkentheti a hemin által kiváltott sejthalált az elsődleges tenyészet neuronjaiban. n=8.(I) Elsődleges kultúra neuronjainak élő/halott vizsgálati képalkotása (50 µM, 6 óra). Skála, 50 µm. Az adatok átlag ± SEM. Az ábrán látható összes statisztikai elemzéshez egyutas ANOVA-t vagy kétutas ANOVA-t használtunk (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, nem szignifikáns). Az adatelemzés részletei az S1 kiegészítő táblázatban láthatók.

5. ábra. A netrin-1-eredetű E1 peptid elősegíti az ICH utáni felépülési folyamatot. (A) A TE1 peptid intraperitoneális (IP) injekciójának kísérleti paradigmájának vázlata egerek ICH modellezésében. (B) Minden csoportban feljegyeztük az ICH utáni túlélési arányt, és a Kaplan-Meier módszert alkalmaztuk. n=10. (C) A testtömeg megváltozik az ICH után 5 nappal. n=6.(D) Kollázs/sóoldat keverék egyenlő arányú tintával (összesen 0,6 µL) C57 egerek striatumába injektálva, a reprezentatív képeken a tintaterület hasonló volt a kezelt egereknél peptid nélkül TE{12}} nappal az ICH után. (E, F) TE1 peptid (12 mg/kg) IP-injektálása, de nem TAT (12 mg/kg) kontroll, javított viselkedés szalageltávolítási feladattal (E) vagy sarokfeladattal (F).

Sóoldat,n=10 egyedi állatok; ICH, n=6 egyedi állatok; ICH + TAT, n=6 egyedi állat; ICH + TE1, n=8 egyedi állat. (G) Reprezentatív hematoxilinnel és eozinnal festett metszetek TE peptiddel vagy peptid nélkül kezelt egerekben 1 5 nappal az ICH után. Skála, 1 mm. (H) A vérzés térfogatának mennyiségi meghatározása a (G) ábrán látható agymetszetekben.

Sóoldat, n {{0}} egyedi állat; ICH, n=6 egyedi állatok; ICH + TAT, n=6 egyedi állat; ICH + TE1, n=8 egyedi állat. Az adatok átlag ± SEM. Az ábrán látható összes statisztikai elemzéshez egyutas ANOVA-t vagy kétutas ANOVA-t használtunk (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, nem jelentős). Az adatelemzés részletei az S1 kiegészítő táblázatban láthatók.

2.6. Netrin-1-A származékos E1 peptid csökkenti a neuronális apoptózist az ICH után

Az E1 peptid mögött meghúzódó mechanizmusok feltárása az ICH funkcionális helyreállításának folyamatában. Fluoro-jade C (FJC) festéssel neuronális degenerációt mutattunk ki a perihematomális régióban.

Azt találtuk, hogy a TE1 peptid beadása szignifikánsan csökkentette az FJC-pozitív sejtek számát a perihematoma régiókban, ami azt jelzi, hogy a pep TE1 gátolta az ICH utáni neuronális degenerációt (6A, B ábra). TUNEL festést végeztünk, és azt találtuk, hogy a TE1 peptid szignifikánsan csökkentette a TUNEL-pozitív neuronok számát (6C, D ábra).

A TUNEL-pozitív asztrociták számában nem volt kimutatható változás a TE1 peptides kezelés után (6E, F ábra). Ezen túlmenően, amikor FITC-vel jelölt 4 kDa-os dextránt használtunk nyomkövetőként a vér-agy gát (BBB) ​​permeabilitásának jelzésére, azt találtuk, hogy a TE1 peptid nem befolyásolta a BBB permeabilitás helyreállítását (S9A, B ábra).

A szérum nyers fluoreszcens egységek (RFU) szintjei hasonlóak voltak, megerősítve az injektált nyomjelző jelenlétét az összes elemzett állatban (S9C ábra). Fluoreszceinnel jelölt lektint is használtunk a mikroerek jelölésére, de nem tapasztaltunk javulást a TE1 kezelés után (S9D, E ábra). Ezek az eredmények mindenekelőtt azt sugallják, hogy az E1 peptid elősegíti a neuronok felépülését az ICH után azáltal, hogy gátolja a neuronális apoptózist.

6. ábra: A netrin-1-eredetű E1 peptid védelmet nyújthat a neuronok halála és degenerációja ellen, de az asztrociták nem védenek az ICH után.(A) Reprezentatív Fluoro-jade C-festett metszetek TE1-gyel kezelt egerekben vagy TE1 nélkül 5 nappal az ICH után. Skálasáv, 50 µm, illetve 10 µm. (B) Fluoro-jade C pozitív sejtek mennyiségi meghatározása a perihematomális régióban (n=4). (C) TUNELfestés, amely a TE1 hatását mutatja a másodlagos agysérülésre (SBI) 5 nappal az ICH megjelenése után. Reprezentatív képek a Saline, ICH, ICH + TAT és ICH + TE1 csoportból.

Mindegyik csoportot ICH-nak vetettük alá, kivéve a sóoldat csoportot. Skálasáv, 50 µm, illetve 10 µm. (D) A TUNEL-pozitív neuronok százalékos arányára vonatkozó kvantitatív elemzéseket a (C) mutatja. n=4. (E) A TUNEL kolokalizációja GFAP-val az ICH után 5 nappal. Reprezentatív képek a Saline, ICH, ICH + TAT és ICH + TE1 csoportból. Skálasáv, 50 µm, illetve 10 µm. (F) A TUNEL-pozitív asztrociták százalékos arányára vonatkozó kvantitatív elemzéseket az (E) mutatja. n=4. Az adatokat átlag ± SEM formában adjuk meg.

Az ábrán látható összes statisztikai elemzéshez egyutas ANOVA-t használtunk (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, nem szignifikáns). Az adatelemzés részletei az S1 kiegészítő táblázatban láthatók.

3. Megbeszélés

Vizsgálatunk azonosította a Netrin-1 mag peptidszekvenciáját, amely kulcsfontosságú az ICH utáni funkcionális helyreállításhoz. A DCC-vel való kölcsönhatás révén ez a Netrin{1}}eredetű peptid védelmet nyújt az ICH utáni másodlagos károsodás miatti neuronhalál ellen, és így ígéretes kezelés az ICH számára.

A Netrin-1, egy nagy molekulatömegű fehérje terápiás alkalmazása megköveteli a Netrin-1 minimális funkcionális szekvenciájának azonosítását, amely elősegíti a downstream jelátvitelt. Vizsgálatunk során az E1 (407–422. aminosavak) és E2 (423–433. aminosavak) peptideket állítottuk elő, amelyek a Netrin-1 EGF3 doménjéből származnak. Megállapítottuk, hogy az E1 peptid (407–422. aminosavak) védelmet nyújtott az idegsejtek halálával szemben az ICH után.

Azt találtuk, hogy a Netrin{0}} és a DCC expressziós szintje megemelkedett az NLT sejtekben a hemin kezelés után. A hemin felszabadul a hemoglobinból az ICH után, és másodlagos sérülést okoz mind a glia-, mind az idegsejtekben [46–48].

Ezenkívül a kísérleti ICH-t követően a Netrin{0}} és a DCC megnövekedett fehérjeszintjét is megfigyeltük. Ezenkívül a netrin-1 és a DCC megnövekedett fehérjeszintjét is megfigyeltük a kísérleti ICH-t követően.

Ezek az eredmények összhangban vannak a korábbi eredményekkel, amelyek azt mutatják, hogy a netrin{0}} fontos szerepet játszik az ICH utáni felépülésben [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com