Absztrakt

Ez a tanulmány egy képdigitalizáláson alapuló vékonyréteg-kromatográfiás (TLC) módszert hozott létre négy fő fenil-etanol-glikozid (PhG) gyors, egyszerű és olcsó kimutatására Cistanche-ban. A négy PhG-t 50%-os metanollal extraháltuk, és poliamid lemezen elválasztottuk metanol-kloroform-jégecet-víz (3,5:1,5:1:7, V/V/V/V) mozgófázissal. A foltképeket 365 nm-es UV-fényben rögzítettük, és az ImageJ szoftverrel digitálisan elemeztük, amely integrált szürke értékeket generált a gyors kvantitatív elemzéshez. A módszer kiváló linearitást mutatottechinakozid, tubulozid A, akteozid és izoakteozid, a korrelációs együttható (r) rendre 0,9974, 0,9931, 0,9923 és 0,9890. A megtérülések 87,1% és 96,5% között, 88,4% és 109,7% között, 94,1% és 105,1% között, illetve 97,0% és 115,1% között változtak. Az ezzel a módszerrel kapott kvantitatív eredmények összhangban voltak a nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) eredményekkel. Ez a tanulmány gyors és pontos módszert kínál négy kulcsfontosságú PhG kvantitatív elemzésére Cistanche-ban.

Kulcsszavak:Cistanche tubulosa; feniletanoid-glikozidok; vékonyréteg-kromatográfia; ImageJ; gyors cistanche minőségelemzés

 

Cisztanche kivonat magas echinakozid tartalommal

 

 

 

 

1. Bevezetés

A Cistanche az Orobanchaceae családba tartozó évelő parazita gyógynövény, elsősorban Kína Xinjiang, Belső-Mongólia és Ningxia régióiban található. Gyógyászati ​​és ehető értékű növényi erőforrásként szárított zamatos szára számos iparágban jelentős gazdasági potenciált mutatott be. A különféle Cistanche fajok közülCistanche deserticolaésCistanche tubulosahivatalosan szerepelnek aKínai Gyógyszerkönyv, míg mindkét faj, együttCistanche salsa, a "Nikujuyou" nyers gyógyszerként ismerik el a Japán Gyógyszerkönyvben. Ezenkívül a Cistanche kulcsfontosságú szerepet játszik a száraz régiók ökológiai környezetének javításában, mivel a tápnövényekkel való együtt ültetése jelentős ökológiai és gazdasági előnyökkel jár a sivatagi és félsivatagos területeken.

 

Cistanche kivonat meghatározott flavonoid tartalommal

A hagyományos kínai orvoslásban (TCM) a Cistanche-t kiváló tonikként tartják számon. 2020-ban új élelmiszer-összetevőként engedélyezték Kínában, jelentősen bővítve piacát és termékfejlesztését. A Cistanche-t nemcsak a vese-yang-hiány, a vér- és esszenciakimerülés, az impotencia és a meddőség, valamint a székrekedés kezelésére használják, hanem ígéretes lehetőségeket mutat a májfibrózis kezelésében is. A kémiai összetételű vizsgálatok a fenil-etanol-glikozidokat (PhG-k) azonosították a Cistanche egyik fő aktív komponenseként. Ezek a vegyületek – beleértve az echinakozidot, az akteozidot, a tubulozid A-t és az izoakteozidot – számos farmakológiai hatást mutatnak, beleértve az öregedésgátló, antioxidáns, fáradtság elleni és hashajtó tulajdonságokat. Az echinakozid és az akteozid a gyógyszerkönyvi szabványokban szereplő Cistanche minőség-ellenőrzésének hivatalos markerkomponensei. A tubulozid A jelentős gyulladáscsökkentő és antioxidáns hatást mutat, míg az izoakteozid kognitív javulással és citoprotektív hatással jár.

Hagyományos analitikai módszerek PhG-k számáraa Cistanche-ban a nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (HPLC), az ultra-nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (UPLC) és a folyadékkromatográfiás tömegspektrometriát (LC-MS) tartalmazza. Ezek a módszerek azonban drága műszerezést igényelnek, időigényes minta-előkészítést igényelnek, és magasan képzett kezelőket igényelnek. Bár a közeli infravörös (NIR) spektroszkópia gyors és roncsolásmentes alternatívát kínál, még mindig nagy NIR-műszerektől függ, és nem könnyen hordozható. Következésképpen égető szükség van egy alacsony költségű, könnyen kezelhető és hordozható módszerre, amely alkalmas helyszíni kvalitatív és kvantitatív elemzésre, különösen az elsődleges tesztelési alkalmazásokhoz.

Az elmúlt években a számítógépes látástechnológia fejlődése lehetővé tette a képfelismerést és -feldolgozást a hagyományos analitikai technikák továbbfejlesztéséhez, így a TLC hatékony kvantitatív módszerré vált. Ez a megközelítés a mintafoltok szürkeértékét a koncentrációjukkal korrelálja. Az ImageJ, egy nyílt forráskódú képfeldolgozó szoftver, kiemelkedik felhasználóbarátságával és sokoldalúságával. Például Bai et al. kifejlesztett egy TLC-ImageJ módszert az aminovajsav (GABA) mennyiségi meghatározására rizsben, igazolva ennek a megközelítésnek a képalapú kvantitatív elemzésben való megvalósíthatóságát.

Ebben a vizsgálatban négy fő PhG-ről készítettünk TLC-foltot Cistanche-ban, lineáris kapcsolatot állítottunk fel a PhG-tartalom és az integrált szürkeértékek között, és mind a négy vegyület kvantitatív elemzését elvégeztük. Ez a megközelítés új megoldást kínál a helyszíni gyors, alacsony költségű észleléshez, és széles körű alkalmazási lehetőséget rejt magában.

A Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd.-ről- a világ legnagyobb Cistanche feldolgozó vállalata, 200 000 hektáros Cistanche termesztési bázissal, egy GMP gyárral, amely évente 20 000 tonna friss Cistanche feldolgozására képes, és több mint 14 szabadalommal rendelkezik a Cistanche extrakciós technológiákhoz, beleértve a fejlett membránelválasztó technológiát. A Hotanból, Xinjiangból származó Cistanche kivonatokra specializálódtunk, termékeink megfelelnek az Egyesült Államok és az Európai Unió nemzetközi minőségi előírásainak. Ami fontos, arra koncentrálunkCistanche tubulosakivonat, amely természetesen magasabb feniletanoid-glikozid-tartalmat tartalmaz, beleértve az echinakozidot, az akteozidot, a tubulozid A-t és az izoakteozidot, így kiváló választás a táplálkozási és funkcionális élelmiszeripari alkalmazásokhoz.

 

Cistanche kivonat meghatározott akteozid tartalommal

2. Anyagok és módszerek

2.1 Műszerek és reagensek

Felszerelés:1000T többfunkciós daráló (MinYe Industry and Trade Co., Yongkang, Kína); AB135-S analitikai mérleg (Mettler-Toledo, Svájc); GAMAG LINOMAT 5 félautomata spotter (CAMAG, Svájc); UV lámpa (CAMAG, Svájc); 1200 sorozatú HPLC rendszer (Agilent, USA); Advanced-III-18W ultratiszta vízrendszer (Tang's Kangning Technology, Chengdu, Kína); poliamid TLC lemezek (10 cm × 10 cm, 10 cm × 20 cm; Sijia Biochemical Plastics, Taizhou, Kína); ikervályús előhívó kamra (200 mm × 200 mm).

Reagensek:Metanol (analitikai minőségű, Beilian Fine Chemicals, Tianjin, Kína); metanol és acetonitril (kromatográfiás minőségű, Sigma-Aldrich, Shanghai, Kína); jégecet (analitikai minőségű, Zhiyuan Chemical Reagents, Tianjin, Kína); hangyasav és kloroform (analitikai minőségű, Damao Chemical Reagents, Tianjin, Kína); ultratiszta víz. Echinakozid, tubulozid A, akteozid és izoakteozid referenciastandardok (tisztaság 98%-nál nagyobb vagy egyenlő, Yinglai Technology, Peking, Kína).

Minták:A friss Cistanche mintákat Xinjiangból (Kína) szerezték be, és a Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd. dolgozta fel. Összesen 51 tételCistanche tubulosaés 8 tételCistanche deserticolaösszegyűjtöttük, felszeleteltük, megszárítottuk, porrá őröltük és tárolásra lezártuk.

Képszerzés:iPhone 15 Pro (12 MP felbontás, F2.2 rekesz, 2× optikai zoom).Képdigitalizáló szoftver:F Color Picker (Deweibo) és ImageJ (1.54p verzió, National Institutes of Health, USA).

2.2 Kísérleti módszerek

2.2.1 Referencia standard oldatok elkészítése

Az echinakozid, tubulozid A, akteozid és izoakteozid referenciastandardokat pontosan lemértük, feloldottuk 50%-os (V/V) metanolban, és térfogatra hígítottuk 10 ml-es lombikokban, így 1,003, 1,007, 1,004, illetve 1,004 mg/m koncentrációjú törzsoldatokat kaptunk.

Mindegyik törzsoldat alikvotjait (2 ml echinakozid, 0,5 ml tubulozid A, 1 ml akteozid, 0,5 ml izoakteozid) átvittük egy 10 ml-es lombikba, térfogatra hígítottuk 50%-os metanollal, és 0,22 μm-es vegyes referenciamembránon átszűrtük, 0,0-es kevert standard membránon. 52,40, 101,12 és 51,14 ug/ml.

2.2.2 Vizsgálati mintaoldatok elkészítése

A Cistanche mintákat felszeleteltük, szárítottuk és őröltük, hogy átmenjenek egy 0,425 mm-es szitán. A C. tubulosa port (0,5 g) vagy a C. deserticola port (1,0 g) pontosan lemértük, összekevertük 30 ml 50%-os metanollal, 40 percig ultrahanggal kezeltük, majd újra lemértük, hogy kompenzáljuk a súlyvesztést. Az oldatot 0,22 μm-es membránon átszűrtük, hogy megkapjuk a vizsgálati mintaoldatot.

2.2.3 TLC Developing Solvent Selection

Az oldószer polaritása, az elúciós erősség és az előzetes kísérleti eredmények alapján három fejlődő oldószerrendszert értékeltek:

1. rendszer: Metanol-jégecet-víz (2:1:7, V/V)

2. rendszer: Metanol-kloroform-jégecet-víz (2:1,5:1:7, V/V)

3. rendszer: Metanol–kloroform–jégecet–víz (3,5:1,5:1:7, V/V)

A kevert referencia standard oldat és a vizsgálati minta oldat alikvotjait (egyenként 5 μl) sávként vittük fel poliamid TLC lemezekre. Az előhívás után a lemezeket megszárítottuk, és kiszámítottuk a retardációs tényezőket (Rf értékek).

2.2.4 Képgyűjtés és -feldolgozás

A vékonyréteg-kromatográfiás lemezeket rögzítettük és 365 nm-es UV-fényben vizsgáltuk. Egy állványra szerelt iPhone 15 Pro készüléket használtak a képek egységes szögből és magasságból történő rögzítésére. F Color Picker és ImageJ szoftvert használtak a digitális kvantitatív elemzéshez, a TLC-képek RGB-értékekké, csúcsterületekké és integrált szürkeértékekké alakításához. A háttérkivonást és a képfordítást az ImageJ segítségével végeztük. A képeket ezután 8 bites szürkeárnyalatossá alakították, újrafordították, és a megjelenítés érdekében beállították a kontrasztot. A célsávokat az integrációs analízishez szürke értékek segítségével a kvantifikáláshoz választottuk ki.

 

Cistanche kivonat specifikációs listája

Látogassa meg a Cistanche World Shopot

 

 

 

 

3. Eredmények és megbeszélés

3.1 Az előhívó oldószer kiválasztása

A négy PhG Rf-értékeit szisztematikusan összehasonlítottuk a három vizsgált fejlesztő oldószer között. Az 1. és 2. oldószerrendszer elégtelen polaritást mutatott, ami olyan foltokat eredményezett, amelyek nem vándoroltak a lemezmagasság felén túl, és gyenge az elválasztás. A 3. oldószerrendszer (metanol-kloroform-jégecet-víz, 3,5:1,5:1:7, V/V/V/V) éles és jól elkülönülő foltokat eredményezett 0,67 (echinakozid), 0,38 (tubulozid A), 0,68 (akteozid) és 0,24 (izoacteozid) Rf értékkel. Ezért minden további vékonyréteg-kromatográfiás elemzéshez a 3. rendszert választottuk.

3.2 A módszer érvényesítése

3.2.1 Kalibrációs görbe és képfeldolgozási módszer kiválasztása

Öt koncentrációszintű vegyes referencia standard oldatokat készítettünk, és mindegyikből 5 µl-t TLC-vel elemeztünk. A képeket ImageJ segítségével dolgoztuk fel, és kalibrációs görbéket állítottunk össze a koncentráció (x, ug/mL) és az integrált szürkeérték (y) függvényében. A lineáris tartományok 21-210 ug/ml az echinakozid, 5,2-52 ug/ml a tubulozid A, 10,1-101 ug/ml az akteozid és 5,2-52 ug/ml az izoakteozid.

Három képdigitalizálási módszert hasonlítottak össze:

Integrált szürke érték– az ImageJ segítségével mérjük az átlagos szürke foltértéket × pixel terület (Ctrl + M).

Csúcs környéke– kontúr diagramok generálása és pontcsúcs területének mérése pálca eszközzel.

RGB értékek– F Color Picker használata az R, G, B csatorna intenzitásának meghatározásához a folt középpontjában, optimalizált kombinációkkal (2G+B az echinakozidhoz, R a tubulozid A-hoz, 2R+G az akteozidhoz és az izoakteozidhoz).

Ezen módszerek közül az integrált szürkeérték-megközelítés adta a legmagasabb korrelációs együtthatót (r nagyobb vagy egyenlő, mint 0,9890), ami a TLC képdigitalizálás kiváló pontosságát jelzi.

3.2.2 Az észlelési és mennyiségi meghatározás határai

A LOD-t és a LOQ-t a következőképpen számítottuk ki: LOD=3.3σ/S és LOQ=10σ/S (ahol σ=a kalibrációs görbe metszetének és S=meredekségének szórása). A LOD értékek 0,041 ug/sáv (echinakozid), 0,005 ug/sáv (tubulozid A), 0,008 ug/sáv (akteozid) és 0,011 ug/sáv (izoakteozid) voltak. A megfelelő LOQ értékek 0,138, 0,017, 0,026 és 0,037 ug/sáv voltak.

3.2.3 Pontosság, stabilitás és ismételhetőség

Az integrált szürke értékek relatív szórása (RSD) a négy PhG esetében 0,56% és 2,4% között volt a pontosság, 0,76% és 2,2% között a stabilitás és 0,61% és 1,9% között a megismételhetőség tekintetében, amelyek mindegyike a módszer jó teljesítményét jelzi.

3.2.4 Helyreállítás

Az átlagos visszanyerés 87,1% és 96,5% között (echinakozid), 88,4% és 109,7% között (tubulozid A), 94,1% és 105,1% között (akteozid) és 96,9% és 115,1% között (izoakteozid) volt, ami az accuracy-t bizonyítja.

3.3 Valódi mintaelemzés: TLC-ImageJ vs. HPLC

A TLC-ImageJ módszert alkalmazták a négy PhG mennyiségi meghatározására 51 tételben.Cistanche tubulosaés 8 tételCistanche deserticola. A kvantitatív eredményeket HPLC analízissel párosított t-próbák segítségével validálták, amelyek nem mutattak statisztikailag szignifikáns különbséget a két módszer között mind a négy PhG-re C. tubulosa-ban, illetve az echinakozidra és az akteozidra C. deserticolában (P > 0,05).

Az eredmények megerősítették, hogy a TLC-ImageJ nemcsak a gyógyszerkönyvi marker komponenseket (echinakozid és akteozid), hanem a tubulozid A-t és az izoakteozidot is pontosan tudja számszerűsíteni, amelyek általában nem szerepelnek a rutin minőségellenőrzésben. A TLC-ImageJ és a HPLC közötti jó egyetértés igazolja ennek a gyors analitikai megközelítésnek a megvalósíthatóságát a Cistanche minőségelemzéshez.

3.4 A TLC-ImageJ módszer előnyei a Cistanche minőségelemzéshez

A TLC-ImageJ módszer számos fő előnyt kínál:

Nincs további festési lépés– a foltok közvetlenül láthatóak 365 nm-es UV fényben kék fluoreszcenciaként.

Nagy áteresztőképesség– 8-10 minta elemezhető egyidejűleg egyetlen TLC lemezen.

Gyors elemzés– a kvantitatív elemzés 30 percen belül elvégzése.

Hordozható és olcsó– csak alapvető TLC-berendezést és okostelefont igényel, kiküszöbölve a fix laboratóriumi létesítményektől való függést.

Sokoldalú– több PhG-re is alkalmazható a gyógyszerkönyvi markereken túl, lehetővé téve az átfogó minőségelemzést.

MertCistanche tubulosaAz olyan kivonatszállítóknál, mint a Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., ez a módszer gyakorlati eszközt biztosít a gyors folyamat közbeni és a végtermék minőségi elemzéséhez, biztosítva a tételek közötti állandó PhG-tartalmat, hogy megfeleljen az egyesült államokbeli és európai piacokon a táplálkozási, funkcionális élelmiszer- és gyógyszeripar által elvárt magas követelményeknek.

 

 

4. Következtetés

Ez a tanulmány létrehozta a TLC képdigitalizálási módszert négy fő fenil-etanol-glikozid gyors kvantitatív elemzésére Cistanche-ban: echinakozid, tubulozid A, akteozid és izoakteozid. A módszer igazodik a célvegyületek fizikai-kémiai tulajdonságaihoz, nem igényel további festést, és lehetővé teszi 8-10 minta egyidejű elemzését egyetlen TLC lemezen 30 percen belül. Az ezzel a módszerrel kapott kvantitatív eredmények összhangban vannak a HPLC eredményeivel, igazolva annak pontosságát és megbízhatóságát.

A módszer különösen alkalmas elsődleges tesztelési alkalmazásokhoz és helyszíni minőségelemzésekhez, mivel hordozható, alacsony költségű berendezésekre támaszkodik, és csökkenti a laboratóriumi infrastruktúrától való függőséget. Már bevezették a kínai Xinjiangban található Cistanche termesztési, feldolgozási és kutatási létesítményeiben, bemutatva gyakorlati hasznosságát.

 

Wecistanche Factory termesztése és feldolgozása cisztanche

 

Wecistanche támogató szolgáltatása – További részletek az együttműködésről
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

 

Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., a világ legnagyobb Cistanche feldolgozó vállalata, büszke arra, hogy alkalmazza és népszerűsíti ezt a fejlett, mégis elérhető minőségelemzési módszert. 200 000 hektáros Cistanche bázisunkkal, GMP-tanúsítvánnyal rendelkező termelési létesítményeinkkel és a legmodernebb membránleválasztó technológiánkkal prémium minőséget biztosítunkCistanche tubulosatermészetesen magasabb fenil-etanol-glikozid-tartalmú kivonatok – az iparágvezető előírásoknak megfelelően. Termékeink megfelelnek az Egyesült Államok és EU nemzetközi minőségi szabványainak, és széles körben alkalmazhatók, beleértve a TCM-főzeteket, funkcionális élelmiszereket, egészségügyi termékeket, étrend-kiegészítőket, gyógyszereket és kozmetikumokat.

Ahogy a Cistanche-kiegészítők iránti globális kereslet folyamatosan növekszik – a piac az előrejelzések szerint 2033-ra eléri az 1,13 milliárd dollárt, ami a természetes öregedésgátló, kognitív egészséget és vitalitást biztosító termékek iránti növekvő fogyasztói érdeklődésnek köszönhető –, a megbízható, gyors minőségelemzési módszerek jelentősége egyre fontosabbá válik. Az itt bemutatott TLC-ImageJ módszer gyakorlati megoldást kínál a gyártók, beszállítók és szabályozó testületek számára az egyenletes termékminőség biztosítására, ezzel is támogatva a Cistanche iparág folyamatos terjeszkedését az Egyesült Államokban, Európában és azon kívül.

 

 

Hivatkozások

[Az eredeti hivatkozásokat megőriztük, és az angol fordításnak megfelelően átalakítottuk.]

Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd.

Weboldal: www.xjcistanche.com

Magas fenil-etanol-glikozid-tartalmú termékekre specializálódottCistanche tubulosakivonatok

SC, HACCP, SOCA, NOP (US Organic Program) és International Organic Crop Improvement Association (OCIA) tanúsítvánnyal rendelkezik

Amerikai és EU-piaci előírásoknak megfelelő