Az Abrus Precatorius levélkivonat hormonális (inzulin, GLP-1 és glukagon) és enzimatikus (-amiláz/-glukozidáz) moduláció révén visszafordítja az alloxán/nikotinamid által kiváltott cukorbetegséget patkányokban, 1. rész

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Háttér

Az Abrus precatorius a népi gyógyászatban a világ afro-ázsiai régióiban használatos. Az Abrus precatorius levélkivonat (APLE) korábbi glükóz-csökkentő és hasnyálmirigy-védő hatását kísérletileg igazolták STZ/nikotinamid-indukált diabéteszes patkányokon; az antidiabetikus hatás és a hasnyálmirigy-védelem mögött meghúzódó mechanizmus azonban ismeretlen maradt. Célkitűzés. Ez a tanulmány feltárta az APLE antidiabetikus mechanizmusait és hasnyálmirigy-védő hatásait diabéteszes patkányokban. Anyagok és metódusok. Az APLE-t etanol/Soxhlet extrakciós módszerrel állítottuk elő. Az összes fenol és flavonoid mennyiségét kalorimetrikusan határoztuk meg a kezdeti fitokémiai szűrést követően. A diabetes mellitus-t (DM) mindkét nemű felnőtt Sprague-Dawley patkányokon (120-180 g súlyú) állapították meg napi egymást követő nikotinamid injekcióval (48 mg/kg; ip) ésAlloxan(120 mg/kg; ip) 7 napon keresztül. Kivéve a kontroll patkányokat, amelyek éhomi vércukorszintje (FBG) 4,60 mmol/l volt, a stabil FBG-vel (16-21 mmol/L) 7 napposzt-nikotinamid/Alloxanaz injekciót cukorbetegnek tekintették, és véletlenszerűen átsorolták a következő csoportok egyikébe (modell, APLE (100, 200 és 400 mg/kg; PO) és metformin (300 mg/kg; PO)), és naponta kezelték őket 18 napon keresztül . A testsúlyt és az FBG-t 72 óránként mérték 18 napon keresztül. A 18. napon a patkányok feláldozták magukat a mélybenérzéstelenítés; szerveket (vese, máj, hasnyálmirigy és lép) izoláltuk és lemértük. Vért vettünk a szérum inzulin, glukagon és (LP-1 szérumszintjének becsléséhez patkány-specifikus ELSA kit segítségével.' A hasnyálmirigyet feldolgoztuk, metszették, és H&E-festékkel végeztük a szövettani vizsgálatot. Az APLE hatása aenzimatikusaz alfa (a)-amiláz és -glükozidáz aktivitását értékelték. Az APLE antioxidáns és szabad gyökfogó tulajdonságait standard módszerekkel értékelték. Eredmények. Az APLE dózisfüggően csökkentette a kezdeti FBG-t 68,67 százalékkal, 31,07 százalékkal és 4,39 százalékkal a modellhez (4,34 százalék) és a metforminhoz (43,63 százalék) képest. Az APLE(100 mg/kg) kezelés visszaállította a súlycsökkenést a modellhez képest. Az APLE növelte a szérum inzulinszintet és a GLP-t{14}}, de csökkentette a szérum glukagont a modellhez képest. Az APLE növelte a hasnyálmirigy-szigetek számát és medián keresztmetszeti területét (×10° um') a modellhez képest. Az APLE az akarbózhoz képest az -amiláz és -glukozidáz koncentrációfüggő gátlását produkálta. Az APLE koncentrációtól függő DPPH és nitrogén-monoxid (NO) gyököket gyűjtött ki, és a standardokhoz képest megnövekedett vas-redukáló antioxidáns kapacitást (FRAC) mutatott. Következtetés. Az APLE antidiabetikus hatását az inzulin és a GLP{21}} glukagonnal fordított modulációja, a c-amiláz és -glükozidáz nem kompetitív gátlása, a szabad gyökök megkötése és a károsodott/nekro-apoptózisos hasnyálmirigy-sejtek helyreállítása közvetíti.

További információért kattintson ide

1. Bemutatkozás

A diabetes mellitus (DM) egyike azon metabolikus szindrómáknak, amelyet a krónikus hiperglikémia jellemez, amely a pán-kreatikus sejtműködés hibáinak másodlagos glükózmetabolizmusának zavarából ered [1]. Patológiailag a DM a glükóz metabolizmusban a hasnyálmirigy-sejtek működésének hibáiból eredő hibák terméke, amely inzulin elégtelenséget (1-es típusú DM) vagy inzulinrezisztenciát (2-es típusú DM) okoz. A DM gyakori tünetei közé tartozik a polifágia, polidipsia, homályos látás, krónikus testsúlycsökkenés, gasztroparesis és polyuria [2]. Idővel a megoldatlan hiperglikémia növeli a DM mikrovaszkuláris szövődményeinek, például a diabéteszes nephropathiának, a diabéteszes retinopátiának és a diabéteszes neuropátiának a kockázatát [2]. Ezek a szövődmények a kiterjedt oxidatív stressz és a lipid miatt jelentkeznekperoxidációamelyek a glükóz és a biológiai molekulák közötti reakciók melléktermékei [3]. A biológiai molekulák, például a DNS, a fehérjék és a lipidek kiterjedt glikozilációja instabil biokémiai intermedierek keletkezéséhez vezet, amelyek reaktív oxigénfajták (ROS) és nitrogénfajták (RNS) forrásaiként szolgálnak. A ROS és az RNS az oxidáns és peroxidatív reakciók kulcsfontosságú mozgatórugói. különböző sejtekben és szövetekben [3].

Epidemiológiai szempontból a DM több mint 387 millió embert érint világszerte [4]. Ez az előzetes becslés az előrejelzések szerint 2035-re 592 millióra fog növekedni [5]. Kezdetben azt hitték, hogy a cukorbetegség felnőttkorban kezdődik, de mostanra már kiderült, hogy a cukorbetegség független az életkortól, ami egyértelműen mutatja a fenyegetés óriási mértékét. a DM a globális egészségügyért.

A Cistanche javíthatja az immunitást

A DM (1-es és 2-es típusú) kezelése hagyományosan antidiabetikus szerek alkalmazását foglalja magában, amelyek nem inzulinok (beleértve a biguanidokat (pl. metformin), szulfonilureák (pl. gliburid), SGLT-2 inhibitorok (pl. dapagliflozin), epesav-megkötő szerek (pl. kolesevelám), amilin-utánzók (pl. pramlintide), dopamin-2 agonista (pl. bromokriptin), DPP-4-gátlók (pl. szitagliptin), GLP{{5} }}RA-k (pl. exenatid), tiazolidindion (pl. roziglitazon) és -glükozidáz inhibitorok (pl. akarbóz és voglibóz)) és inzulin (pl. humán inzulin és analógok) terápiák [6]. A hagyományos antidiabetikus terápiák hatékonynak bizonyultak annak ellenére, hogy némelyikük használata költséges és súlyos mellékhatásokkal járhat[7]. A költségek, a mellékhatások és az az általános vélekedés, hogy a hagyományos drogok szintetikusak, és ami azt illeti, nem biztonságosak a „természetesnek” és viszonylag biztonságosnak vélt gyógynövénykészítményekhez képest, hozzájárultak a gyógynövények és gyógynövényekből származó termékek használata iránti megújult érdeklődéshez. emberi betegségek, köztük a cukorbetegség kezelésére és kezelésére szolgáló termékek[8,9]. Ez a paradigma meglehetősen gyakori a világ szegényebb trópusi országaiban, ahol a legtöbb ember a gyógynövényekre támaszkodik az elsődleges egészségügyi szükségletek kielégítésére [8]. Valószínűleg ez megerősítheti azt a szokásos állítást, hogy a gyógynövények használata megelőzte a modern orvoslást, és hogy a természetes termékek továbbra is sablonként szolgálnak új gyógyszerek[10], köztük az antidiabetikus szerek gyógyszerészeti szintéziséhez. Fontos, hogy ezeket a gyógynövényeket és gyógynövényekből származó terápiákat kiegészítő terápiaként használják, oly módon, hogy tükrözzék a világ afro-ázsiai régióiban élő legtöbb helyi közösség hitrendszerét és etnobotanikai örökségét. Például számos, a cukorbetegség kezelésére szolgáló etnobotanikai állításokkal rendelkező gyógynövény, mint például a Chrysobalanus orbicularis[11], a Spondias mombin és a Mangifera indica[12], a Sesamum indicum [13] és a Bryophyllum pinnatum [14] mindegyike kimutatta az amilázt és - glükozidáz gátló hatások, amelyek létfontosságúak a glikémiás szabályozáshoz. Válaszul a gyógynövények és gyógynövényekből származó termékek kiegészítő vagy alternatív terápiaként történő felhasználása iránti megújult érdeklődésre, hogy az Egészségügyi Világszervezet (WHO) más érdekcsoportokkal együtt javasolta a bennszülött gyógyító rendszerek, különösen a gyógynövények beépítését. a szegényebb országok egészségügyi rendszerei [15]. Ez az ajánlás szükségessé tette a helyi lakosság által emberi betegségek kezelésére általánosan használt gyógynövényekre vonatkozó egészségre vonatkozó állítások ellenőrzésének szükségességét[16,17]. Érdekes módon az Abrus pre-catorius, amelyet általában "jequirity borsónak" neveznek, egy gyógynövény, amelyet széles körben használnak a népi gyógyászatban a világ afro-ázsiai régióiban számos kultúra népi gyógyászatában az emberi betegségek kezelésére[18-20]. Több jelentés is kiemelte az Abrus precatorius levelek hagyományos felhasználását a diabetes mellitus kezelésében[21-23]. Megjegyzendő, hogy az Abrus precatorius leveleiből származó kivonatok hatékonynak bizonyultak a diabetes mellitus [1] és a mellrák [24] ellen, amelyek két olyan emberi betegség, amelyek jelentősen hozzájárultak a globális betegségteherhez [25]. Számos tanulmány igazolta az Abrus precatorius etnofarmakológiai felhasználását és egyéb gyógyászati ​​állításait azzal, hogy kísérletileg bizonyítja biológiai tulajdonságait, beleértve a szabadgyök-fogó [26], a reno-védelmet [27], a neuro-védelmet [28], az immunmodulátort [19], a gyulladáscsökkentőt. [29], anti-lipotoxicitás [30] és anti-thrombocytaaggregáció [31], hogy csak egy mintát említsek.

Korábban az APLE glükóz-csökkentő és hasnyálmirigy-védő hatását kísérletileg igazolták STZ/nikotinamid-indukált cukorbeteg patkányokon, hogy megerősítsék, hogy a helyiek Ghána nyugati régiójában használják antidiabetikus népi gyógyszerként [1]. Az APLE glükóz-csökkentő és hasnyálmirigy-védő hatásának hátterében álló mechanizmus azonban továbbra is kevéssé tisztázott. Jelenleg az APLE glükóz-csökkentő és hasnyálmirigy-védő hatásai mögött meghúzódó mechanizmusok, mint például az inzulin, a glukagon és a GLP-1 modulálása, az -amiláz és -glükozidáz enzimatikus aktivitásának gátlása, a szabad gyökök megkötése és a helyreállítás in vivo és in vitro kimutatták a hasnyálmirigy-sejtek károsodását és a nekro-apoptózist.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Gyógyszerek és vegyszerek. Alloxán-monohidrát (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), nikotinamid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), akarbóz (LGM Pharma, USA), metformin (Bristol laboratories Ltd.) , galluszsav (Merck KGaA, USA), rutin (Acros organics, USA), aszkorbinsav (Carl Roth, Németország), kvercetin (Alfa Aesar, Egyesült Királyság), p-nitro-fenil-glükopiranozid (pNPG) (BBI Biotech, Kína), Patkány A vizsgálat során inzulin ELISA készletet, Patkány Glucagon-ELISA készletet és Patkány GLP{6}} ELSA készletet (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd, Kína) használtak. A vizsgálatban használt összes többi oldószer és vegyszer analitikai minőségű volt.

2.2. Az Abrus precatorius levelek gyűjtése, azonosítása és hitelesítése. Az A. precatorius friss leveleit a Sefwi Asawinso'A' (Bibiani-Ahwiaso-Bekwai körzet, nyugati régió, Ghána) mezőgazdasági területeiről gyűjtöttük. A leveleket egy képesített botanikus azonosította és hitelesítette a Cape Coast-i Egyetem Biológiai Tudományok Iskola herbáriumi egységében, ahol az utalványmintát (CC3366) letétbe helyezték, amint azt korábban közöltük [1].

2.3. Abrus precatorius levélkivonat (APLE) készítése. Az APLE egy korábbi módszer szerint készült [1]. Röviden, az A. precatorius árnyékban szárított leveleit mechanikusan finom porrá őröltük. A porított leveleket felhasználás előtt légmentesen záródó műanyag edényekben tároltuk. A porított levelek 120 g-ját 48 órán át 700 ml etanolban áztattuk, és ronggyal lefedtük. Az elegyet naponta legalább háromszor keverjük. A második napon az elegyet Buchner-tölcsérbe illesztett szűrőpapíron átszűrjük. A szűrletet vízfürdőre szerelt rotációs bepárló segítségével elválasztjuk. Miután az etanolt rotációs bepárlóval kinyertük, a kapott sötétzöld szirupszerű folyadékot exszikkátorban szárítottuk néhány hétig, így sötétzöld szilárd kivonat maradt vissza. A kivonatot felhasználás előtt címkéztük és exszikkátorban tároltuk. Az APLE-t folyamatosan készítettük elő, hogy minden kísérlethez elegendő mennyiséget kapjunk.

2.4. Az APLE fitokémiai szűrése Az APLE-t fitovegyületek jelenlétére szűrtük, amint azt korábban közöltük [1]. 2.5. Az összes fenoltartalom (TPC) meghatározása APLE-ben. Az APLE összes fenoltartalmát a Folin Ciocalteu reagens módszerrel határoztuk meg a korábban leírtak szerint [32], kis módosításokkal. Az APLE híg koncentrációját (250 μl, 1 mg/ml) összekeverjük 750 µl Folin Ciocalteu reagenssel (10 hígításban vízzel) és 750 µl 7 százalékos Na, CO-val. szobahőmérsékleten 2 órán át a szín kialakulásához. Ezután az abszorbanciát 765 nm-en mértük spektrofotométerrel (UV-vis, T70 PG Instruments). A standard galluszsav (0-300ug/mL) görbe elkészítése után az APLE TPC-jét a galluszsav kalibrációs görbéből extrapoláltuk, és galluszsav-egyenértékben (GAE) fejeztük ki. Minden kísérletet három párhuzamosban végeztünk.

2.6.A teljes flavonoidtartalom (TFC) meghatározása APLE-ben. Az APLE teljes flavonoid tartalmát egy korábban leírt módszerrel [33] mértük, néhány módosítással. Röviden összefoglalva: 500 μl Abrus precatorius növényi kivonatot (1 mg/ml) 50%-os etanolban elkészítve összekevertünk 500 μl 10%-os alumínium-kloriddal (AlCl,.6H,O) és 1500μl 10%-os nátrium-acetáttal (ONAC) ,.3H,O). A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 40 percig inkubáltuk, és az abszorbanciát 415 nm-en mértük spektrofotométerrel (UV-vis, T70 PG Instruments). A standard rutin (0-250 ug/mL) kalibrációs görbe elkészítése után az APLE TFC-jét extrapoláltuk a rutin kalibrációs görbéből, és rutin egyenértékben (RE) fejeztük ki. Minden kísérletet három párhuzamosban végeztünk.

2.7. Etikai jóváhagyás. Az állatokat érintő összes protokollt eredetileg a Kwame Nkrumah Tudományos és Technológiai Egyetem (KNUST) Állatkísérletek Intézményi Felülvizsgáló Testülete (FPPS/PCOL/006/2019) felülvizsgálta és hagyta jóvá. A patkányokkal végzett kísérleteket az állatok tudományos kísérletekben való felhasználásáról és gondozásáról szóló európai uniós irányelveknek (2010/63/EU) megfelelően is végezték. Az állatok szenvedését és az állatok számát a lehető legnagyobb mértékben csökkentették annak érdekében, hogy megfeleljenek a 3R (Refinement, Replacement, and Reduction) ajánlások [34] követelményeinek.

2.8. Kísérleti állatok beszerzése és gondozása. Mindkét nemű, egészséges 7-8-hetes felnőtt Sprague-Dawley patkányokat (120 és 180 g közötti súlyú) a Ghánai Egyetem Noguchi Orvosi Kutatóintézetétől (NMRI) vásároltuk. A patkányokat később a ghánai Cape Coast-i Egyetem Orvosbiológiai Tudományok Tanszékének Állatházába szállították. A patkányokat rozsdamentes ketrecekben (34 cm × 47 cm × 18 cm) helyezték el, alomként száraz faforgácsot, normál rágcsálótáppal (GAFCO, TEMA) etettek, és korlátlanul hozzáfértek a vízhez. A patkányokat környezeti hőmérséklet, páratartalom és normál sötét/világos ciklus mellett tartottuk. Ezeket a feltételeket azonban változtatták, hogy megfeleljenek egyes kísérletek speciális követelményeinek. A kísérletekben való felhasználás előtt a patkányokat több mint két hétig hagytuk megszokni ilyen környezeti és laboratóriumi körülmények között.

2.9. Az alloxán/nikotinamid által kiváltott cukorbetegség megállapítása patkányokban. Kísérleti diabetes mellitust állapítottak meg egy éjszakán át éheztetett normoglikémiás felnőtt Sprague-Dawley patkányokon egy korábban leírt módszer szerint [1, 35], némi módosítással. Röviden, a patkányokat egymás után normál sóoldatban oldott nikotinamiddal (48 mg/kg; IP) injektáltuk, és jégen tartottuk; majd 15 perccel később alloxánt (120 mg/kg; ip) 100 mM citrát pufferoldatban (pH 4,5) adtunk be naponta 7 napon keresztül. Ezt követően a patkányok 5%-os glükóz (5 ml/kg; PO) oldatot kaptak naponta 7 napon keresztül. A patkányok hiperglikémia kialakulásának igazolására vért vettünk egy éjszakán át éheztetett patkányokból 3-7 nappal az alloxán/nikotinamid kezelés után. és 5 százalékos glükóz kezelések farokvég-amputációs módszerrel. A patkányok farkát először 10 százalékos etanolba mártott steril pamuttal törölték le. Az éhgyomri vércukorszintet (FBG) URIT G26 glükométerrel (URIT Medical Electronic Co., Ltd.) mérték.

2.10.Experimental Design. A curative rather than prophylactic treatment approach was adopted in this study, where after the establishment of experimental diabetes mellitus in rats, diabetic rats were subjected to various treatments. Figure 1 shows an outline of experiments carried out in this study. Rats having consistent FBG(11.1 mmol/L or >250mg/dL) többszöri mérések alapján diabetes mellitusnak (hiperglikémiásnak) tekintettük [1,35]. A megerősített cukorbeteg patkányokat véletlenszerűen öt csoportba osztották. A kontroll patkányokat nem tették ki alloxánnal; ehelyett normál sóoldatot kaptak. Minden csoportot 18 napig kezeltek az alábbiak szerint:

Kontroll: normál sóoldat (5 ml/patkány/nap; po) plusz rágcsálótáp plusz víz

Modell: nikotinamid (48mg/kg ip) plus alloxan (120mg/kg;ip) plusz rágcsálótáp plusz víz

Metformin: nikotinamid (48 mg/kg; ip) plusz alloxán (120 mg/kg; ip) plusz metformin (300 mg/kg; po) plusz rágcsálóétel és víz

APLE (100 mg/kg): nikotinamid (48 mg/kg; ip) plusz alloxán (120 mg/kg; ip) plusz APLE (100 mg/kg; po) plusz rágcsálótáp és víz

APLE (200 mg/kg): nikotinamid (48 mg/kg; ip) plusz alloxán (120 mg/kg; ip) plusz APLE (200 mg/kg; po) plusz rágcsálótáp plusz víz

APLE (400 mg/kg): nikotinamid (48 mg/kg; ip) plusz Aloxan (120 mg/kg; ip) plusz APLE (400 mg/kg po) plusz rágcsálótáp plusz víz

2.11. A testsúly mérése.A patkányok testtömegét minden állatkísérlet megkezdése előtt megmértük. Ezt követően a patkányok testtömegét minden csoportban 3 naponta megmértük 18 napon keresztül. Az adagokat úgy igazították, hogy tükrözzék a testtömeg változásait 3 naponta. Végül minden csoportban megmértük a patkányok testtömegét leölésük előtt.

2.12. Vérvétel, szérum készítés és szervek izolálása.Miután a 18. napon lemértük a patkányokat, a patkányokat mély kloroformos érzéstelenítésben leöltük. A vérmintákat szívpunkcióval vettük, majd jelölt üres vakutainer csövekbe adagoltuk. Mindegyik csoport reprezentatív vérmintáját 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk (Eppendorf centrifuga 5702,4 fok) 5 percig. A szérum előállításához a felülúszót megfelelően jelölt mintacsövekbe gyűjtöttük. A májat, a vese lépet és a hasnyálmirigyet begyűjtöttük, frissen lemértük, és 10 százalékos formalinban rögzítettük.

2.13. A szérum inzulin, glukagon és GLP mérése-1.A szérum inzulin-, glukagon- és GLP{0}}-szinteket rendre patkányinzulin ELISA-val (Wuxi Donglin Sci &Tech Development Co. Ltd., Kína), patkány glukagon ELISA-val (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd.) mérték. , Kína), és a patkány GLP-1 ELISA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd., Kína) szigorúan a gyártó utasításai szerint.

2.14. A Langerhans hasnyálmirigy-szigetek medián területének meghatározása.A reprezentatív hasnyálmirigy szövettani feldolgozása után a megfelelő csoportok mikrofelvételeit Amscope MD35 okulárkamerával szkennelték le, a korábban leírtak szerint[1]. Minden mikrofényképet feltöltöttek az Adobe Photoshop CS6-ra, majd ráhelyezték egy sztereológiai rácsra. Megszámoltuk a hasnyálmirigy-szigetek strómáit fedő metszéspontok számát. A reprezentatív hasnyálmirigy Langerhans hasnyálmirigy-szigeteinek keresztmetszeti területét Cavalieri módszerrel és pontszámlálással határoztuk meg [36]. A keresztmetszeti területet a következő képlettel határoztuk meg:

ahol

A a hasnyálmirigy Langerhans-szigeteinek keresztmetszeti területe

Az XP a hasnyálmirigy-szigetecskék stromáját fedő metszéspontok teljes számát jelenti

a/p a sztereológiai rács pontonkénti területét jelenti. M a lineáris nagyítást jelenti.

2.15. -amiláz kivonása a tengerimalacok hasnyálmirigyéből.20 órás éhezés után egy tengerimalacot mély érzéstelenítésben feláldoztak, a hasnyálmirigyet pedig műtéti úton eltávolították. A hasnyálmirigyet zsírtól és minden más szövettől mentesítjük, és azonnal mossuk nátrium-foszfát pufferrel (pH 7,4). A hasnyálmirigy lemérése után fagyasztóban 4 fokon tároltuk. A fagyasztott hasnyálmirigyet ezután homogenizáltuk (1 g hasnyálmirigy: 5 ml puffer) jéghideg, 0,1 M nátrium-foszfát pufferrel (pH 7,4) homogenizátor (WiseTis HG-15D homogenizátor) segítségével, majd centrifugáltuk. 4400 ford./perc sebességgel 30 percig 4 fokon. A felülúszót külön mikrofuga-csövekbe pipettáztuk, és fagyasztóban tároltuk -20 fokon. Az extrahált enzim (-amiláz) megerősítésére a kereskedelemben kapható -amilázt összehasonlították az extrahált enzimmel (-amiláz) keményítő és jód felhasználásával. A kék-fekete elszíneződés halvány vagy eltűnését, amelyet az -amiláz aktivitás jelzésének tekintettek, összehasonlították egy kontroll beállítással (nincs enzim plusz keményítő plusz jód), ahol mélykék-fekete elszíneződés volt.

2.16. Az APLE hatása az -amiláz enzimaktivitásra.Az alfa ( )-amiláz enzimaktivitás gátlását egy korábbi módszer szerint vizsgálták [37], némi módosítással. Röviden: APLE-t (125 uL) vagy akarbózt növekvő koncentrációban (100-1500 ug/ml) adtunk egy sor jelölt kémcsőhöz, amely 125 ul -amiláz oldatot tartalmazott 20 mM nátrium-foszfát pufferben (pH 6,9). Az APLE vagy akarbóz/amiláz keveréket 25 fokon 10 percig előinkubáltuk. Ezt követően 125 ul 1 százalékos keményítőt (20 mM foszfátpufferben, pH =6,9) adtunk hozzá meghatározott időközönként. A reakcióelegyet minden esetben 25 °C-on 10 percig inkubáltuk. Az egyes reakciókat időközönként 250 ul 3,5-dinitroszalicilsav (DNSA) reagens hozzáadásával fejeztük be, majd vízfürdőben 100 °C-on 5 percig tovább melegítettük, majd hagytuk szobahőmérsékletre hűlni. Mindegyik reakciót 2,5 ml-re feltöltöttük desztillált vízzel, és az abszorbanciát 540 nm-en mértük spektrofotométerrel (UV-vis, T70 PG Instruments). A kontroll elrendezést ugyanezzel az eljárással készítettük el, azzal az eltéréssel, hogy az -amilázt desztillált vízzel előinkubáltuk APLE helyett. Az alfa()-amiláz gátló aktivitást a következőképpen számítottuk ki:

2.17. Az -amiláz enzimatikus aktivitás gátlásának módja APLE által.Az -amiláz enzimaktivitás APLE általi gátlásának módját egy korábbi módszer szerint végeztük [38], némi módosítással. Röviden, 125 μl APLE-t (5 mg/ml) először előinkubáltunk 125 ul 20 mM foszfátos -amiláz oldattal 25 fokon, 10 percig egy sor címkézett kémcsőben. Ezt követően 125 uL keményítőoldatot adtunk különböző koncentrációkban (0.{11}} mg/ml) a reakcióelegyekhez.

indítsa el a reakciót. A reakcióelegyet ezután 25 °C-on 10 percig inkubáltuk, majd 250 ul 3,5-dinitroszalicilsav (DNSA) reagenst adtunk hozzá a reakció leállítására. A képződött termék mennyiségét az abszorbancia mérésével határoztuk meg 540 nm hullámhosszon spektrofotométerrel (UV-vis, T70 PG Instruments). Az eljárást megismételtük az APLE helyett -amiláz pufferrel végzett előinkubálásával felállított kontrollnál. A Lineweaver-Burk diagramot Michaeles-Menten diagramjából a Graph-Pad prizma 8-as verziójával (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA) készítettük a Km és Vmax becslésére. Az -amiláz enzimaktivitás APLE általi gátlásának módját a becsült Km és Vmax értékekből vezettük le.

2.18. Glükozidáz kivonása tengerimalacok vékonybeléből.A -glükozidáz kinyerését tengerimalacok beléből egy korábbi módszer szerint [39] végeztük, némi módosítással. Röviden, a tengerimalacokat először 20 órán át éheztették, majd mély érzéstelenítésben leölték. A közvetlenül a vakbél felett és közvetlenül a nyombél alatt elhelyezkedő vékonybelet műtéti úton eltávolítottuk, és alaposan leöblítettük jéghideg 0,02 M nátrium-foszfát pufferben (pH 6,9), mielőtt friss pufferoldatba mártották volna. 1 g intestine-ne:5 ml puffer arányban az izolált beleket homogenizáltuk (WiseTis HG-15D homogenizátor, Németország) 4400 fordulat/perc sebességgel 10 percig, 2 perces szakaszos leállás mellett jégen. A homogenizátumot centrifugáltuk (Eppendorf 5430R centrifuga) 30 percig 4 fokon, és a felülúszót óvatosan összegyűjtöttük. Az alikvot részeket 2 ml-es kriocsövekbe helyeztük, és -20 fokon tartottuk, hogy azonnal felhasználhassák a kísérletekben. Az extrahált enzim (-glükozidáz) igazolására egy kereskedelmi forgalomban kapható -glükozidázt összehasonlítottak az extrahált enzimmel (a-glükozidázzal), 50 μl 3 mM p-nitrofenil-glükopiranozidot (pNPG) 25 μl kereskedelmi forgalomban kapható -25-glukozidázzal inkubálva. μl extrahált enzim (a-glükozidáz) 25 fokon. A sárga p-nitrofenol termék 5 perc elteltével történő megfigyelése minden esetben a -glükozidáz aktivitásának megerősítése volt.

2.19. Az APLE hatása a glükozidáz enzimaktivitásra.Az APLE és az akarbóz (egy standard -glükozidáz inhibitor) gátló hatását egy korábbi módszer szerint értékelték [40], némi módosítással. Röviden, foszfát puffert (20 mM; pH =6,9) használtunk a p-nitro-fenil-glükopiranóz (pNPG) (-glükozidáz szubsztrát) előállítására. Külön kísérletekben az a-glükozidázt (50 μL) növekvő koncentrációjú APLE-vel (minden esetben 25 μl), akarbózzal vagy pufferrel előinkubáltuk 10 percig. Ezt követően 25 ul 3 mM p-nitro-fenil-glükopiranozidot adtunk az APLE/a-glükozidáz vagy akarbóz/a-glükozidáz előinkubált keverékhez a reakció elindításához. A reakcióelegyet minden esetben 25 °C-on 20 percig inkubáltuk. 20 perces inkubálás után a reakciót 0,1 M Na,CO (1 ml) hozzáadásával leállítottuk. A kontrollt ugyanezzel az eljárással készítettük, azzal az eltéréssel, hogy a -glükozidázt pufferrel előinkubáltuk APLE vagy akarbóz helyett. A reakció befejeződése után a reakcióterméket (sárga színű p-nitrofenol) spektrofotométerrel (UV-vis, T70 PG Instruments) 405 nm-en mértük az a-glükozidáz aktivitás meghatározására. Az eredményeket a kontroll százalékában fejeztük ki. A kísérleteket minden esetben háromszor megismételték. A -glükozidáz aktivitás százalékos (százalékos) gátlását a következő képlettel becsültük meg:

2.20. A -glükozidáz gátlás módja APLE által.A -glükozidáz enzimaktivitás APLE általi gátlásának módját egy korábbi eljárás szerint [41] végeztük, némi módosítással. Röviden, egy kémcsőkészletben pontosan 25 μl 5 mg/ml APLE-t előinkubáltunk -glükozidáz oldattal (5{15}} μL) 25 fokon 1 0 percig. A második csőkészletben egy -glükozidázt előinkubáltunk 50 µl 20 mM foszfátpufferrel (pH=6,9）). Ezután 25 ul p-nitro-fenil-glükopiranozidot (PNP) adtunk változó koncentrációban (0.{16}},0 mg/ml) mindkét kémcsőkészlethez a reakció elindításához. A reakcióelegyeket ezután 25 °C-on 20 percig inkubáltuk, majd Na, CO-t (1000 µl) adtunk hozzá a reakció leállítására. A felszabaduló termék mennyiségét spektrofotometriásan mértük p-nitrofenol standard görbe alkalmazásával, és átváltottuk reakciósebességre (v). Kettős reciprok görbét ábrázoltunk (1/v és 1/S), ahol S a szubsztrát koncentrációja. A -glükozidáz aktivitás APLE általi gátlásának módját a Line Weaver-Burk diagram elemzésével határoztuk meg.

2.21. A 2,2-Difenil-1-Pikrilhidrazi(DPPH)gyökfogó aktivitás értékelése.A DPPH gyökfogó aktivitását egy korábbi módszer szerint [42] végeztük, némi módosítással. Röviden, 2 ml-es reakcióelegyet készítettünk a metanolban elkészített DPPH (1.0 ml 0,135 mM) és 10 ml különböző koncentrációjú APLE (40, 80, 120, 160) összekeverésével. és 200 ug/ml) vagy aszkorbinsav. A reakcióelegyet erőteljesen rázatjuk, és szobahőmérsékleten 30 percig sötétben hagyjuk. Az abszorbanciát (UV-vis, T70 PG Instruments) mértük 517 nm-en vakpróbával szemben. Minden vizsgálatot három párhuzamosban végeztünk. Kontrollként azonos mennyiségű metanol és DPPH-oldat szolgált. A DPPH gyökfogó aktivitását a következő képlettel becsültük meg:

2.22.Nitrogén-monoxid (NO) gyökfogó vizsgálat.Az APLE és a standardok NO gyökfogó aktivitását Griess Illosvory reakcióval becsültük meg a korábban leírtak szerint [43] néhány módosítással. Röviden, a Griess Ilosvory reagens 5% 1-naftil-amin helyett 0,1% (w/v) naftil-etilén-diamin-dihidrokloridot használt. Változó koncentrációk

({{{{10}}}} ug/mL) mind az APLE-ből, mind a standardokból (galluszsav és aszkorbinsav), amelyeket 167 ul-re készítettek és töltöttek fel címkézett kémcsövekbe, majd 667 ul 10 mM nátrium-nitroprusszidot adtunk hozzá. Ezután nátrium-foszfát puffert (167 ul, pH 7,4) adtunk hozzá, és az elegyet 25 °C-on 150 percig inkubáltuk. Ezt követően 2000 μl szulfanilsav reagenst (0,33% 20%-os jégecetben) adtunk hozzá, és 5 percig állni hagytuk, hogy a diazotálási reakció befejeződjön. Végül további 2000 μl 0,1%-os naftil-etilén-diamin-dihidrokloridot adtunk hozzá, összekevertük, majd 30 percig 25 °C-on állni hagytuk. A nitritkoncentrációt (UV-vis, T70 PG Instruments) 546 nm-en mértük, és a kontroll nitrát oldattal számítottuk ki, amely nem tartalmazott APPLE/vagy standardokat, de tartalmazta a reakcióelegy összes többi komponensét. Vakoldatként nátrium-foszfát puffert használtunk. Az APLE és a standardok százalékos (százalékos) NO tisztító képességét a következő képlettel számítottuk ki:

ahol Ac a kontroll abszorbanciája és At a teszt abszorbanciája (APLE/standard).

2.23. Vascsökkentő antioxidáns kapacitás (FRAC) vizsgálat.A FRAC-t az előző módszer szerint vizsgálták [44], kevés módosítással. Röviden, a reakció 25 0 ul APLE/standard oldatot tartalmazott különböző koncentrációkban (125-200 ug/ml), 625 uL nátrium-foszfát puffert (0,2 M, pH 6,6). ), és 625 ul 1%-os kálium-vas-cianidot [K,Fe(CN)] különböző kémcsövekbe. Ezeket 20 percig 50 °C-on inkubáltuk, hogy a reakció befejeződjön. Ezután 625 ul 10%-os triklór-ecetsav (TCA) oldatot adtunk a kémcsövekhez. A teljes keveréket 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 10 percig, majd 1800 µl felülúszót vettünk és 1800 µl desztillált vízzel kevertük össze. Ezt követően 360 μl 0,1%-os vas(III)-klorid (FeCl) oldatot adtunk hozzá, és alaposan összekevertük. Az oldat abszorbanciáját 700 nm-en mértük spektrofotométerrel (UV-vis, T70 PG Instruments) a reakció vakpróbával szemben. Egy tipikus vakoldatot, amely ugyanazt az oldatkeveréket tartalmazza APLE/vagy kvercetin nélkül, hasonló körülmények között inkubáltuk. A reakcióelegy megnövekedett abszorbanciája megnövekedett redukálóképességet jelez. A kísérletet minden koncentrációnál háromszor megismételtük. A FRAC-t kvercetin-ekvivalensként (QE) mértük.

2.24. Az IC-k és az EC-k becslése0 Az IC és ECsoof APLE antioxidáns, szabadgyökfogó és -amiláz és -glükozidáz enzimaktivitást gátló hatása alapján történő meghatározásához egy sor növekvő koncentrációjú APLE-t teszteltünk a megfelelő tevékenységek. A koncentrációk kijelentkezésre való konvertálása után a vízszintes tengelyen ábrázoltuk a maximális aktivitások százalékos arányát (antioxidáns, szabadgyök-fogó, valamint -amiláz és a-glükozidáz enzimaktivitást gátló hatás) a függőleges tengelyen. Az APLE koncentrációja, amely a maximális aktivitás 50 százalékát produkálta (antioxidáns,

szabad gyökfogó, valamint az -amiláz és a-glükozidáz enzimaktivitás gátló hatását) grafikusan határoztuk meg a GraphPad prizma 8-as verziójú statisztikai szoftverrel.

2.25. Statisztikai analízis.A kapott adatokat átlag±SD formában adtuk meg. A statisztikai elemzés a Graph Pad Prism Version 8 for Windows használatával készült (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). A csoportok közötti átlagos összehasonlítást egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) végeztük, amelyet Tukey többszörös összehasonlító tesztje követett. P kisebb vagy egyenlő, mint 0,05, statisztikailag szignifikánsnak tekintették az összes elemzésben.

Ez a cikk a Hindawi BioMed Research International Volume 2021-ből származik, cikkazonosító: 9920826, 17 oldal: https://doi.org/10.1155/2021/9920826