Az ultraibolya fénynek való akut bőrexpozíció neutrofilek által közvetített vesegyulladást vált ki

Mi és mások kimutattuk, hogy az UV-fény gyors neutrofil beszűrődést idéz elő a bőrbe (6, 7). Bár a neutrofilek fő szerepet játszanak a gyulladásban a helyi sérülés helyén, a közelmúltban felismerték, hogy a neutrofilek a gyulladás elsődleges helyétől távoli szerveknek is otthont adhatnak (8–10), ahol reaktív oxigén termelésével járulnak hozzá a tüdőszövet sérüléséhez. fajok (ROS) (11), vagy aktiválják az adaptív immunrendszert a nyirokcsomókban és a csontvelőben (9, 12). Az SLE-ben a neutrofilek fontos szerepet játszanak mind a helyi, mind a szisztémás betegségekben. A neutrofilek jelen vannak az SLE-s betegek bőrelváltozásaiban (13, 14) és aveseLN-ben szenvedő betegek szövetét (15, 16). A neutrofil gén aláírásának magas expressziója erős előrejelzője az aktív betegségnek, beleértve az LN-t és a bőr fellángolását (17, 18). A proinflammatorikus alacsony sűrűségű granulociták (LDG) szintje különösen a bőrbetegségben szenvedő betegeknél emelkedik (19). Míg ezek az eredmények a neutrofilek jelenlétét feltételezik az SLE-ben előforduló helyi szövetkárosodásban, vajon a neutrofilek biztosítják-e a patogén kapcsolatot a bőrgyulladás és a bőrgyulladás között.vese sérülésnem érthető.

Annak tisztázására, hogy a bőr UV-fénynek való kitettsége hogyan befolyásolja aveseés a neutrofilek szerepét ezekben a folyamatokban, értékeltük a változásokatvese-génexpresszió a neutrofil migrációval összhangban. Megállapítottuk, hogy a bőr akut UV-sugárzása serkenti a gyulladásos folyamatokat avese,beleértve az endoteliális adhéziós molekulák, gyulladásos mediátorok, sérülésmarkerek és átmeneti proteinuria expresszióját. Nevezetesen azt találtuk, hogy a neutrofilek aveseUV-fény expozíció után IL-17A-függő módon, a tubulointerstitialis (TI) területeken lokalizálva, ahol proinflammatorikus fenotípust mutattak. A neutrofil-kereskedelem blokkolása anti-G-CSF immunglobulin (IgG) kezeléssel megszűntvese-gyulladást és megakadályozta a tubuláris sérülési markerek felszabályozását. Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a bőr UV-sugárzása szubklinikai hatást vált kivese-neutrofilek által közvetített gyulladásos és sérülési folyamatok.

Eredmények

A bőr UV-fénynek való kitettsége szubklinikai vesekárosodást okoz.A napfénynek való kitettség összefüggésbe hozható a szisztémás tünetek súlyosbodásával és a betegség fellángolásának előfordulásával SLE-betegeknél, beleértve a nephritist is (2–4). Ezért először azt kérdeztük, hogy az ultraibolya B (UVB) fény (500 mJ/cm2) egyszeri expozíciója által kiváltott akut steril gyulladás a bőrben fekete 6 (B6) egerekben, vajon változásokhoz vezet-evesegyulladást, sérülést és proteinuriát (1A. ábra). A tüdőt választották kontroll szervnek, mivel SLE-ben nem számoltak be összefüggésről a fényérzékenység és a klinikai tüdőbetegség között. Az összesen 500 mJ/cm2 UVB fényt B6 egerekben két minimális erythemás dózisként határozták meg (20), amely az emberi tiltakozáshoz használt referenciadózis (21). Perfundált génexpressziós elemzésekvese tissues (Fig. 1A) revealed up-regulation in the gene expression of adhesion molecules vcam- 1 and e-selectin on days 1 and 2 after UVB light exposure (Fig. 1 B and C). In contrast, vcam-1 and e-selectin expression demonstrated a downward trend in the lung (SI Appendix, Fig. S1). We also observed a >10-foldvese-indukciója az s100A9-ben, egy neutrofil mediátorbanvesekárosodás(22), valamint megnövekedett s100A6 expressziója, amely egy tubuláris sérüléssel kapcsolatos kalciumkötő fehérje (23) (1. ábra D és E). Míg az s100A9 indukciót a tüdőben észlelték, az s100A6 génexpresszió változatlan maradt a tüdőben (SI Függelék, S1 ábra). A gyulladásos válasz aveseaz il-1 expresszió korai növekedésével is összefüggésbe hozható (1. és 2. nap az UV után), míg a tnf vagy il-6 minimális vagy egyáltalán nem változott (1F. ábra). Il-1 expressziót csak 6 nappal a bőr UVB-fénynek való kitétele után észleltünk a tüdőben (SI Függelék, S1. ábra). Gyors indukció a cxcl12 expressziójában, egy kemokinben, amelyet glomerulusok és tubulusok választanak ki, és szerepet játszik avesekárosodás(24), szintén megtalálták avesede a tüdőt nem (1G. ábra és SI függelék, S1. ábra). Ezért az UVB fény által kiváltott bőrsérülések gyorsan előidézikvese-proinflammatorikus folyamatok, míg a tüdőben kevesebb változás figyelhető meg.

A proinflammatorikus válasz mellett megfigyelhető avese,mind a proteinuria, mind a vizelet albumin/kreatinin aránya nőtt az első néhány napban a bőr UVB fénynek való kitettsége után (1. H. és I. ábra). Ez a gyors hatás aveseműködésa lipocalin-2 expressziójának fokozódása kísérte ésvese sérülés1. molekula (kim-1) (1. J és K ábra), a tubuláris markerekvesekárosodásamelyek az LN-ben is megfigyelhetők (25, 26). A proteinuria átmeneti jellege ellenére ezek kifejeződésevese sérülésA markerek a 6. napig fennmaradtak (1. J és K ábra), ami valószínűleg a szövetek helyreállítását tükrözi.

Az UV-fény által kiváltott bőrgyulladás a neutrofilek vesébe történő migrációját eredményezi.Annak vizsgálatára, hogy a neutrofilek részt vesznek-e az UVB fényre adott szisztémás gyulladásos válaszban, megvizsgáltuk a neutrofilek felhalmozódásának kinetikáját UV fénnyel besugárzott bőrben és lépben.vese,és C57BL/6 J (B6) egerek tüdeje, egy olyan törzs, amely a legjobban utánozza a bőr UVB-fény változásait az emberi bőrben (2A. ábra) (27). A bőr akut UVB-sugárzását követően a neutrofilek száma a bőrben hétszeresére nőtt 24 órán belül, és 6 napig emelkedett maradt az UVB előtti kiindulási szinthez képest (D-1) ​​(2B. ábra). Ezt a csontvelőben a neutrofilek számának csökkenése és a keringő vérben lévő neutrofilek számának ötszörösére való növekedése kísérte az 1-6. napon (2. C. és D. ábra). Érdekes módon ugyanebben az időkeretben a neutrofilek megnövekedtek a lépben, a tüdőben ésvese(2. ábra E–G és SI függelék, S2A ábra). A pontos kinetika szervenként változott, és a tüdőben az 1. napon, a 2-6. napon érte el a csúcsot.veseés lép (2. ábra E–G). Ban,-benvese, a neutrofilek többnyire a tubulointerstitialis területen lokalizálódnak, beleértve az érrendszert is, amint azt a neutrofil elasztáz (NE) festődés jelzi a vérlemezke/endothelsejt adhéziós molekula -1 (PECAM-1/CD31) közelében vagy azzal kolokalizálva ) (2H. ábra). A 2H. ábrán látható reprezentatív képek neutrofileket mutatnak az intersticiális érrendszerben vagy annak környékén (teljes fehér nyilak) és az interstitiumban (pontozott fehér nyilak), esetenként neutrofilek, amelyek szintén megtalálhatók a glomerulusokban (sárga nyilak). Hasonló lokalizációt detektáltunk az anti-Ly6G immunfluoreszcens (IF) festéssel (SI függelék, S2B ábra).

Annak megállapítására, hogy más veleszületett immunsejtek a neutrofilekhez hasonló lokális és szisztémás válaszokat mutattak-e, megvizsgáltuk a monociták (CD11b plusz Ly6C plusz Ly6G−) eloszlását ugyanabban az időpontban az UVB fény expozícióját követően. Míg monociták is beépültek a bőrbe, csak kis számú infiltráló monocitát észleltek aveseaz UVB-expozíciót követő 6. napon (~2--szeres versus ~10{3}}-szeres növekedésveseneutrofilek) (2F ábra és SI függelék, S3 ábra). A monociták számának növekedését nem észlelték a tüdőben vagy a lépben (SI Függelék, S3. ábra), ami arra utal, hogy az UV-sérülésre adott szisztémás válasz viszonylag szelektív volt a neutrofilekre.

A neutrofilek bőrbe való beszivárgását szövettani változások kísérték, beleértve a dermis korai gyulladását és az epidermális sejtpusztulást (1. és 2. nap), majd acanthosis és hyperkeratosis kialakulása, egyes esetekben szerocelluláris kéregképződéssel (6. nap) (SI) Függelék, S4 ábra). Nevezetesen, nem jelentek meg nyílt bőrelváltozások az UVB-fénynek való kitettség után, ami arra utal, hogy a megfigyelt immunsejtek beszűrődése steril körülmények között történt, bár a megváltozott bőrmikrobióma hozzájárulása nem zárható ki (20).

Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a bőr egyetlen dózisú UVB-fénynek való kitétele mobilizálja a neutrofileket mind a gyulladás helyi helyén, mind a belső szervekben, beleértve avese,vér neutrophilia kíséretében. Míg a hím és nőstény egerek általános migrációs mintái hasonlóak voltak, a neutrofilek bőrbe való beszűrődése gyorsabb volt a nőstényeknél, mint a hímeknél (2B. ábra). Ezzel szemben a szalag eltávolításával okozott epidermális sérülés nem vezetett a neutrofilek vándorlásáhozveseannak ellenére, hogy a neutrofil infiltráció és a gyulladásos válasz és a szövetsérülés hasonló szintje, mint az UV-fény expozíciónál látható (SI Függelék, S5. ábra), ami azt jelzi, hogy a szisztémás neutrofil disszemináció nem jellemző a steril bőrsérülések minden formájára.

A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE-/VESEBETEGSÉGET

Az IL-17A elősegíti a neutrofilek felszaporodását a bőr UV-fénynek való kitettsége után.A bőrben található kemotaktikus és gyulladásos mediátorok felmérése a neutrofil kemokinek és a cxcl1, cxcl5/6, g-csf és il-1 1 gyulladásos citokinek génexpressziójának szignifikáns növekedését mutatta ki 2 nappal az UV-sugárzás után (1. 3 A–D). Az s100A9 expressziójának gyors és tartós növekedése megegyezett a neutrofilek bőrbe való beszivárgásának kinetikájával (2B ábra és SI függelék, S6 ábra), míg az il-6, tnf és il-33 citokinek átmenetileg megnövekedtek, és a 6. napra visszatértek az alapvonalra (SI függelék, S6. ábra). Ezzel szemben az il-36a csak a 6. napon emelkedett (SI Függelék, S6. ábra), ami talán egy reparatív funkciót tükröz. A monociták átmeneti (1-2 napos) jelenléte a bőrben (SI függelék, S3. ábra) párhuzamosan zajlott a monocita-specifikus kemokinek, a ccl4 és ccl2 (SI Függelék, S6. ábra) felpörgésével. Hasonlóan a neutrofilek felhalmozódásához a nőstény egerek bőrében (2B. ábra), a monociták bőrben történő felhalmozódása is korábban történt nőstényeknél, mint hímeknél (SI Függelék, S3. ábra).

UV skin exposure was accompanied by rapid (6 h) 12-fold induction in il-17a gene expression in the skin (Fig. 3E) as well as >1,000-szeres bőrindukció a g-csf expresszióban az UV utáni 1. és 2. napon (3C. ábra). Annak megállapítására, hogy ezeknek a citokineknek az indukálása releváns volt-e a neutrofil mobilizáció szempontjából, először számszerűsítettük a citokin fehérje koncentrációját a vérben, ami a plazmakoncentráció robusztus és tartós (10--100--szeres) növekedését mutatta ki. IL-17A 6-24 órával az UV-fénynek való kitettség után (3F. ábra), valamint az IL-6 és IL-12 átmeneti (csúcs 6 órával) növekedésével. az IL-17A (28) alatt lehet (3. G és H ábra). Az IFN, GM-CSF, TNF, IL-10, IL-27, IL-23 vagy IL1 plazmakoncentrációinak növekedését nem figyelték meg. Annak megállapítására, hogy az IL-17A szükséges-e az UVB által kiváltott neutrofilek toborzásához, az UV-sugárzás előtt neutralizáló antitesttel blokkoltuk az IL-17A hatását (3I. ábra). Az anti-IL-17A IgG szignifikánsan csillapította a vér neutrophiliáját (3J. ábra), és gyengítette a neutrofilek beáramlását mind a kitett bőrszövetbe (3K. ábra és SI függelék, S7A ábra), mind avese(3L ábra és SI függelék, S7B ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az UV-fény hatására bekövetkező neutrofilek felszaporodását, legalábbis részben, az IL-17A közvetíti.

A neutrofilek közvetítik a vesegyulladást a bőr UV-sugárzása utánKönnyű.Annak megállapítására, hogy a neutrofilek felelősek-e a gyulladásos változásokért avese following skin UVB light exposure, we blocked neutrophil recruitment prior to UV light exposure. Since cutaneous g-csf expression was up-regulated >1,000-szeresére UV-expozíció után, ami arra utal, hogy a G-CSF kemotaktikus szerepe van az UV-fény hatására bekövetkező neutrofilek toborzásában, gátoltuk a neutrofil mobilizációt a csontvelőből a G-CSF blokkolásával, ahogy az a 4A. ábrán látható. A G-CSF semlegesítése megakadályozta a vér neutrophiliáját, valamint a neutrofilek toborzását avesemiután a bőrt UVB fénynek tette ki (4. B és C ábra). Nevezetesen, amint azt a különböző modellekben korábban közölték (29, 30), a G-CSF blokkolása nem változtatta meg a monociták számátvese(4D. ábra). Csökkent neutrofil migráció avesejelentős csökkenése kísérte avese-adhéziós molekulák vcam-1 és e-selectin (4. E és F ábra), valamint az s100A9 és il-1 1 d gyulladásos mediátorok expressziója UVB expozíció után (4. G és H ábra). Továbbá a szövetsérülési markerek lipocalin-2 és kim-1 aveseszignifikánsan csökkentek az UV-fénynek kitett egerekben G-CSF-blokkoló antitesttel kezelt egerekben, mint az izotípussal kezelt UV-sugárzásnak kitett állatokban (4. I. és J. ábra). Amint arról korábban beszámoltunk (6), az UVB-fény akut bőrexpozíciója I-es típusú interferonválaszt váltott ki avese(4K. ábra). A G-CSF blokkolása jelentősen csökkentette, de nem szüntette meg teljesen az IFN pontszámot (4K. ábra). Míg a neutrofilek jelenléte aveseszükséges volt a bőr UV-sugárzása után 1 nappal megfigyelt akut gyulladásos és sérülési válaszokhoz (4. ábra), ebben az időpontban nem volt különbség a proteinuriában, mivel a proteinuria csúcspontja az UV-expozíciót követő 4. napon következett be (1. ábra H és ábra). ÉN). Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy a neutrofilek felelősek a gyulladásos válaszért, és közvetlenül vagy közvetve hozzájárulnak az I. típusú interferon indukciójáhozvesea bőr UV-sugárzását követően. Az anti-G-CSF IgG-vel kapott eredményekhez hasonlóan a neutralizáló anti-IL-17 antitest beadása részben elnyomta a neutrofilek migrációjátveseés csökkent génexpressziót eredményezettvesegyulladásos (vcam-1 és s100A9) és sérülésmarkerek (lipocalin-2 és kim-1), bár csak a kim-1 expresszió csökkenése volt statisztikailag szignifikáns (SI Függelék, 1. ábra . S7 C–F)

A vese neutrofilek egy szubpopulációja visszafelé vándorol, ez a fenotípus az SLE-betegek vérében is kimutatható.Bár régóta feltételezték, hogy a fertőzés vagy steril gyulladás helyére belépő neutrofilek ezt követően apoptózison mennek keresztül, és a makrofágok gyorsan eltávolítják őket, számos tanulmány kimutatta, hogy egyes neutrofilek kétirányú forgalmat bonyolítanak le, azaz a szövetbe való belépés után átvándorolnak. visszajutnak a véráramba, és beszivárognak egy másik helyre, ezt a folyamatot reverz transzmigrációnak (rTEM) nevezik (8, 10, 11, 31–34). Annak vizsgálatára, hogy a neutrofilek bejutottak-e avesea bőrön áthaladó UVB fény hatására a neutrofilek migrációját vizsgáltuk fotoaktiválható B6 egérmodellben (humán ubiquitin C [UBC]-fotoaktivált [PA]-zöld fluoreszcens protein [GFP]).

A kísérleti sémát az 5A. ábra szemlélteti; 1 nappal azután, hogy a bőrt egyetlen dózis UVB-fénnyel exponáltuk, a bőrt ibolya fénynek (405 nm) tették ki, így a beszűrődő immunsejtek fotokonverziója GFP-pozitív sejtekké alakult át. A fotokonvertált neutrofileket (GFP plusz Ly6G plus) ezután mennyiségileg meghatároztuk perfundált sejtben.vesea következő nap. Az áramlási citometriás elemzés kimutatta, hogy a vese-infiltráló neutrofilek körülbelül 20 százaléka volt GFP-pozitív a háttérjel levonása után (körülbelül 10 százalék) (5B. ábra). Ellentétben a májban vagy a cremaster izomban kialakuló steril gyulladás modelljeivel (8, 10), nem észleltünk fotokonvertált neutrofileket a tüdőben, valószínűleg azért, mert a 2. napon kevés neutrofilt találtak a tüdőben (2F. ábra). Annak tesztelésére, hogy a GFP plusz neutrofilek aveseUV-sugárzásnak kitett bőrszövetből extravazált vagy intravaszkuláris PA volt, összehasonlítottuk a GFP plusz neutrofilek számának változásátveseaz egerek közül, amelyekben ugyanaz a bőr, amely UV-fénynek volt kitéve, PA volt lila fénnyel egy nappal később (I. csoport), szemben azokkal az egerekkel, amelyeknél az UV fénynek kitett bőr egy nappal később PA volt lila fénnyel (II. csoport, diagram az SI függelékben, S8A ábra). Bár nem volt különbség a keringő neutrofilek százalékos arányában a csoportok között (SI Függelék, S8B ábra), a GFP plusz neutrofilek nagyobb növekedését figyelték meg aveseegerek esetében, ahol az UV-sugárzásnak kitett bőr is PA (I. csoport) volt, összehasonlítva a GFP plusz neutrofilek növekedésének hiányával azokban az egerekben, ahol a nem UV-sugárzásnak kitett bőr PA volt (II. csoport) (SI függelék, S7B ábra). A II. csoportban a neutrofilek száma hasonló volt az 5B. ábrán látható GFP-pozitivitás hátteréhez (SI függelék, S8B. ábra).

Míg a GFP plusz alacsony szintjevesecsoportban a neutrofilek azt sugallták, hogy az ibolya fény nem PA keringő sejteket nem UV-sugárzásnak kitett bőrben, lehetséges maradt, hogy az UV-fénynek való kitettség megváltoztatta a neutrofilek kölcsönhatásait a bőr vérereivel, lehetővé téve a nagyobb fotokonverziót és az ezt követővesehozzáférés. A TEM neutrofilek relatív arányának meghatározásához számszerűsítettük az rTEM-en átesett neutrofilek jellemzésére használt felületi markerek expresszióját: CXCR4hi (8) és ICAM1hiCXCR1lo (11, 35). Valóban, GFP pluszvesea neutrofilek magasabb szintű CXCR4-et expresszáltak, mint a GFP plusz neutrofilek a bőrben vagy a GFP- neutrofilek a bőrben.vese(5C. ábra). Nak,-nek

érdeklődés,vese-A CXCR4 ligandum, cxcl12 expressziója 1-2 nappal a bőr UVB-fénynek való kitettsége után egyidejű volt a CXCR4hi neutrofilek jelenlétévelvese(1G. ábra), valószínűleg kemotaktikus ingert biztosítva ezeknek a neutrofileknek a vesébe való toborzásához. Érdekesség, hogy a CXCR4hi és ICAM1- hiCXCR1lo neutrofileket későn, UV-expozíció után (6. nap, SI Függelék, S9 B és C ábra) detektáltuk a csontvelőben, ami arra utal, hogy ezen neutrofilek egy része vissza is tért a csontvelőbe. csontvelő hasonló ahhoz, amit az rTEM esetében jelentettek májsérülést vagy a bőr vírusfertőzését követően (12, 36). Ezekkel a megfigyelésekkel összhangban magasabb CXCR4-expressziót észleltünk a vér neutrofiljein az UV-expozíció utáni 2. napon, ami valószínűleg befogta a sejteket aveseés a csontvelő (SI Függelék, S9D ábra). Hasonlóképpen, az ICAM1hiCXCR1lo sejtek szignifikánsan nagyobb százalékát mutatták ki a GFP plusz neutrofilek közöttveseösszehasonlítva a GFP plusz neutrofilekkel a bőrben és GFP- neutrofilekkel avese(5D. ábra). Az ICAM1hiCXCR1lo fenotípust a GFP és a neutrofilek 20-35 százalékán mutatták kivese(5D. ábra), ami arra utal, hogy a neutrofilek egy részhalmaza, amely aveseUV-sugárzásnak kitett bőrön keresztül ezt reverz transzmigrációval teszik, míg a többitveseA neutrofilek valószínűleg akkor aktiválódnak, amikor a gyulladt UV-sugárzásnak kitett bőrön keresztül keringenek. Az ICAM1- hiCXCR1lo neutrofil szubpopulációt is kimutatták aveseUV-fénynek kitett normál B6 egerek közül, amelyek nem kaptak PA-t (SI függelék, S9A ábra).

Míg a CXCR4hi és az ICAM1hiCXCR1lo neutrofil fenotípusokat gyulladásos funkciókkal és szövetsérülésekkel hozták összefüggésbe különböző egérmodellekben (11, 31, 37), kevés vizsgálatot végeztek ezekkel a sejtpopulációkkal humán betegségekben. Tekintettel a neutrofilek új szerepére az SLE-ben (13, 17, 18) és látszólagos heterogenitásukra (19), megvizsgáltuk, hogy normál sűrűségű polimorfonukleáris sejtek (PMN) vagy LDG-k SLE-betegekből

kimutatták a fordítottan vándorló fenotípusokat: CXCR4hi (37, 38) és ICAM1hiCXCR1lo. A PMN-ek és LDG-k áramlási citometriás profilja magasabb CXCR4-expressziót mutatott ezen sejtek felszínén SLE-s betegekben az egészséges kontrollokhoz képest (6. A és C ábra). Ezenkívül az ICAM1hiCXCR1lo PMN-ek kis, de szignifikánsan magasabb százalékát találtuk az SLE-vérben (átlag: 3,5 százalék) az egészséges kontrollokhoz képest (átlag: 1,4 százalék) (6B. ábra). Érdekes módon az LDG neutrofil populáció (CD15 plusz CD14loCD10 plusz a perifériás vér mononukleáris sejtjeiben [PBMC]) nagyobb százalékban tartalmazott ICAM1hiCXCR1lo sejteket, mint a PMN-ek egészséges (átlag 7,1 százalék) és SLE vérben (átlag: 29,4 százalék) 6 B és D). Az rTEM-szerű populáció szignifikánsan magasabb volt az SLE-s betegek LDG-iben, mint az egészséges kontrollokban (6D. ábra). Ezek az adatok azonosítják az rTEM-szerű neutrofil fenotípusok jelenlétét a PMN-ekben, és különösen az LDG-ben SLE-s betegekben.

Vita

A bőr UV-fénynek való kitettségének szisztémás hatásai kevéssé ismertek. Ezeknek az útvonalaknak a normál alapállapotban történő azonosítása tájékoztathatja a napsugárzás utáni szisztémás szöveti érintettség mechanizmusait, amelyek olyan betegségekben fordulnak elő, mint például az SLE (2–4). Itt számos megállapítást közölünk arról, hogy a napfény milyen hatással van a vesére. Először is kimutattuk, hogy a bőr UVB-sugárzásának való akut expozíciója gyulladásos és sérülési reakciókat vált ki avese,beleértve a szubklinikai proteinuriát. Érdekes módon ezekvese-a változásokat a neutrofilek vesébe való beszűrődése kísérte az UVB fény által közvetített bőrgyulladást követően. A neutrofil válasz az IL-17A-tól és a G-CSF-től függött. A vesében lévő neutrofilek proinflammatorikus fenotípusúak, amint azt az NE extracelluláris lokalizációja, az rTEM (CXCR4hi) nagyobb aránya, más néven "öreg" és ICAM1hiCXCR1lo sejtek bizonyítja. A neutrofilek közvetlenül érintettek a szubklinikaivese sérülés,mivel a neutrofilek kimerülése az adhéziós molekulák, a gyulladásos citokinek, az IFN-I aláírás és a vesekárosodás markerek expressziójának jelentős csökkenését eredményezte a bőr UV-sugárzása után.

Más típusú bőrsérülések, mint például a szalag eltávolítása és a TLR7 agonista helyi alkalmazása, arról számoltak be, hogy fokozzákvese sérülésbizonyos lupus modellekben, bár a betegség fokozódását a makrofágok és a dendritikus sejtek közvetítik, nem pedig a neutrofilek (39, 40). Miután bebizonyította, hogy a szalag eltávolítása nem vezetett a neutrofilek toborzásáhozvese, azt javasoljuk, hogy az UV fénynek való kitettség különbözik a steril bőrgyulladás egyéb típusaitól. Ez azzal magyarázható, hogy UV-sérülés után fototermékek vagy egyedi gyulladásos mediátorok képződnek, amelyek a vesét gyulladásra késztetik, a neutrofilek UV-sugárzás utáni eltávolításának különbségei a szalag eltávolításához képest, vagy más tényezők. Megfigyeltük, hogy az UV-fény gyors és erős indukciót váltott ki az il{0}}a hírvivő RNS-nek (mRNS) a bőrben, valamint magas keringő IL-17A fehérjeszinttel (~100-szeres növekedés). , amelyre szükség volt a neutrofilek toborzásához UV fénynek való kitettség után. A bőr g-csf expressziójának egyidejű 100--1,{5}}-szeres indukciója azt sugallja, hogy az IL-17A/G-CSF tengely valószínűleg a neutrofilia és a neutrofil szövetek bejutásának felelőse. UV fényre reagálva. Az IL-17A szerepe a granulopoiesis és a neutrofil rekrutáció szabályozásában a G-CSF indukálásán keresztül jól ismert homeosztatikus körülmények között, és néhány tanulmány kimutatta, hogy az IL-17A fontos a neutrofilek toborzásában steril gyulladás (41, 42). Lupusban az emelkedett IL-17A expressziót a bőrelváltozásokban (43), és a keringő IL-17A megnövekedett szintjét a betegség rosszabb megnyilvánulásaival társították (44), bár a neutrofilekkel való specifikus kapcsolat egy kórokozó populáció ebben a betegségben (13, 17, 18), továbbra is feltáratlan. A csontvelőből származó neutrofilek G-CSF által közvetített mobilizációjára gyakorolt ​​közvetlen hatásai mellett az IL- 17A szintén hozzájárulhat a neutrofilek bejutásához a csontvelőből.veseadhéziós molekulák (pl. VCAM-1 és E-Selectin) expressziójának stimulálásávalvese-endotélium (45, 46).

Az akut UV-expozíció ugyanazon modelljét használva nemrégiben arról számoltunk be, hogy egyetlen dózis UV-fény helyi és szisztémás IFN-I választ váltott ki, amely szükséges volt a hatékony neutrofilek bőrbe toborzásához (6). Mivel az IFN-I-ről kimutatták, hogy IL-17A termelést indukál (47), valószínű, hogy ezek az útvonalak függetlenül vagy együttesen vezetnek az UV-fény által közvetített neutrofilek toborzásához és migrációjához, amelyről itt beszámolunk. Míg eredményeink az IL- 17A gyulladásos szerepére utalnak, az UVB fénynek az IL-17A jelátvitelre gyakorolt ​​elnyomó hatásairól korábban beszámoltak pikkelysömörben, ahol a pikkelysömörben szenvedő bőr UVB fénynek való kitettsége megszüntette a patogén T-sejteket és mieloid gyulladásos dendrikus sejtek (48, 49). Mivel a pikkelysömörben szenvedő bőr – az egészségestől eltérően – gazdag IL-17-termelő és -választ adó T-sejtekben, a sejtek összetételének különbsége valószínűleg meghatározza az UVB-fényre adott választ, beleértve az UVB-fény által közvetített IL-elnyomás mértékét is. -17A receptor kifejezés (50). Az UV-adagolás azt is meghatározhatja, hogy a gyulladásos vagy terápiás hatás jelentkezik-e: az alacsony dózisok gyulladásgátló és immunszuppresszív következményekkel járnak (51), esetleg a CD8 T-sejtes válaszok gátlásával (52).

A neutrofilek többféle szerepet játszanak a szöveti gyulladás során. Ha a kórokozóhoz kapcsolódó molekuláris mintázatok és a károsodással összefüggő molekuláris minták (DAMPS) vagy a receptorok kapcsolódása aktiválja őket, a neutrofilek közvetlenül hozzájárulnak a szövetkárosodáshoz proteázok, ROS felszabadulásával és neutrofil extracelluláris csapdák (NET) extrudálásával (53, 54). A neutrofilek a sejttörmelék fagocitózisával és a szöveti revaszkularizáció lehetővé tételével is elősegíthetik a szövetek helyreállítását (8). SLE-ben a neutrofil gén aláírása erős előrejelzője az aktív betegségnek, beleértve az LN-t és a bőr lupust (17, 18). A neutrofilek megtalálhatók a bőrelváltozásokban (13, 14), valamintveseSLE-betegek biopsziás mintái (15, 16), és gyulladásos tulajdonságaik részben a NET kialakulásának tulajdoníthatók (16). Ez a folyamat magában foglalja a ROS fokozott termelését (55), a mitokondriális DNS felszabadulását (55), valamint a gyulladásos fehérjék, például az s100A9 (56), az IL-1b (57) és az I. típusú interferonok felszabadulását és indukcióját (55). , 58). Megállapításaink szerint a neutrofilek vesébe történő migrációjának gátlása megszüntette az s100A9-et és jelentősen csökkentette az IL-1b expressziót ésveseAz IFN pontszám arra utal, hogy hasonló gyulladásos funkciók játszhatnak szerepet. Az SLE-ben előforduló vesebetegség szempontjából a neutrofilek főként a TI endotéliumában lokalizálódnak, amely a fokozott expressziós hely.vese sérüléskim-1 és lipocalin-2 markerek az LN veseszövetekben (59,60). A proteinuria a glomeruláris gát fehérjékkel szembeni túlzott permeabilitása miatt alakulhat ki, ami a tubulusok általi megromlott fehérje-visszaszívódás vagy e mechanizmusok kombinációja miatt alakulhat ki (61). Az SLE-s betegek TI-sérülése gyakori patológiás lelet az LN-vesékben, beleértve az enyhe glomeruláris sérülést szenvedőket is (61, 62). Kimutatták, hogy a TI-sérülés előrejelzi az LN súlyosságát (63, 64), de a kiváltó mechanizmusok ismeretlenek. Mivel az emelkedett kim{9}} és lipocalin{10}} a TI-sérülés felismert markerei SLE-ben (26, 65), és blokkolják a neutrofilek migrációjátvesegátolta expressziójukat, azt javasoljuk, hogy az UV expozíció után megfigyelt átmeneti proteinuria a neutrofilek által közvetített szubklinikai TI gyulladás következménye (65). A megnövekedett vese vcam-1 expresszió, amely a TI-sérülés másik markere SLE-ben (66), tovább támogatja ezt a modellt.

Amellett, hogy a steril vagy fertőző sérülések lokális helyein gyulladást terjesztenek, a neutrofilekről kimutatták, hogy távoli szerveknek adnak otthont (8–10), ahol a kontextustól függően ROS-termelésen keresztül hozzájárulnak a szövetkárosodáshoz (11) vagy aktiválódnak. az adaptív immunrendszer a nyirokcsomókban és a csontvelőben (9, 12). E neutrofilek gyulladásos természetét annak tulajdonítják, hogy képesek kilépni a sérülés elsődleges helyéről, és másodlagos helyekre vándorolnak, azaz rTEM-en mennek keresztül (9–11, 31–34). Megállapításaink szerint a GFP-t tartalmazó sejtek PA-ja a bőrben UV-sugárzást követően GFP plusz neutrofilek kimutatásához vezetett aveseAz rTEM fenotípusával azt sugallják, hogy egy alpopulációvese-a neutrofilek visszavándoroltak az UV-sugárzásnak kitett bőrről (a GFP plusz a neutrofilek körülbelül 20 százalékát teszik kiveseneutrofilek, és ezek 20-35 százaléka rTEM; ezért az rTEM az összmennyiség 4-7 százalékát teszi kiveseneutrofilek). Az rTEM ezen aránya összevethető a steril májsérülés (~9 százalék) (36) és az ischaemia-reperfúziós sérülés (körülbelül 8 százalék) (11) után jelentett aránnyal. Az rTEM-ről más körülmények között kimutatták, hogy gyulladást előidéző ​​hatásúak (10, 11), és károsítják az apoptózist (35), ami azt eredményezi, hogy szerepet játszanak az UV-indukáltakvese sérülés.A megnövekedett CXCR4 expresszió ezeken a neutrofileken különösen releváns, mint egybeesésvese-a cxcl12, egy podociták és tubulusok által expresszált CXCR4 ligandum (24) expresszióját figyelték meg, amely valószínűleg kemotaktikus jelet biztosít ennek a neutrofil populációnak. Megnövekedett CXCR4 expresszió az immunsejteken, magas szintekkel párosulvavese-A CXCL12-t LN-ben szenvedő SLE-s betegekben azonosították (67), és ez az útvonal lupusban, valamint ischaemia-reperfúzióban is szerepet játszott.vese sérülésegerekben (24, 68). Amellett, hogy az rTEM markere, a megnövekedett CXCR4 expresszió az „elöregedett” neutrofilek indikátora is, amelyek szövetkárosító gyulladásos válaszokat közvetíthetnek (38). A CXCR4 pontos szerepe a neutrofilek toborzásában aveseCXCR4 antagonizmussal vizsgálható, ahogy korábban más steril sérülési modellekben is megtették (38).

A szövetspecifikus neutrofilek migrációja és a különböző szervekben az adhéziós molekulák eltérő expressziójáért felelős mechanizmusok nem teljesen ismertek (69). A cxcl12 kemokin expressziójának magasabb szintje avesede nem a tüdő magyarázhatja a CXCR4hi neutrofilek preferenciális jelenlétét a vesében. Ezenkívül a vcam-1 és az e-szelektin expressziójának indukciója a vesében, ahhoz képest, hogy a tüdőben nem változik az expresszió, valószínűleg hozzájárul a neutrofilek preferenciális toborzásához és visszatartásához a vesében. Az s100A9-expresszió 5--6--szeres növekedése a tüdőben, összehasonlítva a vesében tapasztalható 30--60--szeres növekedéssel, valamint 6--szeres növekedéssel az il-1b tüdőben történő expressziója a vesében tapasztalt 16-szeres növekedéshez képest tovább jelzi a szöveti különbségeket a gyulladásos válaszban. A G-CSF semlegesítését követően a vese neutrofil beszűrődésének csökkenése a neutrofilek keringési számának és aktiválódásának, valamint a vcam{13}} és az e-selectin lokális expressziójának csökkenésének tulajdonítható. Azonban nem lehetünk biztosak abban, hogy ezen adhéziós molekulák bőr UV-expozícióját követő kezdeti felszabályozása a bőrből származó citokineknek/DAMPS-nek tulajdonítható-e, vagy a neutrofilek a szerinproteázok felszabadulásával közvetlenül hozzájárulnak-e expressziójukhoz, amint azt más tanulmányok kimutatták. összefüggések (70). A mechanizmusoktól függetlenül, és megjegyezve, hogy nem végeztünk minden szövet átfogó elemzését, vizsgálataink bizonyítékot szolgáltatnak bizonyos szervszelektivitásra az UV-fény által közvetített szisztémás hatások terén. A jövőbeni tanulmányok foglalkozni fognak a szisztémás neutrofilek terjedésének szövetspecifikus funkcionális következményeivel, például vaszkuláris albuminszivárgás és ödéma kialakulásával a tüdőben (11, 36).

Az SLE-ben szenvedő betegeknél nehéz egyértelműen összefüggésbe hozni a bőr UV-sugárzásának kitettségét a szisztémás betegség súlyosbodásával, mivel a látható fényérzékenységi válaszok jelentős eltéréseket mutatnak (1-3 hét) a különböző egyéneknél (21). Ezen kívül szubklinikaivese sérüléskönnyen kimaradhat mindaddig, amíg az egymást követő UV-fénynek való kitettség nem fokozza a hatásokat. Miközben azt találtuk, hogy a neutrofilek által közvetítettvesegyulladásUV-fény hatására egészséges egerekben nem okoz klinikai megbetegedéseket, ez a mechanizmus többféleképpen is hozzájárulhat a fényérzékeny lupuszos betegek LN fellángolásához. Az Fc-receptorok immunkomplexek általi bevonása fokozhatja a neutrofilek toborzását, ami ROS és proteáz felszabadulását eredményezheti (71); a lupus neutrofilek és az LDG-k megnövekedett NET-termelési képessége, amelyek SLE-s betegekben nem tisztulnak ki hatékonyan (72), szövetkárosító proteázok felszabadulásához (73) és az IFN-I válasz továbbterjedéséhez vezethet (58). , vagy közvetlen sérülés aveseendothelium érkárosodás és szivárgás létrehozásával (16). Ezen túlmenően, a lupus bőrében meghúzódó különbségek, mint például a fokozott IFN-I jelátvitel (5, 74) és a protektív Langerhans-sejtpopuláció hibái (75), beszámolhatnak a neutrofilek által közvetített szisztémás válaszok mértékéről és természetéről. Az autoantitestek lekérdezésével, az apoptotikus sejtek felhalmozódásával és az alacsony komplementszinttel párosuló neutrofil migráció nyomon követése a lupus új modelljeivel, például genetikailag meghatározott hármas mutánsokkal (Sle1.Mfge8−/− C1q−/− és Sle1.Mfge8−) kezelhető. /−C3−/−) (76) vagy más lupus törzsek UV fénynek való kitettséget követően.

A neutrofilek és a gyulladás közötti pontos mechanizmusokat SLE-ben ezen túlmenően a neutrofil/LDG fenotípus is befolyásolhatja, mivel ezekben a populációkban egyre nyilvánvalóbbá vált a heterogenitás (77). A megemelkedett CXCR4 és ICAM1hiCXCR1lo (rTEM) keringő populációkkal kapcsolatos megállapításaink, különösen az SLE LDG-kben, tovább növelik ezt a heterogenitást, és azt sugallják, hogy a vérben lévő gyulladást elősegítő granulociták némelyike ​​korábban „szöveti tapasztalattal” rendelkezhet, azaz a érintett szervszövetek, például a bőr, a szisztémás terjesztés előtt. Az rTEM fenotípusokról korábban beszámoltak rheumatoid arthritises betegek ízületi folyadékában és keringő neutrofiljeiben (35, 78), valamint akut hasnyálmirigy-gyulladással összefüggő tüdőkárosodásban (79). Az SLE-ben betöltött szerepük további vizsgálatot igényel.

A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE-/VESEFÁJDALÁST

Anyagok és metódusok

Egerek.Valamennyi állatkísérletet jóváhagyott a Seattle-i Washingtoni Egyetem Intézményi Állatgondozási és Állathasználati Bizottsága. A kezdeti kísérleteket hím és nőstény C57BL/6J egerekkel is végeztük (Jackson Laboratory, 3-4 hónapos, 1. és 2. ábra). Minden további kísérlethez nőstény egereket használtunk. PA vizsgálatokat végeztek a B6-on. Cg-Ptprc Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J nőstény egerek (Jackson Laboratory, 3-4 hónapos). Ezeket az egereket a humán ubiquitin C promoter transzkripciós szabályozása alatt álló PAGFP-t (T203H variáns) hordozó transzgenikus vektor C57BL/6 embriókba történő injektálásával hoztuk létre. Az állatokat kórokozómentes körülmények között tartottuk, és 12 órás világos-sötét ciklusokban tartottuk, ad libitum táplálékhoz és vízhez való hozzáférés mellett. A kísérleteket minden állaton a nap azonos szakában végeztük, hogy elkerüljük a cirkadián ritmus hatását a neutrofilek migrációjára (38).

UVB fénynek való kitettség és szalageltávolítás.A hím és nőstény C57BL/6 egerek háti oldalát legalább 24 órával az UVB fénnyel történő besugárzás előtt leborotválták, és csak a nem pigmentált bőrű egereket használtuk a kísérletekben. Az egereket izofluránnal érzéstelenítettük, és egy adag UVB-fénynek (500 mJ/cm2) tesszük ki FS40T12/UVB izzók (National Biological Corporation) segítségével, 300 és 315 nm közötti csúcskibocsátással. Az UVB fényenergiát a hátfelületen egy SEL240/UVB detektorral (International Light Technologies) felszerelt Photo light IL1400A radiométerrel mértük. Az egereket 1, 2 vagy 6 nappal az UVB fénnyel való expozíció után elaltattuk, és kontrollként nem besugárzott egereket használtunk (D-1) (2A. ábra). Az epidermális szalag eltávolítását a korábban leírtak szerint végeztük (7), és a bőr ésvese24 órával a sérülés után értékelték

Az IL-17A és a G-CSF gátlása.Az egereket intravénásan kezeltük 100 µg tisztított patkány anti-egér IL-17A IgG-vel (BioLegend) vagy izotípus kontrollal 3 órával az UV fény (1 × 500 mJ/cm2) előtt (3I. ábra). A neutrofilek jelenléte a vérben, a bőrben és a sóoldattal perfundáltveseA szövetet áramlási citometriával értékeltük 24 órával az UV-expozíció után, az alábbiak szerint. Az UV-fény hatására bekövetkező neutrofilek migrációját gátolta az egerek intraperitoneális kezelése 50 ug anti-egér G-CSF monoklonális antitesttel vagy egér IgG izotípus kontrollal (R&D Systems) 24 órával és 3 órával a bőr UVB fénynek való kitétele (1 × 500 mJ) előtt. /cm2) (4A. ábra). A szív perfúzióját követően a neutrofilek és a monociták száma aveseáramlási citometriával és génexpresszióval qPCR-rel értékeltük, az alábbiak szerint. További kontrollcsoportként UVB-fénynek ki nem tett egereket használtunk.

Sejtek izolálása különböző szervekből.A CO2 inhalációval végzett eutanáziát követően a háti bőr egy darabját eltávolítottuk, és RPMI (Roswell Park Memorial Institute) oldatban tartottuk jégen a feldolgozásig. A vért szívpunkcióval vettük etilén-diamin-tetraecetsavval bevont fecskendőben. Ezt követően a szív perfúzióját foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) (~60 ml) végeztük a bal kamrán keresztül, miután a jobb pitvart levágtuk. A sikeres perfúziót a teljesség megfigyelésével határoztuk megveseés a tüdő sápadtsága. A tüdőt, a vesét, a lépet és mindkét combcsontot óvatosan eltávolítottuk, és RPMI-oldatba helyeztük jégre a mintafeldolgozásig. A sejteket a bőrszövet egyenértékű területeiről (~30 mm2) izoláltuk a szövet feldarabolásával és 0,28 egység/ml Liberase TM-mel (Roche) és 0,1 mg/ml dezoxiribonukleáz I-gyel (Roche) történő emésztésével. Worthington) PBS-ben Ca plus 2-vel és Mg plus 2-vel 60 percig 37 fokon, rázás közben. Az egyikből sejteket izoláltunkveseállatonként;veseA szöveteket aprítottuk és 2 mg/ml I-es típusú kollagenázban (Worthington) 30 percig 37 fokon emésztettük egy közzétett protokoll szerint. A tüdősejteket PBS-ben (Ca plusz 2 és Mg plus 2) 1 mg/ml kollagenáz 1-es típusú és 60 U dezoxiribonukleáz I-es emésztéssel gyűjtöttük be. Az egész lépeket 40 μm-es sejtszűrőre zúztuk, és RPMI oldattal mostuk. A lépből, a csontvelőből, a vesékből és a tüdőből származó teljes vért és sejteket 1X vörösvérsejt- (RBC) lízispufferrel (BD Biosciences) kezeltük. Az izolálást/emésztést követően az összes szövetből származó sejteket leszűrtük (40 μm), PBS-sel mostuk, és RPMI-oldatban újraszuszpendáltuk a számlálás előtt.

Áramlási citometriás festés és elemzés.A sejteket Fc Block TruStain FcX-szel (Biolegend) kezeltük, és Zombie Aqua Viability festékkel (Biolegend) festettük a gyártó ajánlásai szerint. A sejteket mostuk, és a felületfestést egérspecifikus fluoreszcens antitestekkel végeztük, amelyeket a Biolegendtől vásároltunk. Különböző mieloid sejtpopulációkat elemeztünk az élő immunsejtek (Zombie Aqua-CD45 plus) kapujában. Számszerűsítettük a neutrofilek (Ly6CintLy6Ghi) és monociták (Ly6C plusz Ly6G−) százalékát és számát. A reprezentatív áramlási citometriás kapuzást az SI függelék, az S10. ábra mutatja be. A felületi markerek százalékos expresszióját és átlagos fluoreszcencia intenzitását a PA modellben (CXCR4, ICAM1 és CXCR1) a fluoreszcencia mínusz egy (FMO) festési kontrollok segítségével határoztuk meg a neutrofil kapuban (Ly6Ghi). Minden mintát CytoFLEX áramlási citométerrel (Beckman Coulter) dolgoztunk fel, és az adatokat a FlowJo szoftver 10-es verziójával (Tree Star) elemeztük.

Fotoaktivációs (PA) tanulmányok.Az UBC-PA-GFP egereket leborotváltuk, és a hátuk egy részét egy dózisú UVB fénnyel (500 mJ/cm2) sugároztuk be a fentiek szerint. Csak a fotokonvertálásra kerülő bőrfelületet tették ki UVB fénynek, míg a fennmaradó bőrfelületet alumíniumfóliával borították. Az UVB által kiváltott steril sérülés után 24 órával az UVB-besugárzott bőrterület egészét lila fénynek (405 nm) vetettük alá 50 W-os, 0,37 numerikus apertúrájú (NA) szálas (Mightex) fénykibocsátó dióda lámpával. 100 mW (területenként 15 perc expozíció). Ezt a módszert a bőr-specifikus fotokonverzió közzétett protokollja alapján optimalizálták (80).Veseés a tüdőt összegyűjtöttük és feldolgoztuk áramlási citometriás elemzéshez 24 órával a PA után, a fent leírtak szerint. A megközelítést és az idővonalat az 5A. ábra diagramja vázolja. A GFP plusz neutrofilek százalékos aránya aveseösszehasonlították az egerekben három kontrollkörülmények között tapasztalttal: 1) nincs UV és PA, 2) UV, de nincs PA, és 3) nincs UV, csak PA. CXCR4 expressziós szintek és ICAM1hiCXCR1lo fenotípus a GFP plus és GFP- neutrofileken belül a bőrben ésveseáramlási citometriával értékeltük ki a Biolegendtől vásárolt, egérspecifikus fluoreszcensen jelölt antitestek felhasználásával. Annak meghatározására, hogy a GFP plusz neutrofilek avesebőrből származott, nem vérből, az egerek egyik csoportjában a bőrt UV-fénynek és PA-nak tették ki a fent leírtak szerint (I. csoport), míg egy másik csoportban a bőrt UV-fénynek tették ki, de a PA-t a szomszédos bőrterületen végezték el. nincs kitéve UV fénynek (II. csoport) (diagram az SI függelékben, S7A ábra).Veseösszegyűjtöttük és feldolgoztuk áramlási citometriás analízishez a fent leírtak szerint.

Génexpresszió és proteomikai elemzések.Bőr,vese,és a tüdőmintákat RNAlater oldatban (QIAGEN) tároltuk. Az RNS-t RNeasy Kit-tel extraháltuk a QIAGEN-től, és komplementer DNS-t (cDNS) szintetizáltunk a High Capacity cDNS Synthesis Kit (Applied Biosystems) segítségével. A gyulladásos kemokinek, citokinek és adhéziós molekulák átiratait valós idejű qPCR-rel számszerűsítettük az SI függelék S1 táblázatában felsorolt ​​primerek felhasználásával, és a 18S transzkriptumszintek átlagára normalizáltuk. Az alkalmazott UVB fény dózisa nem befolyásolta a 18S expresszióját egyik szervben sem. Az mRNS-célpontok relatív expresszióját a standard 2^(-Ct) × együttható segítségével határoztuk meg. Az IFN-pontszámokat 10 reprezentatív interferon-stimulált gén (ISG; Mx1, Irf7, Isg15, Isg20, Ifi44, ifit1, ifit3, oasl1, usp18 és ifi27l2a) expressziójából származtattuk a korábban leírtak szerint (6). Az egyes ISG-k relatív expressziójának átlagát és SD-jét aveseUV-fénynek nem kitett egerek (átlagosan UV és SDnoUV). Ezeket használták azután az egyes ISG expressziós szintjének standardizálására a kezelt egerek veséjében (IgG izotípus plusz UVB vagy a-GCSF plusz UVB). A standardizált expressziós szinteket ezután minden egyes egérre összeadtuk, hogy megkapjuk az IFN expressziós pontszámot; i=kifejezése minden ISG-nek; Génkezelés=relatív génexpressziós szint a kezelés után; és a Gene inoUV=relatív génexpressziós szintje UVB fénynek nem kitett egerekben. ∑ 10 i=1=Geneitreatment-meanGeneinoUV SD(GeneinoUV ) . A plazma- és bőrszövet-fehérje-kivonatokban a fehérjeszinteket meghatározott elemző panelekkel mértük: LEGENDplex Mouse Inflammation Panel és Inflammatory Chemokine Panel (Biolegend).

HA a fagyott veseszövetek festése.Sóoldattal perfundáltvese4 százalékos paraformaldehidben fixáltuk 1 órán keresztül szobahőmérsékleten, majd 30 százalékos szacharózba merítést követően optimális vágóközegben (Sakura Finetek) fagyasztottuk. A 5-μm-es szövetmetszeteket PBS-ben rehidratáltuk az IF-festés előtt. A szöveteket PBS-ben lévő 0,1 százalék Triton X-100 permeabilizáljuk, majd PBS-ben, plusz 0,1 százalék Triton X-100/5 százalék BSA (szarvasmarha szérumalbumin)/5 százalék nyúlszérumban blokkoljuk. . Az NE és az endothel sejteket anti-egér NE Cy5-tel (1:100, Bioss) és anti-egér PECAM-1/CD31 Al488-cal (1:100, Biolegend) való festéssel detektáltuk 4 fokon egy éjszakán át. A neutrofilek jelenléte aveseaz anti-egér Ly6G Al647 (1:100, Biolegend) festéssel igazoltuk. A szöveteket ProLong Gold segítségével rögzítettük 4′,6-diamidino-2-fenil-indol (DAPI) rögzítőközeggel (Invitrogen), és Nikon Eclipse 90i fluoreszcens mikroszkóppal (Szövettani és Képalkotó Core, Washingtoni Egyetem) készítettük el.

Bőrszövettani értékelés.A formalinban rögzített, paraffinba ágyazott bőrszövet metszeteket (4-5 μm) hematoxilinnel és eozinnal festették meg a Washingtoni Egyetem Szövettani és Képalkotó Core-jén az UV-sugárzás előtt, az UVB besugárzást követő 1., 2. és 6. napon (n {{ 7}} nőstény). A bőrt vak módszerrel pontozták a következő paraméterek alapján: dermis/subcutis gyulladás, epidermális sejthalál, acanthosis, hyperkeratosis, szerocelluláris kéregképződés és erózió/fekélyesedés. Ezeket a paramétereket egy 0-től 4-ig terjedő skálán értékelték a súlyosságtól és mértéktől függően, kivéve az eróziót/fekélyesedést, amelyet úgy értékeltek, hogy van (1) vagy hiányzik (0). A reprezentatív képek a NIS-Elements BR 3.{14}}bittel készültek, és az Adobe Photoshopban lettek bevonva, a teljes képre alkalmazva a megvilágítási beállításokat. Eredeti nagyítás szerepel.

Vizeletmérés.A vizelet fehérjeszintjét a Bradford protein teszttel (Thermo Fisher Scientific) értékeltük. A vizeletmintákat PBS-ben 1:40 hígításban vizsgáltuk, és a vizelet fehérjekoncentrációját ismert koncentrációjú BSA sorozathígításai alapján határoztuk meg. A vizelet albumin/kreatinin arányát az Albuwell albumin assay és a Creatinine Companion Kit (Exocell) segítségével értékelték ki a gyártó utasításai szerint.

Humán mintagyűjtés és áramlási citometrikus elemzés.Ezt a tanulmányt a Washingtoni Egyetem intézményi felülvizsgálati bizottsága hagyta jóvá (STUDY00001145). A teljes vért heparinizált csövekbe gyűjtöttük egészséges önkéntesektől és SLE-betegektől tájékozott beleegyezés után. A neutrofileket (PMN-eket) és PBMC-ket Ficoll-Paque szakaszos gradiens elválasztással (GE Healthcare) izoláltuk. A PMN-eket 5%-os dextrán ülepítéssel tisztítottuk az eritrocita pelletből. A vörösvértestek lízisét követően a sejteket a Biolegendtől vásárolt fluoreszcensen jelölt antitestekkel festették, és a CXCR4 expressziót és az ICAM1hiCXCR1lo sejtek százalékos arányát értékelték PMN-ekben (CD66b plus) és LDG-ekben (CD15 plusz, CD14lo és CD10 plus PBMC-ben (19)). Az LDG-k és az ICAM1hiCXCR1lo festés FMO-n alapuló kapuzási stratégiája az SI függelékben, az S11. ábrán látható. A mintákat CytoFLEX áramlási citométerrel (Beckman Coulter) dolgoztuk fel, és az adatokat a FlowJo szoftver 10-es verziójával (Tree Star) elemeztük.

Statisztikai elemzések.Az adatokat GraphPad Prism 7 szoftverrel (GraphPad Software Inc.) elemeztük, és átlag ± SEM formában adtuk meg. A két adatcsoport közötti statisztikai különbséget a nem besugárzott kontrollokhoz viszonyítva (D-1) Student-féle teszttel határoztuk meg. A három csoport közötti statisztikai szignifikancia meghatározására egyutas ANOVA-t használtunk többszörös összehasonlítással és Tukey post hoc módszerrel.