A kvercetin előnyös/kedvezőtlen hatása az SK-N-SH neuroblasztóma sejtek membránjaira 2. rész

Kérjük, kattintson aoscar.xiao@wecistanche.comTovábbi információk

2.2.2. A kvercetin antioxidáns aktivitása

A kvercetin hatékonyságának tesztelésére a membránok oxidatív stressz elleni védelmében olyan kísérleteket végeztünk, amelyekben a membrán lipidmodelljeit ózonnak tették ki (4a. ábra) és kvercetin jelenlétének 6,25 μM koncentrációban (4b. ábra).

Az ózon hatására mindkét függőség lefolyása megváltozik, azaz π=f(A), és Cs-1=f(rn). Az ózontartalmú alfázison egyrétegű eloszláshoz kapott izotermákat kisebb lejtés és az alacsonyabb A értékek felé történő elmozdulás jellemezte. Ezenkívül a Cs-1 értékek az ózon hatására csökkentek. Ezek a változások voltak a legnagyobbak, körülbelül 0,4 ppm-es ózonkoncentráció mellett.cintancheAz ózonkoncentráció további növekedése nem növelte az egyrétegű jellemzők változásait (4a. ábra).

4. ábra. Az alfázisra ható neuroblasztóma rétegek lipidmodelljének felületi nyomásizotermái és a megfelelő összenyomhatósági modulusa (betét) tartalmazta a pufferben oldott ózon jelzett koncentrációját. Izotermák:a)antioxidánsok hiányában;b)az ózontartalmú pufferhez hozzáadott kvercetin (6,25 μM) jelenlétében.

Amikor 6,25 μM koncentrációjú kvercetint vezettünk be az alfázisba, az ózon nem befolyásolta jelentősen az r(A) izoterma lefolyását; a kompressziós modulus értékei azonban ózon jelenlétében hasonlóan változtak, mint a kvercetin hiánya esetén (4b. ábra).

Kérjük, kattintson ide, ha többet szeretne megtudni

A kapott izotermák alapján meghatározott monorétegeket jellemző paraméterek számértékeit a 3. táblázat tartalmazza.

3. táblázat. Az Alim és Cs-I monorétegek felületi paraméterei, amelyeket az alfázison elterjedt neuroblasztóma membrán modelljének monorétegeire számítottak ki, tartalmazták a pufferben oldott ózon jelzett koncentrációit kvercetin hiányában és jelenlétében (6,25 uM). Az adatok három kísérlet átlagát képviselik, ± SD. A különböző betűk jelentős különbségeket jeleznek (p≤0,05).

Ózon jelenlétében a sűrűn csomagolt egyrétegű egyrétegű molekulák (Alim) felületének enyhe csökkenése figyelhető meg. Ennek a paraméternek a maximális csökkentése 3, 2% a vezérléshez képest (monoréteg a tiszta pufferen). A Cs-I paraméter is csökken, elérve a fennsík értékeit 0,6 ppm O feletti ózonkoncentrációnál.Ennek a paraméternek a maximális csökkentése eléri a 24% -ot a vezérléshez képest.

Amikor a szubfázisban 6,25 uM koncentrációjú kvercetin van jelen, az Alim értékek (1-2%) kissé csökkennek, míg a Cs-1 érték csökkenése körülbelül 27%.

Az Alim-változások jellege az ózon és az ózon jelenlétében a kvercetinnel kombinálva különböző kurzusokkal rendelkezik. Körülbelül 0,3 ppm ózonkoncentráció mellett, a kvercetin hiányában az Aimdecrease hirtelen körülbelül 88,3 A2-re emelkedik. Ezután eléri a minimális fennsíkértéket, amely jellegzetes S-alakfüggést ad (5a. ábra, piros pontok). Kvercetin jelenlétében az Alim enyhe sima monoton csökkenése következik be, elérve a magasabb ózonkoncentrációt, amely körülbelül 93,5 A2-es fennsík (5a. ábra, zöld pontok).

5. ábra. A molekulánkénti terület függősége az ózonkoncentrációtól (a) és a kompressziós modulus függősége az ózonkoncentrációtól (b) a neuroblasztóma membránnál a subfázison: kvercetin-vörös pontok nélkül; kvercetin-zöld pontokkal. A vonalak nem mutatnak fizikai modellt, matematikailag illesztettek és a paraméterváltozások nyomon követésének kényelme érdekében rajzolták őket. A maximális rétegkompressziós modulusértékek az ózonkoncentrációval hasonlóan változnak mindkettő esetében: kvercetin hiányában és jelenlétében (5b. ábra).

3. Megbeszélés

A kvercetin hatásmechanizmusát évek óta intenzíven tanulmányozták, de a kísérletek eredményei gyakran ellentmondásosak, és azt mutatják, hogy bizonyos körülmények között ez a vegyület előnyös, másokban pedig kedvezőtlen a sejtek számára. A rendelkezésre álló vizsgálatok elemzése azt mutatja, hogy ennek a vegyületnek a sejtekre gyakorolt hatása két szemponthoz kapcsolódik, azaz a membránokkal való kölcsönhatásához és az antioxidáns aktivitáshoz. A sejtekben azonban nem lehet megkülönböztetni a kvercetin hatás e két módját és ennek a vegyületnek a potenciális anyagként való alkalmasságának értékelését, pl. tumorellenes aktivitással. Emiatt a kísérleteket úgy tervezték, hogy kvalitatív és mennyiségi módon értékeljék ennek a vegyületnek a membránok mechanikai tulajdonságaira gyakorolt hatását, valamint antioxidáns aktivitását a modellrendszerben, ami kiküszöböli más anyagcsere-útvonalak aktivitásának hatásait.

Az elvégzett kísérletek alapján megerősítették, hogy még a legalacsonyabb koncentrációknál (6,25 uM) is a kvercetin módosítja (amint azt az Alimvalue növekedése is jelzi)a modell monorétegei, utánozva a neuroblasztóma sejtek membránjának lipid részét. Rámutat a kvercetin kölcsönhatásának lehetőségére ezeknek a sejteknek a membránjaival, amikor elérik az agyat, még alacsony koncentrációban is. Ez különösen fontos azoknál az idegsejteknél, amelyek membránjai viszonylag nagy mennyiségű lipidet tartalmaznak.

A Cistanche javíthatja az immunitást

Az idegsejtek hozzávetőleges lipid-fehérje aránya 80:20%, és például az eritrocita membrán esetében ez az arány 50:50%[29]. Az idegsejtek membránjában lévő lipidek ilyen szintje kapcsolódik ezeknek a sejteknek az elektromos jelek továbbításában betöltött szerepéhez. Ugyanakkor a sejtmembrán fizikai-kémiai tulajdonságainak finom változásai, mint például a rugalmasság és a merevség, jelentősen megzavarhatják ezt a funkciót.

Az akciós potenciál az idegsejt membránja mentén az ioncsatornák munkájának köszönhetően kerül átadásra, majd az ionszivattyúk hatásának köszönhetően a nyugalmi potenciál helyreáll. Ezeknek a fehérjéknek a megfelelő működése (különösen az alakjuk határozza meg) szorosan függ a lipidkörnyezettől. Ezenkívül a membrán mechanikai tulajdonságainak változásai zavarhatják azoknak a csatornáknak a működését, amelyek kapuzási mechanizmusa pontosan a membrán mechanikai tulajdonságaitól függ.

Ezeket a téziseket olyan tanulmányok igazolják, amelyek kimutatták, hogy a kvercetin sejtmembránra gyakorolt hatása többek között a Ca2+ ionok és/vagy Ca2+metabolizmus transzportjával függ össze [30,31]. Így a kvercetin molekulák bevezetése a membrán környezetébe (különösen az idegsejtekbe) jelentős következményekkel járhat a működésükre.

Annak ellenőrzésére, hogy a modellrendszerekben meghatározott kvercetin hatás jótékony vagy kedvezőtlen szerepet játszik-e a sejtekben, a modellmembránokra kapott eredményeket összehasonlítottuk ennek a vegyületnek az egész neuroblasztóma sejtekre gyakorolt hatásával. Az SK-N-SH sejtek esetében az MTT-tesztet elvégezték,Cistanche kivonat Alzheimer-kór elleniinformációt adva a sejtek életképességéről, amely viszont közvetlenül arányos a mitokondriális dehidrogenáz enzimekkel.

A kapott eredmények azt mutatták, hogy a kvercetin jelenléte 100 és 200uM koncentrációban növelte az életképes sejtek számát. Hasonló eredményeket kapott Bao et al. [32], megvizsgálva a kvercetin hatását a PC-12 sejtekre. Az EXTRACELLULÁRIS környezetbe történő LDH-szivárgást, amely információt ad a sejtmembrán megzavarásáról, szintén ugyanazon a kvercetinszinten vizsgálták. A kapott eredmények azt mutatták, hogy a vizsgált sejtek membránjai ilyen körülmények között nem sérültek meg. Boots et al. [2], a kvercetin tüdőhámsejtekre gyakorolt hatását tanulmányozva hasonló eredményeket figyeltek meg. Ezért arra a következtetésre juthatunk, hogy ezeken a koncentrációkon a kvercetin pozitív hatással van a sejtekre, növelve azok életképességét.

A kvercetin hatás mechanizmusának második fontos aspektusa az antioxidáns tulajdonságaihoz kapcsolódik. A vizsgált polifenol kapcsolódó hatásának felmérésére olyan kísérleteket végeztünk, amelyekben ellenőriztük, hogy a kvercetin védő szerepet játszik-e az oxidatív stressznek kitett sejtekben. Az oxidatív stresszt úgy generáltuk, hogy H-t, O2-t vezettünk be a sejtkörnyezetbe.Cistanche a memória javításáértAmint azt ebben a tanulmányban kimutatták, a hidrogén-peroxid jelentős sejtpusztulást okoz, amelyet a mitokondriumok károsodásaként fejeznek ki.

Amikor az SK-N-SH sejteket 3 órán át tenyésztettük egy 3 és 5 mM H2O2-t tartalmazó közegben, a sejtek életképessége a kezeletlen sejteké körülbelül 44%-ára csökkent (MTT-vizsgálat). A vizsgálatok azt mutatták, hogy a sejtek kvercetinnel történő 24 órás előkezelése az élő sejtek számának növekedését okozza a H2O2-vel kezelt sejtekhez viszonyítva. Suematsu et al. [13] hasonló hatásokról számolt be.

Megmértük az MDA szintjét is, amely az oxidatív stressz biomarkere, mint a lipidperoxidáció végterméke[33]. A magas kvercetin koncentrációjú sejtek előkezelése, majd hidrogén-peroxid hozzáadása az MDA-tartalom enyhe növekedését eredményezte azokhoz képest, amelyek önmagukban HO-nak vannak kitéve. Ennek az lehet az oka, hogy a kvercetin (nagyobb koncentrációban) oxid-reduktív aktiváción is áteshet, és redox körforgás tárgyát képezheti, intracellulárisan reaktív oxigénfajokat generálva [34].

A kvercetinnel és H2O2-vel kezelt sejtek membránpusztulásában (amint azt a változatlan LDH-szint jelzi) nem történt jelentős változás ahhoz az esethez képest, amikor a sejteket csak oxidatív stressznek tették ki. Ezért arra a következtetésre juthatunk, hogy a lipid-peroxidáció növekedése ellenére (magas kvercetin-koncentrációban) ez nem volt elég jelentős ahhoz, hogy elpusztítsa a membránokat és megzavarja azok folytonosságát.

A natív rendszerre vonatkozóan kapott megfigyelések olyan modellrendszerre kaptak, ahol pontosan mind a kvercetin koncentrációt, mind a stresszszintet ellenőrizni lehet. Ellenőrizték, hogy a neuroblasztóma membrán lipid része hogyan rezisztens az oxidatív stresszel szemben. A stresszhelyzeteket úgy hozták létre, hogy ózont juttattak a pufferbe, amelyben a vízi környezetben az ózon bomlási reakciókon megy keresztül, oxidatív gyököket, többek között hidroxilgyököket és szuperoxid-aniongyököket képezve [35]. A reaktív oxigénfajok kapott keveréke megfelel a sejtekben természetesen előfordulóknak, a redox állapotzavar-rendellenességek egyensúlyhiánya miatt [36-38].

A stressz hatására az izotermák alakja megváltozott, ami azt jelzi, hogy a sűrűn csomagolt egyrétegű egyrétegű egyetlen molekulára jutó terület jelentősen csökkent. Ilyen változásokra a zsírsavláncokban a telítetlen kötések oxidációja miatt került sor. Ez a hatás az ózonkoncentráció körülbelül 0,3 ppm-re történő növekedésével nőtt, majd ez az izoterma paraméter ugyanazon a szinten maradt a ROS növekedése ellenére. Ez azt jelenti, hogy körülbelül 0,3 ppm ózonkoncentráció mellett a monorétegben lévő összes telítetlen zsírsav oxidálódott (a neuroblasztóma modellben a telítetlen zsírsavak teljes mennyisége 52% volt).

Az oxidált egyrétegűek jelentős merevséggel rendelkeznek,cistanche kínaiulahogy azt a Cs-1 érték képviseli (minél nagyobb a paraméter értéke, annál nagyobb a réteg merevsége). Kvercetin jelenlétében, még alacsony koncentrációban (6,25 μM) is, az ózonnak kitett membrán módosításai, amint azt az Alim-érték változásai mutatják, jelentősen csökkentek (5a. ábra), ami bizonyítja ennek a vegyületnek az antioxidáns aktivitását. Érdemes azonban megjegyezni, hogy bár a kvercetin megtisztította a gyököket, védve a telítetlen zsírsavakat az oxidációtól, nem fordította meg a membrán merevségének változásait (5b. ábra).

Így kimutatták, hogy a kvercetin antioxidáns hatást mutat, de a lipidmolekulák közötti puszta jelenléte befolyásolja (meghatározza) a laver paramétereit, azaz a zsírsavláncok oxidációval szembeni védelme ellenére a membrán merevsége jelentősen csökkent (a Cs-I értéke körülbelül 25% -kal alacsonyabb a kontrollhoz képest).

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a membránváltozás a fő tényező a kvercetin jelenlétéből eredő sejthatásokban. Ennek a változásnak a következményei (a jelátvitel, a transzport módosítása) azonban a polifenol molekulák számától, a membrán kezdeti összetételétől és a sejt funkciójától függően változnak. Ez megmagyarázza, hogy különböző körülmények között és különböző tanulmányokban a kvercetin védőhatást mutat, míg másokban éppen ellenkezőleg.

Magas oxidatív stressz esetén az antioxidáns hatás segíti a sejtet azáltal, hogy megvédi összetevőit a károsodástól. Ha azonban a membránokat jelentősen módosítják azáltal, hogy ezt a vegyületet a környezetükben helyezik el, ami a jelátviteli vagy szállítási útvonalak eloszlását eredményezi a membrán merevségének megváltozásával, ez kedvezőtlen hatásokhoz vezethet. Emlékeztetni kell arra is, hogy a sejtben sok folyamat egyszerre zajlik, mind a membránokkal, mind az oxidatív stresszt generáló folyamatokkal. A konkrét mutatók szintjének meghatározásával megfigyelhető és mérhető hatás mindig teljes. Ezért vannak olyan helyzetek, amikor a kvercetin hatását kedvezőnek és kedvezőtlennek tartják.

4. Anyagok és módszerek

4.1.Anyagok

A neuroblasztóma sejtek membránjának lipidrészének modelljének összetételét a [39-41] szerzőinek munkája alapján állapítottuk meg. Foszfolipidek: 1-oleoil-2-palmitoil-sn-glicerin-3-foszfokolin;1-hexakozanil-d4-2-hidroxi-szn-glicerin-3-foszfokolin;1,2-dioleoil-sn-glicerin-3-foszfokolin; L-α-foszfatidil-etanol-amin (agy); szfingomielin (agy)-(Avanti Polar Lipids Inc., Alabástrom, AL, USA). A koleszterint elűzték (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Németország). A foszfolipid/koleszterin arány 79%–21% volt. A telített és telítetlen zsírsavak aránya 48% és 52% között volt.

A kémiai tisztaságú Poch oldószerei (kloroform, etanol) (Gliwice, Lengyelország); a HLP 5 Hydrolab (Straszyn, Lengyelország) által termelt frissen ionmentesített víz. A táptalajt, a szérumot és az antibiotikumokat a CytoGen GmbH-tól vásárolták. A kísérletekben használt kémiai reagenseket a Sigma Aldrich-tól kaptuk.

4.2.Sejttenyészet

Humán neuroblasztóma sejtvonal SK-N-SH (Hitelesített Sejttenyészetek Európai Gyűjteménye (ECACC) 10% magzati szarvasmarha szérumban (FBS) tenyésztették ki dulbecco módosított sas közegében (DMEM), kiegészítve 0,01% penicillin-streptomicinnel 37 °C-on nedvesített légkörben, 5% CO2-t tartalmazó légkörben.

4.3. A sejtek életképességének mérése (MTT-vizsgálat)

A sejteket egy 96 lyukú lemezbe vetettük, lyukanként 1×104 sejt sűrűséggel, 0,1 ml térfogatban. A sejteket 24 órán keresztül kezeltük különböző koncentrációjú kvercetinnel (3,75-200 μM). Ezután 3 mM és 5 mM hidrogén-peroxidot adtunk hozzá 3 órán keresztül. Mivel a HO2 3 és 5 μM koncentrációban nem voltak különbségek, statisztikai vizsgálatokhoz ugyanazokat a kezeléseket kezelték, és 3-5 uM H2O2 kezelésként írták le.

Ezután 50μl MTT(3-【4,5-dimetil-tiazol-2-il】-2,5 difenil-tetrazolium-bromid)oldatot (5 mg/ml steril törzsoldat) adtunk a sejtekhez, és 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk párásított 5%CO-ban, légkörben. Ezután 0,4 ml dimetil-szulfoxidot (DMSO) adtunk minden vájathoz, és 10 percig tartottuk. Centrifugálás után a felülúszó optikai sűrűségét 570 nm-en mértük mikroliterlemez-olvasóval (BioTek Instruments, VT, USA).

4.4.Mem1brane kárvizsgálat (LDH vizsgálat)

A laktát-dehidrogenáz (LDH) vizsgálatot a sejtmembrán egészének markereként használtuk.

A kútonként 1× 10* sejtet tartalmazó sejteket 96 lyukú lemezbe vetettük, és kvercetin (3,75-200 μM) jelenlétében 24 órán keresztül inkubáltuk; Ezután 3 mM-et és 5 mM H2O-t adtunk hozzá 3 órára. A 0,5 ml 0,75 mM nátrium-piruvátot és 10 ml NADH(140 μM)-et tartalmazó csövekhez (37 °C-on 10 percig melegítve) 150 μL felülúszót adtunk hozzá, és 30 percig inkubáltuk 37 °C-on. Ezután 0,5 ml 2,4-dinitrofenil-hidrazint adtunk a mintához, és 1 óra elteltével az abszorbanciát 450 nm-en mértük.

4.5. A lipidperoxidáció (MDA-koncentráció) meghatározása

A membrán lipid peroxidációját tiobarbitursav (TBA) malondialdehiddel (MDA) reakcióval becsültük meg. A sejteket 46 lyukú lemezekbe vetettük, amelyek kvercetint és H,O2-t tartalmaznak (a fent leírt koncentrációkban és időkben) 1×104 sejt / lyuk mennyiségben, 0,25 ml térfogatban. A kezelés után a mintákat összegyűjtöttük és centrifugáltuk (1000×&,5 perc). A pelletekhez 0,5 ml 0,5%TCA-t adtunk hozzá, 1 percig örvénylettünk, és 5 percig ultrahanggal lihegtünk. 10 000 g×-os centrifugálás után 10 percig 0,4 ml felülúszót adtunk az 1,25 ml-es 20%-os TCA-hoz 0,5%TBA-val, és száraz termoblokkban (100°C) 30 percig melegítettük. Lehűlés után az abszorbanciát 532 nm-en mértük az MDA mólkihalási együtthatójával, amely 155 M-1 cm-1 volt.

4.6.Modellmembránok

Puffer ózonálás. A foszfátpuffer (0,01 M, pH 7,4)az FM 500 ózongenerátor (Grekos, Lengyelország) által termelt ózonnal telített. A pufferben lévő ózonkoncentrációt Bader és Hoigne szerint határoztuk meg [42].

Felületi nyomás izotermák.cistanche pénisz növekedéseA Langmuir vályút (KSV, Finnország) a felületi nyomás izoterma regisztrálására használták állandó sűrítési sebességgel, amely 5 mm/perc gátsebességnek felel meg. A lipid monoréteget úgy alakítottuk ki, hogy meghatározott mennyiségű lipid kloroform oldatot 1 mg/ml koncentrációban terítettünk el a 0,01 M foszfátpufferből, 7,4 pH-ból kvercetinnel vagy anélkül, valamint ózonnal vagy anélkül álló alfázison. A felületi feszültségeket Pt-Wilhelmy lemezzel mértük. A kísérleteket 25°C±1°C-on végeztük.

4.7. Statisztikai elemzés

Minden egyes vizsgált változatra három-hat független elemzést végeztünk, és átlagoltuk (±SD). A kontrollokhoz képest jelentős különbségeket a SAS ANOVA eljárás alkalmazásával becsülték meg. A statisztikai elemzést Duncan több tartományú tesztjével végeztük, p-t véve<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">

Szerző hozzászólásai: Konceptualizáció, B.K., B.D., és E.R.-S.módszertan, B.K. B.D.; szoftver, B.K., B.D.validation, B.K., B.D., E.R.-S., A.B.írás — eredeti tervezet előkészítése B.K., B.D., E.R.-S., írás – áttekintés és szerkesztés, B.K., B.D., E.R.-S., A.B.visualization, B.K., B.D.supervision, B.K., B.D., E.R.-S., A.B.B.Minden szerző elolvasta és elfogadta a kézirat közzétett változatát.

Finanszírozás:Ez a kutatás nem kapott külső finanszírozást.

Intézményi Felülvizsgálati Testületi Nyilatkozat: Nem alkalmazható.

Tájékoztatáson alapuló beleegyező nyilatkozat: Nem alkalmazható.

Adat-rendelkezésre állási nyilatkozat: Az adatokat a cikk tartalmazza. Összeférhetetlenség: A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Ez a cikk a Molecules 2021, 26, 4945-ből származik. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules