Az öregedés és a hosszú élettartam mindig is csábító téma volt az élőlények számára. Egyfajta felnőtt őssejtként, amely képes az önmegújulásra

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Absztrakt:A mesenchymális őssejtek (MSC) öregedése nemcsak akadályozza az MSC-k alkalmazását a regeneratív gyógyászatban, hanem szorosan összefügg a biológiai öregedéssel és a degeneratív betegségek kialakulásával is. Ebben a tanulmányban a kurkumin (Cur) öregedésgátló hatásait vizsgáltuk kutya csontvelő-eredetű MSC-kre (cBMSC), és tovább tisztáztuk az autofágia modulációján alapuló lehetséges hatásmechanizmust. A cBMSC-ket in vitro szaporítottuk standard eljárásokkal, hogy korai öregedési sejtmodellt hozzunk létre.cistanche adagolás redditBizonyítékaink azt mutatják, hogy a cBMSC-k harmadik passzálásával összehasonlítva sok tipikus öregedéssel összefüggő fenotípust figyeltek meg a cBMSC-k hatodik passzázsában. A Cur-kezelés javíthatja a cBMSC túlélését és késlelteti a cBMSC öregedését azon megfigyelések szerint, hogy a Cur(1 uM) kezelés javíthatja a kolóniaképző egység-fibroblasztok (CFU-Fs) hatékonyságát, és fokozhatja a pluripotens transzkripciós faktorok (SOX{{5}) mRNS expresszióját. } és Nanog), valamint gátolja az öregedéssel összefüggő béta-galaktozidáz (SA- -gal) aktivitást és az öregedéssel kapcsolatos markerek (pl6 és p21) és a gyulladást elősegítő molekulák (tumornekrózis faktor) mRNS expresszióját. (TNF-a) és interleukin-6(IL-6)). Ezenkívül a Cur (0.1 uM~10 μM）) fokozza az autofág aktivitást, amit a mikrotubulusokhoz kapcsolódó protein 1 könnyűlánc 3 (LC3) felszabályozása azonosított, az autofágiát aktiváló kinázhoz hasonlóan -1 (ULK1), autofágiával kapcsolatos gén (Atg)7 és Atg12, valamint a könnyű lánc 3 (LC3-II) II-es típusú generálása, ezáltal növelve az autofág vakuolákat és a savas hólyagos organellumokat, mint valamint a p62 fehérjeszint jelentős csökkenését okozza. Ezenkívül az autofágia aktivátor rapamicin (RAP) és Cur részlegesen javítja a cBMSC-k öregedési jellemzőit, míg az autofágia-gátló 3-metiladenin (3-MA) súlyosbítja a cBMSC-k öregedését, és a Cur-kezelés képes helyreállítani az elnyomott autofágiát és ellensúlyozni az 3-MA által kiváltott cBMSC öregedést. Ezért tanulmányunk rávilágít a Cur-indukált autofágia fontos szerepére és a cBMSC öregedésének javítására gyakorolt ​​​​hatására, és új betekintést nyújt az öregedés késleltetésére és az MSC-k terápiás potenciáljának javítására.

További információért kattintson ide

Kulcsszavak:kurkumin;öregedés; autofágia; kutya csontvelőből származó mezenchimális őssejtek

1. Bemutatkozás

Az öregedés és a hosszú élettartam mindig is csábító téma volt az organizmusok számára. Az önmegújulásra, immunszuppresszióra, differenciálódásra és migrációra képes felnőtt őssejt típusaként a mesenchymális őssejtek (MSC) kiterjedten találhatók különböző szövetekben és szervekben, például csontvelőben, zsírszövetben, magzatvízben, méhlepényben, köldökben. köldökzsinór és izom [1,2], és alapvető szerepet játszanak a szöveti homeosztázis fenntartásában a szervezet teljes élettartama alatt [3,4]. A felhalmozódó bizonyítékok feltárták, hogy a biológiai öregedés és számos degeneratív betegség kialakulása az MSC öregedésének tulajdonítható [5,6]. Ezen túlmenően, az MSC-k ígéretes forrásai a sejtalapú regeneratív terápia számára, de általában in vitro bővítésre szorulnak, hogy elérjék az MSC-k minimális transzplantációs számát (20-100 millió) a kezelésekhez [7]. Az in vitro tenyésztés azonban nem képes teljes mértékben szimulálni az MSC-k in vivo mikrokörnyezetét, és elkerülhetetlenül kiváltja a sejt öregedését [8,9] Az öregedés a mitotikus sejtekben számos stresszor hatására következik be, mint például a telomer diszfunkció [10], DNS. károsodást [11], oxidatív stresszt [12] és onkogén aktivációt [13], és végül a sejtosztódás megszakításához vezet. Ezenkívül az öregedő MSC-k negatív hatással vannak a biológiai funkciókra, beleértve az immunmodulációt, a differenciálódást és a migrációt [14]. Sok munka próbált hatékony stratégiákat kidolgozni az MSC-k öregedésének késleltetésére. A közelmúltban számos gyógynövényből származó terméket javasoltak a szervezet egészségének és hosszú élettartamának elősegítésére, és ígéretes eszközök lehetnek az MSC öregedésének késleltetésében [15].

A Cistanche öregedésgátló hatású

A kurkumin (Cur), a hagyományos kínai orvoslás kurkumából kivont hidrofób polifenol, nagy figyelmet keltett a szövetsejtekben és egyes betegségmodellekben kifejtett gyulladáscsökkentő, antioxidáns, antiapoptotikus, daganatellenes és öregedésgátló hatásai miatt [{ {4}}]. Számos tanulmány kimutatta, hogy Cur egészséggel kapcsolatos előnyökkel jár az életkorral összefüggő betegségekben, beleértve az osteoartikuláris, neurológiai, reproduktív és szív- és érrendszeri betegségeket [20-24]. Az öregedés a mozgásszervi változásokkal, valamint az osteoartikuláris betegségek kialakulásával és progressziójával jár együtt. A Cur-val végzett krónikus diétás beavatkozásról azt találták, hogy középkorú majmokban javítja a kéz és az ujjak motoros funkcióját, és jótékony hatással volt az idős vázizmokra [25,26]. Buhrmanntól és munkatársaitól származó adatok feltárták, hogy a Cur a porcsejtek túlélése és a gyulladásos válaszok egyensúlyba hozásával mérsékelheti a környezeti eredetű osteoarthritist [27,28]. Ezenkívül a Cur neuroprotektív hatást fejt ki az autofágia és a gyulladás közvetítésével, ezért hatékony terápia lehet a neurodegeneratív betegségekben, például Alexander-kórban, Alzheimer-kórban és Parkinson-kórban [29,30].

Valójában az a tény, hogy Cur pleiotróp aktivitással rendelkezik, az MSC-kre gyakorolt ​​aktiváló és védő hatásuknak tulajdonítható [31,32]. Számos tanulmány megerősítette, hogy a Cur részt vesz az immunmoduláló képességek szabályozásában; az MSC-k eltérő potenciálja a különböző sejtvonalakhoz (neurociták, porcsejtek, zsírsejtek és oszteoblasztok), és számos jelátviteli mechanizmusban vesz részt ebben a folyamatban [2831,33-35]. Ezenkívül a Cur jó antioxidánsnak is tekinthető, amellyel javítja a patkány zsírszövetből származó mezenchimális őssejtek (ADSC) élettartamát a telomeráz reverz transzkriptáz (TERT) gén expressziójának növekedése miatt [36]. Egy közelmúltbeli tanulmány kimutatta, hogy a p65 Cur általi gátlása megakadályozhatja a sejtek öregedését és a gyulladásos aktivációt humán köldökzsinór-eredetű MSC-kben [37].cisztanche kivonat előnyeiNyilvánvalóan több figyelem irányult a Cur öregedésgátló hatásaira az MSC-kben a hatalmas terápiás potenciáljuk miatt, de a hatás mögött meghúzódó mechanizmusok még mindig tisztázatlanok. Néhány in vitro tanulmányból származó bizonyíték megerősítette, hogy a Cur által kifejtett jótékony hatások az autofágia modulációjának tulajdoníthatók [29, 38-41]. Han és munkatársai kimutatták, hogy a Cur képes megvédeni a humán köldökvéna endothel sejtjeit (HUVEC) a H2O2-indukálta oxidatív károsodástól, és pozitív hatások jelentkeznek az autofágia foszfatidil-inozitol 3-kinázon (PI3K)/Akt/ keresztül történő fokozásával. a rapamicin (mTOR) gátlás emlős célpontja [40]. Egy másik tanulmány kimutatta, hogy Cur képes elősegíteni a sejtek túlélését azáltal, hogy gátolja a hipoxia/reoxigenáció (H/R) által kiváltott apoptózist és a túlzott autofágiát a kardiomiociták között [41]. Ezért az, hogy a Cur az autofágia pozitív vagy negatív szabályozójaként működik-e, a stressztermelő ingertől és a sejtbeállítástól függ, és további részletekre van szükség annak meghatározásához, hogy az autofágia Cur általi modulálása hatékony stratégia-e az MSC öregedésének késleltetésére. Az intracelluláris anyagok lebontásának és újrahasznosításának elveként az autofágia kulcsfontosságú szerepet játszik a sejtek homeosztázisának fenntartásában és a környezeti nyomásnak való ellenállásban, és hatalmas potenciállal rendelkezik a sejtek öregedésének késleltetésében és az életkorral összefüggő betegségek kezelésében. Az elöregedő MSC-k kulcsfontosságú jellemzői az organellák diszfunkciója és a toxikus metabolitok felhalmozódása [42], ami potenciális kapcsolatra utal az autofágia és az öregedés között. Ma és munkatársai azt találták, hogy az idős BMSC-k autofágiás aktivitása csökkent a fiatal BMSC-ekhez képest, és hogy az autofágiát gátló 3-metiladenin (3-MA) felgyorsíthatja a fiatal MSC-k öregedését; ezzel szemben azt találták, hogy az autofágia aktivátor rapamicin (RAP) részben helyreállíthatja az elöregedett BMSC-k biológiai tulajdonságait[5]. Egy nemrégiben készült tanulmány a modulált autofágia szerepét vizsgálta a RAP és a 3-MA alkalmazása révén a D-galaktóz (D-gal) által kiváltott MSC öregedésben, és kimutatta, hogy a RAP jelentősen enyhítette az MSC öregedését [43]. Érdekes módon számos tanulmány kimutatta, hogy az autofágia növekedése figyelhető meg az öregedő MSC-kben, és hogy az autofágia nélkülözhetetlen az MSC öregedési folyamatainak fenntartásához [44, 45]. Ezért továbbra is ellentmondásos és kétértelmű, hogy az autofágia az MSC-k öregedésének pozitív vagy negatív szabályozójának tekinthető-e. Következésképpen érdekes lenne megvizsgálni az autofágia, az MSC öregedés és a Cur közötti kapcsolatot, amely szélesebb perspektívát nyújthat az öregedés késleltetésére és az MSC-k terápiás potenciáljának javítására.

Ebben a vizsgálatban elsődleges célunk annak tisztázása volt, hogy a Cur-kezelés késleltetheti-e a kutya csontvelőből származó MSC (cBMSC) öregedését, és hogy a mögöttes mechanizmus összefüggésben van-e az autofágia modulációjával. Ebből a célból értékeltük a fenotípusos jellemzést, az autofág aktivitást és a génexpressziót Cur expozíció után öregedő cBMSC-kben, valamint azt, hogy az autofágia és a cBMSC-k öregedésére gyakorolt ​​hatása közötti összefüggést a 3-MA és a RAP segítségével határoztuk-e meg. .

2. Eredmények

2.1. A cBMSC-k jellemzői

A cBMSC-ket in vitro szaporítottuk standard eljárásokkal, és kimutatták, hogy kilenc generáción keresztül stabilan passzáltak (az adatokat nem mutatjuk be). A cBMSC-k műanyaghoz tapadó és fibroblasztszerű megjelenést mutattak a tenyésztési folyamat során (1A ábra). A cBMSC-k differenciálódási képességét adipogén és oszteogén indukció igazolta (1B, C ábra). A cBMSC-k immunfenotípusát áramlási citometriával értékeltük. Az eredmények azt mutatták, hogy a sejtpopuláció pozitívan expresszálta a CD90-et, CD105-öt és az ITGB1-et, és negatívan expresszálta a CD31-et, CD34-et és CD45-öt, ami inkább mesenchymális, mint hematopoietikus eredetre utal (1. ábra és 1. táblázat).

2.2. A cBMSC-k fokozatosan jelenítik meg az öregedési jellemzőket az In vitro kiterjesztéssel

A korai passzázs cBMSC-k (P1 és P3) hosszú fusiform vagy háromszög alakúak, és in vitro növekedés után örvénybe rendeződnek (2A. ábra). Ezt követően a cBMSC-k fokozatosan öregedéssel összefüggő fenotípusokat mutattak a hosszú távú in vitro tenyésztés során, amelyet megnövelt és lapos morfológia és a proliferáció csökkenése jellemez (2A, B ábra). Ezenkívül a kolóniaképző egység-fibroblaszt (CFU-F) vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy mind a CFU-F száma, mind a telepek mérete jelentősen csökkent a tenyésztési passzálások mentén (2C. ábra), összhangban a csökkentett mRNS-sel. pluripotens transzkripciós faktorok Nanog és SOX{13}} expressziója a 6. és 9. passzázsban (2G. ábra).

Az öregedéssel összefüggő -galaktozidáz (SA- -gal) egy lizoszómális enzim, amelynek aktivitása erősen korrelál a sejt öregedésével [46]. Az SA- -gal festés eredményei azt mutatták, hogy az SA- -gal pozitív sejtek száma 7,5±2,4 százalékról (P3) 65-re nőtt.0 ±5.0 százalék (P6) és 87,3±3,3 százalék (P9) (2D ábra).Cisztancse Dzsingisz kánEzenkívül a sejtciklus-kináz inhibitorok (p21 és p16) és a gyulladást elősegítő molekulák (TNF- és IL-6) expressziójának növekedését észlelték, amelyek az öregedéssel összefüggő szekréciós fenotípus (SASP) összetevőiként működnek. a 6. és 9. átjáróban (2E, F ábra). Ezért a cBMSC-k passzázstól függő növekedést mutatnak az öregedő fenotípusokban, és a 9. passzázsnál leállítják a proliferációt.

2.3. Cur Enyhíti a cBMSC-k öregedési állapotát

A 6. átoltott cBMSC-ket Cur hiányában vagy jelenlétében inkubáltuk 0,1,0,5, 1,5 vagy 10μmol/mL (μM) dózisban. 12 óra, 24 óra, 48 óra és 72 óra, és sejtes életképességüket CCK-8 segítségével értékeltük. Az eredmények azt mutatták, hogy a Cur (0.1-10 uM) nem vált ki toxikus hatást a cBMSC-kben, és érezhető hatása van a cBMSC-k életképességének növelésére 24 órás kezelés után (3A. ábra). A Cur celluláris öregedésre gyakorolt ​​hatásának értékelésére a cBMSC-ket 24 órán át különböző Cur (0,1, 1 és 10 uM) koncentrációknak tesszük ki. Az eredmény azt mutatta, hogy az SA- -gal-pozitív sejtek száma szignifikánsan csökkent a cBMSC-kben Cur (1 μM és 10 uM) kezelés után a kontrollcsoporthoz képest (3B. ábra). CFU-F vizsgálatokat alkalmaztak a Cur hatásának értékelésére a cBMSC(P6) önmegújulási hatékonyságára. Az 1 uM Cur dózist találták a leghatékonyabb koncentrációnak a cBMSC-k CFU-F hatékonyságának javítására. A 10 μM Cur dózis azonban káros hatással volt a cBMSC-k önmegújulási hatékonyságára (3C. ábra). Ezen túlmenően a Cur öregedéscsillapító hatását 1 μM dózisnál figyelték meg, ami a p16 downregulációjában nyilvánult meg. IL-6, valamint a TNF- és a Nanog és SOX-2 expressziójának fokozása (3D-F ábra).ciszterna élettartam meghosszabbításaÖsszességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Cur 1 uM dózisban hatékonyan fejthet ki citoprotektív hatást az öregedő cBMSC-kre.

2.4. Cur Treatment Enhanced Autophagic Activity in cBMSCs

A lizoszóma funkcionális aktivációja kritikus szerepet játszik az autofágia lefolyásában, és a lizoszómális savasodás zavarai hátrányosan befolyásolják a lizoszóma degradációs funkcióját [38]. Ezért az autofág aktivitást először LysoTracker festéssel mutatták ki, amely képes nyomon követni a lizoszómális savasodást. Az eredmény azt mutatta, hogy a Cur-val végzett előkondicionálás dózisfüggően növelte a vörös fluoreszcencia intenzitását a cBMSC-ben, ami arra utal, hogy a lizoszómák savasodása megnövekedett (4D ábra).

A Cur cBMSC-k autofágiájára gyakorolt ​​hatásának további értékeléséhez az autofagoszóma markereket, a mikrotubulusokhoz kapcsolódó 1A/1Belight lánc 3 (LC3) és p62/SQSTM1 fehérjét használtuk, amelyek kulcsfontosságú markerek az autofágiás fluxus értékelésében[47,48 ]. A megnövekedett autofág aktivitást a Cur expozíciót követően figyelték meg a cBMSC-kben, amint azt az LC{{10}}I LC3-II-vé való átalakulásának dózisfüggő növekedése mutatja, a gyorsuló p62 mellett. degradáció (4A. ábra). Ezenkívül az ATG7, ATG12.LC3 mRNS expressziója. és az ULK1 a Cur-kezelés után felfelé szabályozott (4B. ábra). A cBMSC-k ultrastruktúráját transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgáltuk. Ezután megfigyeltük az autofagoszómák és autolizoszómák képződésének növekedését a cBMSC-kben 0,1, 1 és 10 μM Cur dózisokkal 24 órán keresztül végzett kezelés után (4C. ábra).cistanche nzAz immunfluoreszcens festés azt is megmutatta, hogy az LC3 jellegzetes pontozott fluoreszcens pontjainak száma jelentősen megnőtt a Cur-kezelés hatására (4E. ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a Cur dózisfüggő módon elősegítheti a lizoszómális savasodást és az autofágia aktiválódását.

Ez a cikk az Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms