A bőr öregedésgátló aktivitásával felruházott Oenothera Biennis sejtkultúra-kivonat javítja a sejtek mechanikai tulajdonságait

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Absztrakt:A bőr öregedése egy nagyon jól ismert folyamat, amely a bőr mechanikai jellemzőinek fokozatos romlását okozza az extracelluláris mátrix gépezet termelésének csökkenése és az összehúzódási folyamat egyidejű változása miatt. Ennek a progressziónak a lelassításához kulcsfontosságú számos olyan fehérje expressziójának indukálása, amelyek elősegítik az elasztikus rostok kialakulását és a szövetek helyreállítását. Itt az Oenothera bi-Ennis sejttenyészet vizes kivonatát kémiai szempontból vizsgálták, majd in vitro, sejtben, illetve ex vivo kísérletekben, mint adjuváns a bőröregedés elleni küzdelemben. kimutatták, hogy az Oenothera biennis kivonat a MYLK génexpresszió növelésével képes volt elősegíteni a mátrix kollagén összehúzódását, az aktin polimerizációt és az esszenciális ECM fehérjék termelését.

Kulcsszavak:metabolomika; molekuláris hálózatok; Oenothera biennis sejtkultúrák hidrofil kivonata; mátrix kollagén összehúzódás; bőröregedés

1. Bemutatkozás

A bőr öregedése egy nagyon jól ismert folyamat, amelyet endogén és exogén tényezők indukálnak. Az öregedés során a bőr összes élettani funkciója menthetetlenül degenerálódik, és ez a fokozatos leromlás károsítja a bőrt [1]. Valójában a bőr fokozatosan elveszíti mechanikai tulajdonságait, ami egyrészt az extracelluláris mátrixfehérjék termelésének hanyatlásának, másrészt az összehúzódási folyamat egyidejű változásának köszönhető [2]. A dermisz extracelluláris mátrixának legfontosabb komponensei az olyan fehérjék, mint a kollagén I és IIl, a laminin, a periosztin, a tenascin, az elasztin, a fibronektin és a proteoglikánok, mivel ezek relatív mennyisége és feltekeredési állapota kulcsszerepet játszik a sejtek és a sejtek közötti kölcsönhatásban. mátrix, amely garantálja a dermis megfelelő textúráját [3]. Például az extracelluláris térben a fibronektin kulcsszerepet játszik a mátrix összeállításában, mivel hidat képez a sejtfelszíni receptorok (pl. integrinek) és a kollagén, a proteoglikánok és más fokális adhéziós molekulák között. A lamininok hozzájárulnak az extracelluláris mátrix szerkezetéhez, és modulálják az adhéziót, a differenciálódást, a migrációt, a fenotípus stabilitását és az apoptózissal szembeni rezisztenciát. Az elasztin a sejtadhézióban és a sejtmigrációban is fontos, és képes részt venni a sejtjelátvitelben. A fibrillinek hasonlóan szoros kölcsönhatásba lépnek a tropoelasztinnal és az integrinekkel, és fontosak az elasztinok rugalmas rostokká történő összeállításában. A Fabulous szorosan kapcsolódik az alapmembránokhoz, rugalmas rostokhoz és az extracelluláris mátrix egyéb összetevőihez, és részt vesz az elasztikus rostok kialakulásában. A tenascinok extracelluláris mátrix (ECM) polimorf glikoproteinek, amelyek fibrotikus folyamatokat közvetítenek, hogy lehetővé tegyék a szövetek hatékony helyreállítását. beállítják a bőr megfelelő feszességét, elősegítve a mátrix komponensek közötti érintkezést, amelyek viszont felelősek a dermis tömörségéért, sűrűségéért és ellenállásáért. Sejtes citoszkeleton szerveződésük alapja az aktin-miozin gépezet, amely meghatározza az alakjuk és szerkezetük esetleges változásait. Az aktin és a miozin kötődése ugyanis kompaktabb sejtkonformációt indukál, közelebb hozza egymáshoz a rostokat, garantálja az egészséges és tömör szövetek kialakulását, és megakadályozza a rostok szétesését, ami ráncosodást eredményez. A fibroblasztok összehúzódási és nyúlási képessége azonban évek múlásával részben elveszik, mivel az elöregedett sejtek már nem képesek megfelelően és teljesen működni. Az alacsonyabb mechanikai erő miatt a fibroblasztok lekerekítettebb és torzabb morfológiájúak, mint a megnyúltak [5]. Egyes bizonyítékok azt mutatják, hogy az öregedés során a MYLK (miozin könnyű lánc kináz) nevű fehérje szintézise jelentősen csökkent. A MYLK egy specifikus miozin domén, a miozin szabályozó könnyű lánc foszforilációja által kifejtett kináz aktivitással rendelkezik, amely képes indukálni az aktinkötést, és ezáltal elősegíti a sejtösszehúzódást [6].bioflavonoidokAmikor ennek a fehérjének alacsony aktivitását észlelték, például a fehérje kisebb expressziója miatt, a mátrix kollagén összehúzódásának [7] és az aktin polimerizációnak [8] megfelelő csökkenését mértük. Az aktin citoszkeleton összeállítása nemcsak a sejtek mozgásához és összehúzódási képességéhez kapcsolódik, hanem az ECM-mátrix fehérje termelődéséhez is a TGF-II receptor (TGFBRII) aktiválása révén[9]. A TGFBRII a TGF-sejtfelszíni receptor komplexhez tartozik, amely a Smad transzkripciós faktorok aktiválása révén számos, az ECM komponenseit kódoló gén expresszióját szabályozza, beleértve a kollagént, a laminint, a fibronektint és a proteoglikánt [10]. Az aktin citoszkeleton szétszerelése leszabályozza a TGF-Il receptort. Ez a leszabályozás viszont csökkenti a kollagén és más ECM fehérjék termelődését, ami a bőr tömegének és a bőr törékenységének csökkenéséhez vezet.

Valójában sok kozmetikai összetevő célja több kulcsfontosságú tényező szintézisének stimulálása, amelyek felelősek a dermális mátrix megfelelő tömörségének megőrzéséért és a bőr jó összehúzódásáért. Ebben a forgatókönyvben az Onagraceae családba tartozó Oenothera biennis (ligetszépe) fajból származó kivonatok nagy érdeklődésre tartanak számot, mivel bioaktív vegyületeket tartalmaznak, például zsírsavakat, fenolokat, triterpéneket és flavonoidokat, amelyeket már korábban is használtak. különféle patológiás bőrbetegségek kezelésében tesztelték [11]. Ezen metabolitok némelyike ​​pedig a jelentések szerint elnyomja a gyulladásközvetítőket, például az interleukin 1-et (IL-1), az interleukin-6-ot (IL-6), a citokineket és a tumornekrózis faktort (TNF-)[12]. ]. Ezenkívül az Oenothera biennis légi részek kivonatai megvédték a HaCaT sejteket a H, O által kiváltott DNS-károsodástól és a sejthaláltól azáltal, hogy blokkolták az oxidatív stressz okozta sejtkárosodást egy olyan mechanizmuson keresztül, amely magában foglalja a ROS eliminációját és a Nrf2/HO-1 jelátviteli útvonalat [ 13]. Ezenkívül a lipidekben gazdag Oenothera biennis olajat jó hidratálóként javasolták az ekcémás betegek számára, köszönhetően annak, hogy könnyen áthatol a bőrön [14]. Sajnálatos módon a kultúrnövények kozmetikai célú kivonatai tartalmazhatnak néhány hátrányt: egyrészt mérgező vagy allergén anyagokkal, például peszticidekkel, műtrágyákkal vagy szennyező anyagokkal szennyezettek; ekkor a növények kiszámíthatatlan stressznek és szezonális körülményeknek vagy a tápanyag-elérhetőség változásainak vannak kitéve, ami váratlan metabolitok szintézisét idézheti elő. Ezenkívül a kivonatok tartalmazhatnak patogén mikroorganizmusokat, amelyek rontják a végtermékek minőségét. Mindezek a hátrányok viszont a másodlagos metabolitok változó tartalmának és az alacsony reprodukálhatóságnak a kockázatához vezetnek. E gyengeségek leküzdésére a növényi sejtkultúrák kozmetikai felhasználása egyre népszerűbbé és nagyra értékelhetővé válik, mivel számos fent említett hátrányt kiküszöböl [15].

További információért kattintson ide

Ebben a tanulmányban az Oenothera biennis sejttenyészetek (ObHEx) hidrofil kivonatát fejlett tömegspektrometrián alapuló megközelítésekkel, bioinformatika segítségével teljes mértékben jellemezték, és számos biokémiai és biológiai vizsgálattal tesztelték. A keverék főként lignánokból és triterpénekből álló bioaktív vegyületeket tartalmaz, mint például az arjunolsav és az ázsiaisav, amelyet korábban a humán fibroblasztok pro-kollagén I termelésével hoznak összefüggésbe [16,17]. A kivonat MYLK expresszióját fokozó képességét, a mátrix kollagén összehúzódását, az aktin polimerizációt és a TGF által szabályozott ECM fehérjék termelését vizsgálták, amelyek elősegítik a dermis összehúzódását, ezáltal lassítják a bőr öregedését.

2. Eredmények

2.1. Az Oenothera Biennis sejttenyészet vízoldható kivonatának minőségi és mennyiségi elemzése

Elvégezték az ObHEx UPLC-MS/MS analízisét, és a nagy felbontású spektrometriai adatokat felhasználták a kémiai jellemzéshez a Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) segítségével, egy web-alapú tömegspektrometriai rendszerrel, amely segít a természetes termékek azonosításában és megjegyzéseiben. (NPS)[18]. Célja, hogy nyílt hozzáférésű tudásbázis legyen a közösségi szintű szervezetek számára, valamint a nyers, feldolgozott vagy megjegyzésekkel ellátott fragmentációs tömegspektrometriai adatok (MS/MS) megosztása. Konkrétan a GNPS spektrális könyvtári kereséseket és egy jellemző alapú molekuláris hálózat (FBMN) munkát végeztünk: az első elemzés lehetővé tette számunkra a természetes vegyületek azonosítását, összehasonlítva azok MS/MS spektrumát a szerkezetileg jellemzett metabolitok spektrumaival, a második pedig a csoporttal kapcsolatos. NP-k egy hálózaton belül, mivel hasonló MS/MS fragmentációs mintákat mutattak szerkezetileg hasonló molekulák [19]. Amint az 1. ábrán és az 1. táblázatban látható, kétségtelenül sok NPS-t úgy azonosítottak, mint a másodlagos metabolitok több osztályába tartozóként, főként a lignánokat (Salvador-félék és liriodendron) és a triterpéneket (muriatsav, ariunolsav, ázsiai sav és hederagenin). A GNPS által nem azonosított kémiai fajokat a szakirodalomnak megfelelően soroltuk be.

A GNPS használatának példájaként az FBMN-analízisből származó hálózatot a 2a. ábrán mutatjuk be, amely azt mutatja, hogy az ObHEx sok más, a nyálkasavval kapcsolatos, nem jellemző triterpént tartalmazott (18, m/z 503,3389, RT 21,89 perc: a muriátsav azonosítása elemzési standardjával való összehasonlítás megerősítette). Például különböző, korábban nem jellemzett fajokat 701 és 665 m/z-nél glikozilált formákként azonosítottak, amelyek rokonságban állnak a muriátsavval vagy annak izomereivel, két HO-molekulával hidratálva vagy nem.

Továbbá a közölt ionok m/z 729, 703, 699,687,685, 683, amelyek a glikozilációból származnak, plusz két H, O molekula m/z531, 505,501, 489,487 és 485 m/z-nél: ezek egyértelmű azonosítása nem sikerült, de nem sikerült. ezek mindegyike triterpéneknek tekinthető, amelyek rokonságban állnak a muriatinsavval vagy rokonaival, az MSMS fragmentációs útvonaluk miatt. A közelmúltban sok m/501 és 485 triterpént izoláltak egy másik Oenothera fajból, az Oenothera Maritimából, és szerkezetük spektroszkópiai adatok alapján tisztáztuk, így jól korrelál az eredményeinkkel [20].

A Cistanche öregedésgátló hatású

Az FBMN-analízis információkat szolgáltatott a 2b. ábrán látható molekuláris hálózatokban található, az Oenothera fajok szakirodalmában nem szereplő metabolitokról is (m/z 617,3862 (MS2 ionok m/z 453, 145 és 119). Ez az m/z érték és töredezettsége megegyezik az 2-OEp-kumaroil-apostolsavval vagy izomereivel, bizonyítva legalább a triterpén-kumaroil- és koffeoil-észterek jelenlétét a kivonatban. Valójában a fajok MS-spektrumai m/z 649-nél (RT 25,72 és 27,19) ionok jelenlétét mutatták m/z 179, 161 és 135 mellett a kávésav rész hasadása miatt, míg a többi faj MS2 spektruma A 2b. ábrán látható m/z 633 (RT 26,88, 27,20, 28,12 és 28,43), 649 (RT24,18, 24,65, 24,83) és 661 (RT 30,28) m/z-nél mutatott ionokat, amelyek m/z 145 és 119 voltak. a kumaroilcsoporthoz.

After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0.9911) a tesztelt tartományon belül. Ezen túlmenően a kimutatási határ (LOD) és a mennyiségi meghatározás határa (LOO) azt mutatta, hogy az alkalmazott módszerek nagy érzékenységgel rendelkeznek. A kvantitatív analízis eredményei (3. táblázat) azt mutatták, hogy a liriodendron és a hederagenin volt a fő képviselt lignán, illetve triterpén.

2.3. A MYLK gén expressziójának elemzése HDF-ben

Az ObHEx aktivitását HDF-ben tesztelték a MYLK gén expresszióján, amely a miozin könnyű lánc foszforilációjáért felelős kinázt kódolja (3a. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a kivonattal végzett kezelés mindkét koncentrációban körülbelül 50 százalékkal növelte a MYLK gén expresszióját, hasonlóan a pozitív kontroll TGF-hez.

2.4. A kollagénmátrix összehúzódási képességének elemzése

Az ObHEx kollagénrostok kontraktilis kapacitására kifejtett aktivitásának értékelésére kollagén gélkorongokban diszpergált HDF-et használtunk [21]. Amint az a 3b. ábrán látható, a kivonat alacsonyabb koncentrációban jelentős növekedést indukált a kollagénkorong összehúzódásában, ami arra utal, hogy potenciális hatással lehet a kollagén szilárdságára. A kezelés ML7-tel (1-(5-jódonaftalin-1-szulfonil)-1H-hexahidro-1,4-diazepin), egy MYLK-gátló, megszüntette ezt a növekedést, jelezve, hogy mind a kivonat, mind a TGF- a MYLK-n keresztül hat a kollagénlemez összehúzódására.

2.5. Az aktin polimerizációs szintjének mérése

Az ObHEx aktinpolimerizációt stimuláló képességét úgy vizsgáltuk, hogy megmértük a polimerizált aktin szintjét a kivonattal kezelt sejtekben és a pozitív kontroll TGF-, önmagában és ML7 jelenlétében. A 3c. ábrán látható, hogy a kivonat mindkét koncentrációjával végzett kezelés körülbelül 50%-os növekedést eredményezett a polimer aktin mennyiségében, szemben a TGF- 33%-ával.vegyél cistanche-tIsmét az ML7com-mal végzett előinkubálás teljesen megszüntette ezt a hatást, ami arra utal, hogy a MYLK részt vesz az aktin filamentumok polimerizációjában.

2.6. A TGF RII/SMAD útvonal elemzése HDF-ben

Annak ellenőrzésére, hogy az ObHEx-szel kezelt sejtek aktinpolimerizációjának és kollagén-összehúzódásának növekedése összefüggésben áll-e a TGF RII által közvetített jelátviteli útvonal aktiválásával, először a TGF RII gén expresszióját figyeltük meg, majd a HDF-et transzfektáltuk az SMAD{{ 0}}luciferáz riporter plazmidot, és értékelte a luciferáz aktivitás növekedését az ObHEx kezelés hatására. A 3d,e ábrán bemutatott eredmények azt mutatták, hogy az ObHEx-szel végzett kezelés 0,002 százalék és 0,006 százalék mellett a pozitív kontrollként használt TGF-hez hasonlóan növelte a TGF RII expresszióját, és ezzel párhuzamosan az SMAD-hoz kapcsolódó luciferáz aktivitás 80, illetve 40 százalékkal nőtt. Szignifikáns jelcsökkenést kaptunk, amikor a sejteket ML7-tel kezeltük, ami azt is mutatja, hogy ez az aktivitás a MYLK-hez kapcsolódik.

2.7. Pro-kollagén I, tropoelasztin és periostin elemzése

A TGF RII jelátviteli aktiválás eredményeként elemeztük a fő extracelluláris mátrix fehérjék, például az I-es típusú prokollagén, a tropoelasztin és a periosztin szintézisét ObHEx-szel kezelt HDF-ben 0,002 százaléknál. A 3f. ábrán látható módon az ObHEx körülbelül 98%-kal, 75%-kal, illetve 51%-kal növelte a jelzett fehérjék termelését, hasonlóan a pozitív kontroll TGF-hez. A méréseket ELISA assay-vel végeztük, pro-kollagén I, tropoelasztin és periosztin elleni specifikus antitestek felhasználásával.

2.8. A MYLK, a foszfo-miozin, a kollagén I és a tropoelasztin elemzése ex-vivo bőrexplantátumokon

A 4a-c ábrákon látható, hogy az ObHEx szignifikánsan megnövelte a MYLK és a foszforilált miozin termelését emberi bőrexplantátumokban.

A kollagén I és a tropoelasztin indukcióját ObHEx-szel előkezelt, majd 8 napon keresztül hidrokortizonnal kezelt bőrexplantátumokon is elemezték a kronológiai öregedés szimulálására [22]. A hidrokortizonos kezelés több mint 100 százalékkal csökkentette a kollagén I és a tropoelasztin mennyiségét, a 0,002 százalékos ObHEx jelenléte pedig csaknem 91 százalékkal visszaállította a tropoelasztin és 120 százalékkal a kollagén mennyiségét az előzőhöz képest. pozitív kontrollként használt aszkorbát (4d-f ábra). Ez az ObHEx potenciális öregedésgátló hatására utal, amely különösen hatékonyan növeli a bőr feszességét a dermális mátrix összetevőire hatva.

2.9.Atomerő-mikroszkópia (AFM) bőrexplantátumokban

Annak érdekében, hogy több információt gyűjtsünk az ObHEx kezelés által előidézett bőr biomechanikai tulajdonságairól, megvizsgáltuk a rugalmasságot, a bőrminták belső mechanikai tulajdonságát a Young-modulusok alapján [23]. A 4. részben leírtak szerint a rugalmassági modulus kiszámításához mind a kezelt, mind a kezeletlen bőrmintákon erőgörbéket gyűjtöttünk atomerő-mikroszkóppal (AFM) és illesztettük őket a Hertz-modellel [24,25]. Amint az 5. ábrán látható, a bőrminták kivonattal történő kezelése alacsonyabb Young-modul értéket mutatott a kezeletlen mintákhoz képest, ami a bőr rugalmassági tulajdonságainak javulására utal. A kezeletlen bőrminták átlagos Young-modulusértéke 0,37±0,15 GPa, míg az ObHEx-szel kezelt bőrminták alacsonyabb, 0 átlagértéket mutattak.{11 }}7±0,02 GPA. A bőrminták Young-modulusértékei összhangban voltak a szakirodalommal [26-28].

3. Megbeszélés

A növényi sejtkultúrák jelentik a legígéretesebb megközelítést a kereskedelmi jelentőségű növényi másodlagos metabolitok fenntartható előállítására, folyamatos anyagellátást kínálva nagy léptékű tenyésztéssel, és fenntartható és környezetbarát rendszert alkotnak [29,30]. A növényi sejtkultúrákból származó kivonatok ígéretes alkalmazásra találtak az egészségügyi és kozmetikai szektorban, mivel jelentős előnyökkel járnak; (i) szabályozott növekedésű laboratóriumi körülmények között bioszintetizált metabolitokat tartalmaznak; (i) szabványos gyártási folyamatokból származnak, amelyek garantálják a a kapott fajok minőségi és mennyiségi jellemzői azonosak; (ii) a kivonatok mentesek olyan szennyeződésektől, mint a mikroorganizmusok, gyomirtó szerek, peszticidek és fungicidek; (iv) függetlenek a földrajzi vagy környezeti ingadozásoktól, és a növényfajok megőrizhetők a jövőben generációk. Ebben a versenyben egy Oenothera biennis sejtkultúra vizes kivonatot (ObHEx) vizsgáltak, mint a bőr öregedésgátló hatásával felruházott bioaktív molekulák ígéretes forrását. Valójában az ObHEx-et nagy felbontású UPLC-MSMS elemzésekkel, bioinformatikai megközelítésekkel párosítva vizsgálták, hogy széles körű szerkezeti jellemzést kapjanak. A vegyületkarakterizálást főként GNPS felhasználásával valósították meg az azonosítási folyamat felgyorsítására, az MS/MS-spektrumok szerkezetileg jellemzett metabolitjaival való összehasonlítására, valamint új, váratlan fajok feltárására, a hasonló NP-k hálózaton belüli csoportosítására. Ezen túlmenően a retenciós időt, a pontos tömegméréseket és az MS2 analíziseket is összehasonlították a standardokéval, és minden adatot összevetettek az irodalommal. Bioaktív lignánokat és triterpéneket, például Salvador-féléket, liriodendront, my-anthemic-savat, arjunolsavat, ázsiai savat és hederagenint azonosítottak. A liriodendron [31] és a muriatinsav [32] erős antioxidáns hatást mutatott, míg a hederagenin bőröregedésgátló tulajdonságokat mutatott a sejtoxidáció csökkentésének és a proteaszóma funkció aktiválásának [33] miatt. Mindazonáltal az arjunol- és az ázsiai savakat tekintették főként felelőssé az alábbi tesztelt tevékenységek némelyikéért, mivel serkentik a kollagén I-szintézist. Valójában kimutatták, hogy az ObHEx javította a bőr biomechanikai tulajdonságait, amelyek leginkább az ECM különböző komponenseinek relatív mennyiségétől és attól függenek, hogy a fibroblasztok hogyan képesek összehúzódni és megfelelő feszültséget biztosítani a bőrrostoknak.cisztanchValójában az ObHEx elősegíti a kollagén mátrix összehúzódását és az aktin polimerizációját azáltal, hogy növeli a MYLK gén expresszióját, fokozva a dermális fibroblasztok összehúzódási erejét. Az aktin citoszkeleton felépítése felerősíti a TGF-II receptort, és a TGF-/Smad jelátvitel stimulálásával összhangban növeli a TGF által szabályozott ECM fehérjék szintjét. Valójában az ObHEx indukálja az I. típusú kollagén, a periosztin és a tropoelasztin termelődését. Mindezek a tulajdonságok ezért ígéretes összetevőjelöltté teszik a kozmetikai készítményekben a bőr feszességének és rugalmasságának korral járó elvesztésének leküzdésére. Ezt a feltevést támasztották alá az AFM analízis során kapott eredmények, amelyek azt mutatták, hogy a bőrszeletek ObHEx-szel történő kezelése a Young-modulus csökkenéseként kimutatható javulást eredményezett a bőr mechanikai tulajdonságaiban, ami a bőr merevségének és merevségének jelentős csökkenését jelzi.

4. Anyagok és módszerek

4.1. Növényi szövettenyészetek és kivonatok elkészítése

Az Oenothera biennis növényeket a GEEL Floricultura ss biztosította, és olasz eredetűek voltak (elkerülve a Nagoya protokoll alkalmazását). A sejttenyészeteket Oenothera biennis növények leveleiből nyertük úgy, hogy szilárd agarlemezeken merisztematikus sejtek szaporodását indukáltuk a bőrkeményedés kialakulásáig. A sejteket folyékony táptalajra vittük át (Gamborg B5, kiegészítve 24 µl diklór-fenoxi-ecetsavval (1 mg/L), adeninnel (1 mg/L) és kinetinnel (0,01 mg/L)). , a sejteket szuszpenziós tenyészetként növesztettük orbitális rázás mellett. Miután megkaptuk a körülbelül 150 g/l-es tenyészetet, a sejteket összegyűjtöttük, és foszfátpufferben (PBS) 7,4 pH-n lizáltuk, így vízoldható kivonatot kaptunk, amelyet liofilizáltunk. A port feloldottuk vízben vagy sejttenyésztő tápközegben a vizsgálathoz megfelelő koncentrációban.

4.2. UPLC-MSMS elemzés a kémiai jellemzéshez

ObHEx-et (5{{10}} mg/ml) állítottunk elő, és kétfázisú butanol/víz extrakciónak vetették alá. A butanolfrakciót szárítottuk és metanolban (10mg/ml) oldottuk az UPLC-MS/MS analízis előtt. A vizsgálatot a Thermo-Scientific (Waltham, MA, USA) Q-Exactive Classic tömegspektrométerén végezték, amely Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 UPLC rendszerrel volt felszerelve. Az összes kromatográfiás futtatást Phenomenex Luna③C18 100 A (150 × 2,0 mm, részecskeméret 3 μm) oszlopon végeztük 40 °C-on és 0,200 ml/perc áramlási sebességgel. Az injekció térfogata 5 μl volt. A mozgófázis A (ROMIL Ltd. víz, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, Egyesült Királyság, 0,1 százalékos ecetsav) és B (100 százalékos acetonitril, ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, Egyesült Királyság) tartalmazta gradiens elúciót. 5 százalék B 0-5percnél, 5-14 százalék B 5-8 percnél, 14-32 százalék B 8-11 percnél, 32-95 százalék Bat {{ 26}}perc, 95-98 százalék Bat32-33 min, 98 százalék B a 33-38percnél, 98-5 százalék Bat38-39 perc és 5 százalék B a { {34}} perc Az összes MS és MSMS analízist ESI negatív üzemmódban hajtottuk végre, a burkológáz áramlási sebessége 30 (tetszőleges mértékegységek), a segédgáz áramlási sebessége 5 (tetszőleges egységek), a permetezési feszültség 3,2 kV, valamint a kapilláris hőmérséklet ill. a kiegészítő gázfűtő hőmérséklete 300 fok. Az adatok gyűjtése Full MS/dd-MS2 (Top5) móddal történt. A teljes MS beállítások a következők voltak: felbontás 70.000, AGC cél 1×106, maximális IT 200ms, és 100-800 m/z.dd-MS2 beállítások a következők voltak: felbontás 17.500, AGC cél 2×105, maximum IT 65 ms, leválasztási ablak 1,5 m/z és NCE 35.

manuálisan ellenőrizték. Az mzXML-adatokat az Mzmine 2.53-mal dolgozták fel a GNPS-en a Feature-Based Molecular Networking (FBMN) feladat előtt. A tömegérzékelési lépést a súlyponti tömegdetektor segítségével végeztük, miközben a zajszintet 5 × 1{{10}}3-on tartottuk. Az Automated Data Analysis Pipeline (ADAP) kromatogram felépítése a következő beállításokkal valósult meg: minimális csoportméret 5 szkennelésnél, csoport intenzitási küszöbértéke 5 × 1{{20}}³, min legmagasabb intenzitás 5×10 plusz ,m/z 0.01 m/z vagy 10 ppm tűréshatár. A kromatogram dekonvolúcióját Wavelets (ADAP) algoritmussal végeztük, az S/N küszöb 3, a minimális jellemzőmagasság 1 × 105, az együttható/terület küszöbérték 5, a csúcsidőtartam tartománya 0.{{ 18}}.{19}} min, és RT wavelet tartomány 0.00-0.05. A kromatogramokat az izotópcsúcsok csoportosító algoritmusával 0,001 m/z vagy 5,0 ppm m/z tűréssel és 0,10 perces RT-tűréssel deizotóposuk. Az FBMN munkát 0,02 Da szülőtömeg-tűréssel és 0,02 Da MS4 fragmens iontoleranciával végeztük. Az éleket úgy szűrtük, hogy a pontszám 0,7 küszöbértéke és legalább 2 egyező csúcsa legyen. Ezenkívül az egyes csomópontokhoz tartozó szomszédos csomópontok maximális számát 10-re állítottuk be.

4.4. Lignánok és triterpének kvantitatív elemzése

A kvalitatív analízisnél leírt UPLC-körülményeket a lignánok kvantitatív analízisénél használtuk, míg a triterpének esetében két izomerpár, az arjunolsav és az ázsiai sav elkülönítésére optimalizáltuk. Az analízist Q-Exactive Classic Mass Spectrometer-en végeztük a korábban leírtak szerint. Az elválasztást Phenomenex Kinetex⑧EVO C18 300 A（150×2,1 mm, részecskeméret 5 μm） végezte. A mozgófázis A (5 mM ammónium-acetát vizes oldat, pH 9.{8}} ammónium-hidroxiddal beállítva) és B (100 százalék acetonitril) tartalmazta, gradiens elúcióval 17-28 B százalék 0-18 percnél, 28-65 B százalék 18-22 percnél, 65-75 B százalék 22-26 percnél, 75-95 százalék {{17} }}, 5 perc, 95 százalék 26, 5-30 perc, 95-17 százalék 30-30, 1 perc, 17 százalék 30, 1-42 perc. Az áramlási sebesség 0,450 ml/perc, az injekciós térfogat pedig 5 ul. Mind a lignánok, mind a triterpének esetében az adatokat Full MS-SIM és PRM móddal gyűjtöttük. A teljes MS-SIM beállítások a következők voltak: 70.{34}} felbontás, AGC cél 3×106, maximális IT 200 ms, és 200-800 m/z lignánok és 400-850 m/z között lehet. triterpének esetében. A PRM-beállítások a következők voltak: 70.{43}} felbontás, 2×10 fokos AGC cél, 100 ms maximális IT, 1,0 m/z izolációs ablak és lignánok esetén 35 NCE, abban pedig 50 triterpének.cistanche AusztráliaSalvadort (#{0}}XS172930) vásároltunk a Biosynth Carbosynth-től (Staad, St. Gallen, Svájc), liriodendront (#SMB00181) és arjunolsavat (#SMB00119) a Sigmától -Aldrich (St. Louis, MO, USA), Ázsiai sav (#0027) az Extrasynthese-től (Genay, Lyon, Franciaország) és hederagenin (#89706) a PhytoLab GmbH & Co.KG-től (Vestenbergsgreuth, Bayern-Mittelfranken, Németország). A miriánsavat Prof. Maria Valeria D'Auria, a Nápolyi Egyetem ajándéka kapta. A kalibrációs görbéket standard oldatok injektálásával kaptuk 0.25-25 μM lignánok és 0.{11}} uM triterpének koncentrációtartományban. Mind a tiszta Salvador, mind a liriodendron két LC-MSMS csúcsot mutatott, valószínűleg az oldatban kialakult kémiai egyensúly miatt. A szabványok észlelési határát (LOD) és mennyiségi meghatározásának határát (LOO) a jel-zaj (S/N) arány alapján határozták meg.

4.5. Bőrsejttenyészetek és -explantátumok

A humán dermális fibroblasztokat (HDF) Dulbecco's Modified Eagle táptalajban (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tartottuk fenn, amelyet 10 százalékos szarvasmarha-magzatszérummal (FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) egészítettünk ki. )95 százalékos levegőben, 5 százalékos CO-ban és párásított atmoszférában 37 fokon. A Villa Cinzia (Nápoly, Olaszország) egészséges női donorok bőréből nyert ({6}} éves) bőrexplantátumokat 24-transwell lemezeken tenyésztettük DMEM/FBS-ben, valamint antibiotikumokkal levegőben. folyékony körülmények 37 fokos hőmérsékleten 5 százalékos CO2 párásított levegőben. A Helsinki Nyilatkozat értelmében minden donor írásos beleegyezését adta a bőrszövetek használatához.

4.6. Citotoxicitási teszt

A citotoxicitási tesztek az MTT-vegyület [{{0}}(45-dimetil-tiazolil)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid][34] felhasználásán alapultak. A sejteket 96-lyukú lemezeken tenyésztettük DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) táptalajban, amelyet 10% magzati szarvasmarha-szérummal egészítettünk ki, körülbelül 8 órán keresztül. 0.05% és 0,0004% (500 ug/ml és 4 ug/ml) közötti 48 órás ObHEx-kezelés után a sejteket PBS-ben mostuk, és 100 μl/lyuk mennyiségben inkubáltuk. "reakciópuffer", amely ∶ 10 mM Hepes-t, 1,3 mM CaCl2-t, 1 mM MgSO-t, 5 mM glükózt és 0,5 mg/ml MTT kolorimetriás szubsztrátot tartalmaz PBS pufferben, pH 7,4. 3 órás inkubálás után 37 °C-on 5% CO-ban, 10% Triton-X100-at, 0,1 N HCl-t abszolút izopropanolban tartalmazó 100 μLof szolubilizáló oldatot adtunk minden egyes lyukba. 16 órás inkubáció után a kolorimetriás reakciót 595 nm-en mértük Victor3 lemezleolvasóval (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

4.7. A MYLK és TGF6RII gén expressziójának elemzése HDF-ben

Lyukanként 1×10 fokú HDF-et növesztettünk 6-lyuklemezeken DMEM-ben 2 százalékos FBS-ben, majd 24 óra elteltével az FBS-t tovább hígítottuk 0,5 százalékra, és a A sejteket 0,002 százalék és 0,006 százalékos koncentrációjú ObHExand TGF- 2,5 ng/ml koncentrációval kezeltük, majd 2 órás inkubáció követte a MYLK és 48 a TGFRII esetében. Az RNS extrakcióhoz a Merck cég (Darmstadt, Németország) által vásárolt "GenEluteM Total RNA Purification" készletet használtuk. A jelzett kezelések után a sejteket PBS-sel mostuk, lízispufferben összegyűjtöttük, és a leírtak szerinti extrakciós eljárásnak vetettük alá. A mintákat DNáz I-gyel (Ambion, Austin, TX, USA) kezeltük 37 fokon 30 percig, hogy eltávolítsuk a genomiális DNS-szennyeződést. Minden mintából 2 μL-t töltöttünk 1%-os agaróz gélre denaturáló töltőfesték jelenlétében, hogy kvantifikáljuk az RNS mennyiségét egy specifikus RNS-markerrel (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). A kvantáláshoz a GeneTools szoftvert (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) használták szoftverként. Ezután 300 ng teljes RNS-t retro-transzkripcióval végeztünk reverz transzkriptáz enzim (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) segítségével. A szemi-kvantitatív RT-PCR-t belső standardként a 18S primer/konkurens (Ambion, Austin, TX, USA) univerzális primerek párjával végeztük. A PCR-termékeket 1,5 százalékos agaróz gélen választottuk el, a Reliance eszközzel (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) néztük meg, és denzitometriával analizáltuk a Genetools szoftver segítségével. Az amplifikációhoz használt primerek szekvenciája a következő volt: MYLK FW: ATCAAACTGTCAAGTTCAG, MYLK Rv: AGGCACTGCGTGCAGTCCA, TGFBR2 FW: GTCACTGACAACAACGGT, TGFBR2 RV: ATGTCAGAGCGGTCATCT.

4.8. A kollagénmátrix összehúzódási képességének elemzése

A HDF sejteket illetően 2.0× 10 fokot szuszpendáltunk újra 5x DMEM táptalajban (Gibco, Waltham, MA, USA) egy 24-lyukú lemezen, és egy 2 mg/ Szarvasmarhabőrből (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) származó kollagén ml-es oldatát adtuk mindegyik lyukba. Az oldat pH-ját 7,2-re állítjuk be. A lemezt 37 °C-on 45 percig inkubáltuk, hogy lehetővé tegyük a kollagéngél megszilárdulását. MYLKprotein inhibitorként 10 százalék FBS-sel és/vagy ML7 25 uM-mal kiegészített DMEM-et később adták hozzá. 16 óra elteltével az ML7-et kitisztítottuk, és 0,002 százalékos ObHExat-koncentrációt adtunk hozzá 2 százalék FBS-t tartalmazó DMEM-ben. Pozitív kontrollként TGF- 2,5 ng/ml-t használtunk. A kialakult kollagén korongot steril mikrospatulával azonnal leválasztottuk a lyukról, hogy elősegítsük annak összehúzódását. Az egyes kezelések korongjának területeit 0 és 5 órában mértük, és Image szoftverrel elemeztük.

4.9. Az aktin polimerizációs fokának elemzése

Ezután lyukanként 1,5 × 1{8}} fok HDF sejtet növesztettek egy 24-lyukú lemezen, és másnap hozzáadták a táptalajhoz 2% FBS-t és a citokalazin B-t, amely az aktin inhibitora. polimerizáció, 2 μM-on 3{{1{{20}}}} percig. 30 perc elteltével a sejtekhez ObHEx-et (0,002 százalék és 0,006 százalék) adtunk hozzá pozitív kontrollként használt TGF- 2,5 ng/ml-rel és ML7 25μM-rel, mint a. a MYLKenzim negatív kontrollja. 30 perces kezelés után a sejteket 4%-os paraformaldehiddel (PFA) puffer-foszfáttal fixáltuk 30 percig jégen. A sejteket PBS-sel mostuk, és foszfátpuffer és Triton-X100 0,2%-os oldatával 30 percig permeabilizáltuk. Ezt követően a sejteket 0,4 μM rodominnal konjugált falloidin oldattal (Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) 1 órán át sötétben inkubáltuk.cistanche előnyeiA 0 időpontban és 18 óra elteltével a fluoreszcenciát 540/570 nm-en mértük Victor3 lemezleolvasóval (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). 4.10.Az SMAD2 útvonal elemzése

A HDF sejteket 3×103 sűrűségben oltottuk be 96-lyukú lemezekre, majd 16 óra elteltével X-tremeGeneTM HP DNS transzfekciós reagenssel (Roche Diagnostics, Basel, Svájc) Smad2 riportervektorral transzfektáltuk a gyártó utasításai szerint. 24 óra elteltével a sejteket ObHEx-szel vagy TGF- 2,5 ng/ml-lel kezeltük, önmagában vagy ML7 25 µM 24 órán át kombinálva. Az inkubálás végén a sejteket PBS-sel mostuk, és a luciferáz aktivitását SteadyGlo Luciferase vizsgálati rendszerrel (Promega Corporation, Madison, WI, USA) a Multiwell Plate Reader Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA) segítségével határoztuk meg. , USA).

4.11. Pro-kollagén I, tropoelasztin és periostin szintézis elemzése

Lyukanként 8×103 HDF-et növesztettünk 96-lyukú lemezeken, és kezeltük a 0.002 százalékos ObHEx vagy TGF 2,5 ng/ml-rel. 24 óra elteltével a sejteket ELISA-vizsgálatra dolgoztuk fel I. típusú prokollagén elleni monoklonális primer antitesttel (sc-166572, Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), majd inkubáltuk a megjelölt másodlagos anti-egér antitesttel. peroxidázzal (170-6516, Biorad, Hercules, CA, USA). A sejtek felülúszóját egy másik lemezre vontuk be a tropoelasztin és a periosztin kimutatására anti-tropoelasztin nyúl antitesttel (ab21600, Abcam, Cambridge, U vagy anti-periostin egérantitest (sc-398631, Santa-Cruz Biotechnology). , Dallas, TX, USA), majd peroxidázzal jelölt másodlagos anti-nyúl antitesttel inkubáltuk (170-6515, Biorad, Hercules, CA, USA). A kolorimetriás reakciót 100 μl vizes oldat hozzáadásával fejlesztettük ki. OPD (O-fenilén-diamin), 0,35 mg/ml 50 mM citrát pufferben és 0,012 százalékos hidrogén-peroxidban (H2O2) 30 perc elteltével az abszorbanciát 490 nm-en mértük Victor Nivo többleolvasóval (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

4.12. Ex vivo tesztek

A MYLK és a foszforilált miozin immunhisztofluoreszcenciáját (IHF) {{0}} éves donorok bőrexplantátumaiban értékelték. Az emberi bőrexplantátumokat 8 mm-es lyukasztó biopsziás küretekkel vágtuk, és 24-lyuklemezeken tenyésztettük DMEM-ben 10% FBS-sel és antibiotikumokkal. A kapott ütéseket 0.002 százalék és 0,006 százalék ObHEx-szel kezeltük 24 órán keresztül. 15 százalékos szacharózban, majd 30 százalékos szacharózban inkubálták, végül lefagyasztották. Ezután 10 μm-es metszeteket készítettünk a CM1520 kriosztát segítségével (Leica Microsystems, Wetzlar, Németország). A kriometszetekkel ellátott tárgylemezeket 30 percig hidratáltuk PBS-ben, és „blokkoló” oldatba helyeztük (6% BSA, 5% szérum, 20 mM MgCl, 0,2% Tween) 1 órára. A kriometszeteket az elsődleges anti-MYLK nyúl antitesttel (1:100, GeneTex, Irvine, CA, USA) és a primer anti-foszfo-miozin antitesttel (1:100, LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA) inkubáltuk 16 órán keresztül 4 fok. A lemezeket 30 percig PBS-sel mostuk, majd a másodlagos anti-nyúl Alexa-Fluor 546 antitesttel (1:1000; A11035 ThermoFisher, Waltham, MA, USA) 1 órán át inkubáltuk. A sejtmagokat DAPI(4',6-5 diamidino-2-phenylindol) 1 ug/ml PBS-ben festettük 10 percig. A képeket fluoreszcens mikroszkóppal vettük, és az ImageJ szoftverrel elemeztük. A tropoelasztin és kollagén I IHF esetén 36-éves női donorok bőrexplantátumait használtuk. A bőrbiopsziákat a fent leírtak szerint vettük, és 0,002 százalékos és 0,006 százalékos ObHEx-szel előkezeltük 24 órán át. 8 napig 10 ug/ml koncentrációjú hidrokortizont adtunk hozzá ObHEx jelenlétében. Ezt követően a biopsziákat a fent leírtak szerint lefagyasztottuk, és a metszeteket az elsődleges anti-tropoelasztin nyúl (1:1000 ab21600, Abcam, Cambridge, UK) és az anti-kollagén I (1:100 C2456 Merck, Darmstadt, Németország) antitesttel inkubáltuk. 16 óra 4 fokon. A lemezeket a fent leírtak szerint elemeztük, és a képeket az ImageJ szoftverrel vettük és elemeztük.

4.13. Atomerő-mikroszkópia (AFM) bőrexplantátumokban

A kezeletlen és ObHEx-szel kezelt bőrminták rugalmasságát az atomerő-mikroszkópián (AFM) alapuló nanometrikus skálán alapuló módszerrel értékelték, amely nem csak biológiai, hanem szervetlen mintákra is kifejlesztett. Ezek a megközelítések a Hertz-modellek feltevésein alapulnak, és a mintát és a konzolt két rugónak tekintik egy sorozatban egy AFM kísérleti környezetben. Röviden, a növényből származó bőrt 0-vel kezelték.{8}}Az ObHEx és a kezeletlen bőrminták 06 százalékát kriosztáttal 10 um vastag szeletekre vágtuk. A mintákat 12 °C-on tároltuk, majd PBS-sel mostuk, és rögzített hőmérsékleten, 22 °C, illetve 55 százalékos relatív páratartalom mellett vizsgáltuk. Mindegyik mintát egy NanoScope IIA AFM vizsgálta meg, Force Spectroscopy Single Mode módban, 0,9 N/m rugóállandójú piramiscsúcs (RESP-20) segítségével. A Young-modulus kiszámításához tíz Erőgörbét vettünk fel ugyanazon mintafelület tíz különböző pontjában. Minden erőgörbe az elhajlás (Volt) és az elmozdulás (nm) görbéje, és átalakítható az Erő (N) és az elválasztás (nm) görbéivé. Valójában minden erőgörbe be- és kirakodási görbéket jelent. Ezek reprezentálják a hegy trendjét a mintához képest: amikor a hegy távol van a mintától, amikor érintkezésbe kerülnek, és a hegy elkezd elhajolni, és amikor ismét eltávolodik. Ezeknek a görbéknek csak az első része vizsgálható. A görbék ezen részeit egy standard Hertzi-modellhez illesztettük, különösen a piramiscsúcs tipikus Hertze-egyenletét, hogy kivonjuk a GPa-ban Young-modulusként ismert rugalmassági modulust.

4.14. Statisztikai analízis

Az összes közölt érték három független kísérlet átlaga volt, mindegyiket három párhuzamosban végeztük el. A csillagok a t-próbával összhangban kiszámított statisztikai szignifikanciát jelölik: *értéket jelent, kisebb vagy egyenlő, mint 0.05;** p érték Kisebb vagy egyenlő, mint 0. 01;***p érték Kisebb vagy egyenlő, mint 0,001.

Ez a cikk a Metabolites 2021, 11, 527 dokumentumból származik. https://doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites