A Cistanches Herba kémiai és genetikai megkülönböztetése UPLC-QTOF/MS és DNS vonalkódolás alapján

Kapcsolatfelvétel: emily.li@wecistanche.com

Sihao Zheng, Xue Jiang, Labin Wu, Zenghui Wang és Linfang Huang *

Absztrakt

CistanchesA Herba (Rou Cong Rong), az úgynevezett "sivatagi ginzeng", feltűnő gyógyító hatással van az erőre és a táplálékra, különösen a vese megerősítésében a yang erősítésére. A Cistanches Herba két növényi eredete azonban,Cistanche deserticolaésCistanche tubulosa, változnak a farmakológiai hatás éskémiaialkatrészek. A növényi eredet megkülönböztetéséreCistanchesHerba, a kombinált módszer rendszerekémiaiésgenetikaiEbben a tanulmányban először az UPLC-QTOF/MS technológiát és a DNS vonalkódolást alkalmazták. Az eredmények azt mutatták, hogy három potenciális marker vegyületet (a campneozid II, a cisztanozid C és a cisztanozid A izomerje) kaptak a két eredet megkülönböztetésére PCA és OPLS-DA elemzésekkel. A DNS vonalkódolás lehetővé tette két eredet pontos megkülönböztetését. Az NJ fa azt mutatta, hogy két origó két kládba csoportosult. Eredményeink azt mutatják, hogy a két eredetCistanchesA Herba különböző tulajdonságokkal rendelkezikkémiaikompozíciók ésgenetikaivariációk. Ez az első jelentett értékelés a két eredetrőlCistanches Herba, és a megállapítás megkönnyíti a minőségellenőrzést és annak klinikai alkalmazását.

Kattintson ide, ha többet szeretne megtudni Cistanche-ról

Bevezetés

CistanchesA Herba (Rou Cong Rong), a "sivatag ginzengeje" néven ismert, szárított zamatos szárából származik.Cistanchedeserticola YC Ma és Cistanche tubulosa (Schrenk) paróka a Kínai Gyógyszerkönyv szerint (2010-es kiadás), és népszerű a vese-yin tonizálása miatt, jótékony hatással van az életre és ellazítja a beleket. Jelenleg a Cistanches Herba elsősorban száraz és meleg sivatagokban fordul elő Kína északnyugati részén, különösen Hszincsiang és Belső-Mongólia tartományokban. A Cistanches Herba két eredete azonban különbözik farmakológiai aktivitásuk éskémiaialkatrészek. Tu et al. három főzetét vizsgáltaCistanchefajok (C. deserticola, C. tubulosa, Cistanche salsa), és azt találták, hogy a C. tubulosa mutatta a legalacsonyabb hatást a Yang-hiányos egérmodellben [1]. Zhang és mtsai. összehasonlították a C. deserticola, a C. tubulosa és a C. salsa farmakológiai aktivitását, és azt találták, hogy ezek a fajok olyan gyógyászati ​​funkciókkal rendelkeznek, mint például a fáradtság és a hipoxia toleranciája, de nem ugyanolyan mértékben [2]. A korábbi kutatások arról számoltak bekémiaiösszetevőt, és jelezte a különbségetkémiaiösszetevője és tartalma növényi eredetűCistanchesHerba [3]. Ami a klinikai alkalmazást és a piaci keringést illeti, tonikként a C. tubulosát hagyományosan vérkeringést serkentő szerként, valamint impotencia, sterilitás, lumbágó, testgyengeség kezelésére használják Japánban [4]–[8].

Következésképpen nagy jelentőséggel bír a két eredet megkülönböztetéseCistanchesHerba minőségellenőrzésre és klinikai alkalmazásra. A Cistanches Herba kétféle eredetű megkülönböztetésére azonban nem összpontosítanak kutatások. Számos kutatott módszert alkalmaztak, beleértve a mikroszkópos, ultraibolya és infravörös detektálást, az egyszerű szekvencia ismétlések módszerét a Cistanches nemzetség azonosítására, de nem csak két eredetre, különösen [9]–[20]. Itt együtt használjukkémiaiés molekuláris technikák két eredet megkülönböztetéséreCistanchesHerba, UPLC-QTOF/MS (ultra-teljesítményű folyadékkromatográfia, kvadrupól repülési idő tömegspektrometriával párosítva) és DNS vonalkódolás. Az UPLC-QTOF/MS gyorsabban és hatékonyabban szolgáltat információkat, mint más technikák. Az UPLC-QTOF/MS nagy szelektivitása és érzékenysége mind kvantitatív, mind kvalitatív elemzésekre, valamint metabolitanalízisre és komplex vegyületek azonosítására a hagyományos kínai orvoslásban [21]–[22] eredményezte. A főkomponens-analízist (PCA) és a látens szerkezetű diszkriminancia-analízist (OPLSDA) is kifejlesztik a potenciális markervegyületek azonosítására. A DNS vonalkódolás, egy egyszerűbb és univerzálisabb molekuláris marker technológia, DNS-fragmentumot használ a fajok vagy nemzetségek azonosítására. Objektív, pontosabb és könnyebben kivitelezhető, mint a hagyományos azonosítási módszerek és más molekuláris marker technológiák. Ezenkívül a DNS vonalkódolást sikeresen alkalmazták állatok és növények azonosítására, beleértve a gyógynövényeket is [23]–[26].

A kutatás célja egy tudományos módszerrendszer létrehozása, kombinált UPLC-QTOF/MS és DNS vonalkódolás, két növényi eredet megkülönböztetésére.CistanchesHerba.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

Megerősítjük, hogy a terepi vizsgálatok nem vettek részt veszélyeztetett vagy védett fajokon. A mintainformációk tartalmazzák a GPS-koordinátákat, lásd az 1. táblázatot."

1. táblázat Minták aCistanchedeserticola és Cistanche tubulosa.

A WLMQ jelentése Wu Lu Mu Qi város; A GJH Gan Jia Hut jelentett; A HBKSEMG Hoboksar mongol autonóm megyét jelentett; A KLMY Ke La Ma Yi városát jelentette; A BDJLSM Badain Jaran-sivatagot jelentett; ALSZQ jelentése Alxa Left Banner; A DSX Dong San megyét jelentette; A CL Ce Le megyét jelentette; MF Min Feng megyét jelentett; A HT He Tian megyét jelentette.

Növényi anyagok és reagensek

Zamatos száraCistanchesA herbát Belső-Mongólia, Csinghaj tartományok, Hszincsiang Ujgur Autonóm Terület, Kínai Népköztársaság vadon élő sivatagi régióiból gyűjtötték 2012 májusában (1. táblázat). A kutatás mintáit vad sivatagi régiókban gyűjtötték, nem magánterületen, ahol nem volt szükség külön engedélyekre. A szárak botanikai azonosságát Dr. Linfang Huang megerősítette. Az utalványmintákat a Gyógynövényfejlesztési Intézetben helyeztük letétbe. Az UPLC analízishez nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) minőségű acetonitrilt (Merck KGaA, Darmstadt, Németország) és hangyasavat (Tedia, USA) használtunk. Az ionmentes vizet Milli-Q rendszerrel (Millipore, Bedford, MA, USA) tisztítottuk. Minden másvegyszerekelemző minőségűek voltak.

Minta előkészítés

CistanchesA herba mintákat (1.0 g, 65-háló) egy 50- ml-es Erlenmeyer-lombikba helyeztük, és hozzáadtunk 50 ml 70 százalékos metanolt. 30 perces áztatás után ultrahangos kezelést (35 kHz) végeztünk szobahőmérsékleten 30 percig. 10, 000 fordulat/perc 10 perces centrifugálás után a felülúszót 4 fokon tároltuk, és 022- μm-es membránon szűrtük, mielőtt az UPLC-QTOF/MS rendszerbe injektáltuk elemzés céljából.

UPLC-QTOF/MS

Az UPLC elemzéshez a következő rendszereket/paramétereket használtuk: Waters Acquity rendszer (Waters) bináris oldószeradagoló szivattyúval, automatikus mintavevővel és PDA detektorral, amely egy Waters Empower 2 adatállomáshoz van csatlakoztatva; ultrahangkezelés (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, Kína); és egy elektronikus analitikai mérlegmodell AB135-2 (Mettler-Toledo., Greifensee, Zürich, Svájc). Waters Acquity UPLC BEH C18 oszlopot (1,7 µm, 2,1 × 100 mm, Waters) és Waters C18 védőoszlopot (ugyanaz az anyag, vizek) használtunk, és 30 fokon tartottuk. A mozgófázis 0,1%-os hangyasav vizes oldata (A) és acetonitril (B) volt, a következő gradiens programmal: 0-3 perc, 10-22% B; 3–4 perc, 22–23 százalék B; 4–6 perc, 23–35 százalék B; 6–8 perc, 35–37 százalék B; 8–11 perc, 37–42 százalék B; 11–12 perc, 42–48 százalék B; 12–15 perc, 48–50 százalék B 0,3 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az injekció térfogata 5 µl volt.

Az UPLC/MS analízist QTOF Synapt G2 HDMS rendszeren (Waters, Manchester, UK) végeztük, amely negatív ion üzemmódban működő elektrospray ionizációs (ESI) forrással volt felszerelve. N2-t használtunk deszolvatációs gázként. A deszolvatációs hőmérsékletet 45{{10}} fokra állítottuk be 800 l/h áramlási sebesség mellett, a forrás hőmérsékletét pedig 120 fokra. A kapilláris és kúpos feszültséget 2500, illetve 40 V-ra állítottuk be. Az adatokat 50–1200 Da között gyűjtöttük, 0.{11}}s pásztázási idővel és 0.{13}}s interscan késleltetéssel, 15-perc elemzési idő alatt. Argont használtak ütközési gázként 7,06661023 Pa nyomáson. Az összes MS adatot a LockSpray rendszerrel gyűjtöttük a tömegpontosság és a reprodukálhatóság biztosítása érdekében. Negatív ESI módban a leucin-enkefalin [MH]-ionját m/z 554,2615-nél használtuk zártömegként.

UPLC-QTOF/MS adatok ehhezCistanchesA Herba mintákat elemezték, hogy azonosítsák a lehetséges diszkriminatív változókat. Az ES nyers adatok csúcsmeghatározása, igazítása és szűrése a Marker Lynx alkalmazáskezelő 4.1-es verziójával (Waters, Manchester, Egyesült Királyság) történt. A felhasznált paraméterek a következők voltak: retenciós idő (tR) 0–15 perc, tömeg 50–1200 Da, retenciós idő tűrése 0,02 perc és tömeg tűréshatár 0,02 Da. Minden földrajzi helyről három párhuzamos mintát használtak (n = 3). A modell elkészítéséhez összesen 6 339 változót használtak fel.

DNS vonalkódolás: DNS extrakció, PCR amplifikáció és szekvenálás

A C. deserticola és a C. tubulosa (30 mg) szárított húsos szárából vett mintákat 2 percig dörzsöltük 30 r/s frekvenciával. A DNS-t a gyártó utasításai szerint (Tiangen) extraháltuk. Pontosabban, a protokollt úgy módosítottuk, hogy a kloroformot kloroform: izoamil-alkohol (24°1 azonos térfogatban) és GP2 pufferoldat izopropanollal (ugyanolyan térfogatú) keverékével helyettesítettük. A dörzsölt port 1,5 ml-es eppendorf-csövekbe helyeztük, hozzáadtunk 700 µl 65 fokos előmelegített GP1-et és 1 µl -merkaptoetanolt, hogy vortex segítségével 10-20 másodpercig keverjük, majd 60 percig 65 fokon inkubáljuk; Hozzáadunk 700 µl kloroform:izoamil-alkohol (24°1) keveréket, centrifugáljuk 5 percig 12000 rpm-en (-13400×g); Pipettázza a felülúszót egy új csőbe, adjon hozzá 700 µL izopropanolt, keverje 15–20 percig; Az egész elegyet a CB3 centrifugális oszlopba vezetjük, és 40 másodpercig centrifugáljuk 12000 fordulat/perc sebességgel; A szűrletet kiöntjük és 500 µL GD-t adunk hozzá (kvantitatív vízmentes etanol hozzáadása a felhasználás előtt), centrifugáljuk 12 000 fordulat/perc mellett 40 másodpercig; a szűrlet eldobása és 700 µl PW hozzáadása (kvantitatív vízmentes etanol hozzáadása a felhasználás előtt) a membrán mosásához, centrifugálás 40 másodpercig 12 000 fordulat/perc mellett; A szűrletet kiöntjük és 500 µl PW-t adunk hozzá, centrifugáljuk 40 másodpercig 12 000 fordulat/perc mellett; A szűrletet kiöntjük, és centrifugáljuk 2 percig 12000 fordulat/perc mellett a maradék mosópuffer PW eltávolítása érdekében; A CB3 centrifuga oszlop áthelyezése egy tiszta 1,5 ml-es eppendorf csőbe, és szobahőmérsékleten 3-5 percig szárítva; Centrifugálja 2 percig 12000 fordulat/perc sebességgel, hogy megkapja a teljes DNS-t. A polimeráz láncreakció (PCR) primerjei a korábban közölt szekvenciákon alapultak [4], [5]. A PCR reakcióelegyek 2-μL DNS-templátot, 8.5-μL ddH2O, 12.5-μL 2× Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., Kína), 1/{ {57}}μL előre/vissza (F/R) primerek (2,5 µM), 25 µl végső térfogatban. A PCR-amplifikációt Kress és mtsai. [4]. A PCR reakció primerje az fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (5′-3′) és a rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (5′-3′). A PCR-termékeket elválasztottuk és 1%-os agaróz gélelektroforézissel detektáltuk. A PCR-termékeket a gyártó protokollja szerint tisztítottuk, és közvetlenül szekvenáltuk.

Szekvencia igazítás és elemzés

Az ITS és ITS2 szekvenciákat a GenBank adatbázisból gyűjtöttük össze. A minták szekvenálásából származó szekvenciákat beküldtük a GenBank adatbázisba (a hozzáférési számokat az 1. táblázat tartalmazza), összeállítottuk a CodonCode Aligner 3.7.1-gyel (CodonCode Co., USA), és a ClustalW segítségével igazítottuk. A Kimura 2-paraméteres (K2P) távolságokat, az alap GC-tartalmát és a szomszédos csatlakozási (NJ) fákat a MEGA 5.05 segítségével, Bootstrap módszerrel (1000-es újramintavételezés) és K2P modellel [27] számítottuk ki és állítottuk össze. Vonalkód rés (távtartó régió, amely az intra- és inter-specifikus között alakult kigenetikaivariációk) és az azonosítási hatékonyság (az azonosítási képesség a különböző vonalkódok összehasonlítására) rajzolása és kiszámítása Meyer és Paulay [28] módszere alapján történt.

Eredmények

UPLC-QTOF/MS kísérleti csúcs hozzárendelés

A különböző termőterületekről származó C. deserticola és C. tubulosa reprezentatív kromatogramjait az 1. ábra mutatja. Az ujjlenyomat-kromatogram hasonlóságokat mutatottCistanchesHerba minták. Összesen 23 minősített tömegcsúcsot detektáltunk, és 16 csúcsot azonosítottunk a retenciós idők és a tömegspektrumok és a korábban közölt adatokkal való egyeztetésével (2. táblázat) [29]–[35]. A 2-es, 3-as, 5-ös, 6-os, 7-es, 8-as, 9-es, 11-es, 12-es, 15-ös, 16-os, 17-es, 20-as, 21-es, 22-es és 23-as csúcsokat feltételesen C1/C2 cisztanbulozidnak, muszaenozidsavnak, C1/C2 cisztanbulozidnak, campneozid II-nek nevezték. , a campneozid II izomerje, az echinakozid, a cisztanozid A, az akteozid, az izoakteozid, a sziringalid A-3′- -L-ramnopiranozid, a cisztanozid C, a 2′-acetil-lakteozid, az ozmantusid B, a cisztanozid D és a tubulcisztanozid B, és cistancinensid A, ill.KémiaiAz összetevőkről megállapították, hogy elsősorban fenil-etanoid-glikozidok (PhG-k), míg az egyik vegyület, a muszaenozidsav, egy iridoid poliszacharid volt. A PhG-k a fő hatóanyagok a veseelégtelenség kezelésében, valamint antioxidáns és neuroprotektív hatások [36].

1. ábra A C. deserticola és a C. tubulosa reprezentatív kromatogramja.

A bal oldalon a C. deserticola különböző helyekről gyűjtött kromatogramjai láthatók; a jobb oldalon a C. tubulosa különböző helyekről gyűjtött kromatogramjai voltak. Ez az ábra a két eredet közötti különbségeket mutatja bekémiaiprofilok.

2. táblázat Kísérletileg azonosított vegyületek a C. deserticolából és a C. tubulosa-ból.

C. deserticola és C. tubulosa PCA-ja

PCA-t alkalmaztak a különböző növényfajok mintáinak megkülönböztetésére. A PCA egy nem felügyelt többváltozós adatelemzési módszer, amelynek célja a másodlagos metabolit-összetétel többváltozós adatai közötti hasonlóságok és/vagy különbségek megjelenítése [37]. A kétkomponensű PCA modell kumulatívan a változás 46,04 százalékát tette ki (PC1, 36,43 százalék; PC2, 9,61 százalék). A 2. ábra azt mutatja, hogy 24 mintát két csoportba csoportosítottak a fajok eredete szerint ábrázolt PCA-pontszámokban, ami azt jelzi, hogy a C. deserticola és a C. tubulosa kémiai összetétele jelentősen eltér egymástól.

2. ábra C. deserticola és C. tubulosa PCA.

Ezeket a mintákat faji származásuk szerint két csoportba soroltuk, ami arra utalt, hogy a C. deserticola és a C. tubulosa kémiai összetétele szignifikánsan eltérő.

OPLS-DA és marker azonosítás

A potenciál azonosításárakémiaiA két faj megkülönböztetésére szolgáló markereket létrehoztuk az OPLS-DA S-plotját (3. ábra). Az S-grafikonon minden pont egy tR–m/z ionpárt jelent. Az X és Y tengely az ion hozzájárulását és bizalmát jelenti; minél távolabb van az ion t R–m/z párja a nullától, annál nagyobb mértékben járul hozzá ez az ion a két csoport közötti különbséghez. Így az 'S' két végére mutató tR-m/z ion jelenti a legnagyobb megbízhatóságú jellemző markereket minden csoportban.

3. ábra C. deserticola és C. tubulosa OPLS-DA (S-parcella).

Egy diagram egy tR–m/z ionpárt jelent. Ezek a négyszögletes telkek voltak akémiaimarkerionok két eredetet különböztetnek meg. A harmadik kvadráns négyzetes diagramjai a C. deserticolában nagyobb hozzájárulással és nagyobb bizalommal rendelkező kémiai marker ionok, az első kvadráns négyzetes diagramjai pedig a C. tubulosa nagyobb hozzájárulásával és megbízhatóságával rendelkező kémiai marker ionok voltak.

Az OPLS-DA eredmények azt mutatták, hogy az UPLC-QTOF/MS használható a C megkülönböztetésére.deserticolaC-től.tubulosa(3. ábra). Összesen hat hiteles és szignifikáns markert határoztunk meg, amelyek elősegítik e csoportok megkülönböztetését (3. táblázat). Három potenciális marker azonosságát feltételesen hozzárendeltük. Az ezzel a három ionnal korrelált komponenseket feltételesen a campneozid II, a cisztanozid C és a cisztanozid A izomerjeiként azonosították. Az a, b és c markervegyületek felhasználhatók a két növényfaj megkülönböztetésére, mivel a és b ionintenzitása. C-ben.deserticolamagasabb volt, mint a C. tubulosa-ban (4A., 4B. ábra), és a c marker kimutatható volt a C. tubulosa-ban, de a C. deserticolában nem (4C. ábra).

4. ábra Az a, b és c markerek ionintenzitása.

A C. deserticolában az a és b markerionok ionintenzitása magasabb volt, mint a C. Tubulosa-ban, és a c markerion kimutatható volt C. tubulosában, de nem volt kimutatható C. deserticolában.

3. táblázat Marer tR–m/z ionpárok az S-diagramon.

DNS vonalkódolás: szekvencia információ és azonosítási hatékonyság

A szekvencia információkat a 4. táblázat mutatja. Az átlaggenetikaiA psbA-trnH távolsága (0.1732) szignifikánsan nagyobb volt, mint a másik két régióé (0.0740, 0,1197). A psbA-trnH átlagos GC-tartalma (20,64 százalék) kisebb volt, mint a másik két régióé (5500 százalék, 5500 százalék). Bár az ITS és ITS2 sikerességi arányát ebben a vizsgálatban nem kaptuk meg, a psbA-trnH régió jól teljesített a PCR amplifikációban és szekvenálásban (100 százalék, 87,23 százalék). Az azonosítás hatékonyságát BLAST1 analízissel és a legközelebbi távolság módszerrel értük el, és elsősorban a vonalkódok sikerességét tükrözte. A psbA-trnH régió egyértelműen magasabb volt, mint a másik két vonalkód az azonosítás hatékonyságában két módszer alapján. Valószínűleg a szekvenciák hiánya az oka annak, hogy az ITS régió 100 százalékos azonosítási hatékonyságot mutatott a BLAST1 módszer alapján, és 0 a legközelebbi távolság módszere alapján.

4. táblázat Három lókusz azonosítási hatékonysága különböző fajok azonosítási módszerekkel.

A genetikai eltérés elemzése hat paraméter segítségével

Hat paramétert használtunk az intraspecifikus variációk és az interspecifikus eltérések elemzésére három vonalkód segítségével (5. táblázat). Az inter- és intra-specifikus variációk közötti jelentős különbség a DNS vonalkódok hasznosságát jelezte. Itt három vonalkód minimális fajlagos távolsága mind nagyobb volt, mint a maximális fajlagos távolság. Ezenkívül a psbA-trnH régiónak nagyobb volt a maximális fajlagos távolsága és az átlagos interspecifikus távolsága, mint a másik két vonalkódnak, ami azt jelzi, hogy a psbA-trnH régió jól teljesített a két eredet megkülönböztetésében.CistanchesHerba.

5. táblázat Három vonalkód interbygenus-specifikus eltérésének és specifikus eltérésének elemzése.

A vonalkód-rés elemzése a C. deserticola és a C. tubulosa azonosítására

A vonalkód-rés a fajok közötti és a fajokon belüli figyelemreméltó variációt mutatja be, és külön, nem átfedő eloszlást mutat a fajokon belüli és interspecifikus minták között. Ebben a vizsgálatban (5. ábra) a távolságtartományt 0–0,45-re állítottuk be, mivel a psbA-trnH legnagyobb K2P távolsága a C. deserticola és a C. tubulosa között közel volt { {11}}.45. A három vonalkód határozott hézagokat mutatott az intra- és inter-specifikus variációk eloszlásában. Ezenkívül a psbA-trnH rés jelentősen nagyobb volt, mint a másik két vonalkódé. Ezért a psbA-trnH régió ideális vonalkód lehet a két eredet megkülönböztetéséreCistanchesHerba.

5. ábra A fajok közötti eltérés és az intraspecifikus eltérés relatív eloszlása ​​három vonalkódban.

Három ITS2, ITS, psbA-trnH vonalkódot elemeztünk a C. deserticola és a C. tubulosa közötti fajok közötti eltérés és intraspecifikus eltérés relatív eloszlására a K2P alapján.genetikaitávolság.

Szomszéd-csatlakozó (NJ) fa

Egy NJ fa illusztrálja a fajok közötti kapcsolatot, és megkönnyíti a csoportosulásuk meghatározását. Ebben a tanulmányban három vonalkódból álló NJ-fát építettünk fel a K2P modell alapján (6. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy két eredeteCistanchesA Herba külön-külön két kládra csoportosult. Így az NJ fa egyértelműen megkülönböztetiC. deserticola és C. tubulosa.

6. ábra C. deserticola és C. tubulosa NJ fája három vonalkóddal.

C. deserticola és C. tubulosa NJ fát építettek három vonalkóddal. A rendszerindítási pontszámok (1000 ismétlés) megjelennek (50 százalék vagy nagyobb) minden ághoz. A C. deserticola és a C. tubulosa egyértelműen két kládba csoportosult.

Megbeszélés és következtetések

CistanchesA herba fontos gyógyászati ​​anyag, amelyet általában az ázsiai közösség táplálására használnak [38]. A Cistanches Herba két eredete, a C. deserticola és a C. tubulosa azonban eltérő kémiai összetételű és farmakológiai aktivitással rendelkezik. Ugyanakkor a két eredet különbözik a klinikai alkalmazásban és az árupiacon. A besorolásaCistancheössze van zavarodva, és hatalmas helyettesítők és hamisító anyagok árasztják el a piacot az erőforrások hiánya és a Cistanches Herba különleges termesztési környezete miatt. A Cistanche nemzetség négy fajt és egy változatot foglal magában: C. deserticola, C. tubulosa, C. Sinensis, C. salsa és C. salsa var. albiflora [39]. A japán kutatók a Cistanches Herba eredetét a C. salsa-nak tekintették [40]–[43], míg Tu [44]–[46] C. deserticolaként azonosította. Ezért összekeverik a Cistanche osztályozásában, és nehéz megkülönböztetni a Cistanches Herba két eredetét.

A minőségellenőrzés hagyományos módszereiCistanchesA Herba morfológiai azonosítás [47], [48], mikroszkópos azonosítás [49] és TLC (vékonyréteg-kromatográfia) [50], [51], FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) [14], HPLC (nagy teljesítményű folyadékkromatográfia) ) [52], [53]. A morfológiai és mikroszkópos módszerekkel könnyen megkülönböztethetők a különböző nemzetségekből vagy családokból származó fajok, amelyek morfológiai és mikroszkopikus jellemzőiben nagy eltéréseket mutatnak, míg a testvérfajokat nehéz megkülönböztetni. A TLC és az FTIR egyértelműen megkülönbözteti a különböző kémiai összetételű fajokat, miközben nehéz meghatározni akémiaikomponens és tartalom. A HPLC-t elsősorban a különböző fajok megkülönböztetésére használjákkémiaielemtartalom, ennek ellenére az analízis ideje hosszabb és az érzékenység viszonylag alacsonyabb az UPLC-hez képest. Ennek megfelelően az UPLC-QTOF/MS technológia gyorsabb és pontosabb volt a kémiai összetétel meghatározásában, mint más kémiai módszerek. A molekuláris azonosítási módszerek jól mutatnak az alapján történő megkülönböztetésbengenetikaivariációk, mint például az SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis) [54], az AFLP (amplified Fragment Length Polymorphism) [55], [56]. Ezeket a molekuláris módszereket azonban nem könnyű kezelni, és nem univerzálisak. Ennek megfelelően a DNS vonalkódolás univerzálisabban, gyorsabban és pontosabban képes megkülönböztetni a fajokat, mint más molekuláris módszerek. Az azonos nemzetséghez tartozó és közeli fajokhozgenetikaiEzek a módszerek önmagukban nem feltétlenül teljesítenek jól az azonosításban. Itt kombináltuk az UPLC-QTOF/MS és a DNS vonalkódolást a C. deserticola és a C. tubulosa azonosítása során, és kiértékeltük azokat a kémiai és molekuláris markereket, amelyek lehetővé teszik ezek megkülönböztetését. 23 minősített tömegcsúcsot detektáltunk és 16-ot azonosítottunk UPLC-QTOF/MS segítségével, és először három potenciális markervegyületet találtunk, amelyek megkönnyítik a két eredet megkülönböztetését PCA és OPLS-DA analízissel. Továbbá négy mutatót értékeltek a DNS vonalkódolási technológiával abból a szempontból, hogy képesek-e megkülönböztetni két eredetet: azonosítási hatékonyság, genetikai hatékonyság, vonalkódolási hiányosság és NJ fa elemzés. A psbA-trnH régiót megfelelő DNS vonalkódként támogatták a C. deserticola és a C. tubulosa megkülönböztetésére.

Összegzésként először is létrehoztunk egy új molekuláris éskémiaielemzéssel kombinált módszer a megkülönböztetésre és a minőség-ellenőrzésre két eredetbenCistanchesHerba. A DNS vonalkódolás két eredetet képes megkülönböztetnigenetikaivariálni és hitelesíteni a fajokat univerzálisan és pontosan; Az UPLC-QTOF/MS technológia képes elemezni a kémiai összetételt a gyógyászati ​​anyagok minőségének gyors és pontos értékelése érdekében. A DNS vonalkódolás és az UPLC-QTOF/MS technológia kombinált módszere garantálja a gyógyászati ​​anyagok több forrásának pontosabb és tudományosabb azonosítását, és módszerként szolgálhat az osztályozásban szereplő egyéb zavaró fajok vagy nemzetségek azonosítására.

Finanszírozási nyilatkozat

A tanulmányt a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (No. 81274013, weboldal: www.nsfc.gov.cn) támogatásával támogatták. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmány megtervezésében, az adatgyűjtésben és elemzésben, a kiadásról szóló döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Hivatkozások

1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY és mások. (1996) Összehasonlítás a vese táplálásáról és a jang erősítésének hatékonyságáról három különböző gyógynövényfajbantávolságok. Kínai gyógyászati ​​anyagok folyóirata 19: 420–421. [Google ösztöndíjas]

2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994) Összehasonlítás három különböző gyógynövényfaj vesetápláló és yangerősítő funkcióiról. China Journal of Chinese Materia Medica 19: 169–171. [PubMed] [Google Tudós]

3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Advances in research ofkémiaiösszetevői a növényekbenCistancheHoffing. et Link. Chinese Traditional and Herbal Drugs 34: 473–476. [Google ösztöndíjas]

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S és mtsai. (2006) Fenil-etanoid oligoglikozidok és acilezett oligocukrok érrelaxáns hatással a Cistanche tubulosa-ból. Bioorg Med Chem. 14: 7468-7475. [PubMed] [Google Tudós]

5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ és munkatársai. (2009) A Cistanche tubulosa kivonat, egy hagyományos kínai nyers gyógyszer hipokoleszterinémiás hatásai egerekben. Am J Chin Med 37: 1125–1138. [PubMed] [Google Tudós]

6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S és mások. (2010) Gátló hatása akteozid izoláltCistanchetubulosa onkémiaimediátor felszabadulás és gyulladásos citokintermelés az RBL-2H3 és KU812 sejtek által. Planta Med, 1512–1518. [PubMed]

7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, et al. (2010) A sivatagi növényből származó, májvédő hatású acilezett fenil-etanoid oligoglikozidokCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 18, 1882-1890. [PubMed] [Google Tudós]

8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D és mások. (2010) Iridoid és aciklikus monoterpén-glikozidok, kankanosidok L, M, N, O és P a Cistanche tubulosa-ból. Chem Pharm Bull (Tokió) 58: 1403–1407. [PubMed] [Google Tudós]

9. He YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) A herba cistanchis kereskedelmi nyers gyógyszerének azonosítása és felmérése. Kínai gyógyászati ​​anyagok folyóirata 20: 117–122. [PubMed] [Google Tudós]

10. Zhu SY (2001) A Cistanche tubulosa egy összezavart faj farmakognosztikai azonosításaCistanchedeserticola. Kínai gyógyászati ​​anyagok folyóirata 24: 24–25. [PubMed] [Google Tudós]

11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG és társai. (2013) Három herba-cistan mikroszkópos azonosítása Xin Jiangban. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883. [Google ösztöndíjas]

12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Kereskedelmi Herba Cistanches mikroszkópos azonosítása digitális képalkotó technikával. Kínai gyógyászati ​​anyagok folyóirata 27: 400–402. [PubMed] [Google Tudós]

13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Tanulmány a herba azonosításárólciszternákés hamisítók. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318. [Google ösztöndíjas]

14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN és társai. (2010) FTIR és 2D-IR spektroszkópiai vizsgálatok különböző gyógynövényforrásokonciszternák. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897–900. [PubMed] [Google Tudós]

15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J és munkatársai. (2009) A Boschniakla rossica és Cynomorium songaricum Cistanche deserticola azonosítása FTIR és kétdimenziós korrelációs IR spektroszkópia segítségével. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507. [PubMed] [Google Tudós]

16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008) Tanulmány a HPLC ujjlenyomatrólCistanchedeserticola. Pharm Care & Res 8: 255–257. [Google ösztöndíjas]

17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) Cistanche deserticola kromatográfiás ujjlenyomata HPLC-vel. Kínai hagyományos és gyógynövényes drogok 36: 268–271. [Google ösztöndíjas]

18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J és mások. (2010) AzonosításaCistanchefajok (Orobanchaceae) a plasztid psbA-trnH intergenikus régiójának szekvenciái alapján. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130. [PubMed] [Google Tudós]

19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) Identification of Cistanche Species byKémiaiés Inter-simple Sequence Repeat Ujjlenyomat. Biol. Pharm. Bika. 32: 142–146. [PubMed] [Google Tudós]

20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W és mások. (2012) Fenil-etanoid-glikozidok szerkezeti jellemzése és azonosításaCistanchesdeserticola YC Ma, UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Fitokémiai elemzés 23: 668–676. [PubMed] [Google Tudós]

21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS Analysis of Alkaloids in Traditional Processed Coptis Chinensis Franch. Evid Based Complement Alternat Med 2012: 942384. [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Google Scholar]

22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013) Processing Technology Investigation of Loquat (Eriobotrya japonica) Leaf by Ultra-Performance Liquid Chromatography- Quadrupol Time-of-Flight Mass Spectrometry Combined with Chemometrics. PLoS ONE 8: e64178. [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Google Scholar]

23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Vonalkódolás állati élet: citokróm c oxidáz 1. alegység eltérése szorosan rokon fajok között. Proc. R. Soc. London. B. 270 Suppl 1S96–99. [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Google Scholar]

24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) Biológiai azonosítás DNS vonalkódokon keresztül. Proc Biol Sci., 270 313: 321. [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Google Scholar]

25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) DNS-vonalkódok használata virágzó növények azonosítására. Proc Natl Acad Sci. 102: 8369–8374. [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Google Scholar]

26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J és társai. (2010) Az ITS2 régió validálása új DNS-vonalkódként a gyógynövényfajok azonosítására. PLoS One 5: e8613. [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Google Scholar]

27. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M és társai. (2011) MEGA5: Molecular EvolutionaryGenetikaElemzés a maximális valószínűség, az evolúciós távolság és a maximális takarékosság módszereivel. Mol Biol Evol 28: 2731-2739. [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Google Scholar]

28. Meyer CP, Paulay G (2005) DNS vonalkódolás: átfogó mintavételen alapuló hibaarányok. PLoS Biol 3: e422. [PMC ingyenes cikk] [PubMed] [Google Scholar]

29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studies on the Constituents Cistanchis Herba. IV. Két új fenilpropanoid-glikozid, a Cistanosides C és D izolálása és szerkezete. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885. [Google ösztöndíjas]

30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studies on the Constituents of Cistanchis Herba. VI. Egy új iridoid glikozid, 6-dezoxieatalpol izolálása és szerkezete. Chem Pharm Bull 33: 3645–3650. [Google ösztöndíjas]

31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009): Differenciation of HerbaCistanchesujjlenyomattal nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával – diódasoros detektálással – tömegspektrometriával. Journal of Chromatography A 1216: 2156–2162. [PubMed] [Google Tudós]

32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W és mások. (2012) A Cistanches deserticola YC Ma feniletanoid-glikozidjainak szerkezeti jellemzése és azonosítása UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS segítségével. Phytochem. Anal. 23: 668–676. [PubMed] [Google Tudós]

33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC és társai. (2008) Fenil-etanol-glikozidok izolálása és tisztítása Cistanche deserticola-ból nagy sebességű ellenáramú kromatográfiával. Food Chemistry 108: 702–710. [PubMed] [Google Tudós]

34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S és mások. (2013) Kvantitatív elemzéseCistanchesA Herba nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával, diódasoros detektálással és nagy felbontású tömegspektrometriával kombinálva kemometrikus módszerekkel. J Sep Sci 26: 1945–1952. [PubMed] [Google Tudós]

35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studies on the Constituents Cistanchis Herba. V. Két új fenilpropanoid-glikozid izolálása és szerkezete, a Cistanoside E és F. Chem Pharm Bull 33: 1452–1457. [Google ösztöndíjas]

36. Jiang Y, Tu PF (2009) Analysis ofkémiaiCistanche fajok alkotóelemei. J Chromatogr A 1216: 1970–1979. [PubMed] [Google Tudós]

37. Massart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988): Adatkezelés a tudományban és a technológiában. Kémometria: tankönyv.

38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014): Ecotypes ofCistanchedeserticola alapjánkémiaiösszetétele és molekuláris tulajdonságai. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328. [Google ösztöndíjas]

39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011) a gyógynövényes tartályok kutatása és ipari fejlesztése. Journal of Chinese Medicine 46: 882–887. [Google ösztöndíjas]

40. Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa, Miyase T, Ueno A, et al. (1987) Új feniletanoid glikozidok aCistanchetubulosa (SCHRENK) Horog. f. I. Chem Pharm Bull 35: 3309–3314. [Google ösztöndíjas]

41. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studies on the constituents of Cistanchis herba III. Chem Pharm Bull 32: 3009–3014. [Google ösztöndíjas]

42. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studies on the constituents of Cistanchis herba IV. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885. [Google ösztöndíjas]

43. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studies on the constituents of Cistanchis herba VI. Chem Pharm Bull 33: 3645–3650. [Google ösztöndíjas]

44. Moriya A, Tu PF, Karasawa D, Arima H, Deyama T és társai. (1995) A Cistanchis Herba (I) farmakognosztikai vizsgálatai. Nat Med 49: 383–393. [Google ösztöndíjas]

45. Moriya A, Tu PF, Karasawa D, Arima H, Deyama T és társai. (1995) A Cistanchis Herba (II) famakognosztikus vizsgálatai. Nat Med 49: 394–400. [Google ösztöndíjas]

46. ​​Liu XM, Jiang Y, Sun YQ, Xu XW, Tu PF (2011) TanulmánykémiaiösszetevőiCistanchedeserticola. Chin Pharm J 46: 1053–1058. [Google ösztöndíjas]

47. Gu XY, Wang X (2013) A RouCongRong és a Confused Varieties eredeti növényeinek azonosítása. Western Journal of Traditional Chinese Medicine 26: 17–18. [Google ösztöndíjas]

48. Zhang HJ, Ding XF A Cistanche deserticola és a hamisítások azonosítása. Shizhen Medicine and Materia Research, 183.

49. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG és társai. (2013) háromféle Cistanche mikroszkópos azonosítási kutatása Xinjiang tartományból származik. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883. [Google ösztöndíjas]

50. Huang M, Liu G (2004) Identification research ofCistanchedeserticola és Cynomorium songaricum. HuBei folyóirat a hagyományos kínai orvoslásról. 26: 54–55. [Google ösztöndíjas]

51. Liu YG, Xu R, Wang W, Liu TN, Chen J (2009) A kutatás előrehaladása a Cistanche deserticola YC Ma minőségellenőrzésével és értékelésével kapcsolatban. Világtudomány és technológia – A hagyományos kínai orvoslás modernizációja. 11: 439–444. [Google ösztöndíjas]

52. Ma ZG (2011) A feldolgozott Cistanche Sinensis G.Beck és Herba Cistanches differenciálása HPLC ujjlenyomatok alapján. Áll. Pharm J. 46: 899–902. [Google ösztöndíjas]

53. Huang LX, Wang YE, Shi MH, Jia XG, Xie X és társai. (2011) HPLC ujjlenyomatok kutatásaCistanchetubulosa. A hagyományos kínai orvoslás Xinjiang folyóirata. 29: 54–56. [Google ösztöndíjas]

54. Chen P, Guo YH, Wang BM, Zhai ZX (2006) SDS-PAGE oldható fehérjékről a Cistanche Hoffing négy növényében. Et Link. Kínai hagyományos és gyógynövényes drogok 37: 1399–1402. [Google ösztöndíjas]

55. Xu R, Chen J, Chen SL, Liu TN, Na R (2007) AFLP elemzése a csíraplazma erőforrások sokféleségéről termesztett és vadon élő Cistanche deserticolában. Kínai hagyományos és gyógynövényes drogok 38: 1703–1707. [Google ösztöndíjas]

56. Gan XY, Li M, Ma HA, Song YX (2011) Study on intraspecific variation ofCistanchedeserticola YCMa AFLP molekuláris markerek segítségével. Északi Kertészet, 141–143.

A PLoS ONE cikkeit itt közöljük a Public Library of Science jóvoltából

PLoS One. 2014; 9. cikk (5): e98061.

Közzétéve online: 2014. május 22. doi: 10.1371/journal.pone.0098061

PMCID: PMC4031141

PMID: 24854031