Az urolitin A öregedésgátló hatása a szarvasmarha-petesejtekre in vitro

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Absztrakt:Az oxidatív stresszt és a mitokondriális diszfunkciót összefüggésbe hozták a petesejtek minőségének életkorral összefüggő hanyatlásával, és jelenleg is keresnek stratégiákat ezek megelőzésére. Az urolitin A (UA) egy természetes metabolit pro-apoptotikus és antioxidáns hatással, amely képes megakadályozni a diszfunkcionális mitokondriumok felhalmozódását különböző korú sejtekben. Az UA-t soha nem tesztelték szarvasmarha petesejteken. Célunk az volt, hogy tanulmányozzuk az UA hatását a reproduktív kompetenciával kapcsolatos fontos gének cumulus-oocyta-komplexek (COC) és granulosa sejtek (GC) expressziójának fejlődési potenciáljára. Felmérték a nukleáris érési progressziót, a mitokondriális membránpotenciált (MMP) és a fiziológiailag érett (22 óra) és in vitro idős (30 óra IVM) petesejtek fejlődési kompetenciáját, amelyeket pubertás előtti és felnőtt nőstényekből nyertünk, UA-val kiegészítve vagy anélkül. Ezenkívül számos gén (NFE2L2, NQO1 és mt-DN5) mRNS-ének mennyiségét és az mt-ND5 DNS-kópiák számát számszerűsítettük prepubertás és felnőtt nőstényekből származó tenyésztett GC-kben, akár UA-val kiegészítve, akár anélkül. Vizsgálatunk megerősítette a petesejtek öregedésének káros hatását a nukleáris érés progressziójára, az MMP-re, a fejlődési kompetenciára és a génexpressziós szintekre. Az UA-kezelés az in vitro érés során fokozódott (p<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">

További információért kattintson ide

Kulcsszavak:oocita; öregedés; urolitin A; asszisztált reprodukciós technológiák

1. Bemutatkozás

A nők szaporodási képességének hanyatlása az egyik első olyan fiziológiai funkció, amelyet az öregedés hátrányosan érint, ezért világszerte újonnan megjelenő egészségügyi problémának számít [1,2]. Számos kóros probléma mellett a női termékenység életkorral összefüggő csökkenése nagyrészt a petesejtek petefészek-tartalékának csökkenésének tulajdonítható [1,3-5], amely minőségük időfüggő romlásával függ össze [2]. Ez a romlási folyamat annak köszönhető, hogy a petesejteket az ovuláció előtt elöregedett petefészek mikrokörnyezetnek teszik ki. Ezenkívül a női ivarsejtek gyakran posztovulációs öregedésnek vannak kitéve, amikor a megtermékenyítési folyamat nem a legjobb optimális időtartamon belül megy végbe, és a megtermékenyítetlen petesejt a petevezetékben vagy in vitro a megtermékenyítés előtt hosszabb ideig marad [6] A petesejt minősége kritikus tényező az asszisztált reprodukciós technológiák (ART) kudarcában, mivel minősége a fő meghatározója az embrió megtermékenyítés utáni fejlődési potenciáljának [7,8]. Az ovulációs aszinkrónia és az elöregedett petesejtek gyakran rontják a mesterséges megtermékenyítés és az embriótermelési programok sikerét kancáknál, szarvasmarháknál és juhoknál, ami jelentős gazdasági veszteségekkel jár[1,9,10]. Ezért rendkívül fontos a petesejtek öregedésének hátterében álló mechanizmusok tanulmányozása annak érdekében, hogy jobb terápiás megközelítéseket tervezzenek számos faj, köztük az ember termékenységének megmentésére, valamint az állatállomány genetikai javításának eszközeként.cistanche wirkungKülönös figyelmet kell fordítani a prepubertás szarvasmarhák petesejtek fejlődési képességének javítására, amelyeket gyakran a genetikai gyarapodás felgyorsítására és a generációs intervallumok lerövidítésére használnak.

Az idős petesejtek fejlődési kompetenciájának romlásának egyik fő oka az oxidatív stressz fokozódása, amely mitokondriális diszfunkciót, DNS-károsodást és orsóképződési hibákat idéz elő, befolyásolva a petesejtek minőségét [1]. Jól ismert, hogy a szabad gyökök fokozott termelése számos krónikus betegségben és a szaporodásbiológiában is a sejtöregedés oka, ami rossz termékenységi eredményeket eredményez [12]. A petefészek mikrokörnyezete, amely petesejteket és granulosa sejteket (GC) tartalmaz, antioxidáns védekező mechanizmust biztosít, amely képes szabályozni az oxidatív körülményeket és fenntartani az oxidáns/antioxidáns egyensúlyt [13]. Az öregedési folyamat során azonban az antioxidáns védekezés hatékonysága a reaktív oxigénfajták (ROS) semlegesítésében gyengül, így nő az oxidatív stressz szintje. Az E2-nukleáris faktorral kapcsolatos 2-es faktor (Nrf2 vagy NFE2L2), más néven Nrf2/Kelch-szerű ECH-asszociált protein 1 (Keap1) útvonal, egy domináns válaszkaszkád, amelyet oxidatív stressz aktivál[14]. Ez az útvonal egy sejtes védekezési mechanizmus, amelyet a sejtek azért fejlesztettek ki, hogy megbirkózzanak az oxidatív stressz káros hatásaival. Normál körülmények között az Nrf2-t negatívan szabályozza a Keap1, a citoplazmában tartja, és alacsony szinten tartja. Ha oxidálószereknek van kitéve, az Nrf2 disszociál a Keapl-ről, lehetővé téve transzlokációját a sejtmagban, ahol specifikus DNS-szekvenciákhoz kötődik. Ezek a szekvenciák, amelyeket antioxidáns válaszelemeknek (ARE) neveznek, citoprotektív gének transzkripciós aktiválásához vezetnek, mint például a NAD(P)H:kinon-oxidoreduktáz-1 (NQO1), a hem oxigenáz-1 (HMOX1) és glutamát-cisztein ligáz katalitikus alegység (GCLC) [15,16]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a Nrf{26}}Keapl jelút aktiválása csökkenti az oxidatív stressz okozta károsodást azáltal, hogy megemeli az antioxidánsok szintjét az emberi GC-ben és az egér petefészkében[17,18]. A női ivarsejtek öregedési folyamatában betöltött szerepe azonban továbbra is megfoghatatlan, bár egyértelműen megállapítható, hogy e folyamat során a mitokondriumok a ROS fő termelőhelyei [9,10].

A Cistanche öregedésgátló hatású

Ezzel szemben a mitokondriumok számos kritikus sejtfunkcióban vesznek részt, és alapvető fontosságúak a petesejtek érése és az azt követő embrionális fejlődés során szükséges energiatermelési igény kielégítésében [19]. A kompetens mitokondriális aktivitást nagymértékben összefüggésbe hozták a mitokondriális DNS (mt-DNS) és ATP-generáció magasabb tartalmával [20], magasabb mitokondriális membránpotenciáljával [21], valamint a mitokondriumok minőségének és mennyiségének fenntartásával a mitofágia révén [22]. Ezenkívül a mitokondriális aktivitásról azt feltételezték, hogy közvetlenül összefügg az embrió életképességével és a jobb termékenységi eredménnyel [23]. Egyre több bizonyíték támasztja alá, hogy az életkorral összefüggő mitokondriális változások a petefészkek öregedéséhez vezetnek, és ezt követően csökkentik az embrió életképességét és beágyazódási potenciálját. Ezek a változások közé tartozik a csökkent mt-DNS kópiaszám, csökkent ATP képződés [20], a mitokondriális génexpresszió megváltozása [24, az mt-DNS károsodása [25] és a csökkent mitokondriális membránpotenciál [26].

A mitokondriumokat célzó terápiás megközelítések hatalmas érdeklődést váltottak ki számos, az öregedéssel összefüggő patológia iránt, mivel nagy potenciállal rendelkeznek a mitokondriális funkció javításában [27]. Ezen a kereten belül az urolitin A (UA) – egy természetes metabolit, amelyet élelmiszerek, például gránátalma elfogyasztása után nyernek, majd a bél mikrobiota átalakítja – kimutatták, hogy megakadályozza az életkor előrehaladtával a diszfunkcionális mitokondriumok felhalmozódását, mitofagiát indukál, és fenntartja a mitokondriumokat is. biogenezis és légzési kapacitás [28,29]. Az UA-t ígéretes terápiás gyógyszerként alkalmazták bizonyos rákos megbetegedések, például a vastagbél- és prosztatarák megelőzésére [30,31]. Ezenkívül az UA gyulladáscsökkentő [32], elhízás elleni [33], antioxidáns [34] és öregedésgátló [35] tulajdonságokkal is rendelkezik.citrus bioflavonoidokEgy közelmúltban végzett tanulmány rávilágított az öregedő emberi bőrfibroblasztok UA-kiegészítésének a Nrf{0}}Keapl-útvonal aktiválására gyakorolt ​​hatására, ami fokozza antioxidáns kapacitásukat. Az Nrf2-Keapl útvonal aktiválása hatékonyan mérsékli a ROS szintet az Nrf2 downstream ARE-válasz gének (SOD, NQO1, GCLC és HMOX1) expressziójának fokozásával, ami ígéretes öregedésgátló hatást jelez [ 35].

Számos tanulmányt végeztek azzal a céllal, hogy késleltesse a petefészek öregedését, következésképpen javítsa a petesejtek minőségét és a termékenységi eredményeket. Az oxidatív stressznek a petefészek öregedési folyamatához, valamint a mitokondriális diszfunkcióhoz való hozzájárulása miatt az antioxidánsok kiegészítése ígéretes terápiaként jelent meg [36,37]. Nem ismert azonban, hogy az urolitin A kiegészítés képes-e helyreállítani a petefészek öregedése során fellépő károsodást, hozzájárulva a meddőségi problémák megelőzéséhez. Ezért ennek a tanulmánynak a célja az volt: (1) annak bemutatása, hogy az öregedés megváltoztathatja a cumulus-oocyta komplexek (COC) fejlődési potenciálját és a GC-k expresszióját az Nrf2 jelátviteli útvonalban részt vevő fontos génekben; (2) annak meghatározása, hogy az UA képes-e megmenteni női termékenység, amely öregedésgátló hatást mutat az időskori COC-k és GC-k esetében; és (3) az UA hatásának értékelése az Nrf2 jelátviteli útvonalban részt vevő gének expressziós szintjére, valamint a petesejtek minőségére.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Kísérleti terv

Ezt a vizsgálatot az Országos Állategészségügyi Hatóság Állatgondozói Bizottsága hagyta jóvá (N fokozat 08965DGAV), az Európai Unió irányelveit ({1}}/609/EEC) követve. Az öregedés petesejtek minőségének változására gyakorolt ​​hatásának és az UA potenciális öregedésgátló hatásának vizsgálatára egy olyan modellt használnak fel, amely serdülőkor előtti és kifejlett tehenekből gyűjtött COC-okat in vitro öregítésnek (30 órás érlelés) vagy fiziológiás érésnek (22) vetettek alá. h) folyamatokat alkalmaztak.

2.1.1. Előző vizsgálat – Dózis-válasz vizsgálat

A szarvasmarha-COC érlelési folyamata során használandó UA-koncentráció meghatározására szolgáló korábbi vizsgálatot egy dózis-válasz vizsgálat alapján végezték el, négy szakaszban. Mivel az UA-t soha nem tesztelték szarvasmarha petesejteken, a korábbi dózisokat sikeresen alkalmazták egyes rákos megbetegedések megelőzésére és enyhítésére, valamint az UA öregedésgátló hatásának bemutatására különböző sejtvonalakban [28,39]. A serdülőkor előtti és kifejlett felnőtt tehenekből (n=978) származó COC-okat kiválasztottuk, majd véletlenszerűen öt csoportra osztották, hogy teszteljék az UA különböző dózisait: kontroll, 1, 10, 25 és 50 uM a fiziológiás in vitro érés során. Az érési periódus után néhány petesejteket (n=154) megfestettünk, hogy meghatározzuk a kromoszómakonfigurációt és az érési stádiumokat. A fennmaradó érett petesejteket in vitro megtermékenyítésnek vetettük alá fagyasztott/felolvasztott spermával. A feltételezett zigótákat tenyésztettük, és a hasítási és a blasztociszta arányát a tenyésztés 2. és 7. napján határoztuk meg. A kapott eredmények, nevezetesen a káros hatások hiánya, valamint az érés és a blasztociszta fejlődés elősegítése alapján 1 uM UA koncentrációt választottunk.

2.1.2.Kísérlet1

Ebben a hat alkalomban végrehajtott kísérletben a pubertás előtti kortól (átlagéletkor=9 hónap,n=660) és a felnőtt kortól (átlagéletkor =39hónap,n=674) származó COC-k is szerepeltek. teheneket gyűjtöttünk, hogy felmérjük az idős és fiziológiailag érett petesejtek petesejtek minőségét és fejlődési potenciálját, valamint az UA hatását a nőstény termékenység megmentésére. A COC-okat véletlenszerűen 8 csoportra osztották: (1) kontroll prepubertás csoport, 22 órán keresztül érlelt prepubertás borjakból származó COC-k (n=148); (2) UA prepubertás korú borjakból származó COC-k, amelyeket 1 uM-os tápközegben érleltek. UA 22 órán át (n=155);(3) kontroll 30 órás prepubertás csoport, 30 órás in oitro érlelésig (n=149) végzett prepubertás borjakból származó COC-k (n=149);(4) 30 órás korú UA prepubertás csoport, 1 uM UA(n=144) érési tápközegben in vitro 30 órán át érlelt prepubertás borjak COC-jai;(5) kontroll felnőtt csoport, 22 óráig érlelt felnőtt tehenekből származó COC-k (n=155) );(6) UA felnőtt csoport, 22 órán keresztül 1 uM UA-val kiegészített tápközegben érlelt felnőtt tehenekből származó COC-k (n=129);(7) kontroll 30 órás felnőtt csoport, felnőtt tehenekből származó COC-k éves korig. 30 óra in oitro érlelés (n=148); és (8) 30 órás UA felnőtt csoport, 30 órán át in oitro érlelt felnőtt tehenekből származó COC-k 1 uM UA(n{36}}) kiegészített érlelő tápközegben.cynomorium előnyeiA megfelelő in vitro érési periódusok után a petesejteket felolvasztott, kapacitált bikaspermával termékenyítettük. Ezt követően értékelték az embrionális fejlődést, értékelve mind a hasított, mind a kitermelt embriók arányát, valamint azok minőségét.

Ezen túlmenően ebben a kísérletben minden csoportból COC-okat vettünk ki, hogy felmérjük a nukleáris érési stádiumukat (kontroll prepubertás csoport, n=7; UA prepubertás csoport, n =7; kontroll 30 órás prepubertás csoport, n{ {3}}; UA 30 órás prepubertás csoport, n=6; kontroll felnőtt csoport,n=16;UA felnőtt csoport,n=21; kontroll 30 órás felnőtt csoport, n{ {9}}; UA 30 órás felnőtt csoport,n=18).A COC-ok mitokondriális membránpotenciálját (MP) is értékelték (kontroll prepubertális csoport, n=10; UA prepubertális csoport, n{ {13}};kontroll 30 órás prepubertás csoport,n=9;UA 30 órás prepubertás csoport,n=9;kontroll felnőtt csoport, n=15; UA felnőtt csoport, n{ {19}}; kontroll 30 órás felnőtt csoport,n=10;UA 30 órás felnőtt csoport,n=14).

2.1.3.Kísérlet2

Mivel a GC-k alapvető szerepet játszanak a tüszőnövekedésben és a petesejt-fejlődésben, egy második kísérletet végeztek öt ülésben, hogy tovább tanulmányozzák az életkor és az UA hatását az NFE2L2, NQO1 és mt-ND5 expressziójára. Az mt-ND5 gén kópiáinak számát is értékelték. A GC-ket a pubertás előtti (átlagéletkor=10 hónap) és a felnőtt tehenek (átlagéletkor =62 hónap) petefészkekből leszívott follikuláris folyadékának centrifugálása után kaptuk. Ezeket a sejteket a következő körülmények között tenyésztettük: (1) prepubertás kontroll, prepubertás borjak GC-tenyészete; (2) prepubertás UA, prepubertás borjak GC tenyészete 1 uM UA-val kiegészítve; (3) felnőtt kontroll, felnőtt tehenek GC tenyészete; és (4) felnőtt UA, felnőtt tehenek GC-tenyészete 1 uM UA-val kiegészítve. A GC-k összefolyása után a tenyésztés 5. napján folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd a DNS-t és az RNS-t extraháltuk, lehetővé téve az NFE2L2, NQO1 és mt-ND5 mRNS transzkriptum, valamint az mt-ND5 kópiaszám későbbi számszerűsítését.

2.2. Petesejtek gyűjtése és in vitro érlelés

Felnőtt és prepubertás tehenek petefészkeit (korábbi vizsgálat, n {0}} és exp. 1, n=1334) egy helyi vágóhídon gyűjtöttük, és 35-37 fokon tartották. foszfáttal pufferelt sóoldat (PBS), amelyet 0,15% szarvasmarha-szérumalbuminnal (w/v, BSA) egészítettünk ki, 0,05 mg ml-l kanamicinnel. A laboratóriumban 2-8 mm átmérőjű petefészektüszőket szívtak ki egy 19-mérőtűvel. Csak azokat a COC-kat, amelyek legalább három réteg kompakt kumuluszsejteket és homogén ooplazmát tartalmaztak, mostuk és választottuk ki érlelésre a kísérleti terv szerint.sivatagi jácintAz érlelés inkubátorban, 38,8 fokos, 5 százalékos CO2 mellett, párásított levegőn, 22 vagy 3 0 órán keresztül, 199-es számú szövettenyésztő táptalajból (TCM) 10 százalék szarvasmarha-magzatszérumot és 0,2 mM nátriumot tartalmazó érési tápközegben történt. piruvát, 10 ng ml-l epidermális növekedési faktor és 10 μL ml-l gentamicin【40】.

2.3. Granulosa sejtek gyűjtése és tenyésztése

A kinyert tüszőfolyadékból granulosa sejteket nyertünk 10 perces, 200x g-vel végzett centrifugálás után[41]. A pelletet 1 ml tápközegben (TCM199 plusz 10% szérum) szuszpendáltuk, hogy egy újabb centrifugálást végezzünk 5 percig. Az új pelletet 1 ml tenyésztőközegben újraszuszpendáltuk, akár 1 uM UA-val kiegészítve, akár nem a kísérleti terv szerint, és homogenizáltuk egy 19G-tűhöz csatlakoztatott fecskendővel, legalább 30-szor a sejtek leválása érdekében. A GC életképességének értékelése után (tripánkék festék, 0,4 tömeg/térfogat%) a sejteket 2 × 105 életképes sejt ml{16}} koncentrációban oltottuk be, és 5 napig tenyésztettük 38,8 fokos, 5 százalékos CO2 hőmérsékleten, párásított helyiségben. légkör az összefolyásig. 48 óránként a táptalajt kiürítettük, és egy újjal frissítettük. A DNS és RNS extrakcióhoz a GC-ket összegyűjtöttük, és centrifugálással mostuk 200xg-vel 10 percig. A sejtpelleteket 1 ml PBS-ben újraszuszpendáltuk, folyékony nitrogénben azonnal lefagyasztottuk, és -80 fokon tároltuk.

2.4. Petesejtek nukleáris érése

A nukleáris érési szakaszokat az in vitro érés 22 vagy 30 órás periódusát követően értékeltük.flavonoid extrakciós módszer pdfAz elpusztult petesejteket ecetsav/etanol (1:3, v/v) oldatban fixáltuk, és 4°C-on tartottuk 48 órán át. Ezután a petesejteket 1%-os aceto-lakmoid oldattal megfestettük, Neubauer-kamrába helyeztük, és fáziskontraszt mikroszkóppal (Olympus BX41) figyeltük meg. A petesejteket a következőképpen osztályozták: csíravezikula (GV), kondenzáló kromoszómák I (CCI), kondenzáló kromoszómák II (CCII), diakinézis, anafázis-I/telofázis-I (AI/TI) és MII (metafázis-II). . Csak a látható kromatin festéssel rendelkező oocitákat vettük figyelembe [42].

2.5. A mitokondriális membránpotenciál felmérése

A mitokondriális membránpotenciál (MP) mérésére, amely a mitokondriális aktivitás indikátora, a mitokondriumokat 5, 6, 6'-tetraklór-1, 1', 3, 3'tetraetilbenzimidazolkarbocianin-jodiddal (JC-1) ​​festettük. , Invitrogen, Waltham, MA, USA). Az elpusztult petesejteket 5 ug ml-l JC-1 [37]-vel inkubáltuk érlelő tápközegben 30 percig 38,8 fokos és 5 százalékos CO2-tartalmú párásított levegőn, sötétben. A petesejteket kétszer mostuk PBS-ben, majd azonnal átvittük egy előmelegített tárgylemezre, és fluoreszcens mikroszkóp alatt (Olympus BX51) figyeltük meg a kék fluoreszcens szűrő használatával (BP 470-490 objektív UPlanFI 20×/0,50). A mitokondriális membránpotenciált ezután a mért vörös/zöld fluoreszcencia arányaként számítottuk ki az Image] szoftver segítségével (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). 2.6. In vitro megtermékenyítés és embriókultúra

Az in vitro megtermékenyítést korábban Percoll gradiens (45 és 90) módszerrel kapacitációnak alávetett holstein-fríz bika fagyasztott-felolvasztott spermájával végeztük, 2 x 10 fokos spermium mL-4 koncentrációban.COC-ok ill. a spermiumokat 20 órán át együtt inkubáltuk 38,8 fokos hőmérsékleten és 5 százalékos CO2-tartalom mellett párásított levegőn. A feltételezett zigótákat ezután BME és MEM aminosavakkal, glutaminnal, glutationnal és BSA-val kiegészített szintetikus petevezető folyadék (SOF) közeg cseppjeibe vittük át [40]. 48 óra megtermékenyítés után a hasítási sebességet (lehasított embriók az összes megtermékenyített petesejtekre vonatkoztatva) átadtuk, és a hasított embriókat BSA-val és 10% magzati borjúszérummal (FBS) kiegészített SOF-ben tartottuk. Az embriókat 12 napig tenyésztettük [41,43], hogy értékeljük a blasztociszták fejlődési sebességét (7., 9. és 12. napon; D7 embriók hasított embriókonként) és kikelt embriók arányát (kikelt embriók D7 embriókonként) és minőségüket [43]. A 7. napi embriókat 1. fokozatba (jó minőség), 2. fokozatba (megfelelő minőség) és 3. osztályba (rossz minőség) osztályozták[4].

2.7.DNS és RNS kinyerése és mennyiségi meghatározása

A teljes DNS-t és az RNS-t a GC-kből a High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Basel, Svájc) és a PureLinkTM RNA Mini Kit (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA) segítségével izoláltuk a gyártó utasításai szerint. Ezek a protokollok magukban foglalták a kiváló minőségű össz-DNS, RNS és DNáz izolálására használt spin oszlopok használatát a genomi DNS RNS-ből való eltávolítására szolgáló kezelésként[40]. Az extrakció után a mintákat -80 fokon tároltuk. A DNS és az RNS koncentrációját és minőségét NanoDropTM One/OneC spektrofotométerrel (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA) határoztuk meg.

2.7.1. Komplementer DNS szintézis

A komplementer DNS (cDNS) szintézisét RNS izolátumokból az Xpert cDNA Synthesis Mastermix kit (GRiSP, Porto, Portugália, a gyártó utasításai szerint) segítségével végeztük. Az RNS reverz transzkripciója minden mintából 500 ng extrahált RNS felhasználásával a cDNS szintézis végrehajtására történt. amelyet termociklerrel (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) hajtottunk végre. A kapott cDNS-eket -20 fokon tároltuk a további vizsgálatokhoz való felhasználásig. 2.7.2. Primer tervezés

Ehhez a vizsgálathoz a megcélzott (NFE2L2 és NQO1) és egy endogén kontrollgén (6-aktin) primereit a National Center for Biotechnology Information (NCBI) Primer-BLAST szoftverével tervezték (http://www. .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, 2020. március 6-án érhető el). A referenciagénekhez és a célgénekhez tartozó primerek szekvenciáit az 1. táblázat mutatja be. Ezen túlmenően az mt-ND5 gént is felhasználtuk ebben a munkában, és az mt-ND5 primerekkel kapcsolatos részleteket egy korábbi tanulmányból nyertük ki [45].

2.7.3. Kvantitatív reverz transzkripciós polimeráz láncreakció

A valós idejű PCR elemzéseket az Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X és ROX használatával végeztük egy QuantStudio 3 termociklerben (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA), 25 ng uL-l koncentrációjú cDNS felhasználásával. Az ND5 gén mitokondriális DNS (mt-DNS) kópiaszámának meghatározását qPCR-rel végeztük a korábban kivont DNS-en keresztül, ugyanazt a berendezést használva, mint a gének mennyiségi meghatározásához. Mindegyik optimalizált reakciót végrehajtottuk, amely Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X-ből állt ROX-szal, minden egyes célgén primerjéből (Forward és Reverse), mintából (cDNS/DNS) és RNáz-mentes vízből, összesen 10 μL térfogattal. A mintákat két párhuzamosban elemeztük, és a templát helyett vizet tartalmazó reakciókat negatív kontrollként alkalmaztuk. A mintákat amplifikációs protokollnak vetettük alá, amely egy kezdeti ciklusból állt 95 fokon 2 perces denaturációs fázisig, majd 40 denaturációs ciklusból 95 fokon 55 másodpercig, majd 40 lágyítási ciklusból 30 másodpercig 60 fokon (az olvadásponttól függően). primer szekvenciák), és a meghosszabbítási fázis 72 fokon 30 másodpercig, és végül egy utolsó kiterjesztési periódus 72 fokon 10 percig.

A génexpresszió mennyiségi meghatározásához a relatív kvantifikációs módszert alkalmaztuk. A génexpresszió relatív mennyiségi meghatározásának ezt a módszerét a vizsgált célgének expressziós szintjével végeztük, amelyeket a housekeeping génekkel normalizáltunk, CT összehasonlító módszerrel. Mivel az RT-qPCR-rel végzett amplifikációt két párhuzamosban végeztük, az egyes gének átlagos CT-értékeit meghatároztuk, és az expressziós szinteket a következő képlet segítségével számítottuk ki:

ahol △Ct=Ct célgén -Ct endogén kontrollgén.

Az mt-DNS kópiák számának meghatározásához a tömegegységhez normalizált relatív kvantifikációt használtuk. Ezt a módszert az UA-val kezelt (tesztnek nevezett) GC-k CT-értékeivel végeztük, amelyeket kontroll mintákkal (jelenleg kalibrátornak nevezett) normalizáltunk. Mivel az mt-ND5 kópiaszámot qPCR-rel határozták meg, és két párhuzamosban végezték el, meghatározták a tesztek és a kalibrátorminták átlagos CT-értékeit, és az arányokat a következő képlettel számítottuk ki:

ahol △Ct=Ct kalibrátor-Ct teszt és E a hatékonyság.

Ez a cikk az Animals 2021, 11, 2048-ból származik. https://doi.org/10.3390/ani11072048 https://www.mdpi.com/journal/animals