A Kummerowia Striata etanolos kivonatának melanogén és antioxidáns hatásai: A Kummerowia Striata szabályozza az anti-melanogén aktivitást a TRP-1, TRP-2 és a MITF expresszió csökkentésével

ABSZTRAKT

A Kummerowia striata-t (K. striata) hagyományos gyógyszerként használják gyulladásos terápiára. Annak megállapítására, hogy van-e előnyös anti-melanogén és antioxidáns hatása, megvizsgáltuk a Kummerowia striata (EKS) etanolos kivonatának biológiai aktivitását különféle in vitro és sejttenyésztési modellrendszerek segítségével. Az anti-melanogén aktivitást B16F10 melanomasejtekben a melaninszintézis és az in vitro tirozináz gátló aktivitás szempontjából értékelték. Az antioxidáns vizsgálatokat 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) és 2,2'-kazino-bisz (3-etilbenzotiazolin-6-szulfonsav) diammóniumsóval végeztük. (ABTS). Az EKS erős antioxidáns aktivitást mutatott a DPPH és az ABTS vizsgálatokban. A tirozináz, a tirozinázzal rokon protein 1, a tirozinázzal rokon protein 2 és a mikroftalmia-asszociált transzkripciós faktor mRNS transzkripciós szintje és fehérje expressziós szintje dózisfüggő módon csökkent az EKS kezelés hatására.

Ezenkívül az EKS nem befolyásolta a sejtek életképességét a tanulmányban használt különböző koncentrációkban, ami azt jelzi, hogy a melaninszintézis EKS által közvetített gátlásának hatásmechanizmusa nem jár citotoxicitással. Azt is megerősítettük, hogy a p-kumársav és a kvercetin fontos vegyületek az EKS melanogenezis-ellenes és antioxidáns tulajdonságaiban. Eredményeink összességében először mutatják be, hogy az EKS anti-melanogén és antioxidáns hatással rendelkezik. Az EKS további értékelése és fejlesztése funkcionális kiegészítőként vagy kozmetikumként hasznos lehet a bőr fehérítésére és a ráncok csökkentésére.

A fehérítésnél azt találtuk, hogy a Cistanche fehérítő hatású, és a Cistanche gazdag C-vitaminban, amelyet nagyon hatékony fehérítőszernek tartanak. A C-vitamin gátolhatja a melanin szintézisét, amely egy olyan típusú melanin, amely fakóvá teheti az emberek bőrét. Ugyanakkor a C-vitamin elősegítheti a kollagén termelődését is, amely egy olyan anyag, amely feszesebbé és rugalmasabbá teszi a bőrt.

A fenti összetevőkön kívül a Cistanche számos aminosavat és nyomelemet is tartalmaz, amelyek szintén nagyon jótékony hatással vannak a bőr egészségére. Például a Cistanche-ban található cink segíthet a pattanások és a leégés kezelésében, miközben megakadályozza a bőr öregedését. Sőt, a Cistanche jó védőhatással is rendelkezik a májra és az immunrendszerre.

Kattintson a cistanche deserticola kiegészítő termékre

1. Bemutatkozás

A külső öregedéssel foglalkozó tanulmányok beszámoltak arról, hogy a bőr fontos szerepet játszik az emberi öregedés azonosításában [1,2]. A bőr öregedését két típusra oszthatjuk: a kronológiai öregedés, amely a bőr szerkezetének és funkcióinak idővel fokozatosan romlásával jár együtt, a másik pedig az exogén öregedés (fotoöregedés), ahol a bőr textúrája a hosszú, időtartamú napfénynek való kitettség [3,4]. A szabad gyökök és a reaktív oxigénfajták a legfontosabb összetevők, amelyek elősegítik a bőr öregedését. Oxidatív stresszt váltanak ki a bőrsejtekben, a folyamat során keletkező anyagok pedig fokozott melanintermelést és ráncosodást okoznak.

A melanint a tirozináz vagy L-3,4-dihidroxifenilalanin (L-DOPA) oxidációja szintetizálja, a tirozináz és a tirozinázzal rokon protein 1 (TRP-1) aktivitása révén. A melanociták fontos szerepet játszanak a bőr sugárkárosodás elleni védelmében [5,6]. A melanocitákban a melanin bioszintézisét a tirozináz enzim közvetíti, amely szabályozza az L-DOPA képződését a tirozin hidrolízisén keresztül és a DOPA kinon képződését a DOPA oxidációja révén [7,8]. Ezenkívül a mikroftalmiával összefüggő transzkripciós faktor (MITF) kulcsfontosságú transzkripciós faktor, amely a melanogén enzimek (azaz tirozináz, TRP-1 és TRP-2) transzkripcióját szabályozza [9,10]. A tirozinázt és a TRP-1-t transzkripciósan szabályozza az MITF, amely fontos szerepet játszik a melaninszintézis folyamatában [11,12].

A Kummerowia striata (Thunb. ex Murray) A Schindl (K. striata) Kelet-Ázsiában, köztük Koreában, Kínában és Japánban őshonos egynyári növény. A növényt régóta hagyományos gyógynövényként használják gyulladáscsökkentő terápiában. Ez a tanulmány a K. striata (EKS) etanolos kivonatának és két vegyületének potenciális anti-melanogén és antioxidáns hatásának elemzésére irányult. Az antioxidáns aktivitást szabad gyökfogó aktivitásuk alapján értékelték 2,2'-kazino-bisz (3-etilbenzotiazolin-6-szulfonsav) diammóniumsó (ABTS) és 2,{{11 }}difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) vizsgálatok. Az anti-tirozináz aktivitást a tirozináz gátlási vizsgálattal értékeltük. Azt találtuk, hogy az EKS és vegyületei ígéretes jelöltek a bőrfehérítésre és a ráncok csökkentésére szolgáló kozmetikai termékekben.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Sejttenyésztési feltételek

Az egér B16F10 melanoma sejtvonalakat az American Type Culture Collection-től (Manassas, VA, USA) vásároltuk. A sejteket Dulbecco's Modified Eagle Mediumban (DMEM, Gibco, San Jose, CA, USA) tenyésztettük 10 százalék borjúmagzati szérummal (FBS) és penicillin/sztreptomicinnel (Gibco, USA) kiegészítve, párásított atmoszférában, amely 5 százalék szén-dioxidot tartalmazott a levegőben. 37 fokon.

2.2. Reagensek

A következő antitesteket kereskedelmi forrásokból vásároltuk: anti-tirozináz, anti-TRP-1, anti-TRP-2 és anti-MITF (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL, USA); anti- -aktin antitestek, valamint egér és nyúl IgG-torma-peroxidáz konjugátumok (Cell Signaling, Beverly, MA, USA).

2.3. Kummerowia striata kivonat készítése

A K. striata (Thunb. ex Murray) Schindler légi részeit a dél-koreai Gyeonggi állambeli Gimpóban gyűjtötték be 2013 szeptemberében, és Joa Sub Oh professzor, a Dankook Egyetem Gyógyszerészeti Főiskolája, Cheonan, Dél-Korea azonosította. Egy utalványmintát (G63) letétbe helyeztek a Bio-centerben, Gyeonggido Business & Science Accelerator, Suwon, Dél-Korea. A K. striata (Thunb. ex Murray) Schindler (1,8 kg) légi részeit szobahőmérsékleten 70%-os etanollal (3 × 18 liter) extraháltuk. Az egyesített etanolos extraktumokat ezután vákuumban 40 °C-on bepároljuk, így 180 g maradékot kapunk. Az etanolos extraktumot desztillált vízben szuszpendáljuk, majd egymás után megosztjuk diklór-metánnal (CH2Cl2), etil-acetáttal (EtOAc) és butanollal (n-BuOH). Az MC-frakciót (7,52 g) folyadékoszlopkromatográfiával választottuk el [üvegoszlop (7,5 × 40 cm), szilikagéllel (70-230 mesh) megtöltve], gradiens keverékeket használva eluensként (CH2Cl2 → MeOH).

Az F001–F006 eluens-frakciókat ebből a kezdeti folyadékkromatográfiás elválasztásból kaptuk. Az F003 frakciót ODS-C18 géllel töltött üvegoszlopon (5,0 × 40 cm) oszlopkromatográfiával tisztítottuk. Az oszlopot ezután H2O → MeOH eleggyel eluáltuk, ami hét alfrakciót eredményezett (F007-F013). 15,2 mg p-kumársavat izoláltunk az F007-ből folyadékoszlopkromatográfiával [üvegoszlop (3,0 × 40 cm, tele ODS-C18-cal), gradiens eluálást alkalmazva (H2O → MeOH). Kvercetint (13,5 mg) izoláltunk az F004-ből folyadékoszlopkromatográfiával [üvegoszlop (3,0 × 40 cm, tele ODS-C18-cal)] gradiens elúcióval (H2O → MeOH). Szerkezetüket 1D és 2D mágneses magrezonancia (NMR) és tömegspektrometria kombinációjával, valamint az irodalommal közölt összehasonlítással tisztázták [13,14].

2.4. Általános eljárások

1D és 2D [1H-1H korrelációs spektroszkópia (COSY), heteronukleáris egykvantumkoherencia (HSQC) és heteronukleáris többszörös kötés korreláció (HMBC)] Az NMR-spektrumokat Bruker Ascend III 70{100 készüléken mértük. {25} MHz NMR spektrométer (Rheinstetten, Németország) belső standardként tetrametil-szilánnal. A kémiai eltolódásokat δ értékekben fejeztük ki. Az elektropermet ionizációs (ESI) tömegspektrumokat LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific) tömegspektrométeren vettük fel. A nyitott oszlopos kromatográfiát szilikagél (Kiesel gel 60, 70-230 mesh és 230-400 mesh; Merck) és ODS-C18 gel ODS-A (12 nm S7 μm, YMC GEL, Japán) segítségével végeztük. A vékonyréteg-kromatográfiát előre bevont szilikagél 60 F254 (0,25 mm, Merck) és előre bevont szilikagél 60 RP-18 F-254S (0,25 mm, Merck) alkalmazásával végeztük. Minden vegyszer és oldószer analitikai minőségű volt, és további tisztítás nélkül használtuk fel.

2.5. Sejtéletképességi vizsgálat

3-(4,5-Dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid (MTT) vizsgálatot végeztünk az EKS sejtre gyakorolt ​​hatásának meghatározására életképességét. A B16F10 egér melanoma sejteket 96-lyukú lemezeken tenyésztettük (1 × 104 sejt/lyuk), és 24 órán át EKS-sel kezeltük. Összesen 100 μl szérummentes táptalajt adtunk hozzá, amely 10% MTT-oldatot (5 mg/ml) tartalmazott, és 3 órán át inkubáltuk. A tápközeget eltávolítottuk, és kétszer mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS). Ezt követően 100 μl dimetil-szulfoxidot (DMSO) adtunk minden egyes lyukba, és feloldottuk rázógépben. Az abszorbanciát 540 nm-en mértük ELISA olvasóval (Molecular Device, USA).

2.6. A sejtek melanin tartalma

A B16F10 sejteket 6-lyukú lemezeken tenyésztettük 1 × 105 sejt/lyuk sűrűséggel, és 24 órán át inkubáltuk. A melanogenezist 100 nM -Melanocita-stimuláló hormonnal (-MSH) indukáltuk. A sejteket arbutinnal (pozitív kontroll) és EKS-sel kezeltük különböző koncentrációkban, és 72 órán át tenyésztettük. Kétszeri PBS-sel történő mosás után lízispuffert [100 mM nátrium-foszfát (pH 6,8) és 0,1 mM fenil-metán-szulfonil-fluorid (PMSF), 1% Triton X-100] adtunk hozzá, és -80 fokon 30 percig feloldottuk. A sejtgyűjtés után 1 N NaOH-t, amely 10% DMSO-t tartalmazott, 65 °C-on 1 órán át reagáltattuk, hogy a pellet feloldódjon, és az abszorbanciát 405 nm-en mérjük.

2.7. Tirozináz gátlási vizsgálat

A tirozináz gátló aktivitást Yagi és munkatársai által leírt módszerrel mértük. [15]. A reakciót 0,1 M kálium-foszfát pufferben (pH 6,5) hajtottuk végre, amely 1,5 mM L-tirozint és 1250 egység/ml gomba tirozinázt tartalmazott. A reakcióelegyet 37 °C-on 20 percig inkubáltuk. A tesztmintákat a tirozináz gátlásra vizsgáltuk úgy, hogy megmértük a tirozináz aktivitásra gyakorolt ​​hatását ELISA leolvasóval 490 nm-en. Arbutint használtunk pozitív kontrollként.

2.8. DPPH gyökfogó aktivitási vizsgálat

A DPPH gyökfogó aktivitását Blois [16] és Ozgen és munkatársai által leírt módszerrel mértük. [17]. Röviden, 100 μl metanolban oldott DPPH oldatot adtunk 100 µl EKS-hez, amelyet a kívánt koncentrációra hígítottunk, és a reakciót szobahőmérsékleten 30 percig folytattuk. Az abszorbanciát 517 nm-en mértük ELISA olvasóval (Molecular Device, USA). Pozitív kontrollként antioxidáns butilezett hidroxianizolt (BHA) használtunk, és meghatároztuk az EKS IC50 értékét.

2.9. ABTS gyökfogó tevékenység

Az ABTS gyökfogó aktivitását egy korábban leírt módszerrel mérték [18,19]. Az ABTS plus-t úgy állítottuk elő, hogy 7 mM ABTS oldatot és 2,45 mM kálium-perszulfát (K2S2O8) oldatot kevertünk össze ABTS: K2S2O8-cal (2:1 arány) 12-16 órán keresztül kation (ABTS plus ) képződéséhez. Az abszorbancia értéke 734 nm-en 1,35 ± 0,05 volt. Összesen 100 μl hígított oldatot és 100 μL megfelelő koncentrációra hígított EKS-t reagáltattunk szobahőmérsékleten 6 percig, majd az abszorbanciát 734 nm-en mértük ELISA olvasó segítségével. Pozitív kontrollként BHA-t, egy antioxidánst használtunk, és meghatároztuk az EKS IC50 értékét.

2.10. Reverz transzkripciós-polimeráz láncreakció (RT-PCR)

A B16F10 melanoma sejteket 6-lyuklemezekre oltottuk 1 × 106 sejt/lyuk sűrűséggel, és EKS-sel (100-400 ug/ml) kezeltük 72 órán keresztül. A teljes RNS extrahálásához Trizol reagenst (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.) adtunk minden egyes lyukhoz a sejtek lizálása céljából, és 200 µl kloroformot adtunk hozzá. Ezután az elegyet 13, 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 20 percig 4 fokon, és a felülúszót izopropanollal kevertük 30 percig -70 °C-on. 13, 000 fordulat/perc 20 perces, 4 fokos centrifugálás után a felülúszót eltávolítottuk, és 70%-os EtOH-dietil-pirokarbonát vizet adtunk minden kémcsőhöz. 13, 000 fordulat/perc 5 perces, 4 fokos centrifugálás után a felülúszót eltávolítottuk és szobahőmérsékleten szárítottuk.

Ezt követően 1 ug extrahált teljes RNS-t reverz átírtunk egyszálú cDNS-vé oligo dT-vel Taq DNS polimeráz és SuperScript®III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.) alkalmazásával. A cDNS-t MyGene™ Series Peltier Thermal Cycler Model MG96 G-ben (LongGene Scientific Instruments, Hangzhou, Kína) amplifikáltuk specifikus primerek és AccuPower® Pfu PCR premix (Bioneer Corporation, Daejeon, Koreai Köztársaság) alkalmazásával. A PCR ciklus körülményei 5 perc 95 fokon, majd 30 ciklus 30 másodpercig 95 fokon, 30 másodperc 60 fokon, 1 perc 72 fokon, és a végső meghosszabbítás 10 percig 72 fokon. Az amplifikáció után a PCR-termékeket 1,5%-os etidium-bromidot tartalmazó agarózgélen elektroforézisnek vetjük alá, és UV-transzilluminátorral elemezzük.

2.11. Western blot analízis

A B16F10 melanoma sejteket 10% FBS-sel kiegészített DMEM-ben tenyésztettük 1 × 106 sejt sűrűségben 6-lyukú lemezeken 37 fokos hőmérsékleten és 5% CO2 mellett 24 órán át. A táptalaj eltávolítása után a tápközegben hígított EKS-t (100-400 ug/ml) 72 órán át kezeltük. A sejteket PBS-sel mostuk, RIPA pufferrel (Sigma Aldrich) összegyűjtöttük, és 15, 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 15 percig 4 fokon. A teljes fehérjét a sejtekből extraháltuk, és Bradford-módszerrel meghatároztuk. A fehérjéket 8%-os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel választottuk el, és nitrocellulóz membránra vittük át (Whatman, Dassel, Németország). A membránt 5% BSA-val blokkoltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, és egy éjszakán át inkubáltuk elsődleges antitesttel 4 °C-on. A membránt ezután mostuk, és torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. A membránt mostuk és SuperSignal® West Pico kemilumineszcens szubsztráttal (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL, USA) detektáltuk.

2.12. Statisztikai analízis

A statisztikai elemzést Student-féle t-teszttel végeztük Microsoft Excel 2007 programmal (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA). Az eredményeket átlag ± szórásként mutatjuk be, és p< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference. 

1. ábra: Kummerowia striata etanolos kivonatának hatása a tirozináz gátlására, a sejtek életképességére és a melanin szintézisre (A) A Kummerowia striata (EKS) etanolos kivonatának tirozináz gátló aktivitását a reakció során keletkező dopakróm mennyiségének mérésével elemeztük. Arbutint használtunk pozitív kontrollként. (B) Melanintartalom 100 nM MSH-val stimulált B16F10 sejtekben. A melanintartalmat a kontroll tartalom százalékában számítottuk ki. (C) A B16F10 egér melanoma sejteket EKS-sel (25-400 ug/ml) és arbutinnal (400 ug/ml) kezeltük. Az EKS és az arbutin citotoxicitását MTT vizsgálattal határoztuk meg. Az értékek három független ismétlés átlagát ± SD. A statisztikai szignifikancia értéke *P < 0,05, **P < 0,01, összehasonlítva a nem kezelt mintákkal vagy -MSH-val kezelt sejtekkel.

\

2. ábra: Kummerowia striata (A és B) etanolos kivonatának antioxidáns hatása A szabad gyökfogó aktivitást a leírtak szerint határoztuk meg. Az antioxidáns aktivitást DPPH gyökfogó aktivitási vizsgálattal és ABTS plusz gyökkation teszttel mértük. Pozitív kontrollként butilezett hidroxi-anizolt használtunk. Az értékek három független ismétlés átlagát ± SD. A statisztikai szignifikancia: *P < 0.05, **P < 0,01, összehasonlítva a nem kezelt mintákkal.

3. Eredmények

3.1. Az EKS melanogenezis elleni hatásai

Az EKS anti-melanogén aktivitásának meghatározására gomba tirozináz tesztet alkalmaztunk, szubsztrátként L-tirozint és enzimforrásként gomba tirozinázt alkalmaztunk. Mivel a tirozináz a melanin bioszintézisének sebességkorlátozó lépését katalizáló kulcsenzim, először az EKS tirozináz gátló képességét mértük. Amint az 1A. ábrán látható, az EKS dózisfüggő módon jelentős gátló hatást fejtett ki a tirozináz aktivitásra. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az EKS gátló hatást mutatott a gomba tirozináz aktivitására, és az EKS gátló hatása hasonló volt a pozitív kontrollként használt arbutinhoz.

Ezt követően az EKS melaninszintézisre gyakorolt ​​hatásának meghatározásához az EKS-sel kezelt B16F10 melanomasejtek melanintartalmát számszerűsítettük. Amint az 1B. ábrán látható, az EKS-kezelés dózisfüggő módon csökkentette a melanintartalmat a melanomasejtekben, jelezve, hogy a celluláris melanin csökkenése a tirozináz aktivitások gátlásának tudható be. Ezenkívül az EKS B16F10 melanoma sejtek életképességére gyakorolt ​​hatásának vizsgálata azt mutatta, hogy az EKS-nek nem volt jelentős citotoxikus hatása a B16F10 sejtekre az alkalmazott koncentráció mellett (1C. ábra). Ezek az eredmények egyértelműen azt mutatják, hogy az EKS anti-melanogén hatást fejt ki a tirozináz aktivitás és a melanin szintézis gátlásán keresztül a B16F10 melanoma sejtekben anélkül, hogy citotoxicitást indukálna.

3.2. Az EKS antioxidáns hatása

Az EKS megkötő aktivitását DPPH szabad gyökök segítségével határoztuk meg (2A. ábra). Az EKS magasabb antioxidáns aktivitást mutatott (megkötő aktivitás=50,22 százalék, IC50=98,71 ug/ml). Az EKS gyűjtőképességét szintén ABTS gyökkation segítségével értékeltük (2B. ábra). Az EKS ABTS gyökfogó képessége hasonló volt a pozitív kontroll BHA-éhoz (fogóképesség=99,53 százalék, IC50=24,64 ug/ml). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az EKS magasabb antioxidáns aktivitással rendelkezik.

3.3. Az EKS hatása a melaninszintézis gének expressziójára

Az EKS melanogenezist szabályozó molekuláris mechanizmusok további vizsgálata érdekében megvizsgáltuk a melanogén gének és fehérjék, például a tirozináz, TRP-1, TRP-2 és MITF expressziójában bekövetkezett változásokat, amelyek kulcsszerepet játszanak. melanogenezisben [20]. Amint a 3A. ábrán látható, a tirozináz, TRP-1, TRP-2 és MITF mRNS expresszióját -MSH váltotta ki; az EKS kezelés azonban szignifikánsan csökkentette az mRNS expressziót (100-400 ug/ml). Ezenkívül az EKS erős gátló hatást mutatott, hasonlóan a pozitív kontroll arbutinéhez. Ezt követően Western blot analízissel értékeltük az EKS hatását a melanogenezishez kapcsolódó fehérjék expressziójára. Amint a 3B. ábrán látható, az EKS-kezelés jelentősen gátolta a tirozináz, TRP-1, TRP-2 és MITF -MSH-indukált expressziós szintjét a B16F10 sejtekben. Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy az EKS B16F10 sejtek melanogenezisére gyakorolt ​​gátló hatása a melanogén gének és fehérjék, például a tirozináz, a TRP1, a TRP-2 és a MITF leszabályozásán keresztül közvetíthető.

3. ábra: Kummerowia striata etanolos kivonatának hatása a melanin bioszintézis folyamatára (A) A tirozináz, TRP1, TRP2 és MITF mRNS szintű expresszióját RT-PCR segítségével határoztuk meg. Arbutint használtunk pozitív kontrollként. A tirozináz, TRP1, TRP2 és MITF mRNS-eket denzitometriás protokollal elemeztük. Arbutint használtunk pozitív kontrollként. (B) A tirozináz, TRP1, TRP2 és MITF fehérjeszintű expresszióját Western blottal határoztuk meg. Arbutint használtunk pozitív kontrollként. A tirozinázt, a TRP1-et, a TRP2-t és a MITF-et denzitometriás protokollal elemeztük. Arbutint használtunk pozitív kontrollként. Az értékek három független ismétlés átlagát ± SD. A statisztikai szignifikancia: *P < {{10}},05, **P < 0,01, összehasonlítva az -MSH-val kezelt sejtekkel.

4. ábra: Kummerowia striata (A) etanolos kivonat hatóanyagainak tirozináz gátló és antioxidáns aktivitása A p-kumársav és a kvercetin (12,5–50 μM) tirozináz gátló aktivitását elemeztük. (B) A kumársav és a kvercetin (100–400 μM) anti-melanogén aktivitását B16F10 sejtekben elemeztük. (C) A p-kumársav és a kvercetin (6,25-100 μM) antioxidáns aktivitását ABTS plusz gyökkation teszttel mértük. Pozitív kontrollként arbutint és BHA-t használtunk. Az értékek három független ismétlés átlagát ± SD. A statisztikai szignifikancia értéke *P < 0,05, **P < 0,01, összehasonlítva a nem kezelt mintákkal.

3.4. Az EKS-ből származó p-kumársav és kvercetin erős anti-melanogén és antioxidáns hatást mutattak

Ezt követően megkíséreltük azonosítani és megtisztítani az EKS-ben jelen lévő funkcionális vegyületeket, amelyek erős anti-melanogén és antioxidáns tulajdonságokat mutatnak. A különböző vegyületeket luteolinként, p-kumársavként, rozmarinsavként, kvercetinként, geniszteinként és (plusz)-katekinként azonosították. Közülük a p-kumársav és a kvercetin dózisfüggő módon gátolta a tirozinázt és a melanin szintézisét, és az arbutinhoz, egy jól ismert depigmentáló szerhez hasonló nyelőképességet mutatott (4. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a p-kumársav és a kvercetin fontos vegyületek az EKS melanogén és antioxidáns tulajdonságai szempontjából.

4. Megbeszélés

Ebben a tanulmányban az EKS és két vegyülete, a p-kumársav és a kvercetin anti-melanogén és antioxidáns potenciáljának elemzésére törekedtünk, és megállapítottuk, hogy az EKS erős anti-melanogén és antioxidáns hatással rendelkezik.

A bőr pigmentációját leginkább a bőr alaprétegében található melanociták okozzák, UV-sugárzás hatására. A stimulált keratinociták -MSH-t (egy kis peptidhormon) választanak ki [21]. Így az UV-expozíció melanintermelést indukál, ami hiperpigmentációt eredményez [22]. Az utóbbi időben sok kutató új és hatékony fehérítő vegyületek kifejlesztésére összpontosított, mivel a fehérítő hatású kozmetikumok a kozmetikai piac jelentős részét alkotják. A melanin bioszintézisének gátlásával kapcsolatos vizsgálatok kimutatták, hogy az arbutin, a kojinsav és sok más természetes termék gátolja a melanogenezist és a hiperpigmentációt. Az arbutin [23] és a kojsav [24] mellékhatásairól azonban nemrégiben számoltak be, és ezeknek az anyagoknak a használata korlátozott lehet. Ezért biztonságos, mellékhatások nélküli bőrfehérítő anyagok kifejlesztésére van szükség. A legújabb kutatások középpontjában a természetes anyagokból készült bőrfehérítő kozmetikumok fejlesztése áll.

Számos tanulmány igazolta a K. striata kivonatok különféle biológiai aktivitásait. Különösen a K. striata gyógyászatilag hatékony gyulladás és oxidáció esetén [25,26]. A K. striata melanogenezisre gyakorolt ​​hatásairól és molekuláris mechanizmusairól azonban a mai napig nem számoltak be. Jelen tanulmányban először mutatjuk be, hogy az EKS anti-melanogén és antioxidáns hatással rendelkezik.

A tirozináz, a TRP-1 és a TRP-2 fontos szerepet játszanak a melanin bioszintézisében [27]. Így a bőrfehérítő szerek hatásának hátterében álló mechanizmus a melanintermelés gátlása a tirozináz aktivitás csökkentésével [28]. Ismeretes, hogy a tirozináz, TRP-1 és TRP-2 gének expresszióját a MITF szabályozza [29]. A jelen vizsgálatban az EKS anti-melanogén aktivitását a tirozináz aktivitás és az -MSH által kiváltott melaninszintézis gátlása közvetíti B16F10 melanomasejtekben, citotoxicitás kiváltása nélkül (1. ábra). Úgy találták, hogy az EKS ezen anti-melanogén aktivitásai az -MSH-indukált mRNS és a tirozináz, TRP-1, TRP-2 és MITF fehérje-expressziójának lelassulásával közvetítettek (3. ábra). Az antioxidáns aktivitást DPPH és ABTS tesztekkel mértük. Az EKS erős antioxidáns aktivitást mutatott, hasonlóan a BHA-hoz, amelyet pozitív kontrollként használtunk (2. ábra). Az EKS-ben jelenlévő aktív vegyületeket p-kumársavként és kvercetinként izoláltuk és igazoltuk. Bár a p-kumárium különböző biológiai aktivitásáról számoltak be, beleértve a szívvédő [30], gyulladásgátló [31,32], antimutagén [33] antioxidáns [34,35] és anti-melanogén [36] hatását. Ez az első olyan tanulmány, amely arról számolt be, hogy az EKS-ből származó p-kumársav és kvercetin anti-melanogén és antioxidáns hatással rendelkeznek.

Ebben a vizsgálatban az EKS anti-melanogén és antioxidáns aktivitását értékelték. Az EKS anti-melanogén és antioxidáns hatást fejtett ki a tirozináz aktivitás szabályozásán és az -MSH által kiváltott melaninszintézisen keresztül a B16F10 melanomasejtekben anélkül, hogy citotoxicitást váltana ki. A fő hatóanyagok a p-kumársav és a kvercetin voltak. Eredményeink tehát először mutatják be, hogy az EKS potenciális depigmentáló és antioxidáns szerként használható.

Összeférhetetlenség

A szerzők nem nyilatkoznak összeférhetetlenségről.

Finanszírozás

Ezt a munkát a KKV-k és Startupok Minisztériuma (MSS, Korea) által finanszírozott technológiafejlesztési program (S2393982) támogatta.

Átláthatósági dokumentum

A cikkhez kapcsolódó átláthatósági dokumentum az online verzióban található.

Hivatkozások

[1] P. Limtrakul, S. Yodkeeree, P. Thippraphan, W. Punfa, J. Srisomboon, Anti-aging and tyrosinase inhibition effects of Cassia fistula flower butanol extract, BMC Complement. Altern. Med. 16 (2016) 497.

[2] A. Gragnani, S. Cornick, V. Chominski, S. Ribeiro de Noronha, S. Alves Corrêa de Noronha, L. Ferreira, Review of major theory of skin aging, Adv. Aging Res. 3 (2014) 265–284.

[3] TD Pedrosa, AO Barros, JR Nogueira, AC Fruet, IC Rodrigues, DQ Calcagno, MA Smith, TP de Souza, SB Barros, MC de Vasconcellos et al., Ránctalanító és fehérítő hatása a jucá Libidibia ferrea Mart.) kivonatok, Arch. Dermatol. Res. 308 (2016) 643–654.

[4] N. Delalle-Lozica, Helyi terápia mint alapvető öregedésgátló megelőzés, Acta Clin. Horvát. 49 (2010) 529–536.

[5] N. Maddodi, A. Jayanthy, V. Setaluri, Ragyogó fény a bőr pigmentációján: az UV-sugárzás hatásainak sötétebb és világosabb oldala, Photochem. Photobiol. 88 (2012) 1075–1082.

[6] C. Dessinioti, AJ Stratigos, D. Rigopoulos, AD Katsambas, A hypopigmentáció genetikai rendellenességeinek áttekintése: a melanociták biológiájából tanultak, Exp. Dermatol. 18 (2009) 741–749.

[7] A. Nishina, A. Miura, M. Goto, K. Terakado, D. Sato, H. Kimura, Y. Hirai, H. Sato, N. Phay, a Mansonone E a Mansonia gagestől gátolta az -MSH-indukálta melanogenezist B16 sejtekben a CREB expresszió és foszforiláció gátlásával a PI3K/Akt útvonalon, Biol. Pharm. Bika. 41 (2018) 770–776.

[8] VJ Hearing, TM Ekel, emlős tirozináz. A tirozin-hidroxiláció és a melaninképződés összehasonlítása, Biochem. J. 57 (1976) 549–557.

[9] M. Kanlayavattanakul, N. Lourith, Növények és természetes termékek a bőr hiperpigmentációjának kezelésére – áttekintés, Planta Med. (2018), https://doi.org/10.1055/a0583-0410 [Epub nyomtatás előtt].

[10] M. Kanlayavattanakul, N. Lourith, Bőrhiperpigmentáció kezelése gyógynövényekkel: a klinikai bizonyítékok áttekintése, J. Cosmet. Laser Ther. 20 (2018) 123–131.

[11] JJ Hsiao, DE Fisher, A mikroftalmiával összefüggő transzkripciós faktor és pigmentáció szerepe melanomában, Arch. Biochem. Biophys. 563 (2014) 28–34.

[12] LA Garraway, HR Widlund, MA Rubin, G. Getz, AJ Berger, S. Ramaswamy, R. Beroukhim, DA Milner, SR Granter, J. Du, C. Lee és munkatársai, Integrative genomic analysiss detect MITF rosszindulatú melanomában felerősített leszármazási túlélési onkogénként, Nature 436 (2005) 117–122.

[13] X. Zhang, P. Guo, G. Sun, S. Chen, M. Yang, N. Fu, H. Wu, X. Xu, Fenolvegyületek és flavonoidok a Pandanus tectorius terméséből Soland, J. Med . Plants Res. 6 (2012) 2622–2626.

[14] H. Li, Q. Ma, Y. Liu, J. Qian, J. Zhou, Y. Zhou, Chemical constituents from Polygonum perfoliatum, Chin. J. Appl. Environ. Biol. 15 (2009) 615–620.

[15] A. Yagi, T. Kanbara, N. Morinobu, Inhibition of mushroom-tyrosinase by aloe extract, Planta Med. 56 (1987) 515–517.

[16] MS Blois, Antioxidáns meghatározása stabil szabad gyök használatával, Nature 181 (1958) 1199–1200.

[17] U. Ozgen, A. Mavi, Z. Terzi, A. Yιldιrιm, M. Coşkun, PJ Houghton, Antioxidant properties of some medical Lamiaceae species, Pharm. Biol. 44 (2006) 107–112.

[18] NJ Miller, C. Rice-Evans, MJ Davies, V. Gopinathan, A. Milner, Egy új módszer az antioxidáns kapacitás mérésére és alkalmazása koraszülöttek antioxidáns állapotának monitorozására, Clin. Sci. 84 (1993) 407–412.

[19] S. Dudonne, X. Vitrac, P. Coutière, M. Woillez, JM Mérillon, 30 iparilag fontos növényi kivonat antioxidáns tulajdonságainak és teljes fenoltartalmának összehasonlító vizsgálata DPPH, ABTS, FRAP, SOD és ORAC vizsgálatokkal , J. Agric. Food Chem. 57 (2009) 1768–1774.

[20] M. Otreba, J. Rok, E. Buszman, D. Wrzesniok, Regulation of melanogenesis: the role of cAMP and MITF, Postepy Hig. Med. Dosw. 66 (2012) 33–40.

[21] JS Han, JH Sung, SK Lee, A hidrolizált ginzeng kivonat (GINST) melanogenezis elleni hatása a JNK mitogén által aktivált protein kináz gátlásán keresztül B16F10 sejtekben, J. Food Sci. 81 (2016) H2085–H2092.

[22] M. Chatatikun, A. Chiabchalard, Thai növények magas antioxidáns szinttel, szabad gyökfogó aktivitással, anti-tirozináz és anti-kollagenáz aktivitással, BMC komplement. Altern. Med. 17 (2017) 487.

[23] C. Couteau, LJ Coiffard, Arbutin, növényi fehérítőszer, fotostabilitás meghatározása, Farmaco 55 (2000) 410–413.

[24] Y. Higashi, Y. Fujii, Kojisav meghatározása bőrfehérítő kozmetikumban nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával, ultraibolya kimutatással párosítva, oszlop előtti származékképzést követően 4-fluor{5}}nitro{ {6}},1,3-benzoxazol, J. Cosmet. Sci. 63 (2017) 205–212.

[25] JY Tao, L. Zhao, ZJ Huang, XY Zhang, SL Zhang, QG Zhang, Zhang BH FeiXiao, QL Feng, GH Zheng, Kummerowia striata (Thunb.) Schindl etanolos kivonatának gyulladásgátló hatása az LPS-re stimulált RAW264.7 sejt, Inflammation 31 (2008) 154–166.

[26] J.-H. Lee, J.-S. Park, Kummerowia striata (Thunb.) oldószerrel extrahált frakcióinak antioxidáns hatásai, Schindl, Indian J. Sci. Technol. 8 (2015) 28–31.

[27] S. Kippenberger, S. Loitsch, F. Solano, A. Bernd, R. Kaufmann, Quantification of tyrosinase, TRP-1, and Trp-2 transzkriptumok humán melanocitákban reverz transzkriptázzal kompetitív módszerrel multiplex PCR – szteroid hormonok szabályozása, J. Invest.Dermatol. 110 (1998) 364–367.

[28] YD Park, SY Kim, YJ Lyou, DY Lee, JM Yang, TXM13 humán melanomasejtek: új forrás a humán tirozináz gátlási kinetikájához és a fehérítő szerek szűréséhez, Biochem. Cell Biol. 84 (2006) 112–116.

[29] A. Tuerxuntayi, YQ Liu, A. Tulake, M. Kabas, A. Eblimit, HA Aisa, Kaliziri kivonat fokozza a tirozináz, TRP-1, TRP-2 és MITF expresszióját egér B16 melanómában sejtek, BMC komplement. Altern. Med. 14 (2014) 166.

[30] N. Prasanna, DN Krishnan, M. Rasool, Nátrium-arzenit által kiváltott kardiotoxicitás patkányokban: a p-kumársav védő szerepe, egy gyakori étrendi polifenol, Toxicol. Mech. Methods 23 (2013) 255–262.

[31] SJ Pragasam, V. Venkatesan, M. Rasool, A p-kumársav, egy gyakori étrendi polifenol immunmoduláló és gyulladásgátló hatása patkányok kísérleti gyulladására, Inflammation 36 (2013) 169–176.

[32] M. Lee, M. Son, E. Ryu, Kim JG Yu SS, BW Kang, GH Sung, H. Cho, H. Kang, A kvercetin által kiváltott apoptózis megakadályozza az EBV fertőzést, Oncotarget 6 (2015) 12603–12624 .

[33] LR Ferguson, IF Lim, AE Pearson, J. Ralph, PJ Harris, Baktériumellenes mutagenezis hidroxifahéjsavak által növényi sejtfalakból, Mutat. Res. 542 (2003) 49–58.

[34] C. Castelluccio, G. Paganga, N. Melikian, GP Bolwell, J. Pridham, J. Sampson, C. Rice-Evans, Antioxidant potencial of intermediates in fenilpropanoid metabolizmus magasabb rendű növényekben, FEBS Lett. 368 (1995) 188–192.

[35] IM Erden, A. Kahraman, A flavonol kvercetin védő hatása az ultraibolya által kiváltott oxidatív stressz ellen patkányokban, Toxicology 154 (2000) 21–29.

[36] SM An, Koh JS és Boo YC: a p-kumársav nemcsak az emberi tirozináz aktivitást gátolja in vitro, hanem a melanogenezist is az UVB-nek kitett sejtekben, a Phytother. Res. 24 (2010) 1175–1180.

For more information:1950477648nn@gmail.com