A Cistanches Salsa proliferációt gátló hatása a jóindulatú prosztata hiperplázia előrehaladására Ⅰ
Oct 18, 2022
Absztrakt:Cistanche Tubulosakezelésére használják a hagyományos gyógyászatbanvesehiány, ideggyengeség, szexuális diszfunkciós betegségek, ésjóindulatú prosztata hiperplázia(BPH). Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy megvizsgálja azt a mechanizmust, amellyel a C. tubulosa kivonat (CSE)antiproliferatív hatás a prosztata szövetéreBPH-indukált patkányok esetében. A CSE BPH-ra gyakorolt hatását a prosztata tömege, a seruln dihidrotesztoszteron (DHT) termelése, valamint az 1-es és 2-es típusú 5o-reduktáz mRNS expressziója alapján értékelték BPH-indukált patkányok prosztataszövetében. Ezenkívül hematoxilin és eozin (H&E) festést végeztünk a prosztata mirigy morfológiájának szövettani vizsgálatához, és Western blot analízissel vizsgáltuk a prosztataszövet fehérje expressziós szintjét. A CSE-kezelés csökkentette a prosztata tömegét, a szérum DHT-koncentrációját, valamint az 1-es és 2-es típusú 5o-reduktáz mRNS-expresszióját BPH-indukált patkányok prosztataszövetében. Ezenkívül a CSE-kezelés elnyomta a sejtproliferációt a gyulladásos eredetű fehérjék (indukálható nitrogén-monoxid-szintáz és ciklooxigenáz 2) és az apoptózissal kapcsolatos fehérjék (kaszpáz-3 és Bcl-2 családbeli fehérjék) expressziós szintjének szabályozásával. A CSE a BPH potenciális terápiás jelöltje lehet, mivel képes szabályozni a gyulladásos és apoptózissal kapcsolatos fehérjék expresszióját.
Kulcsszavak:jóindulatú prosztata hiperplázia, Cistanche Tubulosa, dihidrotesztoszteron, gyulladás, apoptózis, Bcl-2.
Bevezetés
Cistanche TubulosaKína északnyugati részén őshonos parazita növény. Szára fontos hagyományos keleti gyógymód, amelyet a betegségek kezelésére használnakvesehiányésideggyengeség(Deng et al. 2004). A C.tubulosa-ról azt is beszámolták, hogy hatásos a betegségek kezelésében.szexuális diszfunkciós betegségek, úgymintimpotenciaésjóindulatú prosztata hiperplázia(BPH) a koreai orvosi könyvben, a DonguiBogam néven. A fenil-etanoid-glikozidok (PhG-k) a fő aktív alkotórészei ennek a gyógynövénynek (Jimenez és Riguera 1994). Számos PhG-ről kimutatták, hogy számos biológiai tulajdonsággal rendelkezik, beleértve az antioxidáns és daganatellenes hatásokat. Az akteozid, a C. tubulosa egy PhG-je, gátolja a 1-metil-4-fenilpiridinium-ion (MMP*) által kiváltott apoptózist kisagyi szemcseneuronokban (Pu et al. 2003). Bár a C. tubulosa fiziológiai funkcióiról tanulmányokat végeztek, a C. tubulosa BPH-ra gyakorolt hatásai mögött meghúzódó molekuláris mechanizmus(oka)t nem vizsgálták.
A BPH-t a prosztata megnagyobbodása jellemzi, a mirigyen belüli nem rákos növekedés következtében (Andriole et al. 2004). A BPH előfordulásának és incidenciájának növekedése a népesség elöregedésével összefüggésben történik. 2030-ra az Egyesült Államok lakosságának 20 százaléka 65 éves vagy annál idősebb lesz, ez a szám több mint 20 millió férfit fog tartalmazni (Parsons 2010). Bár a BPH gyakori rendellenesség az idős férfiaknál, ennek etiológiája és patológiája A BPH nincs teljesen meghatározva, és jelenleg nincs tökéletes kezelés a BPH kezelésére (Djavan et al. 2010).
A BPH kezelési lehetőségei közé tartoznak a farmakológiai és sebészeti stratégiák.
Az elmúlt években a BPH-ban szenvedő betegeknél a sebészeti beavatkozások száma csökkent a gyógyszeres kezelések javára (Emberton et al. 2011). A BPH természetéből adódóan a gyógyszeres kezelés hosszú és folyamatos gyógyszerhasználatot igényel. Ezért nagyon fontos kérdés a gyógyszer hosszú és folyamatos tolerálhatósága. Különféle farmakológiai ágenseket, például 5a-reduktáz inhibitorokat (finaszterid és du-taszterid) és a-adrenoceptor antagonistákat (alfuzozin, terazozin, doxazozin, tamsulosin) használnak a BPH kezelésére (Lepor 2011;
Untergasser és mtsai.2005). A BPH kezelésének fő farmakológiai hatóanyagai az 5a-reduktáz gátlók, amelyekről ismert, hogy szabályozzák az 5o-dihidrotesztoszteron szintet, és az o-adrenerg blokkolók (Tiwari et al. 2005). Bár ezekről a farmakológiai szerekről úgy vélik, hogy jelentősen gátolják a BPH előrehaladását, számos tanulmány beszámolt nemkívánatos mellékhatásaikról (Patel és Chapple 2006). Például a finaszteridről beszámoltak különböző mellékhatásokról, beleértve a szédülést, az izomnövekedés zavarát és súlyos myopathia a szteroid hormonokhoz való szerkezeti hasonlósága miatt (McConnell és mtsai. 2003; Uygur és mtsai. 1998). Mivel ezek a farmakológiai szerek nemkívánatos mellékhatásokat mutatnak, a BPH hatékony kezelésére szolgáló gyógynövények megtalálása jelentős gyógyászati értékkel bír.
A C. tubulosa BPH-ra gyakorolt hatásának értékelésére kimutattuk, hogy a C. tubulosa kivonat (CSE) képes módosítani a prosztata sejtnövekedés és az apoptózis közötti egyensúlyhiányt tesztoszteronnal indukált BPH patkánymodellekben.
Anyagok és módszerek Anyagok és reagensek
A C.tubulosát az Omniherb Co.Ltd.-től vásároltuk. (Daegu, Koreai Köztársaság) és a finaszteridet a Merck and Co.Inc.-től szerezték be. (New Jersey, USA). A tesztoszteront, a fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF), a Triton X-100-t, a propidium-jodidot (PI), a Nonidet P-40(NP-40) és a protein inhibitor koktélt (PIC) a Sigma-Aldrich cégtől vásároltuk. Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). A GAPDH oligonukleotid primereket és az 1-es és 2-es típusú 5o-reduktázt a Bioneer-től (Deajeon, Korea), a SYBR Primix Ex Taq-ot pedig a Takarától (Shuzo, Shiga, Japán) vásároltuk. Anti-iNOS elleni antitestek (M{{9} }), COX-2(C-20),poli(ADP-ribóz)polimeráz-1(PARP-1,(D-1),kaspáz{{ 16}} (H-277),Bcl-2(C-2),Bcl-xL(H-5),Bax(B-9),és Az anti- -aktint (ACTBD11B7) a Santa Cruz Biotechnology-tól (Santa Cruz, California, USA) vásároltuk. Az anti-PCNA antitestet a BD Biosciences, Pharmingen (San Diego, Kalifornia, USA) cégtől vásároltuk. tubulosa kivonat (CSE)
A C. tubulosa gyógynövényeit az Omniherb Co.Ltd.-től vásároltuk. (Yeongcheon, Kyungpook, Koreai Köztársaság). Nedvességtartalmuk volt<13% by="" weight="" and="" were="" air-dried.="" afterward,="" herbs="" underwent="" extraction="" with="" 50%(v/v)="" ethanol-water="" at="" 60="" ℃for="" 8="" h.="" the="" extract="" obtained="" was="" filtered="" through="" 20="" μm="" cartridge="" paper,="" and="" ethanol="" was="" removed="" by="" vacuum="" rotary="" evaporation="" (eyela,="" japan).="" the="" concentrate="" was="" subsequently="" freeze-dried,="" and="" the="" yield="" was="" found="" to="" be="" 12%="" w/w.="" the="" experiment="" was="" performed="" by="" dissolving="" the="" dry="" extract="" in="" distilled="" water,="" and="" the="" rest="" of="" extract="" was="" stored="" at="" -20="" ℃.="" the="" identities="" of="" the="" active="" components="" of="" the="" extract,as="" determined="" by="" hplc,="" were="" reported="" previously(jiang="" and="" tu="">
Állatok
Tízhetes hím Sprague-Dawley patkányokat (200±20 g) a Daehan Biolink-től (Daejeon, Koreai Köztársaság) vásároltunk. Az állatokat olyan körülmények között helyezték el, amelyek megfeleltek a laboratóriumi állatok gondozására és használatára vonatkozó irányelveknek, amelyeket a Sangji Egyetem Intézményi Állatgondozó Bizottsága (rendeletszám:{5}}) fogadott el és hirdetett ki. A patkányokat a kísérlet megkezdése előtt 2 hétig akklimatizáltuk a laboratóriumi körülményekhez. 4 hétig szabad hozzáférést kaptak élelemhez és vízhez, és 12 órás világos/12 órás sötét ciklusban tartották őket állandó 22±2 fokos hőmérsékleten és 55±9 százalékos relatív páratartalom mellett a kísérlet során. A patkányokat véletlenszerűen 4 csoport (n=6) egyikébe soroltuk: a kontrollcsoport (Con, normál prosztata vivőoldattal: foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS) 200 μL, po）; BPH-indukált csoport (BPH), BPH-indukált csoport finaszteriddel kezelt (5 mg/kg/nap, po,(Fina)), BPH-indukált csoport CSE-vel (200 mg/kg/nap; po) A kontrollcsoport patkányait felvágtuk és majd zoletil@ 50-nel (20 mg/kg, ip.) érzéstelenítést követően a herék eltávolítása nélkül összevarrták; a többi csoport patkányait kasztrálták, majd 3 napos gyógyulás után a BPH-indukált csoportok tesztoszteron-propionátot (10 mg/kg) kaptak. /nap, ip, kukoricaolajban feloldva) önmagában vagy CSE-vel vagy finaszteriddel együtt naponta 4 héten keresztül Az utolsó adagolás után huszonnégy órával az összes patkányt leöltük zoletil® 50 (20 mg/kg, ip) érzéstelenítés után. Vérmintákat vettünk a caudalis vena cavából, a szérumot centrifugálással elválasztottuk, és -80 fokon tároltuk. A teljes prosztatamirigyet eltávolítottuk és lemértük (Guo et al.2004).
A prosztata súlyának és testtömegének aránya
A prosztata szöveteit kimetsszük, leöblítjük és azonnal lemérjük. A prosztata tömeg/testtömeg arányát (PW/BW arány) az alábbiakban leírtak szerint számítottuk ki.
PW/BW arány
= (a kísérleti csoportból származó állatok mindegyik prosztatasúlya/kísérleti csoportból származó állat minden egyes testtömege) x 100 A prosztata súlyának növekedésének gátlása
A vizsgálat befejeztével a prosztatákat eltávolítottuk és lemértük. A növekedésgátlás százalékos arányát a következőképpen számítottuk ki: 100-[(kezelt csoport-kontroll csoport)(BPH-csoport-kontroll csoport)×100]. A dihidrotesztoszteron (DHT) szérumkoncentrációinak elemzése
A DHT szérumkoncentrációit kereskedelmi forgalomban kapható ELISA-val (ALPCO Diagnostics, Salem, New Hampshire, USA) határoztuk meg. Ahogyan azt mondják, a gyártó utasításai szerint végezték.
Szövettani elemzés
A prosztataszövetet mindegyik csoportban 4%-os formalinoldatban fixáltuk, paraffinba ágyaztuk, majd 4 órás metszetekre vágtuk. A metszeteket hematoxilinnel és eozinnal (H&E) festettük szövettani vizsgálat céljából. A képek SZX10 mikroszkóppal készültek (Olympus, Tokió, Japán). A szövettani analízist és a prosztata hámszövetének vastagságát (TETP) a Szöuli Orvostudományi Intézet (Szöul, Korea) hivatásos szövettani szakembere mérte. Leica Application Suite (LAS, ver. 3.3.0) szoftver a szövettani elemzés objektív értékeléséhez. Kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (PCR) elemzés
Az egyes állatok prosztataszövetét homogenizáltuk, és a teljes RNS-t Easy-Blue® Reagent (Intron Biotech-nology Inc., Gyeongi-do, Koreai Köztársaság) alkalmazásával izoláltuk a gyártó utasításai szerint. A teljes RNS mennyiségét Epoch@micro-volume spektrofotométer rendszerrel (BioTek Instruments, Inc. Winooski, Vermont, USA) határoztuk meg. A májból és a zsigeri zsírszövetekből származó teljes RNS-t cDNS-vé alakították át nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlet (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) segítségével. A PCR-amplifikációt a SYBR green (Applied Biosystems) segítségével végeztük. ). Az 5o-reduktáz 1-es típusú, patkányból tervezett oligonukleo-otid primerjei a GGAAGG TTT CAT GGCCTT CG (előre) és a TCG AGG GCA GCT GTA TG (reverse), a patkányból tervezett 5o-reduktáz 2 típusú primerek ATG voltak. GGG ACC CTG ATC CTG TG (előre) és CGA CAC CACAAA GGA AGG CA (fordított), valamint a házigazda génként használt és patkányból tervezett GAPDH primerek a TGA TTC TAC CCA CGG CAA GT (előre) és AGC voltak. ATC ACC CCA TTT GAT GT (fordított). A reverz transzkripciót thermocycler (Gene Amp⑧ PCR rendszer 9700, Applied Biosystems) segítségével végeztük, és az eredményeket az optimális sűrűség GAPDH-hoz viszonyított arányában fejeztük ki. Western blot analízis
Prosztata szövetminden állatból homogenizáltuk a kereskedelmi forgalomban lévő PRO-PREP⑧ (Intron Biotechnology Inc.) lízispufferben, és 25 percig jégen inkubáltuk a sejtlízis indukálására. A szöveti kivonatokat 16 000g(4 fok)-on centrifugáltuk 20 percig, és a felülúszót átvittük egy tiszta csőbe. A fehérjekoncentráció megakadályozta, hogy tipikus szövettani elváltozásokat mutasson, beleértve a megvastagodott mirigyhámot, a mirigy lumenje felé mutató vakuolizált citoplazmát és a mirigy luminális területének csökkenését (3A. ábra). A CSE 4 hétig tartó alkalmazása elnyomta ezeket a tipikus hiperpláziás mintákat, amelyek a normál prosztataszövetből a prosztata hiperpláziába történő szövettani változást jelentik. Röviden, a finaszteriddel és CSE-vel kezelt csoportok szövettani vizsgálata egyértelmű tendenciát mutatott a prosztata hiperplázia javulására. Ezen túlmenően, amint a 3B. ábra mutatja, a TETP-elemzés azt mutatta, hogy a BPH-indukált patkányokban a legvastagabb hámszövetet figyelték meg bármely más vizsgálati csoporthoz képest, és a finaszteriddel és CSE-vel kezelt csoportok a prosztata vastagságának jelentős csökkenését mutatták. .
A prosztata epiteliális sejtek proliferációjának értékelésére megvizsgáltuk a PCNA fehérje expresszióját BPH-indukált patkányok prosztata szövetében. Amint az a 3C. ábrán látható, a Western blot analízis a PCNA-fehérje expressziójának növekedését mutatta a BPH-indukált csoportban a kontrollcsoport PCNA-szintjéhez képest. A BPH-indukált csoporthoz képest azonban a finaszteriddel és CSE-vel kezelt csoportok csökkent PCNA-fehérje expressziót mutattak, ami jelzi a BPH-ban mutatott proliferációt gátló hatásukat.
2. ábra: Cistanche Tubulosa kivonat (CSE) beadásának hatása a szérum dilhidrotesztoszteron (DHT) termelésére és az 5a-reduktáz 1. és 2. típusú mRNS szintjére jóindulatú prosztata hiperplázia (BPH) által kiváltott patkánymodellek prosztata szöveteiben. (A) A DHT szérumkoncentrációit ELISA vizsgálattal határoztuk meg. (B) Az 1-es típusú 5a-reduktáz és a 2-es típusú mRNS expresszióját prosztataszövetben kvantitatív valós idejű PCR-rel elemeztük. A bemutatott adatok csoportonként 6 patkány átlag±SEM-jét jelentik."<><0.001 vs.con=""><0.001 vs.bph="">
