A galluszsavval konjugált peptidkészítmény (Gal2-Pep) antioxidáns és öregedésgátló hatása
May 04, 2023
A bőr nagyon érzékeny az idő előtti öregedésrekülső stressz miatt, ezért ebben a tanulmányban egy peptid készítmény, (galloil)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) TPPTTP peptid és gallusz kombinálásával szintetizáltuksav (GA). Az összes peptidet 2-klór-tritil-klorid gyantán szintetizálták szilárd fázisú peptid felhasználásávalszintézis (SPPS), és elektrospray ionizációval (ESI)/kvadrupól időflflight (Q-TOF) tandem tömegspektroszkópiai (MS) rendszer. Kezdetben Gal2–A Pep nem mutatott toxicitást a 100-as koncentráció alattmM 88 százalékos sejttúlélési rátával a keratinociták ésfibroblasztok. Areaktív oxigén fajok(ROS) tisztító aktivitása a Gal2–A Pep stabilabb volt, mint a GA önmagában; és négy hét után a szobábanhőmérséklet, annakROS-eltávolító tevékenység50 százalék felett maradt. Ezenkívül a peptid készítmény,Gal2–A Pep elasztázgátló hatást is mutatott CCD{0}}Sk-benfibroblasztsejteket. Az RT-qPCR eredményei alapján ebben a tanulmányban bebizonyosodott, hogy a Gal2–A Pep növelte a PGC kifejeződését-1a nak nekmegakadályoznioxidatív stressz, és érvényesítette potenciálját, mint anöregedésgátló szeráltalkifejezésének növelésetípusú kollagénés általa mátrix metalloproteináz-1 (MMP1) expressziójának csökkentése. Amegállapításait A kapott eredmények megerősítik azt a feltételezést, hogy az ebben a tanulmányban szintetizált peptidkészítményt atermészetes antioxidánsésöregedésgátló szerkozmetikai alkalmazásaihoz.
Kattintson ide, ha többet szeretne megtudni a Cistanche öregedésgátló termékekről
1. Bemutatkozás
A bőr öregedésea keratinociták és a tesó sejtosztódásának fokozatos csökkenése és esetleges leállása következtében következik be.robbanások a bőrön belül. A sejtek számának csökkenésével ráncok alakulnak ki a bőrön, aminek következtében az extracelluláris mátrix denaturációja kiszáradáshoz és rugalmasság elvesztéséhez vezet.ticitás a bőrben.1 Az intracelluláris mitokondriális DNS károsodásaés a fehérjeszintézis sebességének csökkenése is bekövetkezika bőr öregedési folyamata során.2 A bőr öregedésének két fő útja vanbelső és külső módokon, ultraibolya (UV) expozícióval
fő mozgatórugójakülső öregedés. Az UV fény reagál a főbb bőrkomponensekkel, beleértve a lipideket, fehérjéket és nukleinsavakat, a sejtekhez vezető reaktív oxigénfajták (ROS) előállításáhozhalál.3–5 A túlzott ROS szint a hasadáshoz és aa kollagén- vagy elasztinláncok rendellenes megkötődését, és elősegíti a mátrix metalloproteinázok (MMP-k), például az MMP-1 expresszióját, amelyek lebontják a kollagént, ami a bőr ráncosodásához és aa bőr öregedésének felgyorsítása.6,7 Ezért antioxidáns terápia eltávolítaniA ROS és a mitokondriális potenciál aktiválása megvédi a bőrt az öregedéstől.
A ROS mellett az elasztáznak jelentős szerepe van aa bőr rugalmasságát, amely lebontja az elasztint, amely fontos fehérje aextracelluláris mátrix.8 Elasztin, jelentős rugalmas visszarúgása miattjellemzői biztosítják a bőr rugalmasságát, míg az elasztáz rendelkezikaz elasztin és más fehérjék hasításának képessége.8 Ezért inhibiAz elasztáz enzim a bőr megereszkedésének kulcsfontosságú stratégiája lehet megakadályozza a bőr rugalmasságának elvesztését.
Ebben a tanulmányban egy új anyagot terveztünk, amely egyesíti aperoxiszóma proliferátor által aktivált receptor gamma koaktivátor1-alpha (PGC-1a)-eredetű peptid TPPTTP és galluszsav (GA)öregedésgátló kozmetikumokban való használatra. A GA különféle gyümölcsökben és zöldségekben, köztük szőlőben, paradicsomban és zöld teában található fitokemikáliáról ismert, hogy magas antioxidáns és antibakteriális hatású. effects.9 Bár a GA-t a kozmetikai és élelmiszeriparban használják, mivel ezek a jótékony plffects, megfogalmazása általában instabil.10 Így fejlesztettük ki (galloyl)2–KTPPTTP (Gal2–Pep) a GA stabilitásának növelése érdekében a PGC-hez való kötéssel-1a-származék peptid TTPTTP.
Ebben a tanulmányban szintetizáltunk egy (galloil)2–KTPPTTP (Gal2– Pep) peptid készítmény galluszsavval konjugálva és megerősítveantioxidáns és öregedésgátló hatású.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Anyagok
Dulbecco módosítottaEagle's Medium (DMEM), penicillin/sztreptomicin, magzati szarvasmarha szérum (FBS), foszfát-bufferedsóoldatot (PBS) és a tripszint a Gibco-tól (Carls
rossz, CA). Hidroxibenzotriazol (HOBt), diizopropil-karbodiimid (DIC), 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-diizopropil-etil-amin (DIEA), galluszsav ésN-szukcinil-tri-alanil-pA nitroanilidet a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) cégtől szereztük be.L- aminosavakat képez (Fmoc-Lys (Boc))–OH, Fmoc-Thr (tBu)–OH és Fmoc-Pro–OH) a Bead-Tech-től (Szöul,Korea).
2.2. Peptidek és galluszsavhoz kapcsolt peptidek szintézise
Minden peptidet 2-klór-tritil-klorid gyantán szintetizáltak (200mmol skála, helyettesítési érték¼ 1,46 mmol g 1) HOBt segítségével–DIC által közvetített szilárd fázisú peptidszintézis (SPPS).
A peptidszintézist SPPS módszerrel enyhe módosításokkal végeztükkorábbi tanulmányokra utaló kationok.11–13 A 2-klorotril-klorid (CTC) gyantát diklórban duzzasztunk
metánnal (DCM, 8 ml) 30 percig. A gyantát lemostákdimetil-formamid (DMF). Minden reakciót szobahőmérsékleten hajtottunk végre. Fmoc védett aminosav származékok (2 ekvivalens(Ekvival.), afiaz első kapcsolt aminosavat vagy 5 ekvivalens, a többi aminosav esetében) vagy DIEA-val (5 ekvivalens, kapcsolt aminosav esetén) vagy HOBt/DIC-vel (6 ekv./5 ekv.) kapcsoltuk DMF-ben.fteraz Fmoc védőcsoport eltávolítása 2 térfogatszázalékos DBU-val DMF-ben (2-szer, 2 percenként, 8 ml). És minden lépést 5-ször mostak DMF-fel. A végső gallusavat lizinhez kapcsolt peptidekkel kapcsoltuk.A galluszsav kapcsolása után a gyanta voltaszűrve, mosva,és nagy vákuumban szárítjuk. A hasítási oldat (TFA:ionmentesített [DI] víz: TIS¼ 95:2,5:2,5, v/v/v százalék) 2 órán keresztül kezeltüknyers peptidek kinyerésére. A nyers peptideket kicsapjuk, és háromszor mossuk hideg dietil-éterrel.
Analitikai fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiaAz (RP-HPLC) vizsgálatot Waters 2695 Separations készüléken végeztükModul Capcell Pak C18 oszloppal (4,6 mm 250 mm, 5mm, Shiseido). A mobil fázis 0,05 százalékos TFA-ból állt a H-ban2O (A mozgó fázis) és 0,05% TFA acetonitrilben (B mozgófázis).
Az eluálást a mobilokhoz lineáris gradiens alkalmazásával végeztükB fázis 5-65 százalék 30 perc alatt aáramlási sebesség 1.{1}} ml min 1. A peptidcsúcsokat 230 nm hullámhosszon detektáltuk. A félpreparatív RP-HPLC-t Waters HPLC rendszeren (Pump 600E, Detector UV-484) végeztük Gemini RP-C18 készülékkel.oszlop (21,2 mm 250 mm, 5mm, Phenomenex). A mobil fázis 0,05 százalékos TFA-ból állt a H-ban2O (A mobil fázis)és 0,05% TFA acetonitrilben (B mozgófázis). Az eluálást a B mozgófázis lineáris gradiensének alkalmazásával végeztük7 százalékról 22 százalékra 15 perc alatt aláramlási sebesség 10 ml min 1. Aa peptidcsúcsokat spektrofotometriásan detektáltuk 230 nm hullámhosszon.
A szintetizált peptideket 5%-os hangyasavban vízben oldottuk, és elektropermet ionizációval (ESI) analizáltuk.kvadrupól időlight (Q-TOF) tandem tömegspektroszkópia(MS) rendszer (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). A mintákat a Q-TOF rendszerrel felszerelt Q-TOF rendszerbe injektáltuknano-spray forrás al1-es kamatlábmL min 1. Az ESI ionA forrásparaméterek a következők voltak: 1,5 kV ionpermet feszültség, 10 psi nyomású függönygáz és 5 psi nyomású burkológáz. A spektrumok bennetartományban gyűjtöttük össze a teljes letapogatási módot és az MS/MS-tm/z
100–1200 Da 25 ms/spektrum akkumulációs idő mellett.Az ütközési energiát 10-ről 80-ra emelték. Az eredményAz adatokat az Analyst TF segítségével szereztük be, ígyware és automatikusana centroid 80 százaléka, minimális csúccsal, 10 százalékos zajcsökkentéssel, közepes izotóp-eltávolítással 3 százalékos küszöbértékkel, zajcsökkentés és simítás nélkül. A szintetizált peptideket azonosítottáktömegtűréssel 0.05 Da és manuálisan szekvenálva a következő MS/MS tűrés alapján 0.01 Da.
2.3. Sejttenyészetek és életképességi vizsgálatok
Humán, felnőtt, alacsony kalciumtartalmú, magas hőmérsékletű (HaCaT) sejtekés CCD{0}}Sk (normál emberi bőrfibroblaszt) sejtek voltakDMEM-ben tenyésztett 10% FBS-t és 1% penicillint/sztreptomicin. A sejteket 37 °C-on inkubáltuk C párásított légkamrában 5 százalék CO-val2.Az életképességi vizsgálatokhoz sejtszámláló készletet-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Peking, Kína) használtunk. HaCaT és CCD-1064Sk cellák96-lyuk mikrolemezekbe oltották (5 103 sejt/lyuk) és 37 °C-on inkubáltuk C 5 százalékos CO-ban2 24 órán keresztül. A tenyészeteket ezután a szintetizált peptidek vagy GA különböző koncentrációinak tesszük ki, és 37 °C-on inkubáljuk. C 5 százalékos CO-ban2 24 órán keresztül. Sejt életképességezt követően CCK{0}} segítségével mértük a gyártó irányelveit követve.
2.4. Az antioxidáns aktivitás meghatározása
2.4.1. DPPH vizsgálat.A szintetizált antioxidáns aktivitásaA peptideket és a GA-t egyenként értékeltük DPPH vizsgálattal. A DPPH vizsgálatokat egy korábban közölt eljárást követően végeztük
módszertan kisebb módosításokkalkation.12,14–16 Először egy 0,12 mg ml 1 DPPH oldatot készítettünk metanolban, majd 100 ulmL DPPH oldat és 100mL szintetizált peptidet vagy GA-t kevertünk össze különböző koncentrációkban ({{0}},1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM és 1 mM)mM) 96-lyuk mikrolemezeken. Egy orbitális rázós inkubátorban aAz elegyeket 30 percig 37 °C-on reagáltattuk C és 100 ford./perc nélkülfény. Az abszorbanciát ezután 517 nm-en mértük, és kiszámítottuk az antioxidáns kapacitást.
2.4.2. ROS-eltávolító tevékenység.
Az intracelluláris ROS-megkötő aktivitást egy 20,70-diklórfluoreszcein-diacetát kit segítségével értékeltük(DCF-DA, Abcam, USA). A HaCaT sejteket 96-lyuk mikrolemezekbe oltottuk (5 103 sejt/lyuk) és 37 °C-on inkubáltuk C-on 24 órán át.AftAz inkubálás után a tenyészeteket a szintetizált peptidekkel vagy GA-val (100mM) és 37 °C-on inkubáltuk C-on 24 órán át. A sejteket ezután 10mM DCF-DA oldatot és 30 percig inkubáltuk. AftAz inkubálás után az oldatot PBS-sel mostuk. Asejteket mikrolemez-leolvasóval elemeztük gerjesztéskor és
485 nm, illetve 530 nm emissziós hullámhossz.
1. ábraA peptidek szintetikus lépése és szekvencia megerősítése kvadrupol-idővelrepülési(Q-TOF) tömegspektrometria: (a) részletes szintetikus eljárás (b) TPPTTP, (c) galloil–TPPTTP és (d) (galloil)2–KTPPTTP.
2.5. Mitokondriális membrán potenciál vizsgálat
JC-1 festéket (Thermo Fisher, USA) használtunk a mitokondriális vizsgálathozmembránpotenciál (MmP) vizsgálat. A CCD-1064Sk és HaCaT sejteket 96-lyuk mikrolemezekbe oltottuk (5 10 3sejt/lyuk)
és 37-en inkubáltuk C-ban és 5 százalékos CO-ban2 24 órán keresztül. Hátsóaz inkubáció,a tenyészeteket a szintetizált peptidek különböző koncentrációinak tettük ki, és 37 °C-on inkubáltuk C 5 százalékos CO-ban2 24 órán keresztül.JC-1 festéket adtak a CCD-1064Sk és HaCaT cellákhozelőállítani a végső koncentrációja 10mM. Aft10 perces inkubálás után a sejteket kétszer mostuk 37-tel C PBS. Zöld és pirosfluoreszcenciaVarioskan LUX készülékkel mértükMultimódusú mikrolemez-olvasó (ThermoFisher, USA) egy excitáció (lVolt)/emisszió (lEm) 475/530 nm és alVolt/lEm475/590 nm, ill.
2.6. Elasztáz gátló aktivitási vizsgálat
CCD-1064Sk sejteket 6-lyuklemezekre oltottunk, és 37 °C-on inkubáltuk. C 5 százalékos CO-ban2 24 órán keresztül. A tenyészeteket ezután 100 ul koncentrációnak tesszük kimM a szintetizált peptidek vagy GA, és 37 °C-on inkubáltuk C 5 százalékos CO-ban2 24 órán keresztül. A sejteket kétszer mostuk dPBS-sel, és minden sejtet sejtkaparóval összegyűjtöttünk. Aer hozzáadva 0.2 M Tris–HCl (pH 8.0) 0,1 százalék Triton-X-szel az összegyűjtöttA sejteket ultrahanggal homogenizáltuk. A homogenizált oldatot 20 percig 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltukés 4 C. Ezután afta felülúszót, a fehérje mennyiségét véve-kationt BCA fehérje vizsgálattal végeztük. Fehérje mindegyikheza mintát adták kifia végső koncentráció 100mgmL 1, ésN-szukcinil-tri-alanil-p-nitroanilidet adtunk hozzávégső koncentrációja 1,6 mM, és 36 °C-on reagált C-on 1 órán át.Ezután az abszorbanciát 405 nm-en mértük mikrolemez-leolvasóval.
2.7. RT-qPCR
Az öregedésgátló markerek mRNS szintjei a CCK-1064Sk sejtekbenRT-qPCR segítségével értékeltük ki. A teljes RNS-t TRIzol reagens (Life Technologies, Carlsbad, CA) és reverz felhasználásával gyűjtöttük össze.
átírva a PrimeScript RT reagenskészlettel (Takara BioInc., Kusatsu, Japán). Egy CFX96 rendszer (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) és iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora)
tories) használtuk az RT-qPCR-hez.b-Az aktint használták az I-es típusú kollagén, az MMP{1}} és a PGC-1 mRNS szintjének normalizálására.a.
2.8. Statisztikai analízis
Az adatokat átlagként adjuk meg szórástólhárom független mérést végeztünk, és Student-féle módszerrel elemeztükt-tesztek, ap < 0.05 considered to be a signinem lehet különbség.
Kérdezz többet:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plusz 86 15292862950
