Az aril-szénhidrogén-receptor-függő és független utak közvetítik a kurkumin öregedésgátló hatását

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Absztrakt:Az aril-szénhidrogén receptor (AhR) egy ligandum által aktivált transzkripciós faktor, amelynek aktivitása polifenolokkal, például kurkuminnal módosítható. Az AhR és a kurkumin evolúciósan konzervált hatást fejt ki az öregedésre. Itt azt vizsgáltuk, hogy az AhR közvetíti-e és hogyan közvetíti-e a kurkumin öregedésgátló hatásait fajok között. In vivo, in vitro és in silico elemzések kombinációjával kimutattuk, hogy a kurkumin AhR-függő vagy -független hatásai vannak kontextus-specifikus módon. Azt találtuk, hogy Caenorhabditis elegansban az AhR közvetíti a kurkumin által kiváltott élettartam meghosszabbítását, valószínűleg egy ligandum-független gátló mechanizmuson keresztül, amely az antioxidáns aktivitásához kapcsolódik. A kurkumin AhR-független öregedésgátló hatásokat is mutatott, például védelmet nyújtott az aggregációra hajlamos fehérjékkel és az oxidatív stresszel szemben a C.elegans-ban, valamint elősegíti az emberi elsődleges endoteliális sejtek migrációs képességét. Ezeket az AhR-független hatásokat nagyrészt a Nrf2/SKN{12}} útvonal közvetíti.

További információért kattintson ide

Kulcsszavak:aril szénhidrogén receptor; kurkumin; oxidatív stressz; Caenorhabditis elegans; egerek; endoteliális sejtek; in vivo; in vitro; in silico

1. Bemutatkozás

Az aril-szénhidrogén-receptor (AhR) egy mindenütt jelenlévő ligandum-aktivált transzkripciós faktor, amelyet emlősökben a 23,7,8-tetraklór-dibenzo-p-dioxinra (TCDD) adott toxikológiai válasz meghatározójaként azonosítottak [1]. Az AhR jelátviteli útvonalakat jól leírták emlőssejtekben. Röviden, a nem ligandozott AhR a citoplazmában lokalizálódik, és különféle kofaktorok stabilizálják, mint például a 90- kDa hősokk fehérje (Hsp90), az AHR-rel kölcsönhatásba lépő fehérje (AIP) és a chaperon p23. Az exogén (pl. TCDD) vagy endogén (pl. kinurenin) ligandumokhoz való kötődés elősegíti ennek a komplexnek a transzlokációját a sejtmagba, ahol az AhR disszociál kofaktoraitól, és az AHR nukleáris transzlokátorral (ARNT) egy heterodimerben összeáll. Az így létrejövő AHR/ARNT komplex kötődik az I. és II. fázisú méregtelenítő génekből álló készlet xenobiotikus reszponzív elemeihez (XRE), ami végül a ligandumok lebomlásához vezet [2]. A xenobiotikus válaszban betöltött szerepén kívül az AhR számos kórélettani folyamatban is szerepet játszik, az immunitástól [3,4], a gyulladástól [5,6], a lipid- és glükóz-anyagcseréig [7,8] a szív- és érrendszeri, máj- és más szervek betegségeit [9-12] fedezték fel az elmúlt évtizedekben. Egyre több bizonyíték utal az AhR eltérõ és ellentmondásos szerepére is az öregedési folyamatban, amelyek a szövet-, dózis- és fajspecifikus hatások figyelembevételével mégis összeegyeztethetõk [13].Cisztancse Dzsingisz kánAz AhR negatív szerepét az öregedésben és az életkorral összefüggő sajátosságokban fajok között leírták [14,15]. A vad típusú Caenorhabditis eleganshoz képest az AhR mutáns törzs, ahr-1(ju145) hosszabb élettartammal és egészséggel rendelkezik; egerekben az AhR-hiány javítja az érműködést és növeli a nitrogén-monoxid-szintáz aktivitását, és ezáltal az NO biológiai hozzáférhetőségét; és végül pozitív korrelációt találtak az AhR expressziója és az érmerevség között középkorú és idős emberekben [14]. Ezenkívül egy kínai populáción végzett epidemiológiai vizsgálatban az AhR expresszióját összefüggésbe hozták a koszorúér-betegség előfordulásával [16].

A Cistanche öregedésgátló hatású

Megjegyzendő, hogy számos, az öregedést vagy az életkorral összefüggő betegségeket befolyásoló vegyület [17-19] módosíthatja az AhR aktivitást [20-22]. Míg az AhR xenobiotikumok általi aktiválása különböző rákos megbetegedésekhez vezet emlősökben [23,24], a táplálkozási és környezeti tényezők ellentétes AhR-függő hatást mutattak a C.elegans egészségi állapotára [25]. Az étrendi AhR-modulátorok közül a polifenolokat, például a kurkumint, nagyrészt tanulmányozták egészségvédő hatásuk miatt. A kurkumin a Curcuma longa sárga pigmentje, amely számos evolúciósan megőrzött jótékony tulajdonsággal rendelkezik, beleértve az antioxidáns, gyulladásgátló és öregedésgátló hatásokat [26]. A kurkumin megakadályozza a fehérje aggregációt és növeli a C.elegans és Drosophila élettartamát a fehérje homeosztázis modulációján keresztül [27-29].ciszterna élettartam meghosszabbításaEzen túlmenően, ha egy Alzheimer-kór transzgénikus egérmodelljébe adták, jelentősen csökkentette a teljes amiloid-béta(A )terhelést [30]. Idős egerekben a kurkumin helyreállította az NO biohasznosulását, így csökkentve az oxidatív stresszt, és javítva az endothel diszfunkciót és az artériák merevségét az aorta pulzushullám sebességével (PWV) mérve – ez a nagy rugalmas artériák merevségének egyik legfontosabb klinikai mérése vagy markere [31]. Számos emberen végzett tanulmány kimutatta a kurkumin védő hatását a szív- és érrendszeri egészségre [32]. A kurkumin hatásmechanizmusa azonban még mindig nagyrészt tisztázatlan, és ami még fontosabb, azt nem vizsgálták, hogy jótékony egészségügyi hatásait az AhR közvetíti-e [33.34].

A modellszervezetek, mint például a C.elegans fonálféreg, fontos szerepet játszottak az öregedés genetikai és környezeti meghatározóinak azonosításában. Ennek oka számos előnyös tulajdonsága, többek között a könnyű laboratóriumi kezelés, a rövid élettartam, valamint a nagyszámú utódnemzés öntermékenyítéssel. A C.elegans genomja teljesen szekvenálva van, génjei és útvonalai többsége evolúciósan konzervált. Az AhR fehérjeszekvenciája az evolúció során konzervált, és a C.elegansban az AhR és ARNT ortológjait az AhR-hez kapcsolódó (ahr-1) és az ahr-1 kapcsolódó (aha{{4) kódolja }})gének, illetve [35]. A megfelelő fehérjék, az AHR-1 és az AHA-1, szekvenciaazonosságuk körülbelül 40 százalékában osztoznak az emlős fehérjékkel, és heterodimert alkotnak (az emlős megfelelőivel is), amely képes megkötni a célpont XRE-it. gének in vitro [36].cistanche nzAz AHR-1 leginkább neuronális sejttípusokban, például GABAerg neuronokban fejeződik ki [37l, és kulcsszerepet játszik az idegsejtek fejlődésének szabályozásában [38]. A gerincesek AhR-ével ellentétben az AHR-1 nem köti meg a TCDD-t és más rokon xenobiotikumokat [35,39], de az emlős AhR-rel közös jellemzőkkel rendelkezik a neuronális folyamatok, a fejlődés és a termékenység szabályozásában [37,38,{ {8}}], ami végül azt sugallja, hogy az ősi AhR nem vett részt közvetlenül a toxikus ligandumok lebomlásának gének szabályozásában [44,45]. Így felismertük, hogy a C.elegans egyedülálló és hatékony modellrendszer az AhR ősi funkcióinak azonosítására és tanulmányozására, amely valószínűleg nincs összefüggésben a xenobiotikus válaszával.

Ebben a tanulmányban az AhR szerepét vizsgáltuk a kurkumin öregedésgátló hatásaiban a fajok között. In vivo, in vitro és in silico elemzések kombinációjával azt találtuk, hogy a kurkumin különböző kedvező öregedésgátló hatásokat fejt ki a nem összekapcsolt ahr-1-függő és független mechanizmusok révén. Azt találtuk, hogy a C.elegans ahr{4}}kimerült állatok hosszú életűek, de érzékenyebbek az oxidatív stresszre. Míg a kurkumin nem hosszabbította meg tovább a C.elegans ahr-1 mutánsok élettartamát, elősegítette az oxidatív stresszel szembeni ellenállásukat. A kurkumin az AhR-től függetlenül is elősegítette az emberi elsődleges endotélsejtek (EC) antioxidáns válaszát és migrációs kapacitását, amely hatás elsősorban a Nrf2/SKN-n{8}} támaszkodott fajok között. Az SKN-1 a humán Nrt2 (nukleáris faktor eritroid 2-kapcsolódó 2. faktor) redox transzkripciós faktor C.elegans ortológja, amely evolúciósan konzervált szerepet játszik a sejt és szervezet homeosztázisában és az oxidatív stresszre adott válaszban [ 46,47] Egy celluláris riporter vizsgálatból és az AHR{15}} ligandumkötő domén (LBD) in silico modellezéséből származó csatolás eredményeként kimutattuk, hogy a kurkumin nagy valószínűséggel elnyomja az AHR-1 aktivitást egy ligandumban. kötéstől független módon. Nevezetesen, és összhangban a C.elegans és az EC adataival, a kurkumin és a pro-oxidánsok ellentétes hatást fejtettek ki az AHR-1 aktivitására, ami arra utal, hogy a kurkumin az antioxidáns kapacitása révén közvetlenül módosíthatja az AHR-1 aktivitást. vagy közvetve a Nrf2/SKN-1 vagy más redox szabályozó fehérjék szabályozásán keresztül.

2. Anyagok és módszerek

2.1. C.elegan1s

2.1.1. C. elegans törzsek és termesztés

A következő C.elegans törzseket használtuk: N2 [vad típusú], CZ2485 [ahr-1(júl.45)], NV38b [alhr-1(ju145);unc-54p:Q40 :YFP], NV38wt [unc-54p::Q40:YFP] (eredeti AM141 törzs [48]), NV42a [unc-54p::alphasymuclein::YFP, ahr-1 (júl. 45)], NV42wt [unc-54p::alphasynuclein::YFPI (eredeti NL5901 törzs [49]), NV35a [ahr-1(ju145);(pAF15)gst-4 p::GFP::NLS], NV35wt (pAF15)st-4p::GFP::NLS](eredeti törzs: CL2166). Karbantartás céljából a férgeket tojásrakással szinkronban tartottuk 20 fokos fonálféreg növekedési táptalajon. (NGM) lemezekre, és E. coli OP50-nel tápláljuk a [25]-ben leírt módszerek szerint. A kísérletekhez a férgeket E. coli HT115(DE3)-mal kiegészített lemezeken szinkronizáltuk 1 mM IPTG-vel kiegészített lemezeken (Fisher Scientific, Geel, Belgium).

2.1.2. Géncsillapítás RNS-közvetített interferenciával (RNAi)

A géncsendesítés úgy valósult meg, hogy E. coli HT115(DE3)-t expresszáló plazmidokat dsRNS-sel etettünk specifikus gének ellen [50]. Az RNSi etetést a születéstől a halálig folyamatosan alkalmaztuk. A HT115(skn-1) baktériumokkal végzett juglonrezisztencia vizsgálathoz az L4 férgeket 24 órán át RNSi-vel tápláltuk, majd friss juglon lemezekre vitték át őket.

2.1.3. E. coli törzsek és növekedés

A baktériumokat LB tápközegben tenyésztettük 37 fokon egy éjszakán át. E.coli hordozó vektorok alkalmazásakor az LB táptalajt 0.01 százalék ampicillinnel és 0,0005 százalék tetraciklinnel egészítettük ki.E.coli HT115(L4440), HT115(ugt{{8} }), HT115(skn-1) és OP50 az Ahringer C. elegans RNAi könyvtárából származott [51].

2.1.4.Élettartam

Az élettartam-elemzést szinkronizált férgek populációjából indítottuk, amelyet a termékeny időszak alatt naponta vittek át friss NGM lemezekre. A termékeny fázis után az állatokat minden másnap átültettük. Az elhullott, élő és cenzúrázott állatokat az átviteli folyamat során pontozták. Az állatokat elpusztultnak tekintettük, ha nem mutattak mozgást, nem reagáltak egy platinahuzallal végzett kézi ingerre, sem a garat pumpálását. Cenzúrázták azokat az állatokat, amelyeknek belső kikelésük volt (zsákos), felrobbant szeméremtestvérük, vagy amelyek kiszáradva a falon pusztultak el. Az OASIS[52] vagy az OASIS 2[53] túlélési elemzéséhez az elhullott és cenzúrázott állatok számát használták fel. Az átlagos élettartam és a túlélési görbe kiszámításához az OASIS-ben és az OASIS 2-ben Kaplan-Meier becslést használtunk, és a p-értékeket az összevont állatpopulációk log-rank tesztje segítségével számítottuk ki.

2.1.5. Mozgás/egészségügyi terjedelem

A mozgást az egészséges öregedés paramétereként határozták meg, az aktív mozgás fázisát pedig egészségi időszaknak nevezik. Az élettartam-vizsgálathoz használt populációkban értékelték. A spontán vagy kézi inger hatására mászó állatokat mozgónak, míg az elhullott vagy mászó viselkedéssel nem rendelkező állatokat nem mozgónak tekintették. A statisztikai elemzést az élettartamra vonatkozóan leírtak szerint végeztük.

2.1.6. Curcumin A C. elegans kezelése

A kurkumint (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Németország) DMSO-ban (Carl Roth, Karlsruhe, Németország) 100 mM koncentrációban oldottuk fel, és autoklávozás után az NGM-be juttattuk. A kurkumin végső koncentrációja a tápközegben 100 μM (0,1% DMSO) volt. A kontrolllemezek 0,1% DMSO-t tartalmaztak. A férgeket a tojástól kezdve folyamatosan kezeltük.

2.1.7. A PolyQ aggregátumok számszerűsítése

A PolyQ40 aggregátumokat fluoreszcens mikroszkóppal (100-szoros nagyítás) tettük láthatóvá 15 mM nátrium-aziddal érzéstelenített 10-napos férgekben (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Németország). Az aggregátumok számának felmérésére a képeket a Fidzsi-szigetek páronkénti összefűző pluginjával [54] fűzték össze, hogy egész férgeket hozzanak létre, és az aggregátumok számát Fidzsi-szigeteken [55] számszerűsítették az "Analyze Particles" beépülő modul segítségével.

2.1.8. Az x-synuclein aggregátumok mennyiségi meghatározása

- A 7-napos férgek fejizomzatában lévő szinuklein-aggregátumokat fluoreszcens mikroszkóppal (400-szoros nagyítás) tettük láthatóvá 15 mM nátrium-aziddal érzéstelenített férgekben (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Németország, S2002) ). A képeket Plastik (1.3.0-s verzió) segítségével szegmentálták (Anna Kreshuk laboratóriuma az Európai Molekuláris Biológiai Laboratóriumban, Heidelberg, Németország) (elérhető a https://www.ilastiku.org/ oldalon, 2018. április 10-én érhető el)[56] . A szegmentált képeket a Fidzsi-szigeteki aggregátumok számának elemzésére használták [55] az "Analyze Particles" plugin segítségével.

2.1.9.Microarray és GO kifejezések elemzése

Öt független ismétlésből mintákat gyűjtöttünk körülbelül {{0}}napos férgekkel állapotonként, és az RNS-t extraháltuk, és egy Affymetrix Chipbe töltöttük. A CEL formátumú microarray nyers adatokat az R szoftverrel (3.4.2 verzió) (R Foundation, Bécs, Ausztria) és a Bioconductor szoftverrel elemeztük (A Bioconductor Project, a Bioconductor nyílt forráskódú és nyílt fejlesztésű) [57]. A háttérkorrekciót, a normalizálást és az expressziószámítást az oligo package58] és az RMA módszerrel végeztük. A tömb minőségellenőrzésére az arrayQualityMetrics 3.34.{16}} [59]csomagot használták. A minőségi intézkedések miatt az ahr{11}}C5 mintát kizártuk a további elemzésből. A differenciálisan expresszált géneket a limma csomag és egy lineáris modell, valamint az FDR segítségével moderált t-statisztikával azonosítottuk, hogy teszteljük a többszörös összehasonlítást [6{{20}}]. 0,1 p-értéket alkalmaztunk. A differenciálisan expresszált géneket a génontológiai kifejezések gazdagítása céljából a Cytoscape (3.6.0-s verzió) (The Cytoscape Consortium, független non-profit szervezet)[61] segítségével elemezték a ClueGo (2.5.0-s verzió) (Laboratory of Integrative) bővítménnyel. Cancer Immunology, Párizs, Franciaország)[62]. A microarray adatok a Gene Expression Omnibus hozzáférési számon keresztül érhetők el. GSE195769.

2.1.10.ROS mennyiségi meghatározása

Az MtROS-t élő wt és ahr{0}} mutáns férgekben mutatták ki a MitoSOX Red (Ther-moFisher Scientific, Dreieich, Németország) segítségével. A fonalférgeket tojásrakással szinkronizáltuk IPTG-lemezekre, táplálékként HT115(L4440) baktériumot használva. Ezután 48 órával később 50 L4 stádiumú állatot vittünk át frissen készített 10 µM MitoSOX Red lemezekre, amelyeket UV-elölt HT115(L4440) oltottunk be. A férgeket sötétben, 20 fokon inkubáltuk. 16 órás inkubációt követően új NGM-lemezekre helyezték őket, amelyeket élő HT115(L4440)-lel megkentek 1 órára, hogy eltávolítsák a maradék festéket a belekből. Képalkotáshoz a fonálférgeket 2%-os agarózpárna tárgylemezekre szereltük, 10 mM levamizol hozzáadásával érzéstelenítettük, és ProLongTM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Németország) segítségével rögzítettük. A képeket azonnal vettük Zeiss Axio Imager M1 mikroszkóppal (Carl Zeiss, Inc., Köln, Németország), 40×-es objektív és DsRed szűrő használatával. Ezt követően a féregfej régiót manuálisan választottuk ki, és az integrált intenzitást a Fij 55 képalkotó szoftverrel számítottuk ki.

2.1.11. Tetrametil-rodamin-etil-észter (TMRE) vizsgálat

A mitokondriális membránpotenciál felmérésére a fonálférgeket tojásrakással szinkronizáltuk HT115(L4440) baktériummal oltott IPTG lemezeken. A kísérlet napján a TMRE-t (Invitrogen, Eugene, OR, USA) DMSO-ban oldottuk fel 5 mM koncentrációra, majd 30 µM-ra hígítottuk hővel inaktivált HT115-tel (L4440) (30 perc, 65 fok). Ebből az oldatból összesen 150 µl-t adtunk hozzá lemezenként, és körülbelül 30 percig sötétben hagytuk száradni. Hatvan kifejlett szinkron férget 1, 3 vagy 5 napos felnőttkorban felszedtünk az előkészített TMRE lemezekre, és 2 órán át, 20 °C-on, sötétben hagytuk a foltra felszívódni. A festés után a férgeket hővel inaktivált HT115(L4440)-nel oltott IPTG lemezekre vittük, és 1 órán át sötétben, 20°C-on inkubáltuk, hogy eltávolítsuk a maradék festéket a belekből.cistanche pénisz méreteA képalkotáshoz 10 fonálférget helyeztünk 2%-os agarózpárna tárgylemezekre, 10 mM levamizol hozzáadásával érzéstelenítettük, és ProLongM Glass Antifade Mountant (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Németország) segítségével rögzítettük. Minden kísérleti futtatáshoz csoportonként 5 tárgylemezt készítettek. A képeket azonnal vettük Zeiss Axio Imager M1 mikroszkóppal (Carl Zeiss, Köln, Németország), 2,5-szeres objektívvel és DsRed szűrővel. A fluoreszcencia intenzitását Fidzsi-szigetek segítségével számítottuk ki [55].

2.1.12. Garat pumpálási sebesség és motilitás vizsgálata

Az N2 és CZ2485 fonálférgeket fehérítéssel szinkronizáltuk [63], és a tojásokat egy éjszakán át keltetőtojás pufferben hagytuk (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3). Az L1 lárvákat 1 mM IPTG-vel kiegészített, 0,1% DMSO-t vagy 100 μM kurkumint tartalmazó NGM-re foltozták. A HT115 (L4440) baktériumokat élelmiszerként használták fel. A fiatal felnőtt férgeket M9 pufferrel összegyűjtöttük, centrifugáltuk (300 g × 3 perc), és kétszer mostuk a baktériumok eltávolítására. A férgeket 0-1 mM H, O, (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Németország) (100 féreg/100 μL) 2 órán át orbitális rázatással inkubáltuk. A kontrollférgeket csak M9 pufferrel inkubáltuk. 2 óra elteltével a férgeket 1 mM IPTG-vel kiegészített, 0,1% DMSO-t vagy 100 μM kurkumint tartalmazó NGM-be helyeztük, és táplálékként HT115(L4440) baktériumokkal oltották be. A garat pumpálási sebessége, amelyet a garat terminális burája 1 perces időközönkénti összehúzódásának megszámlálásával (pumpa/perc), a motilitási teszt pedig a testrepülések számának (testhajlítások/perc) számlálásával kaptunk. Az M9 puffert 1 perces időközönként 2-20 órával később értékelték.

2.1.13. Akut juglonérzékenységi vizsgálat

Az N2 és CZ2485 fonálférgeket DMSO-val vagy 100 μM kurkuminnal NGM-lemezekre történő tojásrakással szinkronizáltuk. A lemezeket 1 mM IPTG-vel egészítettük ki, és táplálékként HT115(L4440) vagy HT115(ugt-45) ​​baktériumokkal oltottuk be. A bőr-1 RNSi hatásának értékelése érdekében a férgeket tojásrakással szinkronizáltuk HT115(L4440) baktériummal beoltott DMSO vagy kurkumin lemezekre. Amint a fonálférgek elérték az L4 lárvaállapotot, 24 órára átvitték őket HT115(bőr-1) baktériummal beoltott DMSO vagy kurkumin lemezekre. Az 1. napon kifejlett férgeket (25 férget) 200 µM Juglone-t (Merck, Darmstadt, Németország) tartalmazó friss NGM lemezekre vittünk, és 25 µl 10-szeres koncentrált baktériummal egy éjszakán át tenyésztünk. A juglon által kiváltott oxidatív stressz alatti férgek túlélését érintéssel kiváltott mozgással ellenőriztük óránként, 6 órán keresztül. Az állatokat halottnak minősítették, amikor nem reagáltak a platina drótcsákány érintésére. A falon kiszáradt fonalférgeket cenzúrázták. Az elhullott és cenzúrázott állatok számát pontozták, és a túlélési elemzéshez az OASIS2 online alkalmazást alkalmazták [53].

2.1.14. A GST-4:GFP intenzitás számszerűsítése

Az NV35wt-t és az NV35a-t tojásrakással szinkronizáltuk 1 mM IPTG-vel kiegészített, 0,1% DMSO-t vagy 100 μMkurkumint tartalmazó NGM lemezekre. A HT115 (L4440), HT115 (ugt{10}}) és HT115 (bőr-7) baktériumokat élelmiszerként használták. A GFP fluoreszcenciájának megjelenítéséhez az 1. napon kifejlett férgeket 10 mM levamizol-hidroklorid oldattal érzéstelenítettük, és 2%-os agaróz párnákra helyeztük. A képeket azonnal gyűjtöttük Zeiss Axio Imager M1 mikroszkóppal (Carl Zeiss, Köln, Németország), 2,5-szeres nagyítással, majd a CellProfiler szoftverrel (The CellProfiler projektcsapat, Cimini Lab, a Broad Institute of MIT és a Harvard, MA, USA). Röviden, a képeket egy csővezeték segítségével dolgoztuk fel, hogy a fényes terű mikroszkóppal minden egyes képen a férgeket szegmentálják, és elkülönítsék őket a háttértől. Ezután az integrált GFP intenzitást férgenként mértük.

2.1.15. Félkvantitatív valós idejű PCR (qPCR) C. elegansban

Mintákat gyűjtöttünk 3 független ismétlésből állapotonként körülbelül 1000 3-napos férgekkel, és RNS-t extraháltunk. Mosás és elúció után az RNS-tartalmat spektrofotometriával számszerűsítettük, és 1-2 ug RNS-t használtunk a cDNS-szintézishez (Omniscript RT Kit (Qiagen, Hilden, Németország).cisztanche porA primer párok az S1 táblázatban vannak felsorolva. A valós idejű qPCR-hez a cDNS-t 1:2 0 arányban hígítottuk 10 mM TRIS-ben (pH 8,0). A reakcióhoz a qPCR Green Core készletet (Jena Biosciences, Jena, Németország)) vagy a GoTaq⑧ qPCR készletet (Promega, Walldorf, Németország) használtuk. A mintákat MyiQ2 ciklusban (BioRad, Feldkirchen, Németország) futtattuk, és minden minta expresszióját két párhuzamosban mértük ugyanazon a többlyukú lemezen. Az expressziót az act-1 és a CDC-42 referenciagénekhez viszonyítva számítottuk ki az iO5 szoftver segítségével. Minden összegyűjtött adatot engedélyeztünk a génvizsgálathoz a BioRad felhasználói utasításai szerint, és az expressziót a normalizált expresszió (ddCr) segítségével számítottuk ki. Az egyes primerpár reakciók hatékonyságát hozzáadtuk a normalizált expresszió helyes mennyiségi meghatározásához. A hatékonyságot a cDNS 1:20, 1:100, 1:500 és 1:2500 hígításaival értékeltük. A normalizált expressziós értékekből minden ismétlésnél kiszámítottuk a vad típushoz viszonyított fold-változást.

2.2. Emlőssejtek

2.2.1. Cos7 sejtek tenyésztése

A Cos7 sejteket (ATTC, #CRL-1651) 37 fokos hőmérsékleten és 5 százalékos CO-tartalom mellett tenyésztették Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) tápközegében (Gibco/ThermoScientific, Dreieich, Németország) 1 százalék piruváttal, 1 százalék glutamaxszal és 1 százalék 0 százalékos szarvasmarhamagzati szérum (FBS) (Gibco/ThermoScientific, Dreier-ich, Németország) és további penicillin (10.000 egység/mL)/sztreptomicin (10.{11}} ug/ Amint a sejtek összefolyó sejtgyepet építettek, 0,05 százalékos tripszin/EDTA (Thermo Scientific, Dreieich, Németország) alkalmazásával leválasztották őket az alapról.

2.2.2. Transzfekciós plazmidok

A Cos7 sejtek transzfekciójához a következő plazmidokat használtuk: pcDNA3, pcDNA3-Ahr-1-VP16,pcDNA3-AhA-1-VP16,pcDNA3-AhR -1(júl.45)-VP16, p1A1-FL, Perl-TK. A plazmidokat Larigot és mtsai. (ezzel a tanulmánnyal együtt benyújtva). A p1A1-FL plazmid XRE-indukálható luciferázt, a Perl-TK renilla luciferázt, a pcDNA3-Ahr-1-VP16 és pcDNA3-AhA{{24 }}A VP16 szekvenciákat hordoz a C.elegans AHR-1 és AHA-1 expressziójához. Ehhez a vizsgálathoz pcDNA3-AhR-1(LBD)-VP16-ot hoztunk létre a pcDNA3-Ahr-1-VP16 plazmid helyspecifikus mutagenezisével a QuikChange II Site-Directed segítségével. Mutagenezis készlet (Agilent, Santa Clara, CA, USA). A következő láncindítópárt használták az AHR-1 L-tól A-ig terjedő szubsztitúciójának létrehozásához, és H-Q-szubsztitúcióhoz a H365-ben az AHR-1:LBD-F5'-GAGAGCATCGGCGCGACCCAACGGCTGCTGAACGAG 3' és LBD-R5'-CTCGTTCAGCAGCAGCCGCTGGGATTCGCCTGGGATTCGCCTG '.Szuperkompetens XL1-A kék sejteket a kapott plazmiddal transzformáltuk amplifikáció céljából. A plazmidszekvenciát Sanger-szekvenálással ellenőriztük.

2.2.3. Cos7 sejtek tranziens transzfekciója

A transzfekció előtt 24 órával 20,{2}} sejt/lyuk egy 48-lyuk lemezre oltottunk 400 ul DMEM-ben (plusz 10% FBS plusz antibiotikumok), és 37 fokon inkubáltuk. A sejteket ezután a következő plazmidkoncentrációkkal transzfektáltuk lipofectamine 200 (Invitrogen, Eugene, OR, USA) használatával: p1A1-FL(244ng/lyuk), Phil-TK(36ng/lyuk),pcDNA3- AhA-1-VP16 (5 ng/lyuk), és vagy pcDNA3-VP16 (10 ng/lyuk), pcDNA3-Ahr-1-VP16 (5 ng/lyuk) vagy pcDNA 3-AhR-1(ju145)-VP16 (5 ng/lyuk) Larigot és mtsai. (ezzel a tanulmánnyal együtt benyújtva). A Lipofectamine 2000-et 1 ul/lyuk koncentrációban használtuk, és felhasználás előtt 20 percig előinkubáltuk a megfelelő plazmidokkal DMEM-ben. Az átmeneti transzfekcióhoz a Cos7 sejteket a 3hin DMEM lipofektamin/plazmid keverékével (plusz 10% FBS) inkubáltuk antibiotikumok nélkül, hogy elkerüljük az antibiotikumok által kiváltott toxicitást. Ezután a transzfekciós tápközeget eltávolítottuk, és üregenként 400 μl DMEM-mel (plusz 10% FBS plusz antibiotikumokkal) helyettesítettük. A transzfektált sejteket 37 °C-on inkubáltuk. Mindegyik lemezen 2 lyuk sejtet nem transzfektáltunk, és így normalizálási célokra használjuk fel. 2.2.4. Cos7 sejtek kezelése

A kívánt kezelési koncentrációnál 1000-szer nagyobb koncentrációjú törzsoldatokat készítettünk minden vegyületre. A kurkumint (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Németország), a benzo(a)pirént (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Németország), a leflunomidot (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Németország) és a luteint (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Németország) DMSO-ban oldották fel. Carl Roth, Karlsruhe, Németország), míg a resveratrol (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Németország) és a rotenon (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Németország) etanolban oldódott (Carl Roth, Karlsruhe, Németország). A transzfekció után 24 órával a sejtek sejttenyésztő tápközegét a megfelelő vegyület 1:100 hígítását tartalmazó sejttenyésztő táptalajra cseréltük. A sejteket 24 órán át kezeltük a luciferáz aktivitás értékelése előtt.

2.2.5. Luciferáz vizsgálat (AhR aktivitás)

Az AhR transzkripciós aktivitását egy XRE által vezérelt luciferáz aktivitásának mérésével értékelték [64]. Ehhez Dual-Luciferase Reporter Assay System rendszert (Promega, Wall Dorf, Németország) használtunk. 24 órás kezelés után a Cos7 sejteket kétszer mostuk PBS-sel, majd 15 percig szobahőmérsékleten lizáltuk a Dual-Luciferase Reporter Assay kitben található passzív lízispufferrel. A lizált sejtekből összesen 20 μL-t egy fehér 96-lyukú lemezre helyeztünk, és lumineszcencia mérésekhez használtuk. A luciferin (LARII) és vanília (Stop&cGlo) szubsztrátokat a gyártó leírása szerint készítettük el. A mintákat luminométerre (EG&G Berthold microplate Luminometer LB 96V Microluminomat plus (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Németország)) töltöttük, és a szubsztrátumokat a luminométer csőrendszeréhez rögzítettük. Először 65 ul LARII-t adtunk minden egyes lyukba. A mintából megmértük a szentjánosbogár luciferáz által keltett lumineszcenciát, majd 65 μL Stop&clo reagenst adtunk hozzá, és megmértük a Renilla luciferáz által keltett lumineszcenciát A lumineszcencia mérésekből származó AhR aktivitás értékeléséhez a következő utófeldolgozást végeztük el lépések: Először a nem transzfektált sejtek lumineszcenciáját levontuk az egyes minták lumineszcenciájából háttérkorrekció céljából, majd a következő lépésben a luciferáz-lumineszcenciát normalizáltuk ugyanannak a mintának a renilla-lumineszcenciájára, hogy kiküszöböljük a transzfekciós sebesség és a sejt közötti különbségeket. A pcDNA-VP16 transzfektált sejtek egy másik normalizálási lépését minden egyes kezelt csoportban elvégeztük az AhR-indep eltávolítása érdekében. véghatások az XRE által vezérelt luciferázra.

Ez a cikk az Antioxidants 2022, 11, 613-ból származik. https://doi.org/10.3390/antiox11040613 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants