A Dieckol mérséklő hatása a hipertóniás nefropátiára spontán hipertóniás patkányokban
Mar 11, 2022
Absztrakt: A hipertónia indukáljavese-fibrózis vagy tubuláris intersticiális fibrózis, amely végül a végstádiumot eredményezivesebetegség.Az epithelialis-mesenchymális átmenet (EMT) az egyik mögöttes mechanizmusvese-fibrózis. Bár korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az Ecklonia cava kivonatok (ECE) és a director (DK) gátló hatást gyakoroltak az angiotenzin (Ang) I-konvertáló enzimre, amely az Ang I-t Ang II-vé alakítja. Ismeretes, hogy az Ang II vese-fibrózis; azt azonban nem értékelték, hogy az ECE vagy a DK enyhítette-e a hypertoniás nephropathiát az EMT csökkentésével. Ebben a tanulmányban az ECE és a DK hatását az Ang II csökkentésére és az 1-es típusú angiotenzin receptor (AT1R)/TGF/SMAD lefelé irányuló jelútjára, ami az EMT-vel és a helyreállítással kapcsolatos.veseműködésspontán hipertóniás patkányokban (SHR) vizsgálták. Az ECE vagy a DK szignifikánsan csökkentette az Ang II szérumszintjét az SHR-ekben. Sőt, avese-Az AT1R/TGF/SMAD expressziója csökkent az ECE vagy DK beadásával. A mesenchymalis sejtmarkerek aveseAz SHR-ek számát az ECE vagy a DK szignifikánsan csökkentette. A fibrotikus szövet aveseAz SHR-ek számát szintén jelentősen csökkentette az ECE vagy a DK. Az SHR-ek vizeletalbumin/kreatinin arányát szignifikánsan csökkentette az ECE vagy a DK. Összességében a tanulmány eredményei azt mutatják, hogy az ECE és a DK csökkentette az Ang II szérumszintjét és az AT1R/TGF/SMAD expresszióját, majd csökkentette az EMT ésvese- fibrózis az SHR-ekben. Továbbá az EMT csökkenése illvese-fibrózis a helyreállításához vezethetveseműködés. Úgy tűnik, hogy az ECE vagy a DK előnyös lehet a hypertoniás nephropathia csökkentésében az EMT és az EMT csökkentésévelvese-fibrózis.
Kulcsszavak:epiteliális-mezenchimális átmenet; E. cava kivonatok; dieckol; spontán hipertóniás patkányok; vesefibrózis; angiotenzin II; vese; vese-
A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE-/VESEBETEGSÉGET
Bevezetés
Azvesea hipertóniás célszerv-károsodás által érintett fő szerv: krónikusvesebetegségáltalában a hipertóniás betegek körülbelül 16 százalékánál fordul elő [1]. A hypertoniás nephropathia kóros jellemzői közé tartozik a gyulladás, a glomeruláris szklerózis, a tubuláris atrófia és az intersticiális fibrózis [2]. A fibrotikus szövet helyettesíti a normális működéstveseszövet, ami ahhoz vezetveseelégtelenség[3,4]. És így,vese-fibrózis vagy tubuláris intersticiális fibrózis a hipertóniás nephropathia fő kóros elváltozása, amely a végstádiumot indukáljavesebetegség(ESRD) [5].VeseA fibrózis a következő jellemzőket mutatja: fokozott masszív extracelluláris mátrix (ECM) termelés, megnövekedett fibroblasztok toborzása a szövetsérülés helyére, valamint megnövekedett fenotípus-változások a fibroblasztokról a -simaizom-aktint (-SMA) expresszáló myofibroblasztokra [6]. A megnövekedett -SMA-t expresszáló myofibroblasztok a kollagén szükségtelenül túlzott lerakódásához vezetnek, és fokozzák a mátrix metalloproteinázok szabályozási zavarát, ami tönkreteszi az alapmembránt és tovább gyorsítja a fibrózist [6]. A közelmúltban számos tanulmány kimutatta, hogy az epithelialis-mezenchimális átmenet (EMT) az egyik mögöttes mechanizmus.vese-fibrózis [7,8]. Az EMT-n keresztül a hámsejt fokozatosan elveszíti az epiteliális markereket, például az E-cadherint, amely a sejt-sejt kapcsolatok fő eleme, és felveszi a mezenchimális fenotípusok markereit, például az -SMA-t [9]. A sejtkapcsolatok elvesztésével az EMT folyamaton átesett sejtek könnyen az intersticiális tér felé mozognak [9]. Ezenkívül a myofibroblasztok tulajdonságait elsajátító hámsejtek -SMA-t expresszálnak, és ECM fehérjéket, például kollagént szintetizálnak, ami végül tubuláris intersticiális fibrózishoz (TIF) vezet [9].
Az angiotenzin II (Ang II) a magas vérnyomás okozta fibrózis fő szereplője. A renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer (RAAS) fő aktivátoraként az Ang II súlyos vaszkuláris, glomeruláris és tubulointerstitialis sérüléseket okoz, amelyek az 1-es típusú angiotenzin receptoron keresztül a transzformáló növekedési faktor-béta (TGF) növekedésével járnak. AT1R) [10]. Az Ang II és receptorának szintje avesea spontán hipertóniás patkányok (SHR) száma magasabb volt, mint a Wistar Kyoto (WKY) patkányoké [11]. Ismeretes, hogy az Ang II TGF-függő jelátviteli útvonalakon keresztül EMT-t indukál [12]. Az NRK52E sejtek (normál patkány tubuláris epiteliális sejtvonalak) Ang II-kezelése a TGF 1/SMAD jelátviteli útvonal expresszióját indukálja, ami végül megnöveli a proapoptotikus és fibrotikus fehérjék számát [13]. Amikor az Ang II kötődik az AT1R-hez, az SMAD3 jelút aktiválódik, és EMT-t indukál az NRK52E sejtvonalakban [12].
A tengeri algákból származó polifenolokról beszámoltak arról, hogy Ang I-konvertáló enzim (ACE) inhibitorként működnek [14–17]. Az ACE részt vesz az Ang I átalakulásában Ang II-vé, és növeli az Ang II-t, mint erős érösszehúzó hatást, ami magas vérnyomáshoz vezet [18]. Számos fluorotannin, például a phlorofucofuroeckol A, director (DK) és az eckol, amelyek jelen vannak az Ecklonia cava vagy Ecklonia stolonifera kivonataiban, ACE-gátló hatást mutatnak; így ezek a polifenolok várhatóan csökkentik a vérnyomást (BP) [15,19]. Annak ellenére, hogy az E. cava kivonatok (ECE) és a DK ACE-gátló hatást mutatnak, egyetlen jelentés sem vizsgálta, hogy az ECE vagy az igazgató részt vesz-e az EMT-ben.vesevagyvese-magas vérnyomás által kiváltott fibrózis. Így az ECE és a DK hatása a csökkenő Ang II-re és az AT1R/TGF/SMAD2/3 lefelé irányuló jelútjára, ami összefügg az EMT-vel.veseés helyreállításaveseműködésSHR-ben, ebben a tanulmányban vizsgálták.
2. Eredmények
2.1. ECE és DK csökkent szisztolés vérnyomás és Ang II szérum szintje SHR-ben
Az SHR-ek szisztolés vérnyomása szignifikánsan magasabb volt, mint a WKY patkányoké, és szignifikánsan csökkentette az ECE vagy a DK adagolását. Az 50, 100 és 150 mg/kg/nap ECE és DK adagolás csökkentő hatásai nem különböztek szignifikánsan (1a. ábra). Az SHR-ek diasztolés és átlagos vérnyomása szignifikánsan magasabb volt, mint a WKY patkányoké. Sem az ECE, sem a DK adása nem csökkentette szignifikánsan a diasztolés és az átlagos vérnyomást (1b, c ábra). Az SHR-ekben az Ang II szérumszintje szignifikánsan magasabb volt, mint a WKY patkányoké, és szignifikánsan csökkentette az ECE vagy a DK adagolását. Ezenkívül a legszembetűnőbb csökkentő hatást a 150 mg/kg/nap ECE-vel kezelt csoportban figyelték meg (1d. ábra).
2.2. Az ECE és a DK gyengítette az AT1R expresszióját az SHR-ek veséjében
Az AT1R expresszióját qRT-PCR-rel és festéssel értékeltük. Az AT1R mRNS expressziója a medullában és a kéregbenveseszignifikánsan magasabb volt az SHR-ekben, mint a WKY patkányoké. Ez az expresszió csökkent az ECE vagy a DK beadásával (2a. ábra). A medullában a csökkentő hatás a DK-val kezelt csoportban volt a legszembetűnőbb. A kéregben a 150 mg/kg/nap ECE volt a legszembetűnőbb csökkentő hatása. Az AT1R expressziós szintje az SHR-ek kéregében és velőjében, amelyet festéssel értékeltünk, szignifikánsan megemelkedett, illetve szignifikánsan csökkent az ECE vagy a DK adásával. Ezenkívül a legszembetűnőbb csökkentő hatást a DK-val kezelt csoportban figyelték meg (2b, c ábra). Az AT1R expresszió ECE és DK csillapításának validálásáravesetubulusokban egy egér proximális tubulus sejtvonalat (TCMK-1) aktivált az angiotenzin II egy in vitro modellben [20]. Az AT1R fehérje expressziós szintje angiotenzin II-vel kezelt TCMK-1 sejtekben ECE-vel (5, 25, 50 ug/ml), DK-val vagy inhibitorral csökkent a csak angiotenzin II kezeléshez képest (2d. ábra).
2.3. Az ECE és a DK csökkentette a TGF, SMAD2/3 és Snail2 expresszióját az SHR-ek veséjében
A TGF expressziója az SHR-ek velőjében és kéregében szignifikánsan magasabb volt, mint a WKY patkányoké, amelyek csökkentek az ECE vagy DK adásával. A velőben a csökkentő hatás a 150 mg/ttkg/nap ECE-vel és DK-val kezelt csoportokban volt a legszembetűnőbb. A kéregben a csökkentő hatás a DK-val kezelt csoportban volt a legszembetűnőbb (3a. ábra). A SMAD2 expressziója az SHR-ek velőjében és kéregében magasabb volt, mint a WKY patkányoké, amelyek szignifikánsan csökkentek az ECE vagy DK adásával. A velőcsökkentő hatás a 150 mg/ttkg/nap ECE-vel vagy DK-val kezelt csoportokban volt a legszembetűnőbb. A kéregben az 50, 100 és 150 mg/kg/nap ECE vagy DK csökkentő hatásai nem különböztek szignifikánsan (3b. ábra). Az SMAD3 expressziója az SHR-ek velőjében és kéregében szignifikánsan magasabb volt, mint a WKY patkányoké, és szignifikánsan csökkent az ECE vagy DK adásával. A legszembetűnőbb csökkentő hatást a 150 mg/kg/nap ECE-vel kezelt csoportban figyelték meg (3c. ábra). A Snail2 expressziója az SHR-ek velőjében és kéregében szignifikánsan megnőtt az ECE vagy DK adásával. A legszembetűnőbb csökkentő hatást a DK-val kezelt csoportban figyelték meg (3d. ábra). Az in vitro modellben a TGF és a pSMAD2/3 fehérje expressziós szintje az angiotenzin II-vel kezelt TCMK-1 sejtekben ECE-vel (5, 25, 50 ug/ml), DK-val vagy inhibitorral csökkent az egyetlenhez képest. angiotenzin II kezelés (3e, f ábra).
2. ábra. Az ECE és DK beadás összehasonlító elemzése az AT1R expressziójának csökkentéséről aveseSHR-ek és angiotenzin II-vel kezelt TCMK-1 sejtekben. (a) AT1R mRNS szint a kéreg területén és a velőbenveseqRT-PCR analízissel mértük. (b) AT1R fehérje expressziós szintek a kéreg területén és a velőbenveseimmunhisztokémiával mértük, és (c) a fehérjeszinteket Image J szoftverrel határoztuk meg. Három adag ECE-t (50 mg/ttkg/nap, 100 mg/ttkg/nap és 150 mg/ttkg/nap) orálisan adtunk be 4 hétig, és 2,5 mg/kg/nap DK-t is orálisan adtunk be 4 hétig. (d) AT1R fehérje expressziós szintjei angiotenzin II-vel kezelt TCMK-1 sejtekben (vese-hám tubuláris sejtek) 5, 25, 50 ug/mL ECE-vel, 2,5 ug/ml DK-val vagy inhibitorral Western blottal mértük. Skálasáv=25 µm. Az eltérő betűvel jelölt átlagok szignifikáns különbségeket jeleznek a csoportok között (p < 0,05).="" -="" ugyanazt="" a="" csoportot="" jelenti.="" ece,="" ecklonia="" cava="" kivonat;="" dk,="" igazgató;="" inhibitor,="" 1="" µmol/l="">
2.4. Az ECE és a DK csökkentette az EMT-t az SHR-ek veséjében
Az SHR-ek mezenchimális sejtmarkerének, például a vimentinnek és az -SMA-nak az expressziója szignifikánsan magasabb volt, mint a WKY patkányoké, és szignifikánsan csökkent az ECE vagy a DK adagolása (4. ábra). Az SHR-ek kéregében a vimentin expresszióját csökkentő hatás a DK-val kezelt csoportban volt a legszembetűnőbb, míg az SHR-ek velőiben a vimentin expresszióját csökkentő hatás a 150 mg/-vel kezelt csoportban volt a legszembetűnőbb. kg/nap ECE. Ezenkívül az SHR-ek kéregében a vimentin expressziójára gyakorolt csökkentő hatás a DK-val kezelt csoportban volt a legszembetűnőbb (4a, b ábra). A -SMA expressziója az SHR-ek kéregében és velőjében a 150 mg/kg/nap ECE-vel kezelt csoportban volt a legjelentősebben csökkent (4c, d ábra). Az epiteliális sejtmarker, például az E-cadherin expressziója az SHR-ek kéregében és velőjében szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a WKY patkányoké (S1 ábra), és jelentősen megnőtt az ECE vagy a DK beadásával.
3. ábra. Az ECE és DK beadás összehasonlító elemzése a TGF , SMAD2/3 és Snail2 expressziójának csökkentésérőlveseaz SHR-ek. (a) TGF, (b) SMAD2, (c) SMAD3, (d) Csiga2 mRNS szint a kéreg területén és a velőbenveseqRT-PCR analízissel mértük. Három adag ECE-t (50 mg/ttkg/nap, 100 mg/ttkg/nap és 150 mg/ttkg/nap) orálisan adtunk be 4 hétig, és 2,5 mg/kg/nap DK-t is orálisan adtunk 4 hétig. (e) TGF, SMAD2/3, pSMAD2/3 fehérje expressziós szintjei angiotenzin II-vel kezelt TCMK{13}} sejtekben (vese-tubuláris epiteliális sejteket) 5, 25, 5{5}} ug/mL ECE-vel, 2,5 ug/ml DK-val vagy inhibitorral Western blottal mértük, és (f) a fehérjeszinteket Image J szoftverrel határoztuk meg. Az eltérő betűvel jelölt átlagok szignifikáns különbségeket jeleznek a csoportok között (p < 0,05).="" -="" ugyanazt="" a="" csoportot="" jelenti.="" ece,="" ecklonia="" cava="" kivonat;="" dk,="" igazgató;="" inhibitor,="" 1="" µmol/l="">
4. ábra Az ECE és a DK beadás összehasonlító elemzése az EMT csökkentéséről aveseaz SHR-ek közül. (a) Vimentin fehérje expressziós szintek a kéreg területén és a velőbenveseimmunhisztokémiával mértük, és (b) a fehérjeszinteket Image J szoftverrel határoztuk meg. (c) -SMA fehérje expressziós szintjét a kéreg területén és a vese velőjében immunhisztokémiai módszerrel mértük, és (d) a fehérjeszinteket Image J szoftverrel határoztuk meg. Skálasáv=25 µm. Három adag ECE-t (50 mg/ttkg/nap, 100 mg/ttkg/nap és 150 mg/ttkg/nap) orálisan adtunk be 4 hétig, és 2,5 mg/ttkg/nap DK-t szintén orálisan 4 hétig. hétig. Az eltérő betűvel jelölt átlagok szignifikáns különbségeket jeleznek a csoportok között (p < 0,05).="" -="" ugyanazt="" a="" csoportot="" jelenti.="" ece,="" ecklonia="" cava="" kivonat;="" dk,="">
2.5. Az ECE és a DK csökkentette a vesefibrózist és a glomeruláris szklerózist az SHR-ek veséjében
A fibrózis terület a kéregben és a velőben aveseaz SHR-ek szignifikánsan magasabbak voltak, mint a WKY patkányoké (5a, b ábra), és szignifikánsan csökkentették az ECE vagy a DK adagolását. A kéregben a DK-val kezelt csoportban, míg a velőben a 150 mg/kg/nap ECE-vel kezelt csoportban volt a legszembetűnőbb csökkentő hatás. Az SHR-ek GSI-je szignifikánsan magasabb volt, mint a WKY-patkányoké (5c, d ábra), és szignifikánsan csökkent az ECE vagy DK beadása. Ezenkívül a legszembetűnőbb csökkentő hatást a DK-val kezelt csoportban figyelték meg.
5. ábra. Az ECE és a DK adminisztrációjának összehasonlító elemzése a csökkentésevese-fibrózis és glomeruláris szklerózis aveseaz SHR-ek. (a) Masson trikrómmal festett kéregterülete és velőterülete aveseA fibrózisos területet (kék szín) és a (b) fibrózis területet Image J szoftverrel határoztuk meg. (c) PAS-festett kéregterület és velőterület az aveseglomeruláris szklerózist mutató és (d) a szklerózist félkvantitatív pontozási módszerrel értékelték (0–4. fokozat). Skálasáv=25 µm. Három adag ECE-t (50 mg/ttkg/nap, 100 mg/kg/nap és 150 mg/ttkg/nap) orálisan adtunk be 4 héten keresztül, és 2,5 mg/kg/nap DK-t is orálisan adtunk. 4 hétig. Az eltérő betűvel jelölt átlagok szignifikáns különbségeket jeleznek a csoportok között (p < 0,05).="" -="" ugyanazt="" a="" csoportot="" jelenti.="" ece,="" ecklonia="" cava="" kivonat;="" dk,="" igazgató;="" gsi;="" glomerulosklerotikus="">
2.6. ECE és DK attenuált vesefunkció súlyosbodása SHR-ben
A 24 órán belüli vízbevitel mennyisége nem különbözött szignifikánsan az összes csoport között (6a. ábra). Az SHR-ek vizelettérfogata 24 órán belül szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a WKY patkányoké (6b. ábra). Szignifikánsan növelte a 100 és 150 mg/kg/nap ECE és DK adagolása. A vizelet nátrium/kálium (Na/K) aránya nem különbözött szignifikánsan az összes csoportban (6c. ábra). Az SHR-ek vizeletében az albumin szintje szignifikánsan magasabb volt, mint a WKY patkányoké, és szignifikánsan csökkentette az ECE vagy DK adását. Az 50, 100 és 150 mg/kg/nap ECE és DK csökkentő hatásai nem különböztek szignifikánsan (6d. ábra). Az SHR-ek vizelet albumin/kreatinin aránya szignifikánsan magasabb volt, mint a WKY patkányoké, és csökkent az ECE vagy DK adásával. Az ECE és a DK 50 és 100 mg/kg/nap csökkentő hatásai nem különböztek szignifikánsan (6e. ábra).
6. ábra. Az ECE és a DK beadás összehasonlító elemzése a csillapításrólveseműködéssúlyosbodása SHR-ben. (a) Vízfogyasztást, (b) vizelettérfogatot, (c) vizelet Na/K arányát, (d) vizelet mikroalbumin szintjét, (e) vizelet albumin-kreatinin arányt (UACR) mértük a leölés előtt. Három adag ECE-t (50 mg/ttkg/nap, 100 mg/ttkg/nap és 150 mg/ttkg/nap) szájon át adtunk 4 héten keresztül, és 2,5 mg/kg/nap DK-t is szájon át. 4 hétig. Az eltérő betűvel jelölt átlagok szignifikáns különbségeket jeleznek a csoportok között (p < 0,05).="" -="" ugyanazt="" a="" csoportot="" jelenti.="" ece,="" ecklonia="" cava="" kivonat;="" dk,="" igazgató;="" ns,="" nem="">
3. Megbeszélés
A hypertonia az ESRD második vezető etiológiája a cukorbetegség után [21]. Nehéz megjósolni a magas vérnyomás súlyosságátvese-fibrózis vérnyomással, mivelvese-A fibrózis akkor is súlyosan előrehaladhat, ha a páciens vérnyomása nem túl magas [21]. Bár az ACE-gátlókkal, például angiotenzin-receptor-blokkolóval, renin-gátlókkal és aldoszteron-antagonistákkal végzett vérnyomáscsökkentő kezelések csökkenthetik a magas vérnyomás súlyosságát.vesebetegség, ezek nem elegendőek a hypertoniás nephropathia progressziójának megelőzéséhez [22]. Annak ellenére, hogy az ajánlott cél-BP 130/80 Hgmm alatt érhető el, a vérnyomás csökkentésére szolgáló kezelési stratégia nem késlelteti a hypertoniás nephropathia progresszióját [23]. Bár a hypertoniás nephropathiát jellemzően nephroangiosclerosisként és glomeruláris hyalinosisként írják le [24,25], a közelmúltban kiderült, hogy a vese interstitiuma, amely részt vesz a TIF-ben, összefügg a betegség progressziójával, valamint a glomeruláris és vaszkuláris kompartmentek. 26,27]. Mivel a TIF a hipertóniás nefropátia fő patofiziológiája, elengedhetetlen a TIF modulálására irányuló új szerek kifejlesztéséhez, hogy megakadályozzák a hypertoniás nefropátia progresszióját. Az elmúlt években az EMT meghatározó szereplője voltvese-fibrózis [28,29].
Az Ang II érszűkületet és ennek következtében magas vérnyomást indukál [30]. Hipertóniában a RAAS szisztémásan aktiválódik, és a RAAS felszabályozása számos szervben, pl.vese[31,32]. Az intrarenális RAAS hiperaktivációja a magas vérnyomás és a krónikus betegségek fontos mechanizmusavesebetegség[31,32]. Mind a TGF 1, mind az Ang II indukálja az intrarenális RAAS aktiválását, és fokozza az EMT-t indukáló angiotenzinogén, renin, ACE és AT1R expresszióját [33]. Vizsgálatunkban az SHR-ek szisztolés vérnyomását szignifikánsan csökkentette akár ECE, akár DK adása. Az SHR-ek Ang II szérumszintjét szignifikánsan csökkentette akár ECE, akár DK adása. Az AT1R expresszióját az SHR-ek kéregében és velőjében szignifikánsan csökkentette az ECE vagy a DK alkalmazása.
A RAAS felszabályozása, mint például az AT1R fokozott expressziója, aktiválja a TGF 1 lefelé irányuló jelátviteli útvonalát [34]. A RAAS által aktivált TGF 1 SMAD-függő és SMAD-független útvonalakon keresztül EMT-t indukál [33]. Mint SMAD-függő jelátviteli útvonal, a TGF 1 jelátvitel a TGF RII-n és a TGF RI-n keresztül történik, és az SMAD2/3 aktiválásához vezet. [10]. Az SMAD4 kötődik az SMAD2/3-hoz, és elősegíti az SMAD komplex transzlokációját a sejtmagba [10]. A transzlokált SMAD-ok felfelé szabályozzák az EMT gének, például a csiga, a twist és a ZEB expresszióját [34]. Vizsgálatunkban az AT1R expressziója szignifikánsan magasabb volt az SHR-ek kéregében és velőjében, mint a WKY patkányoké, és csökkentette az ECE vagy DK adagolását. A TGF és SMAD2/3 expressziója az SHR-ek kéregében és velőjében csökkent az ECE vagy DK adásával.
A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE/VESE FERTŐZÉSÉT
Az EMT-t egy epiteliális marker, például az E-cadherin elvesztése és a mezenchimális markerek, például -SMA, vimentin és fibronektin elérése jellemzi [35]. Az E-cadherin a leginkább kifejezett kadherin a hámsejtekben, ezért gyakran használják epiteliális markerként [36]. Az SMA a myofibroblaszt sejtek fenotípusos markere, expressziója az EMT előrehaladott stádiumainak jellemzője [37]. - Az SMA-t expresszáló miofibroblasztok, amelyek EMT-n mennek keresztül, túlzott ECM szintézisét és abnormális ECM-remodellinget indukálnak.vese-fibrózis [37]. A hipertóniás nephropathia glomerulosclerosis és intersticiális fibrózis kialakulását idézi elő, ami aveseműködésés jelentős proteinuria [6]. Tanulmányunkban a vimentin és -SMA expressziója az SHR-ek velőjében és kéregében növekedett, illetve csökkent az ECE vagy DK adásával. Az SHR-ek velőjében és kéregében a fibrózisos terület mennyisége megnőtt, illetve ECE vagy DK adásával csökkenthető. Az SHR-ek glomeruláris sclerosis indexe emelkedett, illetve ECE vagy DK adásával csökkent.
Az SHR-ek vizelettérfogata fokozatosan csökkent az azonos korú WKY patkányokéhoz képest [38]. Ismeretes, hogy minél nagyobb a vizelet nátrium kiválasztódása, annál kisebb a kálium vizelettel történő kiválasztása. Ezenkívül humán vizsgálatokban a vizelet Na/K aránya a vérnyomás emelkedésével és aveseműködés[39]. Vizsgálatunkban az SHR-ek vizelettérfogata kisebb volt, mint a WKY-patkányoké, annak ellenére, hogy a vízfelvétel mennyisége nem különbözött az SHR-ek és a WKY-patkányok között. Az SHR-ek vizelet Na/K aránya szignifikánsan különbözött a WKY-patkányok, az SHR-ek és az ECE-vel vagy DK-val kezelt csoportok között. Humán vizsgálatokban a vizelet Na/K arányát használták az étrendi nátrium- és káliumbevitel markereként [39]. A vérnyomás a nátriumbevitel növekedésével nőtt. A megnövekedett káliumbevitel azonban csökkentette a vérnyomást azáltal, hogy növelte a nátrium vizeletbe történő kiválasztását [40]. Ezért a vizelet Na/K aránya összefügg a vérnyomással emberben [40]. Vizsgálatunkban nem minden állatot etettek magas nátriumtartalmú étrenddel, ami megmagyarázza, hogy a vizelet Na/K aránya a csoportok között nem mutatott szignifikáns különbséget. A magas vérnyomás fokozza a proteinuriát [37]. Ismeretes, hogy a vizelet albumin-kreatinin aránya a glomeruláris filtrációs ráta csökkenésével jár [41]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az SHR-ekben a mikroalbuminuria kialakulását a túlnyomó tubuláris sérülés okozza, amely a kis molekulatömegű fehérjék vizeletürítését idézi elő [42,43]. Vizsgálatunkban az SHR-ek vizeletalbumin-kreatinin aránya magasabb volt, mint a WKY patkányoké, és csökkentette az ECE vagy a DK adagolása.
Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy számos polifenol gátló hatással van az ACE-aktivitásra [14–17]. Ezek a vizsgálatok azonban csak az ACE-gátló aktivitást közölték IC50-értékként, amely a pozitív kontroll 50 százalékos gátlási koncentrációja, és nem mutattak ki vérnyomáscsökkentő hatást vagy védő hatást a hypertoniás nefropátiával szemben az állatokban. Egy tanulmány kimutatta, hogy az ECE csökkentette a vérnyomást a 2-vese1-klip Goldblatt hipertóniás patkányok [44]. A pirogallol-phloroglucinol-6,6-bieckol csökkentette a vérnyomást a magas zsírtartalmú diéta által kiváltott magas vérnyomás állatmodelljében az érrendszeri diszfunkció modulálásával [45]. Ezek a vizsgálatok azonban csak a vérnyomás csökkenését mutatták, és nem értékelték, hogy az ECE kimutatta-e a hipertóniás nefropátia csillapító hatását. Vizsgálatunk kimutatta, hogy az ECE és a DK csökkentette az AT1R/TGF/SMAD2/3 expresszióját aveseés csökkentette az Ang II szérumszintjét. Emellett az ECE és a DK csökkentette az EMT-t,vese-fibrózis és glomeruláris szklerózis. Úgy tűnik, hogy az ECE és a DK hasznos lehet a hypertoniás nephropathia enyhítésében
4. Anyagok és módszerek
4.1. ECE előkészítése és a DK izolálása
Az ECE-t az Aqua Green Technology Co., Ltd.-től (Jeju, Korea) szereztük be. Az E. cavát tiszta vízzel alaposan mostuk, és szobahőmérsékleten 48 órán keresztül levegőn szárítottuk. Megőröltük, és 50 százalékos etanolt adtunk hozzá, majd 12 órán át 85 °C-on melegítettük. Az ECE-ket szűrtük, majd betöményítés után 40-60 percig magas hőmérsékleten hevítve sterilizáltuk, majd porlasztva szárítottuk. Ezután izolálták a Directort, amely az E. cava egyik reprezentatív fluorotanninja. Röviden, a centrifugális megosztási kromatográfiát kétfázisú oldószerrendszerrel végeztük, amelyben tiszta vizet, etil-acetátot, n-hexánt és metanol elegyet kevertünk (7:7:2:3 arány). A szerves stacionárius fázist az oszlopban, a mozgó fázist pedig az oszlopban töltöttük be, a sebesség csökkenő sorrendjében (2 ml/perc), és felhasználtuk az elválasztáshoz. Dr. Son és munkatársai módszereit követtük. (2019) [45].
A CISTANCHE JAVÍTJA A vese-/veseelégtelenséget
4.2. Hipertónia állatmodell
A hím SHR-eket (8 hetes) és a hím WKY patkányokat (8 hetes) az Orient Bio-tól (Sungnam, Korea) vásároltuk, és körülbelül 24 ◦C-os állandó hőmérsékleten, 50–55 százalékos relatív páratartalom mellett tartották őket. sötét ciklus 12 óra/12 óra. A patkányszublimációt 1 hétig végeztük. A patkányokat véletlenszerűen hat csoportra osztottuk (csoportonként öt patkány): (i) WKY-csoport, amelyben a patkányokat 4 héten keresztül orálisan ivóvízzel adtuk be; (ii) SHR-csoport, amelyben a patkányok 4 héten keresztül orálisan ivóvizet kaptak; (iii–v) SHR csoport, amelyben a patkányok orálisan (iii) 50 mg/ttkg/nap, (iv) 100 mg/kg/nap és (v) 150 mg/kg/nap ECE-t kaptak 4 napig. hét; (vi) SHR csoport, amelyben a patkányok orálisan 2,5 mg/kg/nap DK-t kaptak 4 héten keresztül. 4 hét elteltével a vízfogyasztást, a vizelet térfogatát és a vizelet kémiai analízisét metabolikus ketrecben validáltuk 24 órán keresztül. Az anyagcsere-elemzés befejezése után az összes patkányt leöltük a Gachon Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága (engedélyezési szám: LCDI-2019-0121) etikai elveinek megfelelően.
4.3. Immunhisztokémia
VeseszövetA paraffin blokkokat 8 µm-es metszetekre vágtuk, zselatin bevonatú tárgylemezekre helyeztük, és 37 ◦C-on 3 napig szárítottuk. AzveseA szövetlemezeket paraffinmentesítettük, majd 0,3 százalékos hidrogén-peroxiddal (Sigma-Aldrich, MO, USA) 10 percig inkubáltuk. Ezt követően a lemezeket háromszor öblítettük foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), és állati szérummal inkubáltuk az antitest nem specifikus kötődésének gátlására. Ezenkívül elsődleges antitestekkel (anti-AT1R, anti-E-cadherin, anti-- -SMA és anti-vimentin) inkubáltuk őket, és háromszor öblítették PBS-sel. A szövetlemezeket ezután az ABC kitből (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) származó biotinilált másodlagos antitestekkel inkubáltuk, 3 órán át blokkolóoldattal inkubáltuk, és háromszor öblítettük PBS-sel. A szövetlemezeket 3,3-diaminobenzidin szubsztráttal fejlesztettük ki 3 percig, xilol alapú DPX-oldattal (Sigma-Aldrich) rögzítettük, és fénymikroszkóppal (Olympus Optical Co., Tokió, Japán) tettük láthatóvá. .
4.4. RNS extrakció és kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (qRT-PCR)
A patkányból származó RNSveseA szöveteket RNAiso Plus reagenssel (TAKARA, Japán) izoláltuk a gyártó utasításai szerint. AzveseA szöveteket először két részre osztották, nevezetesen a cortex részre és a velő részre. A veseszöveteket finomra vágtuk és porrá zúztuk, majd a porokat 1 ml RNAiso Plus reagenssel újraszuszpendáltuk, majd 0,1 ml tiszta kloroformmal (Amresco, Solon, OH, USA) kevertük össze, majd centrifugálva 13,000× g-vel 20 percig 4 ◦C-on. Centrifugálás után a felülúszót összekevertük 0,25 ml tiszta izopropil-alkohollal, az extrahált RNS-pelleteket 70%-os alkohollal mostuk és 7500×g-vel 5 percig 4 °C-on centrifugáltuk. A szárított pelleteket 10-30 µl dietil-pirokarbonáttal kezelt tiszta vízben oldottuk, és az RNS mennyiségét meghatároztuk és NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) segítségével ellenőriztük. Komplementer DNS-t (cDNS) állítottunk elő az RNS-ből cDNS-szintézis kit (PrimeScript™, TAKARA) segítségével. Egy kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (qRT-PCR) meghatározta az RNS-szinteket aveseszövetek. A forward és a reverse primereket desztillált vízzel kevertük össze, majd 10 µl keveréket helyeztünk egy 384-lyukú qRT-PCR lemezre. Ezt követően hozzáadtuk a cDNS-t és a SYBR zöldet (TAKARA), majd qRT-PCR géppel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) validáltuk. Az érdeklődésre számot tartó gének az S1 kiegészítő táblázatban vannak felsorolva. Dr. Son és munkatársai módszereit követtük. 2019 [45].
4.5. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
A szérum Ang II szintjének megerősítésére a levett vér egy alikvot részét (1,5-1,7 ml) szérumleválasztó csövekbe (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) adtuk, majd 2000 × g-vel 20 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk. . Ezt követően az elválasztott szérumot egy új csőbe helyezték, és mélyhűtőben tárolták. Az Ang II ELISA készletet (MyBioSource, San Diego, CA, USA) használtuk a szérum jelenlétének elemzésére a gyártó utasításai szerint. Az Ang II-t az állatok vérvételét követő 1 héten belül mértük.
4.6. Szövettani elemzés
4.6.1. Masson-féle háromkróm (MT) folt
A Masson-féle trikróm (MT) festés validálja a fibrózistvese.Paraffinba ágyazott tömbökveseA szöveteket 8 µm vastagságúra metszettük, bevonó tárgylemezre helyeztük, és 37 °C-on 3 napig szárítottuk. A szövetlemezeket xilollal és alkohollal paraffinmentesítettük, majd Bouin-oldattal 24 órán át fixáltuk, majd folyó csapvízzel 3 percig öblítettük. A tárgylemezeket 10 percre Weigert vas-hematoxilin oldattal és 15 percre Biebrich skarlát-savas fukszin oldattal merítettük, majd 10 percig foszfomolibdén-foszfovolfrámsav oldattal differenciáltuk. Végül a lemezeket 3 percre anilinkék oldatba vittük át, majd vízzel mostuk. A megfestett tárgylemezeket xilol alapú DPX oldattal (Sigma-Aldrich) rögzítettük, és fénymikroszkóppal (Olympus) tettük láthatóvá. A kollagén rostok kék színűnek tűnnek a fibrózis területén, míg avese-a hám vörös színűnek tűnik. Az MT-vel festett fibrózisos területeket ImageJ szoftverrel mértük. Az MT-vel festett vese eredeti képeit RGB-képekké alakították, majd ezeket a képeket az ImageJ szoftverrel a színdekonvolúciós bővítmény segítségével dekonvolválták.
4.6.2. Periodikus sav-Schiff (PAS) festés
Periodikus sav-Schiff (PAS) festés igazolta a glomeruláris károsodástvese. Paraffinba ágyazott tömbökveseA szöveteket 8 µm vastagságúra metszettük, bevonó tárgylemezre helyeztük, és 37 °C-on 3 napig szárítottuk. A szövetlemezeket xilollal és alkohollal paraffinmentesítettük, vízzel hidratáltuk, 5 percig 0,5 százalékos perjodsav oldattal oxidáltuk, majd vízzel mostuk. A tárgylemezeket 15 percre Schiff-reagensbe merítettük, majd 5 percig langyos csapvízzel mostuk. Végül a tárgylemezeket Mayer-féle hematoxilin oldatba vittük át 1 percre, majd vízzel mostuk. A megfestett tárgylemezeket xilol alapú DPX oldattal (Sigma-Aldrich) rögzítettük, és fénymikroszkóppal (Olympus) tettük láthatóvá.
A glomerulusokat véletlenszerűen választották ki, és a glomeruláris károsodást félkvantitatív pontozási módszerrel (0–4. fokozat) PAS-festéssel értékelték.veseszövetlemezek.
(1) 0. fokozat: normál glomerulusok; (2) 1. fokozat: minimális szklerózis (a szklerotikus terület legfeljebb 25 százaléka); (3) 2. fokozat: mérsékelt sclerosis (szklerózisos terület 25% és 5{29}}% között); (4) 3. fokozat: közepesen súlyos-súlyos szklerózis (a szklerotikus terület 50-75 százaléka); (5) 4. fokozat: súlyos szklerózis (szklerózisos terület 75–100 százalék); A glomerulosklerotikus indexet (GSI) a következő egyenlettel számítottuk ki: (4 × n4) plusz (3 × n3) plusz (2 × n2) plusz (1 × n1) / n4 plus n3 plusz n2 plusz n1 plusz n0, ahol n ( x) a számavese-glomeruláris sclerosis minden fokozatban [46]. Ezt az elemzést a kezelt csoportokban egy maszkos megfigyelő végezte.
4.7. Szisztolés vérnyomás, diasztolés vérnyomás és átlagos artériás vérnyomás mérések
A szisztolés vérnyomást, a diasztolés vérnyomást és az átlagos artériás vérnyomást noninvazív CODA farokmandzsetta rendszerrel (Kent Scientific Corp., Torrington, CT, USA) mértük. A patkányszublimációt 20 percig 5 napon keresztül végeztük, és a vérnyomást az utolsó napon mértük.
4.8. In vitro modellezés TCMK-1 sejtekkel
A TCMK-1 sejteket, egy egér proximális tubulussejtvonalat az American Type Culture Collection-től (Washington, DC, USA) vásároltuk. Magas glükóztartalmú Dulbecco's Modified Eagle táptalajt (Gibco; Grand Island, NY, USA), 10% magzati szarvasmarha szérumot (FBS) és 1% penicillin-sztreptomicint használtunk táptalajként. Az ECE és DK angiotenzin II-vel kezelt TCMK-1 sejtekben való gátló hatásának igazolására az ECE-t (5, 25, 50 µg/ml) és a DK-t (1,8 µg/ml) 100 nmol/L angiotenzin II-vel kezeltük. (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 12 órán keresztül. Telmizartánt (1 µmol/L, Sigma-Aldrich) alkalmaztak AT1 receptor antagonistaként, és az angiotenzin II előtt 3 órán át előkezelték [47].
A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE-/VESEFÁJDALÁST
4.9. Protein készítése és Western-blot
Az angiotenzin II-vel kezelt TCMK-1 sejtekből a fehérje izolálása érdekében a sejteket foszfatázt és proteináz inhibitort (EzRIPA; ATTO; Tokió, Japán) tartalmazó RIPA lízispufferrel lekapartuk, és jégen inkubáltuk 2 0 ideig. min. 13, 000× g-vel 20 percig, 4 ◦ C-on végzett centrifugálás után a tiszta felülúszókat egy új csőbe helyeztük, és a felülúszók koncentrációját bicinkoninsav vizsgálati készlettel (BCA kit; Thermo Fisher Scientifific, Inc.; Waltham, MA, USA). A TCMK-1 sejtekből származó fehérjeexpresszió validálására blottolást végeztünk. A lizátum fehérjék azonos mennyiségét (30 µg/sáv) 10%-os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid géllel választottuk el elektroforézis segítségével. Ezután a futó fehérjéket polivinilidén-fluorid membránokra vittük át, amelyeket hígított primer antitestekkel (Anti- -}actin, AGTR1, TGF-, SMAD2/3 és pSMAD2/3) inkubáltunk 4 ◦C-on. Az antitestekkel inkubált membránokat 0,1% Tween 20-at tartalmazó Tris-pufferolt sóoldattal alaposan mostuk, és másodlagos antitestekkel inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten. Az összes membránt fokozott kemilumineszcenciával fejlesztették ki (LAS{24}}s; GE Healthcare, Chicago, IL, USA). Az ebben a vizsgálatban használt antitestekre vonatkozó információk az S2 táblázatban találhatók.
4.10. Statisztikai analízis
Az eredményeket átlag ± SD és p-értékek formájában mutatjuk be<0.05 mean="" it="" is="" statistically="" significant.="" the="" kruskal–wallis="" test="" was="" used="" to="" validate="" the="" differences="" among="" the="" groups,="" and="" the="" mann–whitney="" u="" test="" was="" used="" in="" the="" spss="" ver.="" 22="" software="" (ibm="" corporation;="" ny,="" armonk,="" usa)="" completed="" post="" hoc="" comparisons.="" means="" denoted="" by="" a="" different="" letter="" indicate="" significant="" differences="" between="">
5. Következtetések
Összefoglalva, az AT1R felszabályozott az SHR-ekben, és a jelút növelte a TGF-et és az SMAD2-t vagy 3-at, ami EMT-t indukált. Az ECE vagy a DK leszabályozta a jelpályát és csökkentette az EMT-t. Ezért az ECE vagy a DK csökkentette a mezenchimális sejtmarkereket, mint például a vimentin és az -SMA, a fibrózisos szövet expresszióját.vese, valamint a vizelet albumin/kreatinin aránya és gyengítette az EMT-t. Továbbá,vese-fibrózisa a helyreállításához vezetettveseműködés(7. ábra).
