huNyelv
Haza / Tudás / Tartalom

Tudás

Az autofluoreszcencia, mint az öregedés és a fejlett glikációs végtermékek noninvazív biomarkere a Cistanche Tubulosa-ban

Apr 11, 2023

VITA

Korábban az autofluoreszcenciát használták a lipofuscin, az öregedési pigment monitorozására az öregedés biomarkereként.4,13. Bár megfigyeltük a vörösetFllipofuscinra utaló uoreszcencia, amint azt a korábbi vizsgálatokban is láthattuk9, kékFluorescenciát egy korábbi életszakaszban észleltek, amikor a férgeket M165 FC-vel vizsgáltákFluoreszcens sztereomikroszkóp (Leica Microsystems, Tokió, Japán) (az adatokat nem mutatjuk be). Jelen tanulmány célja annak vizsgálata volt, hogy a kék autofluoreszcencia érzékenyebb markerként szolgálhat-e az egyes férgek öregedésének nyomon követésére.

anti- senescence cistanche function

Cistanche ForÖregedés elleni

Buy Cistanche

Öregedésgátló Cistanche termék szállításra készen


AFlaz egyes férgekben mért uorescencia az életkorral nőtt; minél kevesebb féregfluoresced, minél hosszabb a várható élettartamuk. Így kékFlAz uoreszcencia alternatív biomarkert jelenthet az öregedés nyomon követésére. Azonban Pincus et al. arról számolt be, hogy a férgek, amelyek ezt követően elpusztultak (24 órán belül)Fluoreszkált a kinurenin bioszintézise miatt; ezek a kutatók elnevezték ezt a kék fényt"halálFluoreszcencia". Állítólag halálfluorescence reFlbefolyásolja a kinurenin-útvonal által termelt antranilsav glikozilált formája általi kibocsátást; az autóFluoreszkáló anyag lizoszómaszerű bélszemcsékben mutatható ki31. Ez a kék fény ugyanaz a haláljelző lehet, mint Coburn és munkatársai. ben figyelték megC. eleganstöbb órával a halál előtt és után, és ez állítólag megfigyelhető volt mind a fiatal férgek esetében, akik halálos sérülésnek voltak kitéve, valamint az idős korból természetes módon elhaló férgeknél. Valójában megfigyeltük, hogy akedves-1mutáns, amelyből hiányzik a kinurenináz aktivitás, kevésbé volt autofluoreszcens, mint a vad típusú. Eredményeink azonban azt mutatták, hogy a kék bizonyos részeflaz uoreszcencia inkább az öregedéssel jár, mint a halállal. Nevezetesen, amint az ábra mutatja.3b, az öregedő férgek fokozott kék színt mutattakFluoreszcencia még akkor is, ha figyelmen kívül hagyjuk a halált megelőző 2 napon belül szerzett adatokat. Továbbá a férgek isFluoresced több az öregedéssel, függetlenül attól, hogy az állapot akynu-1gén. CsökkentFluoreszcencia akynu-1mutánsnak tehát a veszteségnek kell lennieaz AGE szintézis kinureninek általi felgyorsítása, nem pedig a halál hiányaFluoreszcencia32.


Bizonyos AGE vegyületekFluoreszcens27. Arra következtettünk, hogy a kékFlaz uoreszcencia magában foglalhatja az említett AGE-k emisszióját, elkülönülve attól, ami a halálnak tulajdoníthatóFluoreszcencia. Amikor a kivont féregfehérjéket in vitro cukrokkal inkubáltuk, aFlaz uoreszcencia intenzitása és az AGE-k szintje idővel nőtt. Ribózt tartalmazó táptalajon tenyésztett férgekFluoreszkált, mint a kontrollállatok, amelyeket kiegészítő ribóz hiányában termesztenek, még akkor is, hakynu-1mutálódott. Ezzel szemben a rifampicin, az AGE-termelés ismert gátlója jelenlétében tenyésztett férgek csökkent kék színt mutattak.Fluoreszcencia. A fluoreszcens mikroszkópos vizsgálat valóban azt mutatta, hogy a 13-napos férgek több kék fényt bocsátanak ki, mint a 3-napos fiatal felnőttek. Az anti-CML vagy anti-pentosidin antitestekkel végzett immunfestés nem mutatta ki diffúzan terjedő AGE-k jelenlétét a kékhez hasonló eloszlási mintázatbanFluoreszcencia. AFluorescence származhat más bőségesFluoreszcens AGE-k, például vespertin A, LM-1 és argpirimidin33,34.


Az oociszták sárgájának biztosításához,C. elegansA hermafroditák saját bélbiomasszájukat fogyasztják, ami a későbbi életkorban bélsorvadást és méhen kívüli sárgája lerakódást eredményez. A vitellogeninek (sárgájafehérjék) kétszer nagyobb mennyiségben voltak jelen idős férgekben (a fiatalabb állatokhoz képest), amint arról korábban beszámoltunk35, és hatszor nagyobbat mutattak kiFluoreszcencia glikáció után in vitro. Ezek az adatok azt sugallják, hogy maguk a vitellogeninek 12-szeresére nőtnénekFlelméletileg az idősebb férgek uorescenciája a fiatal felnőttekhez képest. A Western-blot azt mutatta, hogy az anti-CML antitesttel reagáló fő sávok a tojássárgája fehérjék voltak. Ez a megállapítás megegyezik Nakamura és munkatársai korábbi jelentéseivel, akik a vitellogenin erős glikációját mutatták ki36valamint Golegaonkar és munkatársai, akik csökkent glikációt észleltek a vitellogenin-2, vitellogenin-6 és az 1-es elongációs faktor alfa-ban rifampicinnel kezelt fonálférgekben30. Állítólag a vitellogeninek antioxidánsként működnek, és hozzájárulnak a mézelő méhkirálynők hosszú élettartamához37. Ban benC. elegans, a vitellogeninek döntő szerepet játszanak a stressz-rezisztenciában 38. Mivel az antioxidánsok maguk is könnyen oxidálódhatnak, a glikált vitellogenin felhalmozódása ronthatja az oxidatív károsodás elleni védelmet, ami fordított összefüggést eredményez a várható élettartam és a kék szín intenzitása közöttFljelen tanulmányban megfigyelt uorescenciát. Sornda et al. nemrégiben arról számoltak be, hogy az élettartam nincs összefüggésben az YP115/YP88 (vitellogenin-6) által közvetített oxidatív stresszrezisztenciával39. Ezek a kutatók azt javasolták, hogy a vitellogeninekből származó YP170 vitellogenin felhalmozódása 1–5, bélsorvadást és csökkent élettartamot okoz, míg az YP115/YP88 felhalmozódása késleltetheti a bélsorvadást és meghosszabbíthatja az élettartamot. A vitellogenin-6 glikációja és az ebből eredő diszfunkció hozzájárulhat az öregedéshez. Bár a nyúlási tényezőkFlAz in vitro glikációt követően háromszor intenzívebben uoreszkálnak, ezeknek a fehérjéknek a mennyisége hasonló volt a fiatal és idős férgek között. Ezért ennek a faktornak a fokozott autofluoreszcenciához való hozzájárulása kisebb lehet, mint a vitellogenineknek tulajdonítható.

anti- senescence cistanche function


Cistancheáltalában mintaként használtáktanulmányöregedés és öregedés elleni beavatkozások. Javasoltuk a féreg használatát modellként a hosszú élettartamot elősegítő hatások vizsgálatáraa tejsavbaktériumoktól8. Tekintettel a demonstrációra (jelen tanulmányban), hogy a kékFlA fonálférgek uoreszcenciája az AGE-k felhalmozódásának lehetséges jelzője, azt javasoljukCistanche A hermafroditák modellként szolgálhatnak az AGE-termelés elnyomásán keresztül ható öregedésgátló beavatkozások hasznosságának vizsgálatára. Ezzel szemben az autofluoreszcencia nem valószínű, hogy a hím férgek öregedésének biomarkere, mivel a vitellogenineknek alig kell lenniük.

anti- senescence cistanche function

5. ábra Kék fluoreszcencia kynu-1 mutánsokból, amelyeknek nem szabad halálos fluoreszcenciát kibocsátaniuk. a7-napos és 13-napos fluoreszcencia intenzitása (ex 340/em 430)kynu-1mutánsok (n = egyenként 37); az idősebb férgek még mindig többet bocsátottak kiFluorescence, mint a fiatalabb férgek, annak ellenére, hogy akynu-1mutáció. Azonban semmi jelFifiAz autofluoreszcencia értékekben a Mann nem mutatott eltérést–WhitneyU teszt.b Egy ribózzal karbantartott 7-napos féreg több kéket bocsátott kiFluoreszcenciája ellenére akedves-1mutáció. KékFluoreszcenciájaC. elegansribózzal termesztve (n = 24) vagy szorbit (n = 18) összehasonlították a cukrok nélküli kontrollférgekéivel (n = 20). Az autofluoreszcencia értékeket a nem paraméteres Steel segítségével hasonlítottuk össze–Dwass módszer (**p < 0.01). c Túlélési görbéiC. elegansribózzal termesztve (n = 62) vagy szorbit (n = 84) összehasonlították a cukrok nélküli kontrollférgekéivel (n = 64). A férgek 3 naposak voltak a(z) 0 napon. A fonálférgek túlélését a Kaplan számította ki–A Meier-módszert és a túlélési különbségeket a log-rank teszttel tesztelték (**p < 0.01).


MÓD

FonálférgekCistanche A Bristol N2 törzset és származékos mutáns törzseit a Minnesota Egyetem Caenorhabditis Genetics Centere biztosította. A vizsgálatban használt mutációk a CB1370 voltakdaf-2 (e1370)és CB1003KYNU-1 (E1003). A fonalférgeket NGM-en tartottuk fenn és szaporítottuk a 40. standard technika szerint. A féregpetéket kifejlett férgekből nyertük ki, miután nátrium-hipoklorit/nátrium-hidroxid oldattal kezeltük a korábban leírtak szerint 41. A tojásszuszpenziókat egy éjszakán át 25 fokon inkubáltuk, hogy lehetővé tegyük a kikelést, és a szuszpenziót. L1-stádiumú férgeket 156 × centrifugálással centrifugáltukg 1 percig. A felülúszót eltávolítottuk, és a megmaradt lárvákat friss, peptonmentes módosított NGM (mNGM) lemezekre vittükE. coliOP50 (OP50) törzs. A törzseket mNGM agarlemezeken tenyésztettük 25 fokon, kivéve adaf-2törzs, amelyet 20 fokon tenyésztettünk az L4 stádiumig. Minden vizsgálatot fiatal felnőtt férgekkel kezdtünk, amelyek 25 fokos hőmérsékleten kezdtek tojásrakni. A fonálférgekhez nem volt szükség etikai jóváhagyásra.Bakteriális törzsekAz OP50-t a fonálférgek nemzetközileg elismert táplálékaként használták. Az OP50 tenyésztéséhez tripton szójaagart (Nissui Pharmaceutical, Tokió, Japán) használtunk. A baktériumokat (100 mg nedves tömeg) 0,5 ml M9 pufferben szuszpendáltuk; A baktériumszuszpenzió egy 50-µl-es aliquot részét ezután az mNGM-re kentük 55- cm átmérőjű lemezeken, hacsak másképp nem jelezzük.


anti- senescence cistanche function

Az autofluoreszcencia többváltozós elemzése

Az egyenként 100 felnőttből álló populáció 3 és 17 napos korban gyógyult,háromszor mossuk, 3 µl M9 pufferben koncentráljuk, és fagyasztva tároljuknál nél–Felhasználásig 80 fokon. Az extrakció előtt 3 µL lízispuffert (amely50 mM Tris-HCl puffer (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát(SDS), 1% Triton X-100, 1 mM fenil-metil-szulfonilFluorid (PMSF) és
2% 2-merkaptoetanolt) és 4 µl 15% SDS-t osztottak ki minden csőbe. Ezután a mintákat alávetettükFive fagyasztás-olvadás ciklusok fehérje felszabadulásához. A fotolumineszcens spektrumokat aFluoreszcenciaspektrofotométer (Hitachi FL{{0}}) adatértelmező szoftverrel (FL Solutions ver. 2.0). A fonálféreg szuszpenziók fluoreszcens tulajdonságai voltak

gerjesztési-emissziós mátrix (EEM) segítségével elemzikFluoreszcencia spektroszkópia. Többváltozós elemzés (egyhullámhosszú gerjesztés többszörösenhullámhossz-kibocsátás és szinkron pásztázásfluorometria) EEM diagramokat eredményezett, amelyek egypásztázó gerjesztésből és szinkronfluoreszcenciaminden sorozat spektrumát megrajzolták.



Öregedő férgek fluoreszcencia spektruma

Férgek (3–13 naposak) kinyertük 2-t tartalmazó táptalajból'-deoxi-5-Fluorouridine (Tokiói Vegyipar, Tokió, Japán). Ezvegyület blokkolja az utódok embrionális fejlődését, ezáltal kizárja az utódok általi fertőzést. Az egyes idősödő férgeket begyűjtöttékcsövek, mosvaötalkalommal, 3 µl M9 pufferben koncentráljuk, és fagyasztva tároljuk–Felhasználásig 80 fokon. Az extrakció előtt 100 µl lízispuffert(amely 50 mM Tris-HCl puffert (pH 7,5), 150 mM NaCl-t, 10 mM ditiotreitolt (DTT), 1 mM PMSF-et és 1 µl proteáz inhibitor koktélt (Sigma, St. Louis, MO, USA) tartalmaz. minden csövet. A mintákat ezután Mini akkus darálóval (Funakoshi, Tokió, Japán) megőrölték, hogy felszabadítsák.
fehérje. A fehérjetartalmat Pierce-vel kvantitatívan mértük™ 660 nm-es Protein Assay Reagens (Thermo Fisher Scientific Meridian,Waltham, MA, USA) és egy NanoDrop OneC műszer (Thermo Fisher Scientific).). Afluoreszcenciaspektrumot minden egyes 30-µl mintára (amely 1,5μg összfehérje) multimódusú rács segítségével

mikrolemez olvasó modell SH-9000Labor SF6 adatkezelő szoftverrel(Corona Electric, Ibaraki, Japán). Minden mérést háromszor végeztünk el.


image

Egyedi élő férgek autofluoreszcenciájának mérése (wrap-drop módszer)

A véletlenszerűen kiválasztott férgeket M9 pufferrel mostuk, majdaz egyes férgeket 1.{1}} µl M9 pufferbe helyeztük Saran Wrap ragasztónFilm (Asahi Kasei, Tokió, Japán) egy 384-kút fekete tányér fölé feszítve(STEM, Tokió, Japán). Mindegyik lyukon kis mélyedéseket alakítottunk ki areplikátor (Watson, Kobe, Japán). Ennek a módosításnak az volt a célja, hogy a mérés után biztonságosan visszanyerje a férgeket, így nyomon követhető volt az egyes férgek autofluoreszcenciájának korfüggő változása. A ragaszkodásFiAz lm-re esett a választás, mert kevesebbet fluoreszkált, mint a kereskedelmi forgalomban kapható többiFilms.

Azonban az üres (csak M9 puffer) adatokat háromszor ellenőriztükmindegyik jól, figyelembe véve aingadozáskútról kútra. A minimális kimutatási határértékeket és a számszerűsíthető határértékeket az egyes napokra vonatkozó vak adatok alapján határoztuk megμ (az üres jelentése)plusz3.29σ (szórás) ésμplusz√2 × 10σ, ill. Az autofluoreszcencia az egyes férgek testében

multimódusú rácsos mikrolemez olvasóval rögzítették. UtánA mérés során minden férget külön-külön tartottunk 4.0-cm-enátmérőjű, OP50-nel borított lemez (2 mg/10μL M9 puffer) 25 fokon . Minden egyesa vizsgálatot legalább 20 féreggel végeztük, és kétszer megismételtük.


A várható élettartam mérése

A férgeket OP50-nel borított mNGM lemezeken tartottuk 25 fokon 13 napos korukig. által végzett értékelést követőenfluoreszcencia30 féreg voltkülön új, OP50-nel borított mNGM lemezekre helyezték át. A lemezeket 25 °C-on inkubáltuk, és az élő és elpusztult férgeket 24 óránként értékeltük. A férget akkor tekintették halottnak, ha nem reagált a féregszedő gyengéd érintésére.

anti- senescence cistanche function


AGE-k in vitro glikáció után

A fehérje extrakciót a korábban leírtak szerint végeztük. Három napos férgeket használtak mesterséges glikációhoz. A fehérjeminták (2 mg/ml)500 mM glükózzal, 100 mM ribózzal vagy 500 mM fruktózzal inkubáltuk(Finális koncentráció). Minden mintát 37 fokon inkubáltunk 0–4 hét. Alikvotok (50μL) egy polisztirol lemez lyukaiba adagoltuk
(Sumitomo Bakelite, Tokió, Japán) és 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk. UtánA mintaoldat eltávolítása után a lemezt PBS-T-vel mostuk(foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS), 0,05 százalék Tween 20); 250μL 3 százalékos sovány tejminden lyukba hozzáadtuk, és a lemezt 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Minden egyesjól, majd PBS-T-vel mostuk, és 100 ulμL egy anti-AGE (anti-CML)
monoklonális antitest (klón No. 6D12, Trans Genic, Fukuoka, Japán; 75 ng/ml) adagoltunk minden egyes lyukba; a lemezt ezután a szobában inkubáltukhőmérsékleten 1 órán át. PBS-T-vel történő mosás után 100μL peroxidázzal konjugáltkecske anti-egér IgG antitestet (Rockland Immunochemicals, Inc., Limerick, PA, USA; 1:150, 000) adagoltunk minden egyes lyukba, és
a lemezt szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk. PBS-T-vel történő mosás után 100μL munkaoldat (tetrametilbenzidin (TMB) festőoldat: peroxid oldat= 1:1; ELISA POD szubsztrát TMB készlet, népszerű,Nacalai Tesque, Kyoto, Japán) minden egyes lyukba adagoltuk, és a lemezt szobahőmérsékleten tartottuk sötétben, amíg a kioltás meg nem történt.

100 kiegészítésμL 1 mol/l kénsav lyukanként. Mindegyik abszorbanciája450 nm-en (szub: 650 nm), majd azonnal megmértük egy mikrolemez-leolvasóval. Az ELISA-t háromszor végeztük el minden vizsgálati körülményre.


Western blotting öregedő férgek ellen

A mintákat 4× csavarral kezeltük™ LDS mintapuffer (Thermo Fisher ScientiFific) és 10× csavar™ Mintaredukáló szer (Thermo Fisher ScientiFific), és minden minta 1,5μg összfehérjét Bolton futtattunk™ 4–12 százalék Bis-Tris Plus gél (Thermo Fisher ScientiFific). Ezután a fehérjéket átvittük a gélből egy polivinilidénbeFluorid membrán (ATTO, Tokió, Japán) és 5% sovány tejjel blokkolva PBS-ben- 0,1% Tween 20 1 órán át. A membránt egy éjszakán át 4 fokon inkubáltuk anti-AGE (anti-CML) monoklonális antitesttel (6D12. klón 1:1{18}} arányban), mostuk PBS-T-vel, majd szobahőmérsékleten 1 percig inkubáltuk. h peroxidázzal konjugált kecske anti-egér IgG antitesttel (1:25,000). PBS-T-vel történő mosás után a membránt az ECL prime Western blotting detektáló reagenssel (GE Healthcare UK, Little Chalfont, England) inkubáltuk, és ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) vagy ImageQuant segítségével szkenneltük. LAS 500 (GE Healthcare UK). A membránokat ezután PBS-T-vel mostuk, Western BLoT csíkozópufferrel (Takara, Shiga, Japán) inkubáltuk 30 percig szobahőmérsékleten, majd ismét mostuk PBS-T-vel. A membránt újra megvizsgáltuk YP115 és YP170 anti-vitellogenin antitestekkel (mindegyik 1:10 000) 4 fokon egy éjszakán át.42PBS-T-vel mostuk, és peroxidázzal (1:2000) konjugált kecske anti-patkány IgG antitesttel (Proteintech, Rosemont, IL, USA) szobahőmérsékleten 2 órán át inkubáltuk. A terhelési kontrollokhoz a membránokat újra megvizsgáltuk egy anti-aktin antitesttel (C4. klón; Merck KGaA, Darmstadt, Németország) és peroxidázzal konjugált egér elleni antitesttel (GE Healthcare UK). A vitellogenin (YP170 és YP115) és CML sávok sűrűségét az egyes sávokban normalizáltuk a megfelelő sáv aktin sávjaihoz képest. A sávsűrűségeket ImageQuant TL szoftverrel (GE Healthcare) elemeztük. Mindegyik vizsgálatot kétszer végeztük el.


A ribóz és a rifampicin hatása az AGE-kra in vivo

Három napos férgeket tenyésztettünk 400 mM ribózt tartalmazó mNGM-envagy 400 mM szorbit, hogy megfeleljen a magas ribóz ozmolaritásnak; A férgek táplálékát hővel (100 fok, 10 perc) elölt OP50 formájában biztosítottuk, hogy megakadályozzuk a baktériumok erjesztését a cukrban. Az utódok általi fertőzés elkerülése érdekében a férgeket naponta 4 napon át friss lemezekre vitték, amíg teljesen el nem fogytak.

befejezetttojásrakás (7 napos korban). A ribóz hatásának felmérésére túlélési vizsgálatokat végeztünk és autofluoreszcenciát mértünk. Egy féreg volthalottnak tekinthető, ha nem reagált egy féregszedő gyengéd érintésére. Azok a férgek, amelyek a lemez falához tapadva elpusztultak, nem szerepeltek az elemzésben, és cenzúrázták őket. Egy külön kísérletben50 µM-t tartalmazó MGM (végsőkoncentráció) rifampicin (feloldvaDMSO) használtuk. Mindegyik vizsgálatot kétszer megismételtük.


anti- senescence cistanche function

6. ábra A vitellogenin (Vit) és az elongációs faktor (EF) autofluoreszcenciája. aSpektrofotometria (ex 325/em 350–600) vitellogenin éselongációs faktor in vitro ribózzal történő glikáció előtt és után 14 napig: a gly-Vit és a gly-EF glikált vitellogenin és glikát elongációtényező, ill. RiboFLFLaz avin (borda) reprezentatívként jelenik megLFLuoreszcens vegyület. Összehasonlításképpen látható a 17-napos férgek (vad típusú N2) kivonata (C. elegans). b A vitellogenin és az elongációs faktor ribóz általi in vitro glikációja növelte az autofluoreszcenciát
túlóra.c Az AGE és a vitellogenin Western blot analízise különböző korú féreg (vad típusú N2) populációkból kivont mintákban. A blotokat ugyanarról a gélről származtattuk, és sorrendben mindegyik antitesttel feldolgoztuk.d Számszerűsítésvitellogeninek és AGE-k nyugatiblottolás denzitometriával. A kísérleteket kétszer megismételtük, és egy reprezentatív kísérlet adatait mutatjuk be. A piros színű vonal és pontozott vonal az AGE-k hajtásváltozásait mutatja, míg a fekete szín a vitellogenin mennyiségét jelzi. A zárt körök és a keresztek az YP170 és YP115 sávok adatait jelzik.


Régi féregspecifikus fehérjék azonosítása

3- és 17-napos fonálférgek kivonatainak tömegspektrometriás elemzéseAB SCIEX 5800 LC-MALDI-TOF tömegspektrométeren (Newark, NJ, USA) hajtottuk végre Protein Pilot 4.0 verzióval. Mindkét mátrix volttripszinnel emésztjük és mátrixoldattal keverjük össze (7 mg/l - ciano-4-hidroxi-fahéjsav 0,1% (v/v) trifluor-ecetsavban (TFA), 70%
(v/v) acetonitril (ACN)). Afickóaz elválasztáshoz használt sebesség 300 ml/perc volt,és az elválasztást két mozgófázis lineáris gradiensével érték el ({0}},1% (v/v) TFA 2% ACN-ben (A oldószer) és 0,1% (v/v) TFA 80 °C-ban. százalékos ACN(B) oldószer) a következő arányban: A/B= 100/0–50/50 (60 perc), A/B= 50/50–0/100 (20 perc), A/B= 0/100 (10 perc). MALDI-TOF Mass rendszert alkalmaztunk a peptidtömeg előállításáhozujjlenyomat. Peptidillesztés ésfehérjekeresést végeztünk a Swiss-Prot 57.0 adatbázisával.


Az extrahált fehérjéket 50 mM ammónium-hidrogén-karbonátban oldjuk(AmBic), hogy a fehérjekoncentráció 0,1 és 1 µg/µL között legyen. A fehérjék oldhatóságának maximalizálása érdekében a számított térfogatú WatersRapigest-et (Waters Corporation, Milford, MA, USA) adtunk hozzá a kitermeléshezFia 0 végső koncentrációi.1–0,2 százalék Rapigest az emésztés előtti mintákban. A minták
40 fokra melegítettük rázatás közben 10 percig; a tartalom akkor voltcentrifugáltuk, és a kapott pelletet 10 mM DTT-t tartalmazó AmBic-ben szuszpendáltuk. A mintákat 80 fokon 15 percig melegítettük, majd szobahőmérsékleten pelletizáltuk. 200 mM jódacetamid (IAM) alikvot része 50 mM-benAmBic-et adtunk minden mintához, hogy avégsőIAM koncentrációja

20 mM (2-szeres moláris DTT-felesleg jelenlétében); a keverék akkor voltsötétben, szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltuk, hogy az alkilezési reakció lezajljon. Az egyes oldatokhoz 1:50 arányban (tripszin: fehérjekoncentráció) kevertünk tripszint 50 mM AmBic-ben. A mintákat legalább 4 órán át vagy egy éjszakán át 37 fokon rázatással emésztettük. Következőcentrifugálással TFA-t és ACN-t adtunk hozzá, hogy hozzukvégsőkoncentrációja a 0.5–1.0 térfogatszázalék TFA és 2 térfogatszázalék ACN. A mintákat 2 órán át 60 fokon rázattuk. 22 200 × centrifugálás utáng 5 percig a felülúszó voltautomata mintavevő fiolába pipettázva. A fehérjéket korábban tripszinnel emésztettükfordított fázisú folyadékkromatográfiás elemzéshez Ultimate3000RSnanoLC rendszerrel (Thermo Fisher Scientific) ESI-Q-TOF rendszerhez (Impact II Bruker Daltonics) kapcsolva. Az élesztő alkohol-dehidrogenázAz (ADH1_YEAST) fehérje belső standardként a mintákba került;spikinget végeztünk, hogy körülbelül 50 fmol mennyiséget kapjunkszabvány az oszlopon.


Autofloreszcencia in vitro glikáció után

A vitellogenint PBS-oldatban ({{0}},053 µM) a Biosense Laboratories AS-től (Bergen, NORVÉGIA) vásároltuk. Az elongációs faktor oldatot (1,17 µM) az Abnova Corporation-től (Taipei City, Tajvan) vásároltuk. Ezeket az oldatokat 0,1 mM ribózzal glikáltuk 23 napig 37 °C-on. Riboflflaz avint a Sigmától (Tokió, Japán) vásároltuk, és 0,1 mM PBS-ben oldottuk fel. Mindegyik oldatot fluoreszcens spektrofotometriával mértük azonos körülmények között.

Immunfluoreszcenciafiatal és öreg férgek általAz életkor szerint szinkronizált CB1003 OP50-nel táplált 25 fokos hőmérsékleten inkubáltuk. A háromnapos és 13-napos felnőtteket Bouin segítségével permeabilizálták's csőrögzítési protokoll43.


anti- senescence cistanche function

7. ábra 3-napos és 13-napos kynu-1 mutánsok fluoreszcens képei. a–cHárom napos férgek ésd–f 13-napos férgek, nyers képekkel az 1. oszlopban. A halál lehetséges következményeinek kizárása érdekébenFluorescencia, amely a férgek megjelenése előtt 2 nappal kezdődik' halál, a mutánskynu-1használtunk. Az autofluoreszcenciát a 2. és 3. oszlopban lévő képeken láthatjuk. A 3. oszlopban lévő fényképeket a 2. oszlopban lévő képek jelzett (téglalapokkal) felnagyított területeiről. Idős férgek (13-napos) autofluoreszkáltsigniFifijóval magasabb, mint a fiatal férgeké (3-napos). Minden skála 50-et jelezμm. g SzámszerűsítéskékfluoreszcenciaImageJ és ImageQuant TL szoftverrel. Minden oszlop az átlagértékeket jelentiFluoreszcencia intenzitás 1 mm-enként2 kilenc féregből. ** statisztikailag szignifikánsFifinem lehet különbség a 3-napos és a 13-napos férgek közöttp érték < 0.01. A hibasávok az SE-t jelölik.

A minták voltakrögzítettBouinban's fixírlakkmetanollal/ - merkaptoetanolszobahőmérsékleten 30 percig. A kutikula megrepedéséhez férgeket helyeztek beleizopropanol és tároljuk–80 fokon 10 percig, majd szobahőmérsékleten további 30 percig inkubáljuk. Afixírlakkoldatot eltávolítottuk ésBTB-oldattal helyettesítve (25 mM borát puffer, 0,5 százalék Triton X-100, 2 százalék
-merkaptoetanol) szobahőmérsékleten 1 órán át; inkubáció a BTB-ben voltösszesen háromszor ismételjük meg. A férgeket ezután BTB-ről BT-re (25 mM borát puffer, 0,5% Triton X-100) vittük át, és antitest pufferoldatban (1 × PBS, 0,5%) inkubáltuk. Triton X-100, 0,1 mM EDTA, {{10}},1% szarvasmarha-szérumalbumin (BSA), 0,05% nátrium-azid, pH 7,2) szobahőmérsékleten

1 óra, és 10% kecskeszérumot tartalmazó antitest pufferoldattal blokkoltuk(Cosmo Bio, Tokió, Japán) 4 fokon éjszaka. Az elsődleges antitestek egy egér monoklonális anti-AGE (anti-CML) antitestből (klón No. 6D12; 1:125) és egy anti-pentosidin antitestből (PEN-12 klón, Trans Genic; 1:5) álltak. 0). A másodlagos antitest Alexa Fluor 555- konjugált kecske anti-egér antitestből állt (Abcam, Cambridge, Anglia; 1:100). Minden antitest hígítást 0,5% BSA-t tartalmazó antitestpufferrel végeztünk. A mintákat VECTASHIELD fakulásgátló rögzítőközeggel (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) üveglemezekre szereltük.



Fluoreszcens mikroszkóp

A 3- vagy 13-napos kifejlett férgek fluoreszcens képeit, amelyeket a fent leírtak szerint üveglemezekre szereltek, fordítottFluoreszcenciamikroszkóp (BZ-X700; Keyence) 10×-es objektívvel (CFI Plan Fluor DL10×/0,30). AutoFLFLférgek uorescenciája vörösfluoreszcenciaAlexátólAz 555-ös fluort BZ-X DAPI (gerjesztési hullámhossz (Ex), 360 ± 20 nm; emissziós hullámhossz (Em), 460 ± 25 nm) és TRITC (Ex, 545 ± 25 nm) segítségével vizsgáltuk12,5 nm; Em, 605 ± 35 nm)szűrők, ill. A szakasz képek voltaka Metsző módban rögzített egydimenziós réstípussal aszélessége 32, és a Z-verem osztása 0.7μm 40-μm vastagságú minták. A kék számszerűsítésérefluoreszcencia, afluoreszcenciakép által mért intenzitás
A Quant TL szoftvert (GE Healthcare) 1 mm-enkénti sűrűségértékekre normalizáltuk2 egy féreg's vetítési terület. A test méretét a National Institutes of Health által kifejlesztett Adobe Photoshop Elements és ImageJ szoftverrel határozták meg. Ebben a rendszerben egy féreg területe's vetületeautomatikusan megbecsülték, és a testméret indexeként használták.



Statisztikai analízis

A várható élettartam korrelációját Spearman segítségével számítottuk ki's rangkorrelációs együttható. Az in vitro glikáció utáni autofluoreszcencia szinteket kétfaktoros faktoriális ANOVA és Scheffe segítségével hasonlítottuk össze.'s F teszt. AAz in vitro glikáció utáni ELISA értékeket egyfaktoros ANOVA és Dunnett teszt segítségével hasonlítottuk össze többszörös összehasonlításhoz. Fonálférgek túlélésea Kaplan számította ki–A Meier-módszert és a túlélési különbségeket log-rank teszttel vizsgáltuk szignifikancia szempontjából. Az autofluoreszcencia értékek rifampicin kezelést és öregedését követően adaf-2éskynu-1mutánsokat hasonlítottunk össze mindegyik Student segítségével's t teszt, ismételt mérésű kétfaktoros ANOVA és a Mann–WhitneyU teszt. A ribóz kezelések utáni autofluoreszcencia értékek N2 vagy akynu-1mutánsokat a nem paraméteres Steel segítségével hasonlították össze–Dwass módszer. Az autofluoreszcenciás mikroszkóppal kapott sűrűségeket Student segítségével hasonlítottuk össze's t-próba. Ahol szignifikancia volt megfigyelhető, az adatokat osztályoztákFifiszerk. mint *p < 0.05 and **p < 0.01. All A statisztikai elemzéseket Microsoft Excel programmal végeztük kiegészítvea kiegészítő szoftverpluszStatcel 3 (OMS, Tokió, Japán) és JSTAT for Windows(Nankodo, Tokió, Japán).


Jelentés összefoglalója

A kutatás tervezésével kapcsolatos további információk a Természetkutatásban találhatókJelentés összefoglalója ehhez a cikkhez kapcsolódik.


AZ ADATOK ELÉRHETŐSÉGE

A jelenlegi vizsgálat során keletkezett adatkészletek elérhetők a levelezőbőlésszerű kérésre.



IRODALOM

1. Brenner, S. The genetics ofCaenorhabditis elegans. Genetika 77, 71–94 (1974).
2. Riddle, DL, Blumenthal, T., Meyer, BJ, Priess, JR (szerk.).C. elegans II. (HidegTavasz Kikötő Laboratórium Press, Hideg Tavasz Kikötő, 1997).
3. Herndon, LA et al. A sztochasztikus és genetikai tényezők befolyásolják az öregedés szövetspecifikus csökkenésétC. elegans. Természet 419, 808–814 (2002).
4. Klass, MR Öregedés a fonálférgébenCaenorhabditis elegans: az élettartamot befolyásoló fő biológiai és környezeti tényezők.Mech. Aging Dev. 6, 413–429 (1977).
5. Son, HG, Altintas, O., Kim, EJE, Kwon, S. & Lee, SV Age-dependent changes and biomarkers of aging inCaenorhabditis elegans. Öregedő sejt 18, e12853 (2019).
6. Yoshino, J., Mills, KF, Yoon, MJ & Imai, S. Nikotinamid-mononukleotid, kulcsfontosságú NAD(plusz) intermedier, az étrend és az életkor által kiváltott cukorbetegség patofiziológiáját kezeli egerekben.Cell Metab. 14, 528–536 (2011).
7. Denzel, MS, Lapierre, LR és Mack, HID Feltörekvő témák ittC. elegansöregedéskutatás: transzkripciós szabályozás, stresszreakció és epigenetika.Mech. Age ing Dev. 177, 4–21 (2019).
8. Ikeda, T., Yasui, C., Hoshino, K., Arikawa, K. & Nishikawa, Y. InFLFLa tejsavbaktériumok hatása a hosszú élettartamraCaenorhabditis elegansés a házigazda Salmonella elleni védekezésbélben oldódóEnteritidis szerovariáns.Appl. Environ. Microbiol. 73, 6404–6409 (2007).
9. Komura, T., Ikeda, T., Yasui, C., Saeki, S. & Nishikawa, Y. Mechanism underlying pro-longevity induced by bifidobaktériumCaenorhabditis elegans. Biogerontológia 14, 73–87 (2013).
10. Clark, LC & Hodgkin, J. Commensals, probiotics and patogens in theCae Caenorhabditis elegansmodell.Cell Microbiol. 16, 27–38 (2013).
11. Cabreiro, F. & Gems, D. A férgeknek is szükségük van mikrobákra: mikrobiotára, egészségre és öregedésreCaenorhabditis elegans. EMBO Mol. Med. 5, 1300–1310 (2013).
12. Kim, Y. & Mylonakis, E.Caenorhabditis elegansImmunkondicionálás probiotikus baktériummalLactobacillus acidophilusNCFM törzs fokozza a Gram-pozitív immunválaszokat.Megfertőzni. Immun. 80, 2500–2508 (2012).
13. Gerstbrein, B., Stamatas, G., Kollias, N. & Driscoll, M. In vivo spektrofluorimetriaendogén biomarkereket tár fel, amelyek egészségi állapotról és táplálkozási korlátozásokról számolnak beCaenorhabditis elegans. Öregedő sejt 4, 127–137 (2005).
14. Coburn, C. et al. Antranilátfluoreszcenciakalcium által terjesztett nekrotikus hullámot jelez, amely elősegíti a szervezet halálátC. elegans. PLoS Biol. 11, e1001613 (2013).
15. Pincus, Z., Mazer, TC & Slack, FJ AutoFLFLuoreszcencia mint az öregedés mértékeC. elegans: nézzen pirosra, ne kékre vagy zöldre.Öregedés (Albany NY) 8, 889–898 (2016).
16. Sebekova, K. & Sebekova, KB Glikált fehérjék a táplálkozásban: barát vagy ellenség?Exp. Gerontol. 117, 76–90 (2019).
17. Giacco, F. & Brownlee, M. Oxidatív stressz és diabéteszes szövődmények.Circulation Res. 107, 1058–1070 (2010).
18. Srikanth, V. et al. Fejlett glikációs végtermékek és receptoruk RAGE Alzheimer-kórban's betegsége.Neurobiol. Öregedés 32, 763–777 (2011).
19. Zhuo, Q., Yang, W., Chen, JY & Wang, Y. A metabolikus szindróma találkozik az osteoar thritissel.Nat. Rev. Rheumatol. 8, 729–737 (2012).
20. Gkogkolou, P. & Bohm, M. Fejlett glikációs végtermékek: kulcsszereplők a bőr öregedésében?Dermatoendokrinol 4, 259–270 (2012).
21. Liu, J. et al. A fejlett glikációs végtermékek receptora elősegíti a koraia proximális tubuláris epiteliális sejtek öregedése az endoplazmatikus aktiválás révénretikulum stressz-függő p21 jelátvitel.Cell Signal 26, 110–121 (2014).

22. Mendler, M., Schlotterer, A., Morcos, M. & Nawroth, PP A diabéteszes polyneuropathia és a hosszú élettartam megértése: mit tanulhatunk a fonálféregtőlCae norhabditis elegans? Exp. Clin. Endokrinol. Cukorbetegség 120, 182–183 (2012).


Kérdezz többet:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950


























Akár ez is tetszhet