A bakteriális külső membrán hólyagok transzkripciós eltolódást indukálnak az Arabidopsisban az immunrendszer aktiválása felé, ami a kórokozó növekedésének gátlásához vezet a Plantában
Nov 21, 2023
Absztrakt
A Gram-negatív baktériumok gömb alakú hólyagokat képeznek sejtperifériájukon, amelyek később disszociálnak a bakteriális sejtfalról és extracelluláris vezikulákat képeznek. Ezekről a nanoméretű struktúrákról, amelyeket külső membrán-vezikuláknak (OMV-k) neveznek, kimutatták, hogy elősegítik a fertőzést és a betegségeket, és tipikus immunrendszert indukálhatnak mind emlős, mind növényi gazdaszervezetben. Annak érdekében, hogy jobban megértsük, hogy a növények milyen széles körű transzkripciós változásokon mennek keresztül az OMV-nek való kitettséget követően, az Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) palántákat a Gram-negatív növényi patogén Xanthomonas campestris pv baktériumból tisztított OMV-ekkel kezeltük. campestris-ben, és RNS-seq analízist végeztünk OMV-n és ál-kezelt növényeken 2, 6 és 24 órával a fertőzés után. A legkifejezettebb transzkripciós eltolódás az első két vizsgált időpontban következett be, amint azt a differenciálisan expresszált gének száma és az átlagos hajtásváltozás tükrözi. Az OMV-k jelentős transzkripciós eltolódást indukálnak az immunrendszer aktiválása felé, felszabályozva az immunrendszerrel kapcsolatos folyamatok sokaságát, beleértve számos immunreceptort. Az Arabidopsis OMV-ekre és tisztított elicitorokra adott válaszának összehasonlítása során kiderült, hogy az OMV-k hasonló gén- és útvonal-készletet indukálnak, mint az egyedi kiváltók, azonban olyan útvonalakat észleltek, amelyeket OMV-k aktiváltak, és nem más elicitorok. Az Arabidopsis növények OMV-vel történő előkezelése, majd bakteriális kórokozóval való megfertőzése a kórokozók növekedésének jelentős csökkenését eredményezte. A növényi elongációs faktor receptor (EFR), flagellin receptor (FLS2) vagy a brassinoszteroid-érzéketlen 1-asszociált kináz (BAK1) koreceptor mutációi nem befolyásolták szignifikánsan az OMV-k immunindító hatását. Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy az OMV-k széles körű transzkripciós eltolódást indukálnak az Arabidopsisban, ami több immunpálya felszabályozásához vezet, és hogy ez a transzkripciós változás elősegítheti a bakteriális fertőzésekkel szembeni rezisztenciát.
KULCSSZAVAK
Arabidopsis thaliana, bakteriális fertőzés, extracelluláris vezikulák, OMV-k, külső membrán vezikulák, növényi immunitás, RNS-seq, Xanthomonas campestris pv. campestris
A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert
1. BEMUTATKOZÁS
A növények folyamatosan szembesülnek káros mikrobákkal, amelyek a szöveteiken szaporodnak, és akadályozzák a normális növekedést. A hatékony védekezési válasz nagymértékben függ a behatoló mikroba gyors és pontos felismerésétől és azonosításától. Ebből a célból a növények széles körű felügyeleti rendszereket alkalmaznak a kórokozók inváziójának nyomon követésére (Cook et al., 2015). A feltételezések szerint a növény megfigyelőrendszerének első vonala, vagy az első sejtfelület, ahol a növények és a mikrobák kölcsönhatásba lépnek, az intercelluláris tér, az apoplaszt. Ott a behatoló mikrobák felismerését membránhoz kötött, extracellulárisan exponált mintázatfelismerő receptorok (PRR-ek) közvetítik (Boutrot és Zipfel, 2017; Couto és Zipfel, 2016). A PRR-ek felismerik a mikrobiális determinánsokat, amelyek széles körben jelen vannak és sok mikroba között konzerváltak, és amelyek mikrobákkal vagy kórokozókkal kapcsolatos molekuláris mintázatok (MAMP) néven ismertek (Ranf et al., 2016). Mivel a mikrobák gyors mutagenezisen mennek keresztül, az evolúciós szempontból hasznos immunreceptorok alkalmasak arra, hogy felismerjék a kulcsfontosságú mikrobiális komponensek erősen konzervált régióit, amelyeket nem lehet könnyen eldobni vagy mutálni a komoly alkalmassági költségek miatt. Például a bakteriális flagellin számos mikroba, köztük kórokozók fiziológiájában kulcsfontosságú elem, és jelenleg az egyik legjobban tanulmányozott MAMP (Felix és mtsai, 1999; Zipfel és mtsai, 2004). A flagellin vagy a szintetikus flg22 epitóp (amely a flagellum építőelemének, a flagellinnek a N-terminálisán található, erősen konzervált 22 aminosavból áll) a rokon növényi immunreceptor flagellin-érzékelő 2 (FLS2) általi észlelése jelentős transzkripciós változáshoz vezet. , amit egy hatékony immunválasz követ, amely megállítja a fertőzést (Chinchilla et al., 2007; Gómez-Gómez és Boller, 2000). Számos ismert MAMP kapcsolódik a mikroba sejtfalához. Például gombás kitin (Fesel és Zuccaro, 2016), bakteriális peptidoglikán (PG) (Erbs et al., 2008; Gust és mtsai, 2007), bakteriális lipopoliszacharidok (LPS) (Dow és mtsai, 2000; Silipo et al. ., 2005), flagellin (Boutrot és Zipfel, 2017; Felix és mtsai, 1999) stb. Mindazonáltal nem egészen világos, hogy ezek a sejtfalhoz kapcsolódó komponensek hogyan lépnek kölcsönhatásba rokon immunreceptoraikkal a növényben. Az, hogy ez a sejthalál és/vagy a sejtfal degradációja miatt, vagy olyan komponensek aktív felszabadulásával történik, mint a flagellum, további vizsgálatot igényel (Bahar, 2020).
A sejtfalfragmensek Gram-negatív baktériumok általi aktív felszabadulásának egyik példája az extracelluláris vezikulák (EV-k) leválása, amelyek a külső membránról a környező környezetbe hömpölyögnek és kicsípődnek (Kulp és Kuehn 2010; Théry et al., 2018). ). Ezeket a bakteriális EV-ket általában külső membrán vezikuláknak (OMV) nevezik, és ezentúl ragaszkodunk ehhez a nómenklatúrához (Schwechheimer és Kuehn, 2015). Az OMV felszabadulási folyamata folyamatosan és különböző környezeti feltételek között megy végbe, így a gazdatelepülés során is (Gurung et al., 2011; Ionescu et al., 2014; Jin et al., 2011). Az integrált külső membránmolekulák, mint például a külső membrán (OM) fehérjék, LPS és lipidek mellett az OMV-k periplazmatikus folyadékokat is kapszuláznak, amelyek különböző molekulákból állnak, mint például fehérjék, sejtfalbontó enzimek, poliszacharidok és nukleinsavak (Kuehn & Kesty, 2005). Mivel az OMV-k a gazdatelep kolonizációja során szabadulnak fel, és rakományuk MAMP-okból áll, csábító az a feltételezés, hogy immunkiváltók hordozóiként működnek, amelyek a kiváltó molekulákat a rokon immunreceptorok közvetlen közelében szállítják (Bahar, 2020; Katsir és Bahar, 2017). Valójában az OMV-kről kimutatták, hogy mind az emlősök, mind a növényi immunrendszert indukálják, amikor bemutatják gazdáiknak (Bahar és mtsai, 2016; Ellis és Kuehn, 2010; Janda és mtsai, 2021; McMillan és mtsai, 2021). Míg emlős sejtekben az OMV-k LPS- és fehérjekomponensei egyaránt immunkiváltóként működnek (Ellis és mtsai, 2010), addig növényekben még nem világos, hogy mely OMV-molekulák az elsődleges immunkiváltók.
A gazdaszervezet immunválaszának modulálása mellett az OMV-kről kimutatták, hogy virulencia faktorokat hordoznak, és számos folyamatban vesznek részt. Ez magában foglalja a sejt-sejt kommunikációt (Deatheragea és Cooksona, 2012; Mashburn és Whiteley, 2005; Raposo és Stahl, 2019), a toxinok célsejtekhez való eljuttatását (Ellis és Kuehn, 2010; Kadurugamuwa és Beveridge, 1996), a biofilm képződését (Schooling). és Beveridge, 2006), az antimikrobiális vegyületek kioltása (Manning és Kuehn, 2011), a stresszre adott válasz (MacDonald és Kuehn, 2013), a horizontális géntranszfer (Fulsundar és mtsai, 2014; Velimirov és Ranftler, 2018) és a virulencia (Ellis) & Kuehn, 2010; Kunsmann et al., 2015). Míg ezeknek a példáknak a többsége emlős bakteriális kórokozók vizsgálatából származik, a növényi patogén baktériumokkal végzett legújabb vizsgálatok azt is alátámasztják, hogy az OMV-k elősegítik a baktériumok virulenciáját és a növények kolonizációját. Ionescu et al. (Ionescu és mtsai, 2014) kimutatták, hogy a Xylella fastidiosa növényi kórokozó által a xilémedények kolonizációja során kialakuló OMV-termelés gátolja a baktériumok kötődését a növény vízvezető elemeihez (a xilémhez), megbillentve az egyensúlyt a nyálkahártya ülő és mozgékony formája között. kórokozó a mobil forma felé. Úgy gondolják, hogy ez a forma elősegíti a sejt diszperzióját a xilémben, ami a növény gyorsabb hanyatlásához vezet (Ionescu és mtsai, 2014). Két másik tanulmány kimutatta, hogy a virulencia faktorok, például a II-es típusú lipázok/észteráz és xilanáz, valamint a III-as típusú effektorok szekretálódnak az OMV-kkel kapcsolatban (Chowdhury és Jagannadham, 2013; Sidhu és mtsai, 2008; Solé et al. ., 2015), ami arra utal, hogy az OMV-nek fontos szerepe lehet a bakteriális virulenciában. Az OMV-k molekuláris komplexitása, valamint a gazdaszervezetben előforduló kettős és esetleg ellentétes funkciói (immunitást indukálva és virulenciát elősegítve) arra késztet bennünket, hogy tanulmányozzuk az Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) növények OMV-fertőzésre adott szélesebb transzkripciós válaszát, és teszteljük, hogy ez a transzkripciós változás rezisztenciát vagy érzékenységet váltana ki a későbbi bakteriális fertőzésekkel szemben.
2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
2.1 Növényanyag és növekedési feltételek
Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) vad típusú Col-0 vonalat, valamint a következő mutáns vonalakat: bak- (Schlesinger et al., 2011) és falls ever (Nekrasov et al., 2009) használtuk ebben a vizsgálatban. Az Arabidopsis magvakat felületi sterilizálás után Murashige és Skoog (MS) agarlemezekre vetettük a leírtak szerint (Bahar et al., 2016). A lemezeket sötétben, 4 °C-on tartottuk 2–4 napig, majd 22 °C-ra helyeztük a csírázáshoz 5–8 napig. A hasonló méretű kicsírázott palántákat 1 ml MS táptalajt tartalmazó, 1% (w:v) szacharózt (Duchefa Biochemie) tartalmazó 24-lyuk lemezekre helyeztük (2 palánta lyukonként), és további 8-10 napig növesztettük ugyanazok a körülmények, mielőtt az alábbiakban leírtak szerint provokáltuk az elicitorral. Az alapozó vizsgálatokhoz az Arabidopsis vad típusú Col-0 vonal magjait és a mutáns vonalakat (esik és visszaesik) a fent leírtak szerint csíráztattuk, majd 7 × 7 × 6 cm-es cserepekbe ültettük át (1 palánta/cserep), amely keveréket tartalmazott. talaj Green #7611 (Evenari, Ashdod, Izrael) és 9,5 órás fotoperiódusban termesztik 22–24 °C-on. Növények voltak
2.2 Bakteriális külső membrán hólyagok tisztítása
A Xanthomonas campestris pv. glicerinkészletei. campestris(Xcc) 33913 törzset Nutrient Agar (Difco, NA, Becton, Dickinson és Company) lemezekre csíkoztunk, és 2-5 napig 28 °C-on növesztettük. Egyedülálló telepeket gyűjtöttünk össze, és egy 10 ug/ml cefalexin-hidrátot (Cp, Sigma-Aldrich) tartalmazó 3- ml YEB (élesztőkivonat-leves) starter beoltására használtuk. A startereket egy éjszakán át 28°C-on, 185–200 fordulat/perc rázatással növesztettük, majd 500 ml PSB (pepton szacharóz táptalaj) antibiotikumokkal való beoltására használtuk (a fent leírtak szerint) 2-l-es lombikokban. ~1:1000 (v:v) arányban. A tenyészeteket a fent leírtak szerint 0,6–0,8 OD600-ra növesztjük, majd a baktériumsejteket centrifugáljuk, és a felülúszóból az OMV-ket a leírtak szerint extraháljuk (Mordukhovich & Bahar, 2017). A nyers OMV-készítményt ezután Optiprep gradiens centrifugálásnak vetettük alá, hogy tisztított OMV-ket kapjunk a leírtak szerint (Bahar et al., 2016; Mordukhovich & Bahar, 2017). Minden OMV tételt 15-l baktériumtenyészetből tisztítottunk, és végül 1 ml PBS-ben (pH 7,3) újraszuszpendáltuk. A tisztított OMV-ket azonnal felhasználtuk, vagy 4 °C-on tároltuk 7 napig felhasználás előtt. Az OMV-k méreteloszlását dinamikus fényszóró berendezéssel (Zetasizer Nano ZS, Malvern Panalytical, Worcestershire, UK) mértük, átlagos átmérője 121,7 ± 55,43 nm (SD). A részecskekoncentrációt hasonló módon mértük, és az alábbi kísérleti leírásokban szerepel.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
2.3 Arabidopsis palánta kihívás OMV-kkel
Az Arabidopsis OMV-fertőzésre adott transzkripciós válaszának vizsgálatához Col{0}} palántákat használtunk, amelyeket 24-lyuklemezeken neveltek a fent leírtak szerint. Az OMV-fertőzés előtti napon az MS táptalajt eltávolítottuk a lemezekről, és 250 ul steril dH2O-val helyettesítettük, és a lemezeket egy éjszakán át a padon hagytuk. Másnap reggel 20 ul tisztított OMV-t (30 ug/ml, ami 1,44 × 109 részecskének felel meg üregenként) vagy steril dH2O-t adtunk minden egyes lyukba. A palántákat a fertőzés után 2, 6 és 24 órával összegyűjtöttük, papírra töröltük, és folyékony nitrogénnel gyorsan lefagyasztottuk 2- ml Eppendorf Safe-Lock csövekben (Hamburg, Németország). Minden időpontban négy OMV-kezelt és négy ál-kezelt lyukat gyűjtöttünk, amelyek minden egyes kezeléshez négy biológiai ismétlést képviselnek minden időpontban.
2.4 RNS tisztítás
Arabidopsis palántákból TRIzol reagenssel (Invitrogen) vontuk ki az RNS-t a gyártó utasításai szerint. Az RNS-t tovább tisztítottuk a Turbo DNS-mentes Kit (Ambion, Thermo Fisher Scientific) és az RNA Clean-Up and Concentration Kit (Norgen Biotek) segítségével a gyártó utasításai szerint. A tisztított RNS mintákat koncentráció- és minőségelemzésnek vetettük alá TapeStation 2200 gép (Agilent Technologies), RNA Screen Tape és RNA Screen segítségével.
2.5 RNS-könyvtár felépítése és szekvenálása
Minden kezeléshez és időponthoz két, a legmagasabb tisztaságú mintát választottunk ki elemzésre. A kiválasztott RNS-mintákból PolyA-befogású TruSeq mRNS könyvtárakat (Illumina) állítottunk elő a Weizmann Institute of Science (Rehovot, Izrael) Crown Institute of Genomics-ban. Minden mintát megjelöltek, és a mintákból egy poolot készítettek. Ezt a készletet ezután két NGS-sávba töltöttük be, és az Illumina HiSeq szekvenálógépben futtattuk, nagy kimeneti üzemmódban, egyszeri leolvasás (SR) 60 (v4).
2.6 A szekvenálás beolvassa a kezdeti feldolgozást
The raw sequence reads were cleaned with Trimmomatic software v 0.36 (Bolger et al., 2014), removing low-quality reads and remaining adapter sequences. The clean reads were mapped to the reference Arabidopsis TAIR10 reference genome (Lamesch et al., 2012) using bowtie2 (Langmead & Salzberg, 2012) and quantification of gene expression was done using RSEM (Li & Dewey 2011). Principal component analysis and sample correlation matrix were calculated with the function cor() and pre-comp (), respectively, of the R base package version 3.6.1. DEGs were determined using the DESeq2 tool (Love et al., 2014). The FDR (false discovery rate) cutoff chosen was FDR < 0.05. The LogFC (Log of the fold change) cutoff for the up-regulated and the downregulated genes, was >
2.7 Génontológiák és génleírások
A génontológiákat (GO) a TAIR GO Annotations (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp) segítségével kértük le. A génmodellek szerinti génleírásokat a TAIR génleíró keresésével (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/genes/) kaptuk. A GO dúsítását az AgriGO webeszköz (http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php) segítségével számítottuk ki, referenciaként Arabidopsis genomlókuszt (TAIR10) használva.
2.8 Kvantitatív-PCR és RNS-seq validálás
Az RNS-seq adatok validálásához ál- és OMV-fertőzött palánták RNS-mintáit használtuk a cDNS-szintézishez, majd kvantitatív PCR-t (qPCR) végeztünk génspecifikus primerekkel (S4. táblázat), a leírtak szerint (Bahar et al. , 2016). Összességében az RNA-seq adatkészletből 17 DEG-et teszteltünk, OMV-vel vagy ál-kezelt palánták RNS-ének négy biológiai replikációjával. A tesztelt gének relatív expresszióját az ubiquitin expressziójával hasonlítottuk össze egy 7500 Fast valós idejű PCR gép (Applied Biosystems) segítségével, a leírtak szerint (Bahar et al., 2016).
2.9 Az Arabidopsis transzkripciós válaszának összehasonlítása MAMP-okkal és OMV-kkel
OMV-indukált adatkészletünket összehasonlítottuk az flg22-vel, (Denoux et al., 2008), elf26-tal (Zipfel és mtsai, 2006), PGN-nel (Willmann és mtsai, 2011), OG-val (Davidsson és mtsai.) fertőzött Arabidopsis rendelkezésre álló transzkriptómáival. , 2017) és LPS (Livaja et al., 2008). Az adatok összehasonlításához a GO kifejezések dúsítását végeztük, és az indukált GO-kat Venn-diagramokkal vizualizáltuk a fent leírtak szerint.
2.10 Arabidopsis alapozó kísérletek
Az Xcc OMV-k priming hatásának tesztelése Pseudomonas syringae pv-vel fertőzött Arabidopsis-re. paradicsom DC3000 (Pst), a Zipfel és munkatársai által leírt eljárást követtük. (2004). Röviden, a fent leírt módon nevelt 6–8 hetes Arabidopsis növények leveleit 50–100 ul tisztított Xcc OMV-vel (30 ug/ml, ami 3.6-7.2 × 109 részecskének felel meg) infiltráltuk. levélenként), 1 μM flg22-t vagy vizet tű nélküli fecskendővel. Minden kezeléshez 5 levelet/növényt és három növényi ismétlést használtunk. A Pst oltóanyagot úgy állítottuk elő, hogy a baktériumot King's B tápközeg lemezeken (20 g/l pepton, 1,5 g/l MgSO4 x7H2O, 10 ml/L glicerin és 15 g/l agar) tenyésztettük 28 ˚C-on 2-3 napig. majd a telepeket vízzel reszuszpendáljuk, és az inokulum koncentrációját 105 CFU/ml-re állítjuk be. Pst oltóanyagot infiltráltunk az alapozott levelekbe 24 órával az alapozást követően, tű nélküli fecskendővel (körülbelül 100 ul-t infiltráltunk minden levélbe). A baktériumok szaporodását 0-nál (1 órával az oltás után) és 2 nappal az oltás után (dpi) határoztuk meg úgy, hogy összegyűjtöttük és lemértük a beoltott leveleket, 1 ml 10 mM MgCl2-ban maceráltuk, és 10-szeres sorozathígításokat szélesztettünk King's-re. B agar lemezek. Az egyes lemezeken lévő CFU számát 2 nappal később határoztuk meg, és gramm levélre vonatkoztattuk.
1. ÁBRA Arabidopsis transzkripciós válasz OMV-kre a 2., 6. és 24. napon a fertőzés után. Az Arabidopsis palánták OMV-re adott transzkripciós válaszának főkomponens-analízise (A) és mintakorrelációs mátrixa (B) a fertőzés után 2, 6 és 24 órával
2.11 In vitro bakteriális növekedési vizsgálatok
A tisztított Xcc OMV-k in vitro Pst növekedésre gyakorolt hatásának felmérésére Pststartereket King's B folyékony tápközegben tenyésztettünk 24 órán át 28 °C-on, majd három különböző tenyészet beoltására használtuk, amelyek mindegyike 12 ml King's B táptalajt tartalmazott {{3 }}mL Falcon csövek 1:100 arányban. A bakteriális tenyészeteket 30 ug/ml OMV-vel (1:50 vagy 1:100, ami 1,44 × 109 vagy 7,2 × 108 részecskék/ml-nek felel meg) vagy PBS-sel kiegészítettük kontrollként, és 20 órán át 28 °C-on inkubáltuk. A baktériumok szaporodását spektrofotométerrel (Amersham Biosciences) mértük 600 nm optikai sűrűségnél (OD) 22 órán keresztül.
3 EREDMÉNY
3.1 Az RNS-seq analízis feltárja az Arabidopsis gének nagy csoportját, amelyek eltérően expresszálódnak OMV-fertőzésre válaszul
Az Arabidopsis OMV-fertőzést követő transzkripciós változásának tanulmányozására Arabidopsis palántákat kezeltünk a Xanthomonas campestris pv bakteriális kórokozóból tisztított OMV-vel. campestris 33913 (Xcc), és növényi RNS-t gyűjtöttünk a fertőzés után 2, 6 és 24 órával (hpc). Ezután az OMV-vel és az ál-kezelt mintákból származó RNS-t szekvenáltuk és elemeztük az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint. A fő korrelációs (1A. ábra) és a mintakorrelációs mátrixelemzések (1B. ábra) azt mutatják, hogy az egyes kezelési klaszterekben a biológiai ismétlődések szorosan egymás mellett mutatkoznak, ami a biológiai ismétlődések közötti transzkripciós válasz általános hasonlóságát jelzi. Az OMV-vel kezelt minták 2 és 6 hpc-vel együtt csoportosulnak, ami azt jelzi, hogy az OMV-kezelés nagyobb hatással volt a transzkripciós válaszre, mint a mintavételi idő (1B. ábra). Másrészt, az OMV-vel kezelt minták a megfelelő álkezeléssel együtt 24 hpc-nél csoportosulnak, ami azt jelzi, hogy az OMV-k által kiváltott transzkripciós változás ezen az időponton csökkent, és hasonló volt az ál-kezelt növényekéhez.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
Minden egyes tesztelt időpontban az OMV-kezelt palántákat összehasonlítottuk az ál-kezelt palántákkal, és a differenciálisan expresszált géneket (DEG) extraháltuk. Minden időpontban összesen 984 és 175 gént találtunk szignifikánsan (Log-szeres változás > 1 vagy ← 1, p érték és FDR < 0,05) felfelé vagy lefelé szabályozottnak. OMV-fertőzésre adott válaszként (2A. ábra; S1 kiegészítő táblázat). A génexpressziós log fold-change (LogFC) maximum 9,08-tól (AT1G26410, 6 hpc), ami több mint 500-szeres változásnak felel meg, a -5.73-ig (AT3G17520, 24 hpc) terjedt. A legtöbb DEG-t 2 és 6 LE-nél találtuk, ahol összesen 647, illetve 876 DEG-et azonosítottak (fel- és leszabályozott együtt). 24 LE-n 121°-ot találtak. Az OMV-fertőzés után 2 és 6 órával a felszabályozott gének több mint 50%-a megosztott volt közöttük (2B. ábra). Az időbeli génexpresszió változásának vizsgálatához kivontuk az összes olyan felszabályozott DEG-t, amelyet minden időpontban találtunk (37 gén), és összehasonlítottuk azok időbeli változását (2C. ábra). Ezeknek a géneknek a fold-change expressziója szignifikánsan eltérő volt a különböző időpontokban (egyirányú ANOVA; F2, 108=8.1633, p=0.0005). A Tukey Kramer HSD teszttel végzett post hoc összehasonlítás azt mutatta, hogy a LogFC 2 (M=3.45, SD=1.72) és 6 LE (M=3.87, SD) mellett is=1.98) szignifikánsan magasabb volt, mint 24 LE-nél (M=2.32, SD=1.31) (p=0.0145 és p=0 .0005) (2D ábra). Míg az átlagos LogFC kifejezés 6 hpc-nél magasabb volt, mint 2 hpc-nél, statisztikailag nem különbözött (p=0.5413). Ezért, ha figyelembe vesszük a DEG-ek számát és a teljes LogFC gént a három vizsgált időpontban, azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a legjelentősebb transzkripciós változás az OMV-fertőzés után 2 és 6 órával következett be. Az RNS-seq eredmények validitásának vizsgálatához 17 felfelé szabályozott gén expresszióját kvantitatív PCR-rel (qPCR) határoztuk meg specifikus primerekkel. A tesztelt gének közül 14 ugyanazt a mintát mutatta, mint az RNS-seq analízisben, és szignifikánsan felfelé szabályozott a hamisításhoz képest. A vizsgált gének közül háromnak magasabb volt a relatív expressziója, de nem különböztek szignifikánsan az ezzel a módszerrel végzett génektől (S1. ábra).
2. ÁBRA Az Arabidopsis eltérően expresszált géneket OMV-fertőzésre válaszul. (A) A differenciálisan expresszált gének (DEG) teljes száma (felfelé vagy lefelé szabályozott, LogFC > 1 vagy ← 1, p-érték és FDR < 0.05) 2-nél, 6. és 24 órával a kihívás után. (B) Átfedés a DEG-k között különböző időpontokban (balra, felfelé szabályozva; jobbra, lefelé szabályozva). (C) A mindhárom időpontban talált, fokozottan szabályozott géneket LogFC expressziós grafikonon ábrázoltuk, amely a génexpressziót mutatja az idő függvényében. (D) Az összes DEG logFC átlaga különböző időpontokban. A különböző betűk statisztikai különbséget jeleznek p < 0,05 mellett a Tukey-Kramer HSD teszttel
3.2 Az Arabidopsis az OMV-ekre az immunrendszer aktiválása felé irányuló transzkripciós eltolódással reagál
Az OMV kihívás által jelentősen érintett Arabidopsis útvonalak azonosítására az AgriGO webeszközt használtuk (Du et al., 2010; Tian et al., 2017). 333, illetve 55 szignifikánsan (FDR < 0,05) felfelé és lefelé szabályozott génontológia (GO) kifejezést azonosítottunk minden időpontban, az OMV-fertőzésre adott válaszként. A fokozottan szabályozott GO-k közel 25%-a a növény ingerre adott válaszához kapcsolódott (3A. ábra). Az „ingerre adott válasz” kategóriában a legdominánsabb GO kifejezések a stresszreakcióhoz, a biotikus ingerekre, a vegyszerekre és az endogén ingerekre vonatkoztak (3B. ábra; S2 kiegészítő táblázat). Az AgriGO eszköz 103 jelentősen felszabályozott molekuláris funkciót is azonosított, beleértve a „transzferáz-aktivitást”, „kináz-aktivitást”, „transzkripciós faktor-aktivitást”, „ion- és fémion-kötést”, „szénhidrát-kötést”, „fehérje-kötést”, „katalitikus aktivitást”. , „Adenil nukleotid kötés”, „transzmembrán receptor aktivitás” és további kötési funkciók (S2 kiegészítő táblázat). A szignifikáns kifejezések celluláris elhelyezkedése a sejt különböző részeiben volt, beleértve a sejtmagot, a vakuólumot és az endomembrán rendszert, de leginkább a sejt perifériájához kapcsolódott, és magában foglalta a „plazmamembránt”, „extracelluláris régiót”, „sejtfalat” és 'apoplast' ontológiák (S2 kiegészítő táblázat). A jelentősen leszabályozott GO-k viszont magukban foglalták a „toxin-katabolikus és anyagcsere-folyamat”, „víz- és vízhiányra adott válasz”, „lipidtranszport és lokalizáció” és más kifejezéseket (S2 melléklet). A biotikus ingerekre adott válaszhoz kapcsolódó GO-k nem gazdagodtak a leszabályozott génekben. A jelentősen leszabályozott molekuláris funkciók között számos redox kifejezés szerepelt, mint például az „oxidoreduktáz aktivitás”, „hemkötés”, „vasion-kötés”, „lipidkötés”, „oxigénmegkötés” és több oxigénnel kapcsolatos funkció (S2 kiegészítő táblázat). . A leszabályozott terminusok szintén az extracelluláris régióban helyezkedtek el. Annak meghatározásához, hogy a legmagasabb kifejezéssel rendelkező DEG-ek mely GO-kifejezésekhez tartoznak, az eredeti DEG-listát úgy szűrtük ki, hogy kiválasztjuk azokat a géneket, amelyek LogFC értéke 4-nél nagyobb, vagy -4-nál kisebb (ez 16-szeres különbségnek felel meg) . 117 gént azonosítottunk, amelyek megfeleltek ezeknek a kritériumoknak, amelyek közül 115 volt minden időpontban felfelé és 2 leszabályozott. Mivel a kevés lefelé szabályozott gének LogFC-je kisebb, mint -4, nem azonosítottak szignifikánsan elnyomott GO-kat. Másrészt 72 jelentősen felülszabályozott GO-t azonosítottak, amelyek közül a legjelentősebbek a „külső biotikus ingerre adott válaszhoz”, „más organizmusokra adott válaszhoz”, „sejtek oxigénszintre adott válaszához”, „védelmi válaszhoz” kapcsolódnak. , „stresszre adott válasz” és több immunrendszerrel kapcsolatos GO (3C. ábra).
3. ÁBRA Arabidopsis génontológia (GO) kifejezések, amelyek az Xcc OMV-fertőzésre adott válaszként feldúsultak. A kategóriaeloszlás kördiagram-ábrázolása a felülszabályozott biológiai folyamat (A) és az ingerekre adott válasz (B) GO kifejezésekben. (C) Az OMV-fertőzésre adott válaszként 4-nél nagyobb logFC-értékkel rendelkező Arabidopsis-gének listája. A géneket kiszűrtük a DEG-ek teljes adatkészletéből, és az AgriGo webeszköz segítségével azonosították a dúsított GO kifejezéseket. FDR határérték < 0.05
3.2 Az OMV-fertőzés az immunreceptorok fokozott szabályozásához vezetett
A MAMP érzékelését és a növény MAMP-okra adott válaszát nagyrészt membránhoz kötött PRR-ek közvetítik, amelyek közvetítik a kórokozó észlelését és a fertőzés hatékony mérséklését. A PRR-eket általában két csoportba sorolják: receptorkinázok (RK-k) és receptorszerű fehérjék (RLP-k) (Boutrot és Zipfel, 2017). Az OMV-kre adott válaszként eltérően kifejezett PRR-ek azonosításához DEG-készletünket összehasonlítottuk az Arabidopsis RK-k (Kemmerling és mtsai, 2011; Mott és mtsai, 2016) és az RLP-k (Wang és mtsai, 2008) korábban létrehozott listáival. Adatkészletünkben 33, illetve 10 fokozottan szabályozott RK-t és RLP-t azonosítottunk minden időpontban együtt (1. táblázat). A 175 lefelé szabályozott gént tartalmazó listánkban nem találtunk RK-t vagy RLP-t. Kemmerling et al. (2011) 49 RK-ból álló listát határoztak meg, amelyek expresszióját szignifikánsan indukálták az olyan MAMP-ok, mint az flg22 és az NLP (nekrózist és etilént indukáló peptid 1-szerű fehérje), vagy a kórokozókezelés. Összehasonlítottuk ezt a listát a kísérletünkből származó, fokozottan szabályozott RLK-kkal, és azt találtuk, hogy a Kemmerling és munkatársai által meghatározott RK-k 45%-a. (2011) OMV-kra adott válaszként is indukáltak. Ezek közül kiemelendő az FRK1, SOBIR1, SERK4, RLK/IKU2, PSKR1, HAESA, EFR, BIR és IOS1 (1. táblázat). Az RK-csoport közül az FRK1-nek volt a legmagasabb expressziója 2 és 6 hpc mellett, 7,11 és 5,2 LogFC-vel, míg az összes RK átlagos LogFC értéke 2,11 és 2,13 volt 2 és 6 hpc mellett. Míg a membránhoz kötött RK-k és RLP-k többnyire a behatoló mikrobák extracelluláris érzékelését közvetítik, a nukleotidkötő hely-leucinban gazdag ismétlődés (LRR) receptorok (NLR) intracelluláris immunreceptorok. 7 különböző NLR-gént találtunk az OMV-kihívás hatására 2 és 6 hpc-nél, 24 hpc-nél egyet sem találtunk (az NLR listát a TAIR-ből kinyertük, 102 gén) (1. táblázat).
A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert
3.3 Az OMV-k több WRKY transzkripciós faktor expresszióját indukálják
Úgy találták, hogy a WRKY transzkripciós faktorok (TF-ek) szerepet játszanak a növényi immunválaszokban, részt vesznek mind a MAMP-triggered immunity (MTI), mind az effektor által kiváltott immunitási (ETI) válaszokban (Birkenbihl et al., 2018; Rushton et al., 2010). ). Az OMV-fertőzés 20 különböző WRKY TF (a lista a TAIR-ből kinyert, 70 gén) upregulációjához vezetett csak 2 és 6 HPC-n (1. táblázat). A WRKY TF-ek hiányoztak a lefelé szabályozott génkészletünkből. Az OMV kihívás által érintett TF-ek másik családja a MYB domént tartalmazó fehérjék (Tsuda és Somssich, 2015), amelyekről ismert, hogy több folyamatban vesznek részt, beleértve a biotikus és abiotikus stresszeket (Ambawat et al., 2013). Összességében 9 különböző MYB TF (a lista a TAIR-ből kivont, 211 gén) expresszálódott eltérően az OMV-fertőzés hatására, 5 felfelé és 4 lefelé szabályozott (1. táblázat). A differenciálisan kifejeződő TF-ek további osztályait, amelyeket észleltünk, az 1. táblázat sorol fel.
3.4 Az Arabidopsis OMV-re adott transzkripciós válaszának összehasonlítása a tisztított MAMP-okra adott válaszokkal
A tisztított elicitorra adott Arabidopsis válasz és a nyers és molekulárisan összetett szerkezet – OMV-k – közötti különbségek megismerése érdekében RNS-seq adatainkat összehasonlítottuk az Arabidopsis ismert MAMP-okra adott transzkriptomikai adataival, beleértve az flg22-t (Denoux et al., 2008) elf26. (Zipfel és mtsai, 2006), PGN (Willmann és mtsai, 2011), OGs (Davidsson és mtsai, 2017) és LPS (Livaja et al., 2008). A dúsított GO-kat kivontuk a fent említett adatkészletekből a fent leírtak szerint (S3 kiegészítő táblázat), és összehasonlítottuk az OMV-fertőzést követően dúsított GO-kkal. Általában az OMV-k által indukált Arabidopsis GO kifejezések hasonlóak voltak az egyedi, fehérjetartalmú és nem fehérjetartalmú MAMP-ok által indukáltakhoz, az OMV-indukált GO-k 56, 51 és 47%-át osztották meg az flg22, elf26 és PGN által indukált GO-kkal. Másrészt az indukált GO-k között kisebb átfedés volt megfigyelhető az LPS-sel és az OG-vel, amelyek aránya 24, illetve 33% volt az OMV-indukált GO-kkal (4A. ábra). Nevezetesen, a patogenezishez kapcsolódó 1 (PR1) gén (At2g14610), amely az LPS-indukált immunválaszok ismertetőjele (Silipo és mtsai, 2005, 2008), minden vizsgált időpontban hiányzott az OMV-indukált génlistáról. Negyvenegy GO-t az OMV indukált, és nem az itt tesztelt többi MAMP (4B. ábra). Ez a lista tartalmazta az „apoptózissal”, „gyógyszerre adott válaszreakcióval”, „kábítószer-transzporttal és „multi-drog-transzporttal” és „lipázaktivitással” kapcsolatos GO-kat (S3 kiegészítő táblázat, csillaggal és félkövér betűtípussal jelölve).
3,5 OMV-k indukálják az Arabidopsis rezisztenciát a bakteriális fertőzésekkel szemben
Itt és korábban (Bahar et al., 2016) bizonyítékot szolgáltattunk arra vonatkozóan, hogy az Arabidopsis immunrendszerét OMV-fertőzés indukálja. Annak vizsgálatára, hogy ez az OMV által közvetített immunindukció hatékony immunválaszsá alakul-e, egy planta bakteriális növekedési tesztet alkalmaztunk (Zipfel és mtsai, 2004), amelyben az Arabidopsis növényeket OMV-vel előkezelték, majd bakteriális beoltással. Jelentős, több mint 10--szeres csökkenés a Pseudomonas syringae pv. A paradicsom DC3000 (Pst) CFU/g levél mind az OMV-, mind az flg{6}}előkezelt növényekben megfigyelhető volt, összehasonlítva az ál-előkezeléssel, két nappal az oltás után (5A. ábra). A Pst in vitro növekedését nem befolyásolta negatívan az OMV-k táptalajhoz való hozzáadása, ami arra utal, hogy a csökkent Pst növekedés a plantában összefügg az OMV indító hatásával, és nem az OMV-k közvetlen hatása a baktériumokra (Sup. ábra). S2). Annak tesztelésére, hogy az OMV által kiváltott Pst-rezisztenciát az FLS2, EFR vagy BAK1 közvetíti-e, megismételtük ezt a kísérletet Col-0 bakmutánssal, és a kettős mutáns vonal az efr-re esik. Mindkét mutáns vonal esetében az OMV előkezelés a Pst CFU/g levél szignifikáns csökkenését eredményezte az álkezelt növényekhez képest (5B-C. ábra). Ahogy az várható volt, az flg22-vel kezelt fls efr és bakmutáns vonalak hasonló Pst-titerekkel rendelkeztek, mint a kezeletlen növények, mivel ismert, hogy nem reagálnak az flg22-re. Ahhoz, hogy összehasonlíthassuk a kórokozó titerének relatív csökkenését a Col{20}}-ben az immunreceptor-mutáns vonalak zuhanásaival és bakjaival előállított növényekben, három független kísérletben kiszámítottuk a Pst-titer különbségét OMV-vel és álkezelt növényekben (Supp. S3 ábra). A Pst titer átlagos csökkenése az OMV-előkezelt hátsó növényekben kisebb volt, mint a Col-0 növényekben megfigyeltnél (0,89 vs. 1,14 log CFU/gr levélcsökkenés bak és Col{30}} esetében, egy- mód ANOVA; F2, 4=4.3781, p=0.0523). Nem tapasztaltunk hasonló csökkenést az fls efr mutáns vonalnál (1,26 vs. 1,32 log CFU csökkenés fls efr és Col{41}} esetén, egyirányú ANOVA: F1, 4=0.0352, p=0.5698) (5D-E ábra).
1. táblázat OMV-indukált RK-k/RLP-k és immunrendszerrel kapcsolatos transzkripciós faktorok Arabidopsis palántákban
1. TÁBLÁZAT (Folytatás)
1. TÁBLÁZAT (Folytatás)
4. MEGBESZÉLÉS
A bakteriális külső membrán vezikulák (OMV) összetett nanostruktúrák, amelyek a bakteriális külső membránból származnak, és fehérjék százaiból és más sejtfalkomponensekből állnak. Korábban kimutatták, hogy az Arabidopsis növények az OMV-fertőzésre olyan tipikus immunválaszok aktiválásával reagálnak, mint a ROS burst, az immunmarker génexpresszió és a tápközeg lúgosítása (Bahar et al., 2016). Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk az Arabidopsis bakteriális OMV-kre adott szélesebb körű transzkripciós válaszát és a későbbi fertőzésekre gyakorolt hatását. Az ebben a vizsgálatban elvégzett RNS-seq adatelemzések átfogó következtetése az, hogy az Arabidopsis immunrendszer a Xanthomonas campestris pv.campestris (Xcc) OMV-vel való érintkezést követően aktiválódik. Ezt a következtetést különálló és egymást kiegészítő elemzések támasztják alá. Először is, az Xcc OMV-knek kitett növényekben a génontológia (GO) feldúsulása egyértelműen azt mutatja, hogy az Arabidopsis az OMV-ket stresszorként érzékeli. A növényi válasz sejtes elhelyezkedése elsősorban a sejtperifériával függött össze, ami a kihívást jelentő anyag, az OMV-k külső sejtes érzékelésére utal. Ez tovább támasztja azt az elképzelést, hogy az OMV-ket és alkotórészeiket az extracelluláris receptorok érzékelik, hasonlóan sok ismert MAMP-hoz. Másodszor, észrevettük, hogy az RK-k és RLP-k nagy készlete fel van szabályozva az OMV kihívására válaszul. E receptorok közül sokról ismert, hogy közvetítik a kórokozó észlelését, vagy korábban kimutatták, hogy a növényi immunválaszhoz kapcsolódnak. Az FLG22-indukált receptorszerű kináz 1 (FRK1) volt a leginkább indukált receptor. Ez azért érdekes, mert nem tudtuk kimutatni a flagellint az Xcc OMV proteomikai elemzésünkben (az adatokat nem mutatjuk be). Ismeretes, hogy az FRK1-et más immunelicitorok is indukálják, de érdekes, hogy expressziója miért magasabb, mint a többi, itt fokozottan szabályozott RK-é. Az elongációs faktor receptor (EFR) expressziója viszont csak a 2 órás időpontban volt szignifikánsan felszabályozva, és logFC értéke 1,12 volt, annak ellenére, hogy az EF-Tu megtalálható az Xcc OMV-kban (Bahar et al., 2016). ). Találtunk néhány NLR-gént is, amelyek az OMV-fertőzés hatására felfelé szabályozottak, amelyek fele betegségrezisztens fehérjeként van feltüntetve, de a növényi immunitásban való funkciójukat nem írták le. Bár nem feltételezzük, hogy az NLR-ek közvetlenül részt vesznek az OMV észlelésében, indukálhatók az RK/RLP-k OMV-molekulák érzékelése után, amint azt a tisztított MAMP-okra, például az flg22-re, elf18-ra és LPS-re adott válaszként is megfigyelték (Denoux et al., 2008). Livaja és mtsai, 2008; Zipfel és mtsai, 2006). Harmadszor, számos immunrendszerrel kapcsolatos transzkripciós faktort, a WRKY-t, a MYB-t és másokat jelentősen felszabályozták az OMV-k (Bjornson et al., 2021). Vizsgálatunkban az OMV-re adott fő transzkripciós változás az első két időpontban (2 és 6 hpc) következett be. Ezt szemlélteti mind a szignifikánsan nagyobb számú, differenciálisan expresszált gének (DEG), mind a szignifikánsan magasabb Log foldchange (LogFC) 2 és 6 hpc-nél. Mindazonáltal a 24 LE-n talált összesen 121 DEG-nek csaknem a felét (52) nem találták meg 2 vagy 6 LE-n. Ez arra utal, hogy a 24 hpc-nél a DEG-ek fele későn szabályozott gének, amelyek expressziója 6 hpc-nél később volt felfelé vagy lefelé szabályozva. Valójában korábban azonosítottak olyan Arabidopsis géneket, amelyek eltérő expressziós dinamikájúak az előhívó kihívásokat követően (Bjornson et al., 2021).
4. ÁBRA A dúsított génontológia (GO) kifejezések összehasonlítása OMV-re és egyetlen tisztított MAMP-re adott válaszban. A MAMP kihívásra válaszul Arabidopsis expressziós adatkészleteket (elf26, flg22, OGs, PGN és LPS; hivatkozásokért lásd az Anyagok és módszerek szakaszt) használtuk a dúsított GO-k kinyerésére az AgriGo webes eszköz segítségével. Az egyes MAMP-ok dúsított GO-készleteit összehasonlítottuk a dúsított GO-listával az OMV-k hatására, Venny segítségével (A és S3 kiegészítő táblázat). A csak az OMV adatkészletekben dúsított GO kifejezések a (B) részben FDR-értékük szerint vannak rendezve.
Vizsgálatunkban az OMV-re adott fő transzkripciós változás az első két időpontban (2 és 6 hpc) következett be. Ezt szemlélteti mind a szignifikánsan nagyobb számú, differenciálisan expresszált gének (DEG), mind a szignifikánsan magasabb log-szeres változás (LogFC) 2 és 6 hpc-nél. Mindazonáltal a 24 LE-n talált összesen 121 DEG-nek csaknem a felét (52) nem találták meg 2 vagy 6 LE-n. Ez arra utal, hogy a 24 hpc-nél a DEG-ek fele későn szabályozott gének, amelyek expressziója 6 hpc-nél később volt felfelé vagy lefelé szabályozva. Valójában korábban azonosítottak olyan Arabidopsis géneket, amelyek eltérő expressziós dinamikájúak az előhívó kihívásokat követően (Bjornson et al., 2021). Az itt látott gyors és többnyire átmeneti génexpressziós mintázat összhangban van más tanulmányokkal, amelyek az Arabidopsis MAMP-okra adott időbeli válaszát tesztelték. Például Denoux és mtsai. (2008) és Bjornson et al. (2021) kimutatták, hogy az Arabidopsis transzkripciós változása a különféle MAMP-okra válaszul perceken vagy órákon belül következik be, és a legtöbb esetben a DEG-ek a növényi fertőzést követő 24 órán belül visszatérnek az alapszintre. Ellentétben a növény és a kórokozó közötti kölcsönhatásokkal, ahol a kölcsönhatás dinamikus és folyamatos, ha nem élő mintával, például tisztított MAMP-vel vagy OMV-vel támadják, várható, hogy a növény válasza, legalábbis transzkripciós szinten, átmeneti lenne, és nem tartana fenn napokon át. Az elmúlt három évtized intenzív kutatásai több növényi immunreceptort tártak fel, amelyek felelősek a mikrobák felismeréséért. Ezen receptorok közül sok képes kimutatni egyetlen mikrobiális jellemzőt, és részletesen tanulmányozzák őket, hogy jobban megértsék a kórokozó észlelését, az immunrendszer jelzéseit, valamint a modell- és haszonnövények válaszát. A növények azonban egyszerre vannak kitéve különböző forrásokból származó mikrobiális tulajdonságoknak, amelyek összetettebbé teszik az immunrendszer észlelését és válaszát. Arra voltunk kíváncsiak, hogy az Arabidopsis szingulárisan tisztított MAMP-okra és OMV-kre adott transzkripciós válasza milyen különbségeket mutat, amelyek természetesebb és összetettebb mikrobiális szerkezetet képviselnek, de magától a mikrobától bizonyos fokú komplexitást eltávolítanak. Az OMV-k virulencia faktorokat, degradatív enzimeket, toxinokat és más biomolekulákat hordoznak, amelyek funkcionális szerepet játszhatnak a baktériumok növekedésében a növényben, ezért érdekes volt megvizsgálni, hogy az OMV-fertőzés egyedi GO-kat indukál-e, amelyeket nem indukálnak szintetikus MAMP-ok.
5. ÁBRA Az Arabidopsis levelek OMV-vel történő előkezelése rezisztenciát vált ki a későbbi bakteriális fertőzésekkel szemben. A Col-0 növényeket (A) előkezeltük OMV-vel, vízzel (mock) vagy flg22-vel kontrollként, majd 24 órával később 105 CFU/ml Pst DC3000 szuszpenzióval oltottuk be tű nélküli fecskendős infiltrációval. . A beoltott levelekben a Pst DC3000 sejttitert a beoltás után 48 órával határoztuk meg sorozathígítású lemezekkel. Az Arabidopsis Col{8}} és fls efr (B) vagy bak (C) növényeket az (A) pontban leírthoz hasonló kísérletben teszteltük. Összehasonlították az OMV előkezelést követő átlagos Log Pst DC3000 CFU/gr csökkenést (a kezeletlen növényekkel összehasonlítva) a Col{10}} és az efr (D), valamint a Col-0 és vissza (E) esetében. Mindegyik oszlop az átlagos Log Pst DC3000 CFU/gr csökkenést jelenti három független kísérletből (a független kísérletek adatait a mellékelt S3. ábra mutatja be). A különbségek statisztikailag nem voltak szignifikánsak (kétfarkú diák t-próba. p értékek a grafikon oszlopai felett vannak feltüntetve). Az A, B és C kísérleteket legalább háromszor végezték el hasonló eredménnyel (minden kísérletben kezelésenként 3 növény/ismétlés). A csillagok (**) szignifikáns különbséget jeleznek a hamishoz képest (Dunnet teszt p < 0,001)
A transzkriptomikai összehasonlításhoz hasonló kísérleti körülmények között, azaz növényekben és hasonló időpontokban végzett vizsgálatok adatait gyűjtöttük össze. A GO dúsításában jelentős átfedés volt megfigyelhető az Arabidopsis OMV-re és flg22-re, elf26-ra és PGN-re adott válaszában. Ez nem váratlan, mivel ismert, hogy a kórokozó-érzékelés hatására aktiválódó védekezési útvonalak közül sok hasonló, függetlenül a specifikus kiváltótól vagy annak forrásától (Bjornson et al., 2021; Zipfel et al., 2006). Mindazonáltal kiderült, hogy néhány egyedi GO-t az OMV-k szabályoztak, nem pedig a többi általunk vizsgált MAMP. Ezek közé tartoznak a sejtfal lebomlásához kapcsolódó GO-k, mint például a „lipáz aktivitás” és a „glikozil kötésekre ható hidroláz aktivitás”, amelyek arra utalhatnak, hogy a növényvédelmi rendszer az OMV lebomlását célozza. Érdekes módon három, a kábítószer-szállítással kapcsolatos GO-ról is kiderült, hogy az OMV-kihívás egyedileg szabályozza. Ez arra utalhat, hogy a növények mérgező vegyületeket juttatnak a sejtjeikbe, talán OMV által közvetített szállítással. Ellentétben az Arabidopsis immunrendszert kiváltó peptidekre és PGN-re adott válaszával, viszonylag kis átfedést figyeltünk meg az Arabidopsis OMVs OG-kra adott válasza és az LPS között. Ez a kis átfedés, különösen az LPS-sel, némileg meglepő, tekintve, hogy az emlőssejtekben az LPS-t közismerten erősen hozzájárulnak az OMV-k által kiváltott gazdaszervezet immunválaszához (Ellis et al., 2010). Továbbá az a tény, hogy nem találtuk a PR1 LPS-immun fémjelének felszabályozását (Silipo és mtsai, 2005), arra utalhat, hogy az LPS nem fő kiváltója a növényi immunkölcsönhatásnak a bakteriális OMV-kkel. Ezt azonban alaposabban meg kell vizsgálni. Kimutatták, hogy az OMV-k hozzájárulnak mind az emlős, mind a növényi gazdaszervezet bakteriális kolonizációjához, és bizonyos esetekben a bakteriális virulenciához. Másrészt az OMV-k aktiválják a gazdaszervezet immunrendszerét, így kétélű fegyverként működnek, egyrészt elősegítik a baktériumok túlélését és virulenciáját, másrészt táplálják a gazdaszervezet megfigyelőrendszerét, és aktiválják a gazdaszervezet immunitását (McMillan és Kuehn, 2021). ). Priming vizsgálataink azt mutatták, hogy az OMV-fertőzés a Pseudomonas syringae pv jelentős gátlásához vezetett. paradicsom DC3000 (Pst) növekedése a növényben, hasonlóan a szintetikus MAMP-oknál tapasztalt priming hatáshoz (Jung et al., 2009). Ezért ebben az esetben az OMV-k előzetes beadása a beoltott szövetbe nem segítette elő a baktériumok megtelepedését, hanem a növényeket arra késztette, hogy hatékony immunválaszt váltsanak ki, amely gátolja a patogén növekedését. Ez az eredmény összhangban van transzkripciós adatainkkal és korábbi tanulmányunkkal, alátámasztva azt az elképzelést, hogy az OMV-k robusztus és hatékony immunválaszt indukálnak Arabidopsisban. Két közelmúltbeli tanulmány is kimutatta, hogy az Arabidopsis patogén vagy kommenzális Pseudomonas fajból származó OMV-vel végzett előkezelés elnyomta a későbbi Pst fertőzést (Janda és mtsai, 2021; McMillan et al., 2021). Ezek az eredmények kumulatívan azt jelzik, hogy a vizsgált körülmények között az OMV infiltráció nem segíti elő a kórokozó fertőzést. Egy korábbi tanulmányban kimutattuk, hogy több immunreceptor mutáns fenntartja a WT-reakciót az Xcc OMV-kra. Ezek a mutánsok ismert PRR-eket tartalmaztak, amelyek vagy fehérjeszerű (FLS2, EFR, RLPReMAX) vagy nem fehérjeszerű MAMP-okat (LYM1/LYM3) ismernek fel (Bahar et al., 2016). Érdekes módon Janda et al. (2021) arról számoltak be, hogy amikor az Arabidopsis (influenza) FLS2 receptor mutáns vonalát Pst-ből származó OMV-vel fertőzték meg, az FRK1 expressziója nem változott, és hasonló volt az ál-kezelt növényekhez, ami arra utal, hogy az FLS2 közvetíti a Pst OMV-ekre adott választ. Lehetséges, hogy a flagellin nagyobb mennyiségben fordul elő a Pst OMV készítményekben, mint az Xcc 33913 OMV-kben, ezért a flagellin receptor eltávolítása kifejezettebb hatással volt a növény Pst-re adott válaszára, mint az Xcc OMV-ekre.
A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert
Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez
【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Kimutatták, hogy a különböző növényi immunvizsgálatok eltérő eredményeket adhatnak, ami állítólagos ellentmondásos következtetésekhez vezet. Például kimutattuk, hogy egy levéllemezes ROS burst assay-ben az Arabidopsis OMV-ekre adott válasza az EFR-receptortól függött, azonban az Arabidopsis palántákkal végzett immunmarkergén-expressziós vizsgálatban minden mutáns vonal ugyanolyan érzékeny volt az OMV-kre, mint a WT. McMillan et al. (2021) kimutatták, hogy az OMV-ken alkalmazott különböző fizikai kezelések megszüntettek bizonyos tevékenységeket, például a palánta növekedésének gátlását. Ez azonban nem változtatott más immunrendszeri teljesítményeken, például a növényi alapozáson. Ezért fontos, hogy különféle vizsgálatokat kombináljunk a különböző immunkimenetek tesztelésére, hogy minél szélesebb képet kapjunk az adott kiváltóra adott növényi immunválaszról. Az ismert PRR-ek és társreceptorok szerepének további vizsgálata érdekében a növényi priming assay-vel teszteltük a falls ever-t és a bak mutáns vonalakat. Eredményeink azt mutatják, hogy az Arabidopsis kettős mutáns vonal esését az Xcc OMV hasonló módon aktiválta, mint a WT növényeket, ami alátámasztja azt az elképzelést, hogy a flagellin és az EF-Tu kivételével MAMP-ok is jelen vannak az Xcc 33913 OMV-ben. Immunmarker génexpressziós vizsgálatok alapján korábban azt feltételeztük, hogy a BAK1 koreceptor részt vesz az OMV észlelésében és/vagy válaszában (Bahar et al., 2016). Ebben a tanulmányban újra megvizsgáltuk ezt a javaslatot a priming assay segítségével. Itt a bak mutáns vonalat OMV előkezeléssel alapozták meg, de valamivel kisebb mértékben, mint a WT Col{8}} növények. Bár ez a határ nem volt statisztikailag szignifikáns, nagyobb volt, mint a kettős fls valaha mutáns vonal esetében. Ez az eredmény összhangban van egy nemrégiben végzett vizsgálattal is, amely kimutatta, hogy a bak mutáns vonal reagál az OMV-re, mint WT-növényekre az immunerősítő kísérletekben (Tran et al., 2021). Összességében ez arra utalhat, hogy míg a BAK1 részt vesz az OMV észlelésében, az OMV más immunérzékelési és jelátviteli útvonalakat indít el, ami hatékony immunválaszhoz és a kórokozók növekedésének elnyomásához vezet. A BAK1 és SOBIR1 korreceptorok részvétele az OMV-re adott válaszban (Bahar és mtsai, 2016) arra engedett következtetni, hogy több immunreceptor, valószínűleg PRR is részt vesz az OMV észlelésében. Egy közelmúltbeli tanulmány azonban azt sugallta, hogy az OMV-k általi növényi immunaktiváció MAMP-független lehet, és a növényi plazmamembránban az OMV integrációja által kiváltott fiziko-kémiai változások eredménye (Tran et al., 2021). Ez egy érdekes hipotézis, amellyel még foglalkozni kell. Érdekes módon McMillan et al. (2021) arról számoltak be, hogy a proteináz K-val kezelt OMV-k megőrizték immunindító képességüket, ami azt jelzi, hogy ez az aktivitás független lehet az OMV fehérjetartalmú rakományától. Bár ez az eredmény alátámaszthatja Tran és munkatársai MAMP-független immunaktivációs hipotézisét. (2021) szerint az OMV-ben jelenlévő egyéb, nem fehérjeszerű MAMP-ok, mint például az LPS és a PGN, aktiválhatják az MTI-t (Bahar és mtsai, 2016; McMillan és mtsai, 2021). Ezenkívül a proteináz K-vel kezelt OMV-k megőrizték képességüket a palánta növekedésének gátlására, ami azt jelzi, hogy a növekedésgátlás az OMV-k fehérjetartalmú rakományától függ (McMillan et al., 2021). Összességében ezek az eredmények tovább hangsúlyozzák a növény OMV-re adott válaszának összetettségét és annak fontosságát, hogy különféle kimeneteket használjunk egy adott kiváltó specifikus útvonalakban való részvételének tesztelésére.
2021-ben négy független tanulmány, köztük ez is (amely valószínűleg egyidejűleg zajlott), arról számolt be, hogy a bakteriális OMV-k modulálják a növényi immunrendszert, és hatékony választ indukálnak a kórokozók fertőzése ellen (Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021; Tran et al., 2021). Ezek az izgalmas eredmények az OMV-ket a növény-mikroba kölcsönhatások új és fontos szereplőjévé teszik, ahol még sok a tanulnivaló. Ebben a tanulmányban szélesebb képet adunk az Arabidopsis Xcc OMV-re adott transzkripciós válaszáról. Kiegészítő kutatási megközelítésekre lesz szükség az OMV-k növényi észlelésében szerepet játszó összetevők és mechanizmusok további megértéséhez.
IRODALOM
Ambawat, S., Sharma, P., Yadav, NR és Yadav, RC (2013). MYB transzkripciós faktor gének, mint a növényi válaszok szabályozói: áttekintés. Növények élettana és molekuláris biológiája, 307–321.
Bahar, O. (2020). Növényi patogén baktériumokból származó membránvezikulák és szerepük a növény-patogén kölcsönhatások során. In: M. Kaparakis-Liaskos, & TA Kufer eds. Bakteriális membrán hólyagok – Biogenezis, funkciók és alkalmazások. Springer International Publishing, Svájc, 119–129.
Bahar, O., Mordukhovich, G., Luu, DD, Schwessinger, B., Daudi, A., Jehle, AK, Felix, G. és Ronald, PC (2016). A bakteriális külső membrán vezikulák növényi immunválaszt indukálnak. Molecular Plant-Microbe Interactions, 374–384.
Birkenbihl, RP, Kracher, B., Ross, A., Kramer, K., Finkemeier, I. és Somssich, IE (2018). Az Arabidopsis WRKY szabályozó hálózat elvei és jellemzői a korai MAMP által kiváltott immunitás során. Növénylap, , 487–502.
Bjornson, M., Pimprikar, P., Nürnberger, T. és Zipfel, C. (2021). Az Arabidopsis thaliana minta által kiváltott immunitás transzkripciós tája. Természet Növények, , 579–586.
Bolger, AM, Lohse, M. és Usadel, B. (2014). Trimmomatic: Rugalmas trimmer az Illumina szekvenciaadatokhoz. Bioinformatika, 2114–2120.
Boutrot, F. és Zipfel, C. (2017). Növénymintázat-felismerő receptorok funkciója, felfedezése és kiaknázása a széles spektrumú betegségekkel szembeni rezisztencia érdekében. Annual Review of Phytopatology, 257–286.
Chinchilla, D., Zipfel, C., Robatzek, S., Kemmerling, B., Nürnberger, T., Jones, JDG, Felix, G. és Boller, T. (2007). Az FLS2 és BAK1 receptor flagellin-indukált komplexe elindítja a növény védekezését. Természet, 497–500.
Chowdhury, C. és Jagannadham, M. v. (2013). Virulencia faktorok szabadulnak fel a Pseudomonas syringae pv külső membrán hólyagjaival kapcsolatban. paradicsom T1 normál növekedés során. Biochimica Et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics,(1), 231–239.
Cook, DE, Mesarich, CH és Thomma, BPHJ (2015). A növényi immunitás megértése, mint felügyeleti rendszer az invázió észlelésére. Annual Review of Phytopatology, 541–563.
Couto, D. és Zipfel, C. (2016). A mintázatfelismerő receptor jelátvitel szabályozása növényekben. Nature Reviews Immunology, (9), 537–552.
Davidsson, P., Broberg, M., Kariola, T., Sipari, N., Pirhonen, M., & Palva, ET (2017). A rövid oligogalakturonidok patogénrezisztenciával összefüggő génexpressziót indukálnak Arabidopsis thaliana-ban. BMC Növénybiológia, 1–17.
Deatheragea, BL és Cookson, BT (2012). Membránvezikulák felszabadulása baktériumokban, eukariótákban és archaeákban: A mikrobiális élet konzervált, de alulértékelt aspektusa. Fertőzés és immunitás, 1948–1957.
Denoux, C., Galletti, R., Mammarella, N., Gopalan, S., Werck, D., De Lorenzo, G., Ferrari, S., Ausubel, FM és Dewdney, J. (2008). Védelmi válaszútvonalak aktiválása OG-ok és Flg22 kiváltók által Arabidopsis palántákban. Molekuláris növény, 423–445.
Dow, M., Newman, M.-A. és von Roepenack, E. (2000). A növényi védekezési válaszok indukálása és modulálása bakteriális lipopoliszacharidok által. Annual Reviews of Phytopatology, 241–261.
Du, Z., Zhou, X., Ling, Y., Zhang, Z., & Su, Z. (2010). agriGO: GO elemző eszköztár a mezőgazdasági közösség számára. Nucleic Acids Research, W64–W70.
Ellis, TN és Kuehn, MJ (2010). A bakteriális külső membrán vezikulák virulenciája és immunmoduláló szerepe. Mikrobiológiai és Molekuláris Biológiai Szemle, 81–94.
Ellis, TN, Leiman, SA és Kuehn, MJ (2010). A Pseudomonas aeruginosa természetes úton előállított külső membrán-vezikulái erős veleszületett immunválaszt váltanak ki a lipopoliszacharid és a fehérje komponensek kombinált érzékelésével. Fertőzés és immunitás, 3822–3831.
Erbs, G., Silipo, A., Aslam, S., de Castro, C., Liparoti, V., Flagiello, A., Pucci, P., Lanzetta, R., Parrilli, M., Molinaro, A. , Newman, M.-A. és Cooper, RM (2008). Az Agrobacterium és Xanthomonas kórokozókból származó peptidoglikán és muropeptidek növényi veleszületett immunitást váltanak ki: szerkezet és aktivitás. Kémia és Biológia, 438–448.
Felix, G., Duran, JD, Volko, S. és Boller, T. (1999). A növények érzékeny érzékelési rendszerrel rendelkeznek a bakteriális flagellin legkonzerváltabb tartományára. Növénylap, 265–276.
Fesel, PH és Zuccaro, A. (2016). -glükán: A gomba sejtfalának kulcsfontosságú összetevője és a növényekben megfoghatatlan MAMP. Gombagenetika és Biológia, 53–60
Fulsundar, S., Harms, K., Flaten, GE, Johnsen, PJ, Chopade, BA és Nielsen, KM (2014). Az Acinetobacter baylyi külső membrán vezikulumainak génátviteli potenciálja és a stressz hatása a vezikulációra. Alkalmazott és környezeti mikrobiológia, 3469–3483.
Gómez-Gómez, L., & Boller, T. (2000). FLS2: LRR-receptor-szerű kináz, amely részt vesz az Arabidopsis bakteriális kiváltó flagellinjének észlelésében. Molecular Cell, 1003–1011.
Gust, AA, Biswa, R., Lenz, HD, Rauhut, T., Ranf, S., Kemmerling, B., Gotz, F., Glawischnig, E., Lee, J., Felix, G. és Nürnberger , T. (2007). A bakteriális eredetű peptidoglikánok kórokozókkal összefüggő molekuláris mintákat alkotnak, amelyek veleszületett immunitást váltanak ki az Arabidopsisban. Journal of Biological Chemistry, 32338–32348.
Ionescu, M., Zaini, PA, Baccari, C., Tran, S., da Silva, AM és Lindow, SE (2014). A Xylella fastidiosa külső membrán vezikulák modulálják a növény kolonizációját azáltal, hogy blokkolják a felületekhez való kötődést. Proceedings of the National Academy of Sciences of Amerikai Egyesült Államok, E3910–E3918.
Janda, M., Ludwig, C., Rybak, K., Meng, C., Stigliano, E., Botzenhardt, L., Szulc, B., Sklenar, J., Menke, FLH, Malone, JG, Brachmann, A., Klingl, A. és Robatzek, S. (2021). Biofizikai és proteomikai elemzések a Pseudomonas syringae pv paradicsom DC3000 extracelluláris vezikulák funkcióira utalnak a baktériumok növekedésében a növényi fertőzés során. bioRxiv, 2021.02.08.430144.