Hálózati farmakológia és állatkísérletek alapján a Cistanche Tubulosa fenil-etanol-glikozidjának a diabéteszes nephropathia hatására gyakorolt ​​hatásának feltárására

Absztrakt: Cél A hatás feltárásaCistanchefeniletanol-glikozidok(CPhGs) bekapcsolvadiabéteszes vesebetegség(DKD) hálózati farmakológia és állatkísérletek alapján. Módszerek Az UHPLC-QE-MS módszerrel elemeztük aa CPhG-k kémiai összetevői. TCMSP és Swiss Target Prediction adatbázisokat használtunk az alapvető összetevők szűrésére. OMIM és GeneCards adatbázisokat használtunk a DKD-vel kapcsolatos célpontok megszerzésére. A közös célok elérése után a STRING webhelyet használták fel egy fehérjeinterakciós hálózat felépítésére. A DAVID adatbázist használták a GO-hoz, a KEGG útvonalelemzést, a Cytoscape szoftvert pedig a "CPhGs core komponent-target-pathway" hálózat felépítéséhez. Tíz patkányt választottunk véletlenszerűen normál csoportként, a fennmaradó patkányokat magas cukor- és zsírtartalmú takarmányokkal etettük, és egyetlen intraperitoneális STZ-injekciót kaptunk a DKD modell létrehozása érdekében. Modellcsoportra, dapagliflozin (1 mg/kg) csoportra, valamint magas, közepes és alacsony dózisú CPhG-csoportokra osztották (500, 25{{40}}, 125). mg/kg) csoportok, 10 állat minden csoportban, gyógyszeres beavatkozás 6 hétig, általános állapotok megfigyelése, testsúly meghatározása és vércukorszint mérése minden héten; 24 órával vizeletet gyűjtöttünk az utolsó adag után. 24-óra összes vizeletfehérje (24-UTP) kimutatása; vért gyűjteni a hasi aortából és feláldozni, szétválasztani a szérumot, és kimutatni a karbamid-nitrogént (BUN), a húgysavat (UA), az összkoleszterint (TC), a trigliceridet (TG) és a magas vérnyomást. A veseszövet kóros elváltozásainak megfigyelésére nagy sűrűségű lipoprotein (HDL) és alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) szintet, HE-festést és Masson-festést, a szérum IL-1, IL{{17} kimutatására ELISA-t alkalmaztak. } és TNF-szinteket, valamint Western blot-ot használtunk a veseszövet kimutatására. JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, SOCS3 fehérje expressziója. Eredmények Összesen 699 komponenst detektáltunk az UHPLC-QE-MS technológiával. A szűrést követően a CPhG-k 16 fő összetevőjét és 323 kapcsolódó célpontot kaptunk. A CPhG-k és a DKD 99 célpontot osztottak meg. A fő célpontok a STAT3, SRC, EGFR stb. voltak. A KEGG útvonalelemzés 151 jelátviteli útvonalat vizsgált meg, kimutatva, hogy az IL-17 jelátviteli útvonal, a PI3K/Akt jelút, a TNF jelátviteli útvonal stb. kulcsszerepet játszhat a DKD kezelése CPhG-kkel. A CPhG-k növelhetik a DKD patkányok testtömegét (P＜0,01), csökkenthetik a vízfogyasztást (P＜0,01), szabályozhatják a glükóz- és lipidanyagcserét, csökkenthetik az 24-UTP- és BUN-szinteket (P＜0,01), valamint javíthatják a veseszövetet. . A patológiás károsodás csökkentette a p-JAK2/JAK2 és p-STAT3/STAT3 fehérje expresszióját a veseszövetben (P＜0,01), és növelte a SOCS3 fehérje expresszióját (P＜0,01). Következtetés A CPhG-k több komponensen, több célponton és több útvonalon keresztül avatkoznak be a DKD-be, esetleg a JAK2/

STAT3 jelátviteli útvonal.

Kulcsszavak: Cistanche feniletanol-glikozid; diabéteszes nefropátia; UHPLC-QE-MS; hálózati farmakológia; állatkísérlet; JAK2 /STAT3 jelzési útvonal

MENNYI IDEIG TELJES, HOGY A CISTANCHE MŰKÖDIK A VESEBETEGEKNÉL?

Diabéteszes vesebetegség (DKD), mint a cukorbetegség egyik legfontosabb mikrovaszkuláris szövődménye, nemcsak az elsődleges tényező, amely akrónikus vesebetegséghanem a végstádiumú vesebetegség (ESRD) fő oka is világszerte. Ok [1-2]. A DKD klinikai kezelése elsősorban a vércukorszint, a vérnyomás és a vérzsírszint szabályozását, másodsorban a vesefunkció védelmét, a nefrotoxikus gyógyszerek alkalmazásának elkerülését és az életmód javítását foglalja magában [3-4]. A DKD összetett patogenezise és a konkrét beavatkozási célok hiánya miatt azonban a jelenlegi kezelési lehetőségek korlátozottak és nem hatékonyak. A végstádiumú DKD előfordulása továbbra is növekszik. Ezért nagyon fontos, hogy hatékony természetes gyógyszereket találjunk.

Cistanche Deserticola Y. C． Ma vagyCistanche C.A szárított húsos száraCistanche tubulosa (Schenk) Wightpikkelyes levelekkel [5] először a "Shen Nong's Materia Medica"-ban jegyezték fel, és a legjobb minőségűek közé sorolták. „Sivatagi ginzeng” néven ismertek [6]. Édesek, sósak és melegek. , visszatér a vese és a vastagbél meridiánjaiba, és vese yang tápláló, esszenciát és vért pótló, beleket nedvesítő és hashajtó hatása van. A kutatások azt mutatják, hogy a fenil-etanoid-glikozidok (CPhG-k) az egyik fő hatóanyaga, és felelősek a fejlődéséért.

A farmakológiai hatások kifejtésének anyagi alapja; A Cistanche kivonat cukorbetegség ellenes [7-8], májrákellenes [9], vesevédő [10-11], neuroprotektív [12-13] és egyéb farmakológiai hatásokkal rendelkezik, de jelenleg a CPhG-k nem hatékonyak a DKD kezelésében. Hatásai és mechanizmusai nem tisztázottak.

Ez a tanulmány hálózati farmakológiai és molekuláris dokkolási módszereket [14] használt, a CPhG-ket vették kutatási tárgynak, előre jelezték és elemezték fő hatóanyagait és lehetséges célpontjait a DKD kezelésében, majd létrehozták a streptozocin (STZ) által indukált magas. A lipidtáppal táplált DKD patkánymodellt in vivo kutatások tárgyaként használták, hogy referenciaként szolgáljanak a kapcsolódó kezelések klinikai kiterjesztéséhez és alkalmazásához, valamint a hatásmechanizmus további kutatásához.

1 anyag

1.1 Állatok

70-Hetes, SPF-szintű, testtömegű (240±20) g hím SD patkányokat a Xinjiang Orvosi Egyetem Állatkísérleti Központjától vásároltunk [SYXK számú kísérleti állathasználati engedély (új) {{4} }], at Az állatokat adaptívan neveltük 1 hétig (22 ± 2) fokos hőmérsékleten, 50% és 70% közötti relatív páratartalom mellett, és 12 óra/12 órás váltakozó világos és sötét ciklusban. A kísérletet a Hszincsiangi Orvosi Egyetem Orvosi Kísérleti Állatközpontjának Állat-etikai Bizottsága hagyta jóvá (etikai szám: IACUC-20220127-19).

1.2 Reagensek és gyógyszerek

CPhGs (batch number 201610, purity >80%-át a Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. biztosította. A Dapagliflozint (sz. NB2248) az AstraZenecától (UK) vásároltuk. A magas cukor- és zsírtartalmú takarmányt (katalógusszám: Boaigang-B1135DM) és az STZ-t (tételszám: 2021110307) a Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.-től vásárolták; vizelet mikroalbumin (20220611 gyártási szám), karbamid-nitrogén (20220626 gyártási szám), húgysav (20220613 gyártási szám), összkoleszterin (20220615 gyártási szám), trigliceridek (20220615 tételszámú), trigliceridek (20220616 tételszámú 20220616), 0 magas 2-protein20 ), és az alacsony sűrűségű lipoproteint (20220615 tételszám) a Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute-tól vásárolták; interleukin-6 (IL-6, tételszám: JL20896), interleukin-1 (IL-1, tételszám: JL20884) és tumornekrózis faktor- (TNF-, tételszám: 13202 ) a Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd.-től vásárolták; JAK2 nyúl poliklonális antitest (lot number 22v9316), p-JAK2 nyúl poliklonális antitest (tétel száma 78g9360), STAT3 nyúl poliklonális antitest (tétel száma 15x8824), p-STAT3 nyúl poliklonális antitest (tétel száma 74mLOCSalt (nyúl 74mlont3 antitest) 31d4841) mind a Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd.-től vásárolták; A HRP-vel jelölt kecske anti-nyúl IgG poliklonális antitestet (20000758 tételszám) a Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.-től vásároltuk; -aktin nyúl monoklonális antitestet (gyártási szám: AC230205001), RIPA lízispuffert (20220416 tételszám), BCA fehérjekoncentráció-meghatározó készletet (20230401 tételszám) a Beijing Solebao Technology Co., Ltd.-től vásároltunk.

1. 3 Műszerek

Vanquish ultra-nagy teljesítményű folyadékkromatográfia, Q Exactive Focus nagyfelbontású tömegspektrométer, Heraeus Fresco17 centrifuga, FC automatikus mikrolemez-leolvasó (Thermo Fisher Scientific, USA); JXFSTPRP-24 daráló (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Mingche D24 UV tisztavízmérő (Németország Merck Millipore Company); ACQUITY UPLC BEH C18 oszlop (1,7 μm, 2,1 mm×100 mm) (American Waters Company); Accu Chek Performa vércukormérő (Swiss Roche Company); CM1850UV kriosztát, DM300 függőleges fluoreszcens mikroszkóp (Leica Company, Németország); GL-88B örvénymérő (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); elektronikus analitikai mérleg (Bio-Rad Company, USA).

2 módszer

2. 1 UHPLC-QE-MS elemzés

2.1.1. Vizsgálati oldat elkészítése

Mérjünk le 100 mg CPhG-t, adjunk hozzá 500 μL 80%-os metanolt, 30 másodpercig vortexeljük, ultrahangos kezelést végezzünk jeges vízfürdőben 1 órán át, hagyjuk állni -40 fokon 1 órán át, centrifugáljuk 4 fokon. , 12 000 fordulat/perc 15 percig, szívja ki a felülúszót, 0. Szűrje át egy 22 μm-es mikroporózus membránon, és tárolja -80 fokos hűtőszekrényben.

2.1.2 Kromatográfiás körülmények

ACQUITY UPLC BEH C18 oszlop (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm); mozgófázisú acetonitril (A) -1% hangyasav (B), gradienselúció (0-11 perc, 15-75% A; 11-12 perc, 75-98% A; 12-14 perc, 98% A 14-14,1 perc, 98% - 15% A 14,1-15 perc, 15% A); Térfogatáram 0 . 5 ml/perc; oszlop hőmérséklete 35 fok; injekció térfogata 5 μL.

2.1.3 Tömegspektrometriai feltételek

teljes szkennelés ddMS2 teljes keresési mód; köpenygáz térfogatáram 45 arb; segédgáz térfogatáram 15 arb; kapilláris hőmérséklet 400 fok ; ütközési energia NCE módban 15% ~ 30% ~ 45% ciklus; permetezési feszültség ± 4. 0 kV.

2.2 Hálózati farmakológiai kutatás

2. 2. 1 CPhG

Komponens cél szűrése: Az UHPLC-QE-MS módszerrel elemzett kémiai komponenseket relatív tartalom szerint válogatja, és törölje azokat, amelyek kémiai szerkezetét még nem határozták meg. Írja be a szűrt összetevők InChIKey sorozatszámát a TCMSP adatbázisba, hogy megkapja az egyes összetevők farmakokinetikai paramétereit. Az orális biohasznosulás (OB) > 30% és a gyógyszerszerűség (DL) > 0,18 feltételei alapján a követelményeknek megfelelő jelölteket szűrik. Adja meg az egyes komponensek SMILES számát a Swiss Target Prediction adatbázisban a cél előrejelzéséhez, és megkapja a CPhGs kémiai komponens célpontját.

2. 2. 2 DKD

Betegségcélpont-szűrés Használja a "diabetikus nephropathia" keresőkifejezést a betegség célpontjainak kereséséhez az OMIM, GeneCards és NCBI adatbázisokban.

2. 2. 3 Komponens-cél-betegség hálózatépítés

A CPhG-komponensek és betegségek keresztcélpontjait R szoftveres leképezéssel kaptuk meg, a Cytoscape 3.7.2 szoftverrel pedig egy komponens-cél hálózati rendszert építettünk fel, amelyben az elemző beépülő modul magcélpontokat észlelt.

2. 2. 4 Fehérje-fehérje interakciós hálózat (PPI) felépítése

Importálja a komponensek és betegségek metszéspontjában lévő célfehérjéket a STRING adatbázisba, hozzon létre egy fehérje-fehérje interakciós hálózatot (PPI), törölje a hálózatba kapcsolt csomópontok nélküli fehérjéket, és állítsa be a legalacsonyabb fehérjeinterakciós pontszám megbízhatósági szintjét {{1} értékre. }.700. Építsen fel egy PPI-hálózatot, töltse le a TSV formátumú eredményeit, importálja azokat a Cytoscape 3.7.2 szoftverbe, és használja az elemző beépülő modult a további alapvető célok megjelenítéséhez.

2. 2. 5 GO, KEGG elemzés

Használja a DAVID adatbázis Funkcionális megjegyzések szakaszát az összetevőbetegségek metszéspontjainak dúsítási elemzéséhez. Először állítsa be az elemzési paramétereket, írja be a metszéspontot a Génlista mezőbe, válassza ki a hivatalos génszimbólumot célazonosítóként, válassza ki a Génlistát adattípusként (Listatípus), majd válassza ki a "Homo Sapiens (faj)" lehetőséget. célforrás (Faj). Race)", az elemzési paraméterek megerősítése után indítsa el az elemzést, szerezze meg a GO és KEGG elemzési eredményeket, majd használja az ImageGP online rajzplatformot a KEGG és GO elemzési eredmények buborékdiagramjának megrajzolásához. A Cytoscape 3.7.2 szoftver összeállítja az összetevőt -target-pathway hálózati kép.

2. 2. 6 Molekuláris dokkolás

Először töltse le a hatóanyag 3D szerkezeti diagramját SDF formátumban a PubChem adatbázisból, majd töltse le a metszéspont 3D szerkezeti diagramját PDB formátumban az US Global Protein Database (PDB) kínálatából, végül töltse fel a CB-Dockba. webhely a molekuláris dokkoláshoz. Szűrje le a domináns dokkolókonformációkat, és jelenítse meg őket a Pymol segítségével.

2.3 Állatkísérletek

2.3.1 Modellezés, csoportosítás és gyógyszerbeadás

1 0 patkányt véletlenszerűen választottunk ki normál csoportba, és közönséges takarmányt etettek, a fennmaradó patkányokat pedig magas cukor- és zsírtartalmú takarmányokkal etettük. 6 hét elteltével egyszeri intraperitoneális injekciót adtak be nekik 30 mg/kg STZ-t (0,1 mmol/L STZ pH 4,5-ös nátrium-citrát pufferben oldva), majd 72 órával később vért vettek a farokvénából. az éhomi vércukorszint (FBG) kimutatására. Ha az FBG nagyobb vagy egyenlő, mint 16,7 mmol/l, a diabétesz modellt sikeresen létrehozták [15]; folytatás 2 hétig magas cukor- és zsírtartalmú takarmányt kaptak. A DKD-modellezés sikeresnek bizonyult a vizelet glükóz-pozitivitása és az 24-óra összes vizeletfehérje (24-UTP) alapján, amely 20 mg-nál nagyobb vagy egyenlő. Közülük 3-an meghaltak a modellezés során, 7-en pedig sikertelenek voltak. , összesen 50 volt sikeres. A sikeresen modellezett patkányokat véletlenszerűen felosztották a modellcsoportra, a dapagliflozin csoportra (1 mg/kg), valamint a CPhG-k magas, közepes és alacsony dózisú (500, 250, 125 mg/kg) csoportjaira. Mindegyik beadási csoportot intragasztrikusan adtuk be. A normál csoport és a modellcsoport patkányai megfelelő gyógyszert kaptak, a normál csoport és a modellcsoport patkányai pedig ugyanannyi normál sóoldatot kaptak szondán keresztül, naponta egyszer, összesen 6 héten keresztül. A beadási időszak alatt a normál csoport kivételével a patkányok mindegyik csoportban továbbra is magas zsírtartalmú takarmányt kaptak.

2.3.2 Biokémiai indikátorok észlelése

6 hetes CPhG beavatkozás után 24-óra vizeletet gyűjtöttünk a patkányoktól, és 24-óra összes vizeletfehérjét (24-UTP) mértünk; vért vettünk az éhgyomri farokvénából az FBG szintjének kimutatására; vért vettünk a hasi aortából, 4 fok, 1500 fordulat/perc. Centrifugálja 10 percig a szérum elválasztásához és a szérum-karbamid-nitrogén kimutatásához.

BUN), húgysav (UA), összkoleszterin (TC), triglicerid (TG), nagy sűrűségű lipoprotein (HDL), alacsony sűrűségű lipoprotein (alacsony sűrűségű lipoprotein LDL) szintje.

2.3.3 A veseszövet patológiás morfológiájának megfigyelése

A patkányokat nátrium-pentobarbitállal elaltattuk és leöltük. A veséket lehúztuk, lemértük, 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk, dehidratáltuk, átlátszók, viaszba mártották, beágyazták és metszetekre vágták a hematoxilin-eozin (HE) festéshez.

A Masson-festést követően mikroszkóp alatt megfigyeltük a szövet morfológiáját, és Image-Pro Plus 6.0 szoftvert használtunk az integrált optikai sűrűség elemzésére és a relatív kollagénrost területének számszerűsítésére.

2, 3. 4 ELISA

A módszert a szérum gyulladásos faktorok szintjének kimutatására használták patkányokban. Az IL-6, IL-1 és TNF-szinteket a kit utasításai szerint észlelték.

2. 3. 5 Western blot módszer a kapcsolódó fehérje expresszió kimutatására

Patkány veseszövetet vettünk, RIPA lizátumot adtunk hozzá a teljes fehérje extrakciójához, és a koncentrációt BCA módszerrel határoztuk meg.

Nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézis után PVDF membránra vigyük át, majd blokkolást követően JAK2 (1:2000), p-JAK2 (1:1000), STAT3 (1:2000), p-STAT3 (1:2000), SOCS3 (1:2000), -aktin (1:2000) antitestek, inkubáljuk 4 fokon egy éjszakán át, adjunk hozzá HRP-vel jelölt IgG másodlagos antitestet (1:5000), és inkubáljuk szobahőmérsékleten 1 órán át, elektrolumineszcencia készlettel kifejlesztve, exponáljuk protein gél leképezővel, Image J szoftverrel

Darabok mennyiségi elemzése. Az -aktint belső referenciaként használva a célsáv szürkeértékének és a belső referenciasávnak az aránya a relatív fehérje expresszió.

2.4 Statisztikai elemzés

Az adatokat az SPSS 25.{1}} szoftver dolgozta fel, és az adatokat (x±s) adtuk meg. A csoportok közötti összehasonlításhoz egyirányú varianciaanalízist alkalmaztunk. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.