A Diclinanona Calycina (Annonaceae) kérgéből származó benzilezett dihidroflavonok és izokinolinból származó alkaloidok és citotoxicitásuk

További információért forduljontina.xiang@wecistanche.com

Absztrakt: Diclinanona calycina RE A sült krumpli, közismertebb nevén "enviro", az Annonaceae család Brazíliában honos faja. Az Annonaceae Amazonas növényekből származó bioaktív vegyületek folyamatos kutatása során a D.calycina kérgét klasszikus kromatográfiás technikákkal vizsgáltuk, amely tizenhárom olyan vegyületet (alkaloidokat és flavonoidokat) eredményezett, amelyeket először írtak le a D. calycinában, valamint a Diclinanona nemzetségben. Ezen izolált vegyületek szerkezetét kiterjedt analízissel állapítottuk meg, 1D/2D-NMR spektroszkópiával kombinálva MS-sel. Az izolált alkaloidok a következő alosztályokba tartoznak: egyszerű izokinolin, thali online (1); aporfin, anonaine (2);oxoaporfin, liriodenin (3); benzil-tetrahidroizokinolinok, (S)-(plusz)-retikulin(4); dehidro-oxonorretikulin (3,4-dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-izokinolinil)(3-hidroxi-4-metoxifenil)-metanon)(5) );( plusz )-1S,2R-retikulin-Ng-oxid (6); és (plusz )-1S,2S-retikulin-N-oxid (7);tetrahidroprotoberberin, koreximin(8); és pavin, bisnorargemonine (9). Amíg aflavonoidoka benzilezettekhez tartoznakdihidroflavonok, izorhamnetin (10), dichamanetin (11), valamint uvarinol (12) és izouvarinol (13) keveréke. Az 5. vegyületet először írják le a szakirodalomban természetes termékként. A fő izolált vegyületek citotoxikus aktivitását rákos és nem rákos sejtvonalakkal szemben értékeltük. A vizsgált vegyületek közül a legígéretesebb eredményeket a benzilezett dihidroflavonok dichamanetin (10), valamint az uvarinol (12) és izouvarinol (13) keveréke kapta, amelyek mérsékelt citotoxikus aktivitást mutattak a vizsgált vegyületekkel szemben.rákos sejtsorok(<20.0 ug·ml-)="" and="" low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-I). A dichamanetin (11) citotoxikus aktivitást mutatott a HL-60 és a HCT116 ellen 15,78 ug·mL-I (33,70 umol·LI) és 18,99 ug∶mL- (40,56 umol) IC50 értékkel. L-), míg az uvarinol (12) és izouvarinol (13) keveréke citotoxikus aktivitást mutatott a HL-60 ellen (9,74 ug.mL-1 IC5-értékkel), a HCT116 pedig IC50-nel. értéke 17,31 ug. mL-I. Ezek a citotoxikus aktivitások egy vagy több hidroxi-benzil-csoport jelenlétének tulajdoníthatók ezekben a molekulákban, valamint annak a pozíciónak, amelyben ezek a csoportok kapcsolódnak. A retikulin, anonaine és liriodenin citotoxikus hatásait korábban megállapították, és a liriodenin a legerősebb vegyület.

Kulcsszavak: Diclinanona calycina; alkaloidok és benzilezett dihidroflavonok; citotoxikus aktivitás

Kattintson a további információkért a termékekről

1. Bemutatkozás

Az Annonaceae trópusi és szubtrópusi fák és cserjék nagy családja, amely körülbelül 112 nemzetséget és 2440 fajt foglal magában [1]. Számos faj ehető gyümölcseiről és gyógyászati ​​tulajdonságairól ismert ]2]. A korábbi fitokémiai vizsgálatok néhány Annonaceae fajjal másodlagos metabolitok különböző osztályainak izolálásához és jellemzéséhez vezettek, mint például monoterpének, diterpének, triterpének, lignánok,flavonoidok, asaron eredetű fenilpropanoidok, acetogeninek és főleg tipikus izokinolin eredetű alkaloidok [3-7]. Ezen Annonaceae fajokból izolált másodlagos metabolitok némelyike ​​fontos biológiai aktivitást mutatott, például gyulladáscsökkentő és ureázgátló tulajdonságokat [8,9], tripanocid [10,11], leishmanicid [11,12], maláriaellenes [4,13]. , antimikrobiális [4,14,15], antioxidáns és antireumatikus hatások [9,15] és különösen citotoxikus aktivitás különböző humán tumorsejtvonalakkal szemben [4,6,11,16-21].

Bár az Annonaceae családot primitív és jól tanulmányozott családnak tekintik, fajával kevés fitokémiai és/vagy farmakológiai vizsgálatot végeztek[3]. A fitokémiai és/vagy farmakológiai vizsgálatok főként az Annona, Asimina és Cananga nemzetség fajaira összpontosítottak nagy gazdasági jelentőségük miatt, valamint a Duguetia, Guatteria és Xylopia nemzetségek egyes fajaira[5]. Az elmúlt 20 év nagy növekedése ellenére a fitokémiai és farmakológiai vizsgálatok terén a vizsgált fajok száma még mindig nagyon kicsi a nagyszámú elismert fajhoz képest. Jelenleg a Web of Science, a Scopus és a SciFinder tudományos adatbázisai szerint a leírt Annonaceae fajoknak csak körülbelül 15 százaléka rendelkezik megfelelő fitokémiai és/vagy farmakológiai vizsgálattal.

A kevéssé vizsgált fajok közé tartoznak a Diclinanona Diels nemzetségbe tartozó fajok. Ez a nemzetség az Annonoideae alcsaládba tartozó Annoneae törzsbe tartozik, és csak a trópusi Dél-Amerikában (főleg az Amazonas vidékén) fordul elő. Ez egy mindössze három fajból álló nemzetség, a Diclinanona calycina(Diels)RE Fries Diclinanona matogrossensis Maas és Diclinanona tessmannii Diels, amelyek fákként fordulnak elő [22-24]. A D.calycina (szinonimája Xulopia calycina Diels) egy 8 to 30 m magas fa, közismertebb nevén "envireira" és "enviro", Brazíliában, Peruban és Venezuelában az Amazonas-medencében elterjedt [23]. A D.calycina felületileg hasonló a Xylopia-hoz a hosszúkás és keskeny szirmú virágai miatt, de különbözik a fás, nem ágaskodó, gömbölyű és vastag falú egykarmúival [23,24].

A D. calycinával végzett korábbi vizsgálatok csak farmakológiai vizsgálatokról számoltak be. Az első tanulmány a metanolos, kloroformos és vizes kivonatok antimikrobiális hatásának vizsgálatát írja le a Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Staphylococcus aureus és Candida albicans mikroorganizmusokkal szemben [gél-diffúziós módszerrel]. A második a szerves (diklór-metán: metanol 1:1) és vizes kivonatok Enterococcus faecalis mikroorganizmus elleni antimikrobiális hatásának vizsgálatáról számol be mikrodilúciós húsleves vizsgálattal (MDBA) és korong diffúziós vizsgálattal (DDA)[26]. Így az Amazonas esőerdőiből származó Annonaceae új bioaktív természetes termékeinek folyamatos keresése során jelen tanulmány célja a D.calycina kéregének fitokémiai és farmakológiai tulajdonságainak vizsgálata volt. Ebben a jelentésben tizenhárom vegyület (kilenc alkaloid és négy benzilezettdihidroflavonok) izolálták és először azonosították a D.calycina, valamint a Diclinanona nemzetségben. Ezenkívül a fő vegyületek citotoxicitását B16-F10, HepG2, K562 és HL{{ ellen is vizsgálták. 4}} tumorsejtvonalat az Alamar blue assay segítségével.

2. Eredmények és megbeszélés

2.1. A vegyületek szerkezeti feltárása

Miután Dragendorff-reagenssel felfedezték a nitrogéntartalmú vegyületek jelenlétét a metanolos kivonatban, Costa és mtsai. módszere szerint sav-bázis kezelésnek vetettük alá. [12] alkaloidális és semleges frakciókat eredményezve. A kromatográfiás elemzésnek alávetett alkaloidfrakcióban a nitrogéntartalmú vegyületek magas koncentrációját figyelték meg. Az egymást követő kromatográfiás elválasztások, amint azt az Extrakció és izolálás részben leírtuk, tizenhárom kémiai összetevő (1-13, 1. ábra), kilenc izokinolin eredetű alkaloid 1-9 és négy benzilezett dihidroflavon izolálásához és azonosításához vezettek. 10-13. Ezen izolált vegyületek szerkezetét (1. ábra) kiterjedt analízissel állapították meg, 1D és 2D NMR spektroszkópiával kombinálva MS-sel (kiegészítő adatok), valamint összehasonlították az irodalomból származó adatokkal.

Az 5. vegyületet barna amorf por formájában kaptuk, és Dragendorff-reagensre pozitívnak bizonyult. Protonált molekulát mutatott m/z328 [M plusz H]' értéknél az LR-ESI( plus )MS-ben, amely kompatibilis a C18H1NO5 molekulaképlettel. Az 5 'H és 13C-NMR spektruma (1. táblázat) megegyezett a retikulin (4)[27] spektrumaival, kivéve a nitrogénkötésű metilcsoport (CH3-N) hiányát és a az 1. pozícióban lévő metincsoport, amelyet a bc 192,8-nál karbonilcsoporthoz konjugált imincsoport tipikus 13C-NMR-spektrumában jel váltott fel δc 165,1-nél. A 'H-NMR spektrumban három lefelé irányuló hidrogénatom: δH 6,88 (1H,d, J=8,4 Hz, H-5'）, 5H7,57 (1H,d, J{{33}) }.0Hz, H-2'）és δH 7,60(1H, dd, J=8.4 és 2,0 Hz, H-6'） , feltárta az ABX tengelykapcsoló rendszer jelenlétét. Két szingulett szignál 6H 6,90 (1H,s, H-8) és 6,71 (1H, s, H-5) 1,2,4,5-tetraszubsztituált fenilgyűrű jelenlétét jelezte. Ezenkívül az 5-ös H-NMR-spektrum két metoxicsoport jeleit is mutatta, amelyek bH 3,93 (3H, s) és 6H 3,95 (3H, s), valamint két metiléncsoport jeleit mutatta, amelyek δμ 2,79 (2H, t), J=7.8 Hz） és 6H 3.89(2H,t,/=7.8 Hz), H-4-nek és H-3-nek tulajdonítva (1. táblázat) . Ezek az adatok azt mutatják, hogy az 5-ös alkaloidnak benzil-tetrahidroizokinolin-váza van [28-30].

Ezeket a csoportokat a HMBC-NMR kísérlet két- és háromkötéses 'H-13korrelációs térképe alapján hoztuk létre (2. ábra és 1. táblázat). Ez az elemzés feltárta, hogy a hidrogén δH 3,89 （H{7}}) mellett háromsávos 'H-13C korrelációt mutatott a 6c130.1(4a）) és δc165 szénatomokkal. {42}}(C-1) és a kétkötésű lH-13C korreláció a szénnel atδc 25,4(C-4), ami megerősíti az imincsoport jelenlétét a molekulában. Másrészt a δH 7,57 （H-2'） és δH 7,60（H-6'） jelek háromkötéses lH-13C korrelációt mutattak a szénatomokkal δc 124,3（ C-6'）,5c 151,4（C-4'）és δc192,8（C-7）, és 5c116,0（C-2'）,6c 151,4 (C-4') és c 192,8(C-7'), ami létrehozza a karbonilcsoportot a molekulában (2. ábra és 1. táblázat). Ezért ezen NMR adatok alapján az 5. vegyület

benzil-tetrahidroizokinolin-alkaloid 34-dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-izokinolinil)(3-hidroxi-4-metoxifenil)-metanonként jött létre, amely dehidro-oxonorretikulinnak nevezik. Ezt az alkaloidot először írják le az irodalomban természetes termékként. Első és egyetlen feljegyzését Dörnyei et al. 1982-ben 【31】 szintetikus eredetű termékként. Csak az 'H-NMR adatokat írjuk le néhány meghatározatlan multiplicitással. Így az összes 1H- és 13C-NMR kémiai eltolódás teljes hozzárendelését egykötéses (HSOC) és két- és háromkötéses (HMBC)'H-13C-NMR korrelációs kísérletekkel határoztuk meg, és a Asztal 1.

A 6. és 7. vegyületet benzil-tetrahidroizokinolin-alkaloidként (plusz)-1S,2R-retikulin-N-oxidként és (plusz)-1S,2S-retikulin-N-oxidként azonosítottuk. Ezen alkaloidok H-NMR adatait összehasonlították Lee és munkatársai által leírt adatokkal. [28]azonos deuterált oldószer (CD3OD) használatakor bizonyos inkonzisztenciákat figyeltek meg (1. táblázat), főleg a H-1, H-8 és H, C-NO vonatkozásában. Az irodalomban nem találhatók 13C-NMR adatok ezekre az alkaloidokra. A korlátozott 1H- és 13C-NMR adatok, valamint az ezeknél a molekuláknál megfigyelt kétértelműségek alapján 'H és 13C 1D és 2D NMR-kísérleteket végeztünk a helyes hozzárendelésük és multiplicitásuk meghatározására.

A 6. és 7. izomer H{{0} és H-1 hidrogénjének helyes helyzetét a HMBC háromkötéses 'H-13C korrelációs térképe alapján állapítottuk meg. -NMR-kísérlet (2. ábra). A 6. izomer esetében az elemzés kimutatta, hogy a hidrogén δH 5,78 (H-8) mellett háromkötéses 'H-13C korrelációt mutatott a szénatomokkal 6c 79,8 (C-1), δc120 .6(4a) és δc 149,4 （C-6）, míg a hidrogén δH 4,13 （H-1） háromkötéses 'H-13C korrelációt mutatott a szénatomokkal c 60,7（C-3）,6c 115,7 （C-8）, δc 120,6（C-4a） és 131,2 （C-1'）, így megállapítható a a H-8 és H-1 hidrogének helyes helyzete a 6-os izomernél. Ezt az attribúciót tovább erősíthetjük a hidrogén elemzésével δH 6,76（H-5）, amely háromkötést mutatott H-13C korreláció a szénatomokkal δc 27,0（C-4）, δc 127,1（C-8a） és δc 145,7（C-7）(2. ábra). A 7 izomer esetében az analízis kimutatta, hogy a hidrogén δH 6,30-nál （H{63}}） háromkötéses 'H-13korrelációt mutatott a szénatomokkal δc 79,4（C-1）, δc 122,8（ 4a） és δc 148,9 （C-6）, míg a hidrogén δH 4,46 （H-1） háromkötéses H-13C korrelációt mutatott a szénatomokkal δc 62,9 （ {82}}）,5c 115,5（C-8）, bc 122,8（C-4a） és 131,4（C-1'）, így megállapítható a H hidrogének helyes helyzete -8 és H-1 a 7-es izomer esetében. Ezt az attribúciót a hidrogén elemzése is megerősítette δH 6,71 （H-5）-nél, amely háromkötéses lH-13C-t mutatott korrelációk a szénatomokkal δc26,3（C-4), δc 126,9（C-8a） és 6c 146,1（C{110}}）(2. ábra). A NOESY kísérletet is elvégezték a 6 és 7 izomerek helyes sztereokémiájának megállapítására. Ebben a kísérletben a H-1（δH 4,13） és a H, CN(5 3.15) erős NOE-korrelációja azt jelezte, -az oxigén orientációja a 6-os izomerben. Másrészt a 2D-NOESY kísérletben nem találtunk nyilvánvaló NOE-korrelációt H-1(6H 4,46) és HAC-N(5H 3,20) között a 7, az oxigén orientációját jelzi a 7 izomerben (2. ábra). Ezen izomerek kémiai eltolódásában mutatkozó kis különbségek egyértelműen megfigyelhetők a nitrogén sztereokémiája miatt, amelyet az oxigén helyzete és helyzete befolyásol. A 6. és 7. vegyületre kapott 'H- és 13C-NMR-adatok összehasonlítása olyan közeli szerkezetű molekulák adataival, mint a hexapetalin A és hexapetalin B [30], kétértelműség nélkül alátámasztja az 1. táblázatban leírt adatokat.

A 1-4 és 8-13 vegyületeket talifolin (1) [32], anonaine (2) [33] liriodenin (3) [10,34], (S)-( plusz )-retikulin ( 4)[27], coreximin (8) [34,35], bisnorarrgemonine (9)[36], izochamanetin (10) [37], dichamanetin (11) [37] és uvarinol (12) és izouvarinol keveréke (13) [37] spektroszkópiai profiljaik és az irodalomban található értékekkel való összehasonlítás alapján. Az lH- és 13C 1D és 2D-NMR-spektrumok, valamint az összes izolált vegyület tömegspektruma kiegészítő anyagokként érhető el.

Kemofenetikai (a növényi kemoszisztematika/növényi kemotaxonómia új kifejezése) szempontból fontos megjegyezni, hogy a C-benzilezett flavanonok és a C-benzilezett dihidrokalkonok a flavonoidok egy speciális típusa, amelyek a jól ismert flavanon pinocembrinből származnak. és különösen az Annonaceae családba tartozó Uoaria nemzetség fajainál írták le [3,38-42]. Ezeknek a vegyületeknek a jelenléte a D. calycinában az Uoaria-val való szoros kemofenetikai kapcsolatokra utal. Másrészt további vizsgálatokat kell végezni a növény más részein, valamint más Diclinanona fajokon is ennek a kemofenetikai kapcsolatnak a megerősítésére. A flavanonok és kalkonok széles körben elterjedtek a magasabb rendű növényekben, de a benzilcsoportok hozzáadása meglehetősen ritka, és úgy tűnik, hogy az Annonaceae esetében az Uoaria nemzetségre [3,39-42] és most a Diclinanona nemzetségre korlátozódik. A benzilcsoportok feltehetően C6-C1-útvonalból származnak, de az o-hidroxi-funkcionalitás szokatlan. A szubsztituensek hiánya a B-gyűrűben az Uoaria és a Diclinanona flavonoidokban összefügg a Popowia cauliflora flavonoidjaira vonatkozó korábbi megfigyeléssel [38].

A jelen munkában izolált és ismertetett izokinolin eredetű alkaloidokat már több Annonaceae fajban regisztrálták különböző nemzetségekben. Ezek egy része, mint például a liriodenin és az anonaine, kemofenetikus markereknek számít, és ezen alkaloidok jelenléte a D.calycinában tovább erősíti ezen kemofenetikus markerek rokonságát az Annonaceae családban [5-7,15,20,27, 33-35,43].

Érdemes megemlíteni, hogy Zidorn [44] szerint a kemofenetikai vizsgálatokat olyan vizsgálatokként definiálják, amelyek egy adott taxonban található speciális másodlagos metabolitok tömbjének leírására irányulnak, amint azt több publikált munkában is megfigyelték [5-7,15,20 ,27,33-35,43-46]. Így a kemofenetikai vizsgálatok hozzájárulnak a taxonok fenetikai leírásához, hasonlóan az anatómiai, morfológiai és kariológiai megközelítésekhez, amelyekről már korábban is elismertek, hogy nagy jelentőséggel bírnak a „természetes” rendszerek létrehozásában, és amelyek továbbra is rendkívül fontosak a taxonok számára. osztályozott szervezetek leírása modern molekuláris módszerek segítségével [44].

2.2. Citotoxikus vizsgálat

Az izolált vegyületek in vitro citotoxikus aktivitását (2. táblázat) a 2., 3., 5. és 8. vegyület kivételével (alacsony hozamuk miatt) összehasonlítottuk.rákos sejtHL-60 (humán promielocitás leukémia), MCF-7 (humán mell adenokarcinóma), HepG2 (humán hepatocelluláris karcinóma), HCT116 (humán vastagbél karcinóma) és nem rákos sejtvonal MRC{{5} }(humán tüdő fibroblaszt) Alamar blue assay alkalmazásával 72 órás inkubáció után.

Among the compounds evaluated (Table2), the most promising results were verified for benzylated dihydroflavones dichamanetin (10), and the mixture of uvarinol (12)and isouvarinol (13), which showed moderate cytotoxic activity against the tested cancer cell lines and low cytotoxicity against the non-cancerous cell line MRC-5(>25.0 ug.mL-1). A dichamanetin (11) citotoxikus aktivitást mutatott HL-60 és HCT116 ellen 15,78 ug·mL-1（33,70 μmol·L-1) IC50 értékkel. és 18,99 ug·mL-1（40,56 umol.L-1）, rendre. Az uvarinol (12) és izouvarinol (13) keveréke citotoxikus aktivitást mutatott a HL-60 ellen 9,74 ug∶mL-1 ICs0 értékkel és a HCT116 ellen, 17,31 ug∶mL{ ICs0 értékkel {30}}. A benzilezett dihidroflavonok közül csak az izorhamnetin (10) mutatott citotoxikus aktivitást a HepG2-vel szemben 19,79 ug:mL -1 (54,65 umol.L-1) IC50 értékkel. A szakirodalom szerint a benzilezett dihidroflavonok citotoxikus tulajdonságokkal rendelkeznek [39-42]. Az ebben a munkában leírtak közül az izorhamnetint (10), a dichamanetint (11) és az uvarinolt (12) írják le a nasopharynx karcinóma (KB) humán tumorsejtvonalai és a P-388 limfocitás leukémia elleni citotoxikus tulajdonságainak vizsgálata. (PS) 5,3 és 4,1, 4,8 és 1,8, illetve 5,9 és 9,7, ug.mL-1 IC50-értékekkel [39,40]. Ezek a különböző aktivitások egy vagy több hidroxi-benzil-csoport jelenlétének tulajdoníthatók a molekulákban, valamint annak a pozíciónak, amelyben ezek a csoportok kapcsolódnak. Ennek a megfigyelésnek a megerősítéséhez azonban további vizsgálatokra van szükség.

Az izokinolinból származó anonaine (2), liri-adenin (3) és (S)-( plusz )-retikulin (4) in vitro citotoxikus hatását a közelmúltban Menezes és munkatársai írták le.[2{{16] }}], Souza et al. [6] és Costa et al. [43] a liriodeninre helyezve a hangsúlyt, amely erős citotoxikus aktivitást mutatott a B{{10}}F10 (egér melanoma), a HepG2 (humán hepatocelluláris karcinóma), a HL{13. }} (humán promielocitás leukémia) és K562 (humán krónikus myelocytás leukémia), IC5s0 értékkel 10,0 μmol.L-1【43】 alatt. Az anonaine mérsékelt aktivitást mutatott a B16-F10, HepG2, HL60 ellen és a K562 IC50-értéke 19,0 umol.L-1[20]-nál alacsonyabb. Az (S)-(plus )-retikulin csak a HepG2-vel szemben mutatott mérsékelt aktivitást, IC50 értéke 15,35 μmol L-1【 6,20】.

3. Anyagok és módszerek

3.1. Általános kísérleti eljárások

Az optikai forgatásokat metanolban (MeOH) P{{0}} polariméterrel (Jasco, Tokió, Japán) rögzítettük 589 nm-en. Az 1D és 2D NMR kísérleteket CDCl-ben végeztük. (kloroform-d) vagy CDCl plusz csepp CD, OD (metanol-du és CD, COCD3 (aceton-d6) 298 K-on AVANCE I HD NMR spektrométeren (Bruker, Billerica, MA, USA), amely 11,75 T-n működik (Kézi 13C 500 és 125 MHz-en) és egy Bruker AVANCE I 600 NMR spektrométeren, amely 14,1 T('H és13Cat 60{) mellett működik. {63}} és 150 MHz). Az összes lH- és 13C-NMR kémiai eltolódás (δ) ppm-ben van megadva a tetrametil-szilán jelhez viszonyítva 0.00 ppm belső referenciaként, és a csatolási állandók (D) Hz-ben vannak megadva. Az NMR spektrométert egy 5- mm-es többmagvú inverz detektáló szondával (1D és 2D NMR kísérletek) z-gradienssel láttuk el. A háromkötéses (HMBC)1H-13C-NMR korrelációs kísérleteket a JcH és LRJ (cH 140, illetve 8 Hz) átlagos csatolási állandóra optimalizáltuk. Kis felbontású tömegspektrometriás (LC-MS) elemzéshez a Az izolált vegyületek mintáit metanolban (HPLC minőségű) újraszuszpendáltuk, létrehozva az állományt. k oldat (1 mg·mL{40}}). A törzsoldatok alikvotjait (5 ul) tovább hígítottuk 5 µg·mL-re, és közvetlen infúzióval analizáltuk egy hármas kvadrupól tömegspektrométerbe, a modell TSO Quantum Access (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA), amely elektrospray ionizációval volt felszerelve. (ESI) vagy atmoszférikus nyomású kémiai ionizációs (APCI) források. ESI-MS feltételek: permetezési feszültség, 5 kV; köpenygáz, 10 tetszőleges egység (arb); segédgáz, 5arb;seprőgáz,0arb;kapilláris hőmérséklet, 250 fok ; kapilláris feszültség, 40 V; csőlencse, 70 V; tömegtartomány, m/z 100 és 1000 között. APCI-MS feltételek: kisülési áram, 5 μA; párologtató hőmérséklet, 350 fok; köpenygáznyomás, 25 tetszőleges egység (arb); ionseprő gáznyomás,0,0 arb; aux gáznyomás, 10 arb; kapilláris hőmérséklet, 250 °C; cső lencse offset, 70 V; skimmer offset, 0 V; Ütközési gázként argont használtunk, és az MS/MS spektrumot 25 és 30 eV közötti ütközési energiák felhasználásával kaptuk. Szilikagél 60 (Sigma-Aldrich, San Luis, MO, USA, 70-230 mesh) az oszlopkromatográfiához (CC), míg a szilikagél 60 F254 (Macherey-Nagel, Düren, Németország, 0,25 mm, alumínium) analitikai és preparatív vékonyréteg-kromatográfiával (PTLC) (Macherey-Nagel, 1,00 mm, üveg) használtuk. A vegyületeket UV254/365 fény alatti expozícióval, p-anizaldehid reagens permetezéssel, majd főzőlapon történő melegítéssel és Dragendorff-reagens permetezésével tettük láthatóvá.

3.2.Növényi anyag

A jelen vizsgálat során a D.calycina botanikai anyagát (kéregét) 2017. május 27-én gyűjtötték az Adolpho Ducke Reserve-n (földrajzi koordináták: 02° 53'36,1 D és 59° 58'28,9" W), Manaus, Amazonas állam Brazíliában, és Prof. Dr. Antonio Carlos Webber, az Universidade Federal do Amazonas (DB/UFAM) Biológiai Tanszékének növénytaxonómusa azonosította. A 10 810-es számú utalványmintát letétbe helyezték a DB/UFAM Herbáriumában. a hozzáférést (minta) a Sistema Nacional de Gestao do Patrimonio Genetico e do Conhecimento Tradicional Associado (SISGEN) A70EDCD rekorddal regisztrálták.

3.3. Kivonás és izolálás

A D.calycina kérgét először szobahőmérsékleten 24 órán át szárítottuk, majd légkeveréses kemencében 48 órán át 40 fokos hőmérsékleten szárítottuk, majd négykés malomdarálóban (Marconi, Piracicaba, SP) porítottuk. , Brazília), hogy megkapjuk a porított anyagot (1340 g). Ezt követően kimerítő macerálást végeztünk hexánnal (8×4 L), majd MeOH-val (8×4 L). A kapott extrakciós oldatokat rotációs bepárlóban csökkentett nyomáson ({10}} fok) bepároljuk, így 24,85 g hexános, 199,43 g metanolos kivonatot kapunk.

A Dragendorff-reagenssel végzett vékonyréteg-kromatográfiás elemzés azt mutatta, hogy a MeOH-extraktumban nagy mennyiségű alkaloid van jelen. Ezért a MeOH-kivonat egy alikvot részét (188,3{9}} g) először sav-bázis extrakciónak vetettük alá, így alkaloidális (5,46 g) és semleges (4,47 g) frakciókat kaptunk. Ezt követően az alkaloidfrakció egy részét (5{56}}g) szilikagél kromatográfiás oszlopnak (CC) vetettük alá, amelyet előzőleg 10%-os NaHC03-oldattal [12] kezeltünk, és hexánnal (100%), hexán-CHCl-dal eluáltuk. (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 és 10:90 v/o), CH2Cl2 (100%), CH2Cl 2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 és 10:90,0/u), EtOAc (100 százalék),EtOAc-MeOH (95:05, 90:10,85:05, 80:10,75:25, 70:30,60:40, 50:50,40:60, 30:70,20 :80 és 10:90 térfogatarányú, végül MeOH-val 250 frakciót kapunk (egyenként 30 ml-t). A vékonyréteg-kromatográfiás értékelést követően CH2Cl2-MeOH 95:05, 90:10 arányú keverékével, 85:15 és 80:20, mint eluens rendszer (v/o), a hasonló mintákat egyesítettük, így 16 frakciót kaptunk (F1-F16).

Az F5 frakciót (181,2 mg) a kezdeti CC-ből hexán-CH,Cl2 (50:50-10:90, v/o) eluálással új szilikagél CC-nek vetettük alá, a fenti módszert alkalmazva, hexánnal (100%), hexánnal eluálva. -CH,Cl2 (90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 és 10:90 v/o), CH,Cl ,(100 százalék), CHCI2-EtOAc(90:10,80:20,70:30,60:40,50:50,40:60,30:70,20:80 és 10:90 o/), EtOAc (100%), EtOAc-MeOH (85:15, 70:30, 50:50, 30:70 és 15:85/o) és MeOH (100%), így 118 frakciót kapunk ( egyenként 15 ml), amelyeket 12 szubfrakcióban (F5.1-F5.12) egyesítettünk, a vékonyréteg-kromatográfiás elemzésnek megfelelően CH2Cl2-MeOH 95:05 és 90:10 arányú keverékével. F5 szubfrakció .1 (28,9 mg) hexánnal (100%) eluálva preparatív TLC-nek vetettük alá, eluáltuk CH,Cl-MeOH-val (95:05, v/v, két elúció), így kaptuk a 2-t (1,4 mg) és a 3-at (1,7 mg). illetőleg. Az F5.4 (21,5 mg) alfrakciók hexán-CH,C(80:20,vo), F5.5 (16,7 mg) alfrakciók hexán-CH,Cl (80:20,70:30,60; 40 és 50:50) eleggyel eluálva , v/), és az F5.6 (15,4 mg) hexán-CHCl2 (50:50, 40:60 és 30:70, v/o) eleggyel eluált F5.6-ot (15,4 mg) egyesítettük (53,6 mg), majd preparatív vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatnak vetettük alá. CH,Cl-MeOH-val (95:05, v/u, két elúció) 3 (8,9 mg) vegyületet kapunk.

F6 frakció (2099,1 mg) a kezdeti CC-ből hexán-CHCl(10:90, v/)), CH2Cl, (100) eleggyel eluálva százalék), és a CH,Cl2-EtOAc-ot (90:10-10:90, o/o) új szilikagél CC-nek vetettük alá a fenti módszerrel, ugyanazzal az oldószerrendszerrel eluálva, így 140 frakciót kaptunk (30). ml mindegyik). A vékonyréteg-kromatográfiás értékelést követően CH2Cl2-MeOH 95:05, 90:10 és 85:15 arányú elegyével eluensrendszerként (o/o) a hasonló mintákat egyesítettük, így 13 alfrakciót kaptunk (F6). .1-től F6.13-ig). Az F6.6 szubfrakciót (1541,3 mg) új szilikagél CC-nek vetettük alá a fenti módszerrel, ugyanazzal az oldószerrendszerrel eluáltuk, így 120 frakciót (egyenként 30 ml) kaptunk, amelyeket vékonyréteg-kromatográfiával (a fenti módszerrel) elemeztünk. részfrakciók (F6.6.1-F6.6.12). A hexán-CH,Cl (60:40 és 50:50, v/v) eleggyel eluált F6.6.2 szubfrakciót (17,0 mg) preparatív vékonyréteg-kromatográfiás eljárásnak vetjük alá, CH2Cl2-MeOH-val (90:10, v/o, egy elúció), ami 3-at (1,4 mg) eredményez. Az F6.6.3 szubfrakció (643,3 mg) hexán-CH2Cl2 (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 és 10:90) eleggyel eluálva. o/v), CH2Cl2-t (100%) és CH2Cl2-EtOAc-ot (90:10 és 80:20, o/o) vetettünk alá preparatív TLC-nek, amelyet CH2Cl2-MeOH-val (90) eluáltunk. :10, vfo, egy elúció, új F6.6.3.1 szubfrakciót (161,8 mg) kapunk, amelyet új preparatív vékonyréteg-kromatográfiának vetettünk alá, eluálószerként EtOAc-MeOH (90:10, v/o, egy eluálás) a 4(148,2) vegyületet kapva. mg). Az F6.6.4 szubfrakciót (90,2 mg), amelyet CH2Cl{109}}EtOAc-vel (70:30 és 60:40, o/o) eluáltunk, preparatív vékonyréteg-kromatográfiának vetettük alá, CH2Cl-MeOH (90:10, v/o, egy elúció), így 1 (1,4 mg) és 4 (50,1 mg) vegyületet kapunk. A CH,Cl-EtOAc-vel (60:40 és 50:50, o/o) eluált F6.6.5 szubfrakciót (83,4 mg) szintén preparatív vékonyréteg-kromatográfiás eljárásnak vetettük alá, amelyet CH,Cl{}MeOH-val (90:10, ufo, egy elúció), így ismét 1 (1,5 mg) és 4 (45,5 mg) vegyületet kapunk. A CH,Cl{149}}EtOAc-vel (50:50 és 40:60 térfogatarányú) eluált F6.6.6 szubfrakciót (101,4 mg) preparatív vékonyréteg-kromatográfiás eljárásnak vetettük alá CH,Cl-MeOH (90:0) eleggyel eluálva. 10, vfo, egy elúció), amely 8-at (3,4 mg) és egy másik F6.6.6.1 szubfrakciót (48,8 mg) eredményez. Ezt az alfrakciót (F6.6.6.1) preparatív vékonyréteg-kromatográfiás eljárásnak vetettük alá, először EtOAc-MeOH-val (85) eluáltuk. :15, vo, egy elúció) és utólag CHCl-MeOH (90:10, v/v, egy elúció), ami ismét 4-es vegyületet (37,4 mg) eredményez. Ehhez az eljáráshoz a kromatográfiás lemezt először EtOAc-MeOH mozgófázissal eluáltuk (85:15, v/o, egy eluálás). Ezt az elúciót követően a kromatográfiás lemezt megszárítottuk az oldószer eltávolítása érdekében, majd új eluálásnak vetettük alá CH,Cl,-MeOH (90:10,vf,egy elúció) mozgófázissal, így 4. F6.6.7. 109,0 mg) CH,Cl2-EtOAc-vel (40:60, 30:70, 20:80 és 10:90, vfo) eluálva preparatív vékonyréteg-kromatográfiás eljárásnak vetettük alá CH,Cl2-MeOH-val eluálva. (90:10 térfogatarányú, egy elúció) egy másik F6.6.7.1 szubfrakciót (24,8 mg) kapunk, amelyet új preparatív vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatnak vetünk alá, először EtOAc-MeOH (85:15, v/o, egy elúció), majd utólag eluálva. CH2Cl2-MeOH (90:10, vfo, egy elúció), 11,1 mg (9) képletű vegyületet eredményezve. Az F6.6.10 szubfrakciót (92,0 mg) EtOAc-MeOH-val (60:40 és 50:50, v/o) eluáltuk preparatív TLC-nek vetettük alá, amelyet CH-val eluáltunk. Cl,-MeOH (90:10, v/o, egy eluálás) 5 (1,7 mg) és 6 (7,8 mg) hozammal. Az EtOAc-MeOH (50:50, 40:60, 30:70, 20:80 és 10:90 térfogatarányú) eleggyel eluált F6.6.11 szubfrakciót (326,0 mg) preparatív vékonyréteg-kromatográfiás eljárásnak vetjük alá, kloroformmal eluálva. MeOH (90:10, v/o, egy elúció) 1 (2,4 mg) és 7 (12,5 mg) esetében.

Az F7-es frakciót (692,4 mg) a kezdeti CC-ből, amelyet EtOAc-tal (100%) és CHCl2-EtOAc-vel (95:05,90:10,85:15 és 75:25,ofo) eluáltunk, új szilikagéllel kezeltük. CCugyanazt a módszert alkalmazva, mint a kezdeti CC-nél leírtak, ugyanazokkal az oldószerrendszerekkel, ami 110 frakciót eredményez (egyenként 30 ml). Vékonyréteg-kromatográfiás kiértékelés után CH2Cl2-MeOH 95:05, 90:10 és 85 arányú keverékével. :15 eluens rendszerként (o/o), a hasonló mintákat egyesítettük, így 12 szubfrakciót kaptunk (F7.1-F7.12).F7.8 (147,4 mg) CH,Cl2--el eluálva. EtOAc-ot (50:50, 40:60 és 30:70 térfogatszázalék) preparatív vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatnak vetünk alá, eluálva CHCl-MeOH-val (95:05, vfo, egy eluálás), így 10 (5,4 mg) és 11 (11). 120,6 mg), ill. CHCl2-EtOAc-vel (30:70, 20:80 és 10:90, térfogatszázalék) eluált F7.9-et (144,2 mg) szintén preparatív vékonyréteg-kromatográfiának vetettük alá, amelyet CH,Cl-MeOH-val eluáltunk. 95:05, vo, egy elúció), így a 11. vegyületet (91,2 mg) és a 12. és 13. vegyület keverékét (39,4 mg) kapjuk.

Thalifolin (1): Barna amorf por;” H-NMR és 13C-NMR az irodalom szerint [32]; LR-ESI(plusz)-MS [M plusz H]* plusz m/z 208.

Anonaine (2): Barna amorf por; 1H-NMR és 13C-NMR az irodalom szerint [33]; LR-ESI(plusz)-MS [M plusz H] plusz m/z 266.

Liriodenin (3): Sárga kristályok (CH,Cl-MeOH 3:1);1H-NMR és 13C-NMR az irodalom szerint [10,34]; LR-ESI(plusz)-MS [M plusz H] plusz m/z 276.

(S)-(plusz)-Retikulin(4): Barna amorf por; [ ]p25 plusz 71,60 (c 0,05 g/100 ml, MeOH); 1H-NMR és 13C-NMR az irodalom szerint [27;LR-ESI(plus)-MS [M plusz H] plusz m/z 30.

3,4-Dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-izokinolinil)(3-hidroxi-4-metoxifenil)-metanon (dehidro-oxonorretikulin)(5) ): Barna amorf por; 'H és13C-NMR adatok, lásd az 1. táblázatot; LR-ESI(plusz)-MS [M plusz H] plusz m/z 328.

( plusz ){{0}}S,2R-Retikulin-N-oxid(6): Barna amorf por; [lp25 plusz 136,4 (c0,146 g/100 ml, MeOH); 1 kézi 13C-NMR adatok, lásd 1. táblázat; LR-APCI( plusz)-MS [M plusz H] plusz m/2346

( plusz ){{0}}S,2S-Retikulin-N-oxid (7): Barna amorf por; [ ]p25 plusz 394,5 (c 0,03 g/100 ml, MeOH); 'H és 13C-NMR adatokat lásd az 1. táblázatban; LR-APCI( plusz)-MS [M plusz H] plusz m/z346.

Koreximin (8): világossárga amorf por; [ ]p25 plusz 201,1 (c 0,08 g/100 ml, MeOH)'H-NMR és 13C-NMR az irodalom szerint [34,35]; LR- ESI(plusz)-MS [M plusz H] plusz m/z 328.

Bisnorargemonine (9): Barna amorf por; 1H-NMR és 13C-NMR az irodalom szerint [36]; LR-APCI(plusz)-MS [M plusz H] plusz m/z 328.

Izochamanetin (10): világossárga, amorf por; [p25-12.4(c 0,5 g/100 ml, MeOH)'H-NMR és 13C-NMR az irodalom szerint [37;LR-APCI(-)-MS [MH]-m/z361.

Dichamanetin (11): sárga amorf por; [ ]D25-10,7 (c 0,5 g/100 ml, MeOH);1H-NMR és 13C-NMR az irodalom szerint [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]-m/z467.

Uvarinol(12) és izouvarinol(13) keveréke: Sárga amorf por; H-NMR és 13C-NMR az irodalom szerint [37]; LR-ESI(-)-MS [MH]- m/z 573.

3.4. In vitro citotoxikus vizsgálat

3.4.1.Cellák

HL-60 (humán promielocitás leukémia), MCF-7 (humán mell adenokarcinóma), HepG2 (humán hepatocelluláris karcinóma), HCT116 (humán vastagbél karcinóma) és MRC-5 (humán tüdő fibroblaszt) A sejtvonalakat az American Type Culture Collection-től (ATCC, Manassas, VA, USA) szereztük be, és az ATCC állati sejttenyésztési útmutató ajánlása szerint tenyésztettük. Minden sejtvonalat mikoplazmára teszteltünk egy mycoplasma festőkészlet (Sigma-Aldrich) segítségével, hogy ellenőrizzük a szennyeződéstől mentes sejtek használatát.

3.4.2. Citotoxicitási vizsgálat

A citotoxicitási vizsgálathoz a sejtek életképességét az Alamar blue módszerrel határoztuk meg, a korábban leírtak szerint [{0}}]. Minden kísérlethez a sejteket 96-lyuklemezekre szélesztettük. A kémiai összetevőket feloldottuk dimetil-szulfoxidban (DMSO, Vetec Ouimica Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brazília), majd mindegyik lyukba hozzáadtuk, és 72 órán át inkubáltuk. Pozitív kontrollként doxorubicint (doxorubicin-hidroklorid, 95 százalék vagy annál nagyobb tisztaság, Laboratory IMA SAIC, Buenos Aires, Argentína) használtunk. A kezelés végén 20 μl resazurin törzsoldatot (0,312 mg/ml) (Sigma-Aldrich Co.) minden lyukba hozzáadtuk az abszorbanciát 570 nm-en és 600 nm-en SpectraMax190 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) segítségével. 95 százalékos konfidencia intervallumokkal (CI95 százalék) a GraphPad Prism szoftverrel (Intuitive Software for Science; San Diego, CA, USA).

4. Konklúziók

A D.calycina kéregének fitokémiai vizsgálata tizenhárom vegyület izolálásához és azonosításához vezetett (1-13); kilenc izokinolin eredetű alkaloid (1-9) és négyflavonoidok(10-13). Az alkaloidok a következő alosztályokba tartoznak: egyszerű izokinolin, thali online(1);aporfin, anonaine (2); oxoaporfin, liriodenin (3); benzil-tetrahidroizokinolinok, (plusz)-retikulin(4), de hidro-oxonorretikulin(3,4-dihidro-7-hidroxi-6-metoxi-1-izokinolinil)({{13} }hidroxi-4-metoxi-fenil)-metanon) (5), 1S,2R-retikulin-Ng-oxid (6) és 1S,2S-retikulin-N-oxid (7); tetrahidroprotoberberin, koreximin (8); és pavin, bisnorargemonine (9). Míg a flavonoidok a benzilezett dihidroflavonokhoz tartoznak, az izorhamnetin (10), a dichamanetin (11), valamint az uvarinol (12) és az izouvarinol (13) keveréke. Az izolált vegyületeket először a D. calycina, valamint a Diclinanona nemzetségben írják le.

Az izolált vegyületek (az anonaine, liriodenin, 1,2-dihidro-oxonorretikulin és koreximin kivételével) citotoxikus aktivitását a rákkal szemben értékelték (HL-60, MCF-7, HepG2, ill. HCT116) és nem rákos (MRC-5) ​​sejtvonalak. Ezek közül a legígéretesebb eredményeket a benzilezett dihidroflavonok dichamanetin (10), ill.

az uvarinol (12) és izouvarinol (13) keveréke, amely mérsékelt citotoxikus aktivitást mutatott a vizsgált rákos sejtvonalakkal szemben (<20.0μg.ml-1）and low="" cytotoxicity="" against="" the="" non-cancerous="" cell="" line="" mrc-5(="">25.0 ug·mL-'). A dichamanetin (11) citotoxikus aktivitást mutatott a HL-60 és a HCT116 ellen 15,78 ug·mL-1 (33,70 μmol-L-1) (33,70 μmol-L-1) és 18,99 ug·mL-I (40mo,l-I) IC50 értékkel. .L-1）, míg az uvarinol (12) és izouvarinol (13) keveréke citotoxikus aktivitást mutatott a HL-60 ellen, IC50-értéke 9,74 ug∶mL-I, illetve a HCT116, IC50 mellett értéke 17,31 ug·mL-1. Ezeket az eredményeket a tumorsejtvonalakon szintén először ismertetik a benzilezett dihidroflavonok esetében. A retikulin, anonaine és liriodenin citotoxikus hatásait korábban megállapították, amelyekben a liriodenin a legerősebb vegyület.

Az ebben a munkában kapott eredmények azt mutatják, hogy az Annonaceae család fajai ígéretes forrásai a citotoxikus tulajdonságokkal rendelkező biológiailag aktív vegyületeknek, és azt sugallják, hogy vizsgálatukat más biológiai vizsgálati modellekben is folytatni kell.

Hivatkozások

1. Couvreur, TLP; Pirie, MD; Chatrou, LW; Saunders, RMK; Su, YCF; Richardson, JE; Erkens, RHJ Az Annonaceae virágos növénycsalád korai evolúciós története: Folyamatos diverzifikáció és boreotróp geodiszperzáció. J. Biogeogr. 2011, 38, 664–680. [CrossRef]

2. Corrêa, MP Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas; IBDF Ministério da Agricultura: Rio de Janeiro, Brazília, 1984.

3. Leboeuf, M.; Cave, A.; Bhaumik, PK; Mukherjee, B.; Mukherjee, R. Az Annonaceae növénykémiája. Phytochemistry 1982, 21, 2783–2813. [CrossRef]

4. Rupprecht, JK; Hui, Y.-H.; McLaughlin, JL Annonaceous acetogenins: A Review. J. Nat. Prod. 1990, 53, 237–278. [CrossRef]

5. Lúcio, ASSC; Almeida, JRGDS; Da-Cunha, EVL; Tavares, JF; Filho, JMB Az Annonaceae alkaloidjai: előfordulásuk és biológiai tevékenységeik összeállítása. In The Alkaloids; Knolker, H.-J., szerk.; Elsevier: Amszterdam, Hollandia, 2015; 5. fejezet; 74. évfolyam, 233–409. [CrossRef]

6. Souza, CAS; Nardelli, VB; Paz, WHP; Pinheiro, MLB; Rodrigues, ACBC; Bomfifim, LM; Soares, MBP; Bezerra, DP; Chaar, JS; Koolen, HHF; et al. A Duguetia pycnastera (Annonaceae) kérgéből származó asaron eredetű fenilpropanoidok és izokinolin eredetű alkaloidok és citotoxicitásaik. Quim. Nova 2020, 43, 1397–1403. [CrossRef]

7. Araújo, MS; Silva, FMA; Koolen, HHF; Costa, EV Izokinolinból származó alkaloidok a Guatteria olivacea (Annonaceae) kérgéből. Biochem. Syst. Ecol. 2020, 92, 104105. [CrossRef]

8. Ngouonpe, AW; Mbobda, ASW; Boldog, GM; Mbiantcha, M.; Tatuedom, OK; Ali, MS; Lateef, M.; Tchouankeu, JC; Kouam, SF Természetes termékek a Duguetia staudtii (Annonaceae) gyógynövényből. Biochem. Syst. Ecol. 2019, 83, 22–25. [CrossRef]

9. Santos, RC; Souza, AV; Andrade-Silva, M.; Cruz, KCV; Kassuya, CAL; Cardoso, CAL; Vieira, MC; Formaggio, ASN Duguetia furfuracea (A. St.-Hil.) Benth kivonatának és dicentrinonjának antioxidáns, reumaellenes és gyulladásgátló vizsgálata. & Hook. f. J. Ethnopharmacol. 2018, 211, 9–16. [CrossRef]

10. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Valdez, RH; Ueda-Nakamura, T.; Dias Filho, BP; Nakamura, CV Az Annona foetida Mart ágaiból származó oxoaporfin és pirimidin- -karbolin alkaloidok tripanocid hatása. (Annonaceae). Molecules 2011, 16, 9714–9720. [CrossRef]

11. Silva, DB; Tulli, ECO; Milita, GCG; Costa-Lotufo, LV; Pessoa, C.; Moraes, MO; Albuquerque, S.; Siqueira, JM A Duguetia furacea-ból izolált kivonat és alkaloidok daganatellenes, tripanocid és antileishmaniális hatásai. Phytomedicine 2009, 16, 1059–1063. [CrossRef] [PubMed]

12. Costa, EV; Pinheiro, MLB; Xavier, CM; Silva, JRA; Amaral, ACF; Souza, ADL; Barison, A.; Campos, FR; Ferreira, AG; Machado, GMC; et al. Az Annona foetida-ból származó pirimidin- -karbolin és más alkaloidok, antileishmaniális hatással. J. Nat. Prod. 2006, 69, 292–294. [CrossRef]