A metabolomika a BMP-2/Smad jelátviteli útvonal elemzésével kombinálva megvilágítja az Epimedii Folium – csontos táplálékkiegészítő összes flavonoidjának javító hatásait a menopauza utáni csontritkulásban

Absztrakt

A posztmenopauzális csontritkulást (PMOP) az ösztrogénhiány váltja ki. Az elégtelen ösztrogén a csontképződést meghaladó csontfelszívódáshoz vezet, ami csökkenti a csonttömeget. Tanulmányok megerősítették, hogy az összes flavonoid kivonat aEpimedii Folium(TFE) enyhítheti a csontritkulást, míg a kondroitin-szulfátot (CS) tartalmazó csonttáp glükózamin-hidrokloriddal (GLcN) kombinálva terápiás hatást fejt ki a csontanyagcserével kapcsolatos betegségekre. Mivel az oszteoporózist alapvetően anyagcserezavarok jellemzik, a TFE kivonat csont-táplálék-kiegészítővel (TG) kombinálva szinergikus, többcélú szabályozó hatást fejthet ki, ezáltal új megközelítést kínálva a PMOP megelőzésében és leküzdésében.

Ez a tanulmány szisztematikusan feltárta a TG PMOP-ra gyakorolt ​​​​javító hatásait és mechanizmusait in vivo és in vitro kísérletekkel, amelyeket metabolomikai technológiával kombináltak. In vivo petefészek-eltávolított (OVX) patkánymodellt hoztak létre bilaterális ovariectomiával. A TG PMOP-ra gyakorolt ​​farmakodinámiás hatásait csontszövettani festődés, csont ásványi sűrűség és fiziológiai mutatók alapján igazoltuk. Ezenkívül metabolomikai technológiát alkalmaztak a vizelet metabolitjainak mennyiségi meghatározására, hogy feltárják a TG és a kapcsolódó metabolikus hálózatok által szabályozott lehetséges PMOP biomarkereket. In vitro az MC3T3-E1 sejteket TFE-vel és TG-vel kezeltük a biztonságos dózisok szűrése érdekében. Ezt követően oszteogén indukciót hajtottak végre, és a TG osteogén differenciálódásra gyakorolt ​​hatásait és mechanizmusait alkalikus foszfatáz (ALP) festéssel, Alizarin Red S (ARS) festéssel és Western blot analízissel tanulmányozták.

A farmakodinámiás eredmények azt mutatták, hogy a TG csökkentette az oszteoklasztok képződését, és jelentősen helyreállította a csont ásványianyag-sűrűségét és a fiziológiai indikátor szinteket. A metabolizmus eredményei azt mutatták, hogy a TG elsősorban azáltal enyhítette a csontvesztést, hogy beavatkozott több anyagcsereútba, beleértve a nikotinát és nikotinamid metabolizmust, a hisztidin metabolizmust, a pirimidin metabolizmust, a triptofán metabolizmust, az alanin/aszpartát/glutamát metabolizmust, a purin metabolizmust, a B6-vitamin metabolizmust és másokat. In vitro kísérletek megerősítették, hogy a TG elősegítette az oszteoblasztok proliferációját és az oszteogén differenciálódást a csont morfogenetikus protein-2 (BMP-2)/Sma- és Mad-kapcsolódó fehérje (Smad) jelátviteli útvonalán keresztül. Összefoglalva, a TG hatékonyan javíthatja a PMOP-t egy többcélú szinergikus hatás révén. Ez a tanulmány kísérleti alapot és elméleti támogatást nyújt a TG klinikai alkalmazásához.

Kulcsszavak:összes flavonoidjaEpimedii Folium; csontos táplálék-kiegészítő; posztmenopauzális csontritkulás; metabolomika; BMP-2/Smad jelátviteli útvonal

 

Egy új gyógynövény Cistanche Bone táplálékkiegészítő

 

 

 

1. Bevezetés

Az oszteoporózis (OP) egy szisztémás anyagcsere-csontbetegség, amelyet csökkent csonttömeg és csont ásványianyag-sűrűség (BMD), a csont mikroarchitektúra pusztulása és fokozott csonttörékenység jellemez. A posztmenopauzális csontritkulás (PMOP) a leggyakoribb típus, és csökkent ösztrogénszekrécióval jár. Az ösztrogén csökkenése a csontfelszívódást meghaladja a csontképződést meghaladó mértékben, ami a csont homeosztázisának megzavarásához vezet [1].

Egy kínai csontritkulás prevalencia vizsgálata 20 416 résztvevővel azt találta, hogy a 40 éves vagy idősebb emberek körében az OP prevalenciája 5,0% volt a férfiaknál és 20,6% a nőknél [2]. Az OP prevalenciájának értékelése az 50 évesnél idősebb amerikai felnőttek körében 16%-os előfordulási arányt talált férfiaknál és 29,9%-os nőknél [3], ami magasabb prevalenciát jelez a nők körében. Klinikailag a PMOP kezelésére használt gyógyszerek főként parathormon-analógokat, biszfoszfonátokat, ösztrogént, kalcitonint és RANKL-gátlókat tartalmaznak; ezek a gyógyszerek azonban olyan káros hatásokat okozhatnak, mint a szívdobogás, az állkapocs oszteonekrózisa és a szív- és érrendszeri betegségek, így hosszú távú használatra alkalmatlanok [4]. A hagyományos gyógyszerek jelentős mellékhatásterhe miatt sürgetővé vált a kevesebb mellékhatást okozó és a hosszú távú kezelésre alkalmas hagyományos kínai orvoslás (TCM) lehetőségeinek azonosítása. A TCM-et régóta használják az OP fejlesztésére, és széles körű figyelmet kapott hazai és nemzetközi szinten. Tanulmányok igazolják, hogy több kínai gyógynövény, mint plEpimedii FoliumésRhizoma Drynariaejelentős hatást gyakorolnak az OP javítására [5].

Összes flavonoid aEpimedii Folium(TFE) a fő aktív komponensek, köztük az icarin, epimedin A és epimedin B. A csontritkulás elleni hatásEpimedii Foliumszámos tanulmányban beszámoltak; például az icariin fokozza a csontvelői mezenchimális őssejtek (BMSC) oszteogén differenciálódását [6]. A TFE kivonat javíthatja a csontvesztést a barna zsírszövet növelésével és a fehér zsírszövet mennyiségének csökkentésével a csontvelőben [7].

 

Cistanche-ból készült csontos táplálék-kiegészítő

 

A kondroitin-szulfát (CS) egy szulfatált glikozaminoglikán és egy lineáris poliszacharid, amely uronsavat és N-acetil-hexózamint tartalmazó ismétlődő diszacharid egységekből áll [8]. A glükózamin-hidroklorid (GLcN) egy amino-monoszacharid, amelyet glükózból szintetizálnak emberi szövetekben; főként a porcokban és az ízületi kötőszövetben van jelen, és az ízületi porc és az extracelluláris mátrix fontos összetevője. Mindkettőt gyakran használják étrend-kiegészítőként. ZHENG HX et al. [9] arról számolt be, hogy a CS csökkentheti a szérum gyulladásos citokineket és gátolja az oxidatív stresszt; csökkentheti az oszteoklasztok expresszióját is az OPG/RANKL szabályozása révén, ami gyulladásgátló és antioxidáns hatásokra, valamint az oszteoklasztok differenciálódásának gátlására utal. Az Egyesült Államokban a CS-t gyakran kombinálják GLcN-nel az étrend-kiegészítőkben, és főként a mátrix komponensek elvesztésének csökkentésére használják osteoarthritisben [10]. Ezen túlmenően, mivel a CS képes sejtdifferenciálódást indukálni, használták kondrogenezisben és osteogén konstrukciókban [11–12].

Számos tanulmány utal arra, hogy a TFE-kivonat, a CS és a GLcN bizonyos terápiás hatással bírnak a csontanyagcserével kapcsolatos betegségekben. Azonban továbbra sem világos, hogy a kombinált TFE-kivonat-csont-tápanyag-kiegészítő (TG) szinergikus előnyökkel jár-e az OP és annak mechanizmusai javításában.

 

Cistanche-ból készült csontos táplálék-kiegészítő
 

 

Világszerte működő Cistanche Shop

Wecistanche támogató szolgáltatása – További részletek az együttműködésről
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

2. Anyagok és módszerek

2.1 Állatok

Negyven 8 hetes nőstény Sprague–Dawley patkányt (180–220 g) vásároltunk a Changchun Yisi Experimental Animal Co., Ltd.-től (állatengedély száma: SCXK (Ji)-2020-0001). Az állatokat SPF-laboratóriumban tartottuk 23±223 \\pm 223±2 fokon és 50%-os páratartalom mellett, szabad hozzáférést biztosítva élelemhez és vízhez, 12 órás fény/12 órás sötét ciklus alatt. Az állatkísérleteket a Jilini Mezőgazdasági Egyetem Kísérleti Állatjóléti és Etikai Bizottsága (elfogadási szám:. 20240717001) felülvizsgálta és jóváhagyta.

2.2 Gyógyszerek és reagensek

Koreai Epimedii FoliumA nyers gyógynövényt a Tonghua County Senyu Chinese Medicinal Materials Co., Ltd.-től (Jilin tartomány) vásároltuk. Az Icariint (T11A11B111118 tételszám) a Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.-től vásárolták. A GLcN-t (M-AT-1904020 tételszám) a Zhejiang Jinke Pharmaceutical Co., Ltd.-től vásárolták. CS (sz. sz. HS1904270), a Hencinguticale Coharmacenguticale Co.px. Ltd. További reagensek a következők: penicillin-nátrium injekcióhoz, ösztradiol-valerát tabletták, tribrómetanol, ELISA készletek PINP-hez és CTX-I-hez, hidroxiprolin, foszfor és kalcium vizsgálati készletek, ALP festőkészlet, -MEM táptalaj, tripszin, penicillin-TB, transzfer buffer, gyors sztreptomicin, blokkoló PVDF membránok, HRP kecske anti-nyúl IgG, anti-GAPDH antitest, előfestett fehérje marker, RIPA lízis puffer, ECL kit, PAGE gél előkészítő készlet, fehérjetöltő puffer, CCK-8 készlet, magzati szarvasmarha szérum, Alizarin Red S, aszkorbinsav, -glicero, , dézsámfoszfát nátrium és anti-bódium-nátrium RUNX2, BMP-2, Smad1, ALP, OSX és p-Smad1/5.(Minden tételszám és beszállító az eredeti szövegben felsoroltak szerint szerepel.)

2.3 Műszerek

Mikrolemez-olvasót (ThermoFisher, USA), fordított mikroszkópot (Motic Group), biológiai biztonsági szekrényt (ThermoFisher, USA), CO2_22 inkubátort (ThermoFisher, USA) és digitális kétcsatornás fűtőfémfürdőt (Changchun Kelebo Biotechnology Co., Ltd.) használtak.

2.4 TFE kivonás

A TFE-t a Zhang Dongxue és munkatársai által leírt módszerrel extraháltuk. [13]. A kapott liofilizált port UV-Vis spektrofotometriával mértük 270 nm-en. Ha standardként icariint használunk, a TFE-kivonat összes flavonoid tartalmát 79,0%-nak határoztuk meg.

2.5 Állatkísérleti tervezés

A patkányokat véletlenszerűen öt csoportba osztották: normál (ál), modell (OVX), ösztradiol-valerát (EV), TFE-kivonat (T) és TG. A színlelt csoportból csak kis mennyiségű hasi zsírt és lágyszövetet távolítottak el; az összes többi csoportban kétoldali petefészek-eltávolítás történt. A gyógyszereket 0,5%-os nátrium-karboxi-metil-cellulózban szuszpenzióként állítottuk elő, és orális szondán keresztül adtuk be. Az ál- és OVX csoportok sóoldatot kaptak szondán keresztül. A T-csoport 490 mg·kg-1^{-1}-1 TFE-t kapott. Az EV csoport 0,1 mg·kg−1^{-1}−1-et kapott. A TG csoport 124 mg·kg-1^{-1}-1 CS-t, 155 mg·kg-1^{-1}-1 GLcN-t és 490 mg·kg-1^{-1}-1 TFE-t kapott. Az adagokat az ember által javasolt dózisokból alakítottuk át. A szonda térfogata 2 mL·kg-1^{-1}-1·d-1^{-1}-1 volt 8 egymást követő héten. A sikeres modellezés megerősítette, hogy a szérum ösztradiol (E2) szintje az OVX csoportban szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az ál-csoportban. Mivel a CS+GLcN önmagában csak enyhe javuló tendenciát mutatott a patkány BMD-ben, külön, csak csonttápanyag-csoportot nem hoztak létre.

A 3., 6. és 8. héten a patkányokat metabolikus ketrecekbe helyezték szabad vízzel és 12 órás éheztetéssel, és 24 órás vizeletmintákat gyűjtöttünk. A vizeletet 4 fokon, 3500 fordulat/perc-1^{-1}-1 sebességgel centrifugáltuk 10 percig; a felülúszókat -80 fokon tároltuk. A 8. hét végén az állatokat elaltattuk, vért vettünk, 4 fokon, 4000 r·min-1^{-1}-1-gyel centrifugáltuk 15 percig, hogy szérumot nyerjünk, majd -80 fokon tároljuk.

2.6 Fiziológiai mutatók mérése

A 8. héten vizeletet és hasi aortavért vettünk. ELISA kiteket használtunk a PINP szérum csontképződési marker és a CTX-I csontreszorpciós marker mérésére. A szérum és a vizelet hidroxiprolin (Hyp) szintjét lúgos hidrolízissel mértük. A vizelet kalciumát (U-Ca) MTB mikrolemezes módszerrel, a vizelet foszforát (UP) pedig foszfomolibdát módszerrel mértük.

2.7 Csont ásványi sűrűség és mikro-CT

8 hét elteltével a bal combcsontokat begyűjtöttük, megtisztítottuk és mikro-CT-vel szkenneltük. A trabekuláris paramétereket kvantitatívan elemeztük, beleértve a trabekuláris szeparációt (Tb.Sp), trabekuláris vastagságot (Tb.Th), trabekuláris számot (Tb.N), csonttérfogat-frakciót (BV/TV) és szerkezeti modellindexet (SMI).

2.8 Csont hisztopatológia

A jobb combcsontokat 4%-os paraformaldehidben rögzítettük, dekalcifikáltuk, paraffinba ágyaztuk, metszettük, majd HE-vel és TRAP-pal megfestettük. A TRAP-pozitív oszteoklasztok sötétvörösnek tűntek.

2.9 Anyagcsere-elemzés

A vizeletet (100 μL) 10-szeresére hígítottuk desztillált vízzel, 30 másodpercig vortexeltük, 4 fokon, 15 000 r·min-1^{-1}-1 fordulatszámmal 10 percig centrifugáltuk, és a felülúszót használtuk az elemzéshez. Minden patkányból azonos térfogatú (100 μl) vizeletet egyesítettünk, hogy minőség-ellenőrzési (QC) mintákat készítsünk.

A kromatográfiát ACQUITY UPLC CSH C18 oszlopon (2,1 mm × 150 mm, 1,7 μm) végeztük 40 °C-on. Az A mozgófázis acetonitril (0,1% hangyasav), a B mozgófázis pedig víz (0,1% hangyasav). Az áramlási sebesség 0,20 ml·perc-1^{-1}-1 volt, az injekció térfogata 5 μL. Gradiens: 0–4 perc, 95% B; 4–5 perc, 95–65 % B; 5–13 perc, 65–25 % B; 13–14 perc, 25–0% B; 14–18 perc, 0–95% B.

A tömegspektrometriát Q Exactive Plus készülékkel végeztük pozitív és negatív ion üzemmódban ±3,2 kV permetfeszültséggel, 2,0–8,0 psi köpenygázzal, 350 fokos kapilláris hőmérséklettel és 100–1000 pásztázási tartományban.

2.10 Többváltozós statisztika és adatfeldolgozás

A nyers LC–MS adatokat Compound Discoverer szoftverrel előfeldolgoztuk és normalizáltuk. Felügyelet nélküli PCA-t használtunk a klaszterezés és a csoportkülönbségek értékelésére. A VIP értékek meghatározásához felügyelt OPLS-DA-t használtunk. A normalizált adatokra t-próbát alkalmaztunk. A VIP > 1 és P < 0,05 értékű metabolitokat potenciális biomarkereknek tekintették, és tovább azonosították.

2.11 Biomarker azonosítás és útvonal-elemzés

A pontos retenciós időt (Rt), m/z-t és molekulatömeget a TIC kromatogramokból kaptuk. A jelölt képleteket és az elemi összetételt Compound Discoverer online adatbázisok (HMDB, KEGG) segítségével jósoltuk meg. Az útvonal dúsítását MetaboAnalyst segítségével végeztük.

2.12 Osteoblast kultúra és differenciálódás

Az MC3T3-E1 egér kalvariális oszteoblasztokat 37 fokos CO2_22 inkubátorban tenyésztettük. Amikor 80–90%-os konfluens volt, a sejteket oszteogén indukció céljából szélesztettük. Az osteogén komplett tápközeg 10 mmol·L-1^{-1}-1 - glicerofoszfáttal, 50 μmol·L-1^{-1}-1 aszkorbinsavval és 100 nmol·L-1^{-1}-1 dexametazonnal kiegészített -MEM-ből állt.

2.13 Citotoxicitási vizsgálat

A sejtek életképességét CCK-8 értékelte. Az MC3T3-E1 sejteket (5 x 103^33 sejt/lyuk) 96 lyukú lemezekre oltottuk, és egy éjszakán át inkubáltuk. A sejteket ezután TFE-vel (2-12 ug·mL-1^{-1}-1), CS-vel (50-250 ug·mL-1^{-1}-1) vagy GLcN-nel (0,2-1,0 mmol·L-1^{-1}-1) kezeltük 24 órán keresztül. Az életképesség kiszámításához 450 nm-en mértük az abszorbanciát. Az eredmények alapján az optimális dózisokat választottuk ki, és kombináltuk a TG és a kontroll vizsgálatához.

2.14 ALP festés

Az MC3T3-E1 sejteket (1 × 104^44 sejt/lyuk) 12 lyukú lemezekre oltottuk, és vakpróbára (indukció nélkül), kontrollra (oszteogén indukció), T-re (oszteogén indukció + TFE) és TG-re (oszteogén indukció + TG) osztottuk. A médiát minden második napon cserélték. 7 nap elteltével ALP-festést végeztünk a kit utasításai szerint.

2.15 ARS festés

Az ALP-festéssel azonos csoportosítást és kezelést alkalmazva a sejteket 14 napig indukáltuk. A sejteket 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk, 0,1%-os Alizarin Red-el (pH 7,2) festettük 30 percig, mostuk, és mikroszkóp alatt megfigyeltük.

2.16 Western Blot

Annak vizsgálatára, hogy a TG befolyásolja-e az oszteogén differenciálódást a BMP-2/Smad jelátvitelen keresztül, MC3T3-E1 sejteket (5 × 105^55 sejt/lyuk) oltottunk be 6 lyukú lemezekre a fentiekkel megegyező csoportosítással. A sejteket RIPA plusz proteáz és foszfatáz inhibitorokkal lizáltuk. A BCA mennyiségi meghatározását követően a fehérjéket denaturáltuk, 10%-os SDS-PAGE-val elválasztottuk, PVDF-re vittük, blokkoltuk, elsődleges antitestekkel (GAPDH, p-Smad1/5, Smad1, BMP-2, RUNX2, OSX, ALP) inkubáltuk, majd HRP másodlagos antitest, ECLJ, képalkotás, képalkotás.

2.17 Statisztikai elemzés

Az adatokat átlag ± SD-ben fejezzük ki. A statisztikai elemzéshez SPSS-t használtunk. A normalitásvizsgálat után egyutas ANOVA-t végeztünk. A különbségeket P < 0,05 értéknél tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.

 

Cistanche-ból készült csontos táplálék-kiegészítő
 

3. Eredmények

3.1 Szérum biokémiai indikátorok

Amint az 1. táblázatban látható, az ál-csoporthoz képest az OVX-csoportban az E2-szintek szignifikánsan csökkentek, ami sikeres modellalkotást jelez. A szérum PINP-értéke az OVX-csoportban szignifikánsan csökkent, ami csökkent csontképződést jelez a PMOP-ban. Az OVX-hez képest a PINP a T és a TG csoportban szignifikánsan megemelkedett, jelezve, hogy mind a T, mind a TG növelte a csontképződési markereket, a TG jobb felépülése mellett. A színlelttel összehasonlítva a CTX-I szignifikánsan megemelkedett az OVX-ben, ami fokozott csontreszorpcióra utal ovariectomia után. Az OVX-hez képest a CTX-I a T-ben és a TG-ben szignifikánsan csökkent, a TG kifejezettebb csökkenése mellett. A szérum hidroxiprolin (S-Hyp) szignifikánsan megemelkedett az OVX-ben a hamishoz képest, ami a kollagén fokozott lebomlására utal; az OVX-hez képest az S-Hyp csökkent T és TG-ben, a TG szignifikáns csökkenésével, ami arra utal, hogy jobban gátolja a kollagén lebomlását.

3.2 A vizelet biokémiai indikátorai

A színlelttel összehasonlítva az UP szignifikánsan nőtt az OVX-ben; az OVX-hez képest az UP markánsabban csökkent TG-ben. Az U-Ca szignifikánsan megemelkedett az OVX-ben, mint a hamis; az OVX-hez képest az U-Ca szignifikánsan csökkent mind a TG-ben, mind a TG-ben, a TG nagyobb csökkenése mellett. A vizelet Hyp (U-Hyp) szignifikánsan megemelkedett OVX-ben a hamishoz képest; az OVX-hez képest az U-Hyp szignifikánsan csökkent minden kezelési csoportban, nagyobb csökkenést mutatva a TG-ben, mint a T-ben (2. táblázat).

3.3 Csont hisztopatológia

A HE festés azt mutatta, hogy a trabekuláris folytonosság jó volt ál-, kevesebb zsírsejtekkel a velőüregben. Összehasonlítva a színlelttel, az OVX gyengébb trabekuláris folytonosságot mutatott, és jelentősen megnövekedett a zsírsejtek száma. Az OVX-hez képest a trabekuláris kontinuitás helyreállt T és TG-ben, valamint a zsírsejtek száma csökkent; A TG nyilvánvalóbb felépülést mutatott (1A. ábra). A TRAP festés azt mutatta, hogy az oszteoklasztok száma szignifikánsan megnőtt OVX-ben, mint hamis; az OVX-hez képest az oszteoklasztok csökkentek a T-ben és a TG-ben, a TG-ben pedig szignifikánsan csökkent (1B. ábra).

3.4 Csont ásványi sűrűség és mikro-CT paraméterek

A Micro-CT szignifikánsan csökkent csonttömeget mutatott az OVX-ben, összehasonlítva a színlelttel. Az OVX-hez képest a csonttömeg helyreállítása TG-ben szignifikánsabb volt, mint T-ben, a trabekuláris denzitás egyértelmű növekedésével (1C. ábra). A kvantitatív analízis azt mutatta, hogy a BV/TV, a Tb.Th és a Tb.N szignifikánsan csökkent az OVX-ben a színlelttel szemben. Az OVX-hez képest ezek az indexek szignifikánsan emelkedtek a TG után (jobb, mint a T). A Tb.Sp és az SMI szignifikánsan megemelkedett az OVX-ben, mint a hamis; az OVX-hez képest a TG szignifikánsan csökkentette ezeket az indexeket, mint a T (3. táblázat).

3.5 PCA

Mind a pozitív, mind a negatív ion módban a vizelet metabolitprofiljainak PCA-ja a 3., 6. és 8. héten egyértelmű elkülönülést mutatott az ál-, OVX- és TG-csoportok között, jelezve a modellezés előtt/után, valamint a TG-kezelés előtt/után eltérő metabolikus profilokat (lásd az eredeti publikációban hivatkozott kiegészítő anyagot).

3.6 Lehetséges biomarker-szűrés

Az OPLS-DA kifejezettebb csoportszétválasztást mutatott hetek során mindkét ionmódban. A vulkánrajzok és a 200 permutációs tesztek támogatták a modell megbízhatóságát (R2Y és Q2 közel 1; Q2 metszéspontja < 0), ami arra utal, hogy nincs túlillesztés.

3.7 Biomarker azonosítás és útvonal-elemzés

VIP > 1 és P < 0,05 használatával a potenciális biomarkereket szűrtük. Az m/z, MS/MS, Rt és molekulatömeg alapján, valamint a HMDB/KEGG-re való hivatkozással 46 lehetséges biomarkert azonosítottak. A KEGG dúsítása elsősorban a nikotinát és nikotinamid metabolizmust, hisztidin metabolizmust, pirimidin metabolizmust, triptofán metabolizmust, D-aminosav metabolizmust, alanin / aszpartát / glutamát metabolizmust, purin metabolizmust és B6-vitamin metabolizmust tartalmazott (2. ábra). A hierarchikus klaszterezés dinamikus változásokat mutatott a TG beavatkozás utáni 3., 6. és 8. héten (lásd az eredeti publikációban hivatkozott kiegészítő anyagot).

3.8 Citotoxicitási vizsgálat

24 órás kezelés után 6 ug·mL−1^{-1}−1 TFE növelte a sejtek életképességét; nagyobb dózisok gátolták az életképességet. A GLcN 0,4 mmol·L−1^{-1}−1 mellett szignifikánsan növelte az életképességet. A CS 150 ug·mL-1^{-1}-1 mellett növelte az életképességet (4. táblázat). Így 6 ug·mL-1^{-1}-1 TFE-t, 0,4 mmol·L-1^{-1}-1 GLcN-t és 150 ug·mL-1^{-1}-1 CS-t választottunk ki. A kombinált adagolás 1,00 ± 0,11 kontroll életképességet és 1,22 ± 0,03 TG életképességet mutatott, ami azt jelzi, hogy a kiválasztott TG dózis biztonságos és nem citotoxikus.

3.9 Hatások az oszteogén differenciálódásra és a fehérjeexpresszióra

Az ALP az osteogén differenciálódás korai markere. Osteogén indukció alatt a TG sötétebb ALP festődést mutatott, mint a T, ami az ALP expresszió jobb elősegítését jelzi (3A. ábra). Az ARS festés azt mutatta, hogy mind a T, mind a TG elősegítette a mineralizált csomók képződését a kontrollhoz képest, kifejezettebb hatással a TG-ben (3B. ábra). A Western blot az osteogén markerek fokozott expresszióját mutatta ki indukció alatt. A vakpróbával összehasonlítva a kontroll sikeres osteogén differenciálódást jelez. A kezelés után a TG erősebben növelte a BMP-2, p-Smad1/5, RUNX2, OSX és ALP fehérje expresszióját (3C. ábra; 5. táblázat).

 

4. Vita

A posztmenopauzális petefészek-elégtelenség csökkenti az ösztrogénszintet és megzavarja a csontanyagcserét, fokozza az oszteoklasztok differenciálódását, miközben csökkenti az oszteoblasztok differenciálódását, ami végső soron csontvesztést okoz [14–15]. Korábbi kutatások [13] alapján feltételezték, hogy a TFE és a csont táplálékkiegészítő kombinációja szinergikus hatásokat fejthet ki a PMOP javításában. Ezért ez a tanulmány egy OVX patkánymodellt és egy oszteoblaszt-differenciációs modellt használt a TG hatékonyságának és mechanizmusának értékelésére.

A PINP-t (csontképződés) és a CTX-I-t (csontreszorpció) mind a T, mind a TG javította, a TG szignifikánsabb hatásokat mutatott. A hidroxiprolin (Hyp), a kollagén fő komponense, növeli a szérum és a vizelet mennyiségét OP-ban [16–17]. Ebben a vizsgálatban az OVX növelte a szérum és a vizelet Hyp-értékét; A kezelés csökkentette ezeket a szinteket, a TG pedig szignifikánsan csökkentette, mint a T. A fokozott csontfelszívódás OVX-ben szintén növeli a kalcium- és foszforveszteséget, növelve a vizelet kalcium- és foszforszintjét, összhangban a DESAI S et al. [18]. A kezelés csökkentette az U-Ca-t és az UP-t, a TG nagyobb csökkenésével. Az ösztrogénhiány megváltoztatja a trabekuláris szerkezetet, gátolja a BMSC oszteogenezist, elősegíti az adipogenezist és növeli az oszteoklaszt aktivitást [19]. A TG hatékonyabban javította a trabekuláris kapcsolódást, csökkentette a csontvelő zsírsejtek számát és csökkentette az oszteoklasztok számát, mint a T. A Micro-CT megerősítette, hogy a TG növelte a BMD-t és javította a trabekuláris mikroarchitektúrát (BV/TV, Tb.Th, Tb.N), miközben csökkentette a Tb.Sp-t és az SMI-t.

Mivel az OP anyagcsere-betegség, a metabolomikát a TG által szabályozott metabolikus hálózatok feltárására használták. A TG szabályozott útvonalai főként aminosav-, nukleotid- és vitamin-anyagcserét foglalnak magukban. A triptofán a BMD-hez kapcsolódik, és a csökkent szint OP-t jelezhet [20]. Ebben a vizsgálatban a triptofán csökkent volt az OVX-ben, és szignifikánsan helyreállt 8 hetes TG-kezelés után, ami arra utal, hogy a TG enyhítheti a csontvesztést a triptofán metabolizmusának modulálásával. Az arginin/kreatin metabolizmushoz kapcsolódó kreatinint összefüggésbe hozták az OP-val [21–22]. Itt a kreatinin a 8. héten volt a legmagasabb az OVX-ben, és a TG jelentősen csökkentette azt, ami arra utal, hogy az arginin metabolizmus szabályozása hozzájárulhat a PMOP javulásához. A glutation metabolizmus részt vesz a PMOP-ban [23]. Az L-glutamát a glutation (GSH) metabolizmusából állítható elő. A GSH antioxidáns funkciókkal rendelkezik, és támogatja a csontok átépülését [24]. A PMOP-ban az oxidatív stressz fokozódik, az antioxidáns kapacitás csökken, és az oszteoklasztok aktivitása meghaladja az oszteoblasztok aktivitását, ami rontja a csontképződést [15]. Ebben a vizsgálatban az L-glutamát magasabb volt az OVX-ben a 8. héten, és a TG csökkentette az L-glutamátot, ami arra utal, hogy a TG csökkentheti a GSH átalakulását L-glutamáttá, és ezáltal támogatja a GSH-szintet, és ellensúlyozza az ösztrogénhiánnyal összefüggő anyagcsere-rendellenességeket.

A purin anyagcsere zavarai OP-ban húgysav felhalmozódáshoz vezethetnek [25–27]. A metabolomika azt mutatta, hogy a TG csökkentette a húgysavszintet a 3., 6. és 8. héten az OVX-hez képest, ami a purinszintézis és a húgysav-felhalmozódás elnyomására utal. LIU DF et al. [28] arról számolt be, hogy a beavatkozások növelhetik az adenozin szintjét a purinanyagcsere-zavarok enyhítésére. Ebben a vizsgálatban a TG szignifikánsan növelte az adenozinszintet 8 hét után, ami arra utal, hogy hozzájárult az oszteogén differenciálódáshoz és a csont helyreállításához.

A vitaminok (D, B komplex, K) fontos szerepet játszanak a csontanyagcserében [29–31]. A niacin és a nikotinamid a B3-vitamin formája [32]. A niacin hozzájárul a NAD/NADP koenzim szintéziséhez, gyulladásgátló és antioxidáns hatással [33]. A nikotinamid elősegítheti a NAD termelését is; A NAD támogatja a mitokondriális működést, csökkenti a ROS károsodást és segít fenntartani a csont homeosztázisát. OP-ban a csökkent NAD akadályozhatja az osteogén differenciálódást és mineralizációt [34]. Ebben a vizsgálatban a niacin és a nikotinamid magasabb volt az OVX-ben a 3., 6. és 8. héten (a legmagasabb a 8. héten). A szerzők arra a következtetésre jutottak, hogy a NAD szintézis károsodhat a betegségben, ami niacin/nikotinamid felhalmozódásához és alacsony NAD-hoz vezethet, míg a TG csökkentette a niacin/nikotinamid szintet, ami valószínűleg a NAD szintézishez való felhasználást tükrözi. A piridoxamin (PM) a B6-vitamin része [35]. A B6-vitamin támogatja a kondrogén differenciálódást [36], a B6-hiány pedig gyengítheti a kollagén térhálósodását és a csontok szilárdságát [37]. A B6-vitamin metabolizmusát összefüggésbe hozták a PMOP progressziójával [38]. Ebben a vizsgálatban a PM alacsonyabb volt az OVX-ben a 8. héten, míg a TG növelte a PM-et, ami arra utal, hogy a kollagén és a csontok erősségének támogatásában szerepet játszhat.

A csontremodelling során az osteoblastok közvetítik a csontképződést. Az ALP és az ARS festődés a korai osteogenezist, illetve a késői mineralizációt tükrözi, és jellemzően nő az oszteogén indukció hatására [39–40]. Itt a TG hatékonyabban fokozta az ALP aktivitást és mineralizálta a csomókat, mint a TFE önmagában. A BMP-k a TGF-szupercsalád tagjai, és kulcsszerepet játszanak az osteogén differenciálódásban. A BMP-2 megköti a receptorokat, aktiválja a Smad1/5/8-at (Smad4-gyel), és elősegíti az olyan transzkripciós faktorokat, mint a RUNX2 és a downstream OSX, végső soron elősegítve az oszteogén fehérjeszintézist, az extracelluláris mátrix lerakódását és a mineralizációt [41]. Korábbi kutatások arról számoltak be, hogy a TFE a BMP-2/RUNX2/OSX útvonalon keresztül elősegíti a BMSC osteogenezist [42]. Ez a tanulmány a BMP-2/Smad jelátvitelre összpontosított, és azt találta, hogy a TG szignifikánsan megnövelte a BMP-2, a p-Smad1/5, a RUNX2, az OSX és az ALP expresszióját, mint a TFE önmagában, ami alátámasztja a BMP-2/Smad által közvetített erősebb pro-osteogén hatást.

Összefoglalva, az in vivo és in vitro eredmények azt mutatják, hogy a TG hatékonyan javítja az OVX által kiváltott csontanyagcsere-rendellenességeket. A mechanizmusok közé tartozhat az aminosav-, nukleotid- és vitaminanyagcsere szabályozása, valamint a BMP-2/Smad jelátvitel aktiválása az oszteogenezis elősegítése érdekében. Ez a tanulmány elméleti támogatást nyújt a TG-hez a PMOP megelőzésében és kezelésében.

 

5. Ipari perspektíva: Botanikai összetevők trendjei a menopauza utáni csontok egészségére – a mechanizmus-orientált kutatástól a szabványos gyártásig

SEO fókusz: gyógynövénykivonat posztmenopauzális csontritkulás ellen, botanikai összetevők a csontok egészségéért, osteogenesis BMP-2/Smad útvonal, Epimedium flavonoidok (icariin) kivonat, metabolomika által vezérelt botanikai termékfejlesztés.

5.1 Miért számít a mechanizmus által vezérelt "Gyógynövénykivonat a menopauza utáni csontritkulás kezelésére" tartalom a B2B-ben

Márkák, importőrök és formulátorok építéséheza nők egészségeéscsontok egészségeportfóliók, a piac egyre inkább díjazza azokat a botanikai koncepciókat, amelyekben meg lehet magyaráznivilágos tudományos logika-például:

többutas metabolikus moduláció (metabolomika által támogatott), és

oszteogenezissel kapcsolatos jelátviteli utak, mint plBMP-2/Smad.

A fentebb lefordítotthoz hasonló tanulmányok azért értékesek, mert összekapcsolnakösszetétel (TFE + CS/GLcN) → fenotípusos eredmények (BMD, osteoclast redukció, mikro-CT indexek) → molekuláris/biokémiai bizonyítékok (BMP-2/Smad, PINP/CTX-I) → anyagcsere hálózatok (B-vitamin útvonalak, aminosav és purin anyagcsere).

5.2 Növénytani összetevők beszerzése: a szabványosítás, a nyomon követhetőség és a méretezhető kitermelés az igazi különbségek

A B2B ellátásban a "fű" nem egyetlen specifikáció, hanem egy ellátási lánc. A késztermékeket gyártó cégek számára a legfontosabb kérdések a következők:

Lehet-e az összetevőszabványosított(pl. marker vegyületek, ujjlenyomatok)?

ott vannakminőségi rendszerekésgyártási ellenőrzéseka hosszú távú ellátás támogatására?

Biztosítani tudja a szállítódokumentációs csomagokhatósági és vevői auditokhoz?

5.3 Ahol a Cistanche illik (trend + gyártási képesség, nem helyettesítő állítás)

A bevált csont-egészségügyi botanikai anyagok mellett (pl.Epimédiumflavonoidok),CistancheA tágabb értelemben vett TCM és a funkcionális botanikai tér figyelme felkeltette a figyelmet a tonik formulákban való hosszú használatának, valamint az ipar egyre növekvő preferenciájának köszönhetően.egyetlen gyógynövény kivonatésszabványosított hatóanyagokamelyek integrálhatók a modern kiegészítő formátumokba.

A botanikai partnereket értékelő vásárlók számára a gyártásorientált beszállítói profil válik fontossá, amely lefedi:

vertikálisan integrált beszerzés,

kitermelési és feldolgozó kapacitás,

és a vállalati háttér átláthatósága.

Gyártási képességünkről (referenciaforrás):a cégprofil és a gyári háttér a beszállítói oldal hivatalos "Rólunk" oldalán tekinthető meg. ([xjcistanche.com])

Megfelelőségi megjegyzés a B2B blogokhoz:Ha a termék pozicionálása a „menopauza utáni csontritkulást” célozza, gondoskodjon arról, hogy a kifelé irányuló nyelve megmaradjon.szerkezet/funkcióvagytáplálkozási támogatás– orientált (az Ön piacától függően), és kerülje a betegség kezelésére vonatkozó állításokat, kivéve, ha ezt a helyi szabályozás támogatja és megengedi.

További információ (beszállítói referenciaoldalak):

Cég áttekintése / gyári háttér: ([xjcistanche.com])

Kapcsolódó botanikai tartalomközpont (TCM-receptek és hozzávalók történetmesélése):(a megadott hivatkozási linket beillesztheti, miután megerősítette, hogy a végső URL elérési útja helyes)

 

Hivatkozások

[1] LI J, CHEN X, LU LY és társai. A csontvelői zsírszövet és a csontanyagcsere kapcsolata posztmenopauzális osteoporosisban.Cytokin Growth Factor Rev, 2020, 52: 88.
[2] WANG LH, YU W, YIN XJ et al. A csontritkulás és a törések előfordulása Kínában: a kínai csontritkulás prevalencia vizsgálata.JAMA Netw Open, 2021, 4(8): e2121106.
[3] WRIGHT NC, SAAG KG, DAWSON-HUGHES B, et al. Az új National Bone Health Alliance (NBHA) diagnosztikai kritériumainak hatása az oszteoporózis prevalenciájára az USA-ban.Osteoporos Int, 2017, 28(4): 1225.
[4] LIANG B, BURLEY G, LIN S és társai. Az oszteoporózis patogenezise és kezelése: meglévő és kialakulóban lévő utak.Cell Mol Biol Lett, 2022, 27(1): 72.
[5] LEI SS, HUANG XW, LI LZ és mások. A mechanizmus feltárásaEpimedii Folium–Rhizoma drynariaegyógynövénypár elősegítette a csonthibák gyógyulását hálózati farmakológiai és kísérleti tanulmányokon keresztül.J Ethnopharmacol, 2024, 319(3): 117329.
[6] LIU W, XIANG SY, WU YC és mások. Az Icariin elősegíti a BMSC-k oszteogén differenciálódását az mTOR/autofágia útvonalon keresztül, hogy javítsa a ketogén étrenddel összefüggő csontritkulást.J Orthop Surg Res, 2024, 19(1): 127.
[7] CHEN L, MA R, LUO P et al. Az epimedium összes flavonoidjának hatása a csontvelő zsírszövetére petefészek-eltávolított patkányokban.Front Endokrinol (Lausanne), 2022, 13: 900816.
[8] LIU TS, YU H, WANG S és mások. A kondroitin-szulfát a lipidanyagcsere szabályozásával enyhíti a kalciumhiány okozta csontritkulást.Nutr Metab (London), 2023, 20(1): 6.
[9] ZHENG HX, CHEN DJ, ZU YX és társai. A kondroitin-szulfát megakadályozza az STZ által kiváltott diabéteszes csontritkulást a vércukorszint csökkentésével, az antioxidatív stresszel, a gyulladáscsökkentő és az OPG/RANKL expresszió szabályozásával.Int J Mol Sci, 2020, 21(15): 5303.
[10] STELLAVATO A, RESTAINO OF, VASSALLO V, et al. A kondroitin-szulfát az USA étrend-kiegészítőiben a gyógyszeres minőségű termékekkel összehasonlítva: analitikai ujjlenyomat és potenciális gyulladáscsökkentő hatás az emberi osteoarthritises chondrocytákra és synoviocytákra.Gyógyszerészet, 2021, 13(5): 737.
[11] SODHI H, PANITCH A. Glikózaminoglikánok a szövetmérnökségben: áttekintés.Biomolekulák, 2020, 11(1): 29.
[12] QI SS, SHAO ML, SUN Z stb. A kondroitin-szulfát enyhíti a diabéteszes csontritkulást és javítja a csontok mikroszerkezetét az antioxidáns, gyulladásgátló és a csontanyagcsere szabályozása révén.Front Endokrinol (Lausanne), 2021, 12: 759843.
[13] 张冬雪,曲帅,王明月,等．淫羊藿总黄酮联合骨营养剂抗骨质疏松作用探讨．中国骨质疏松杂志, 2023, 29(12): 1797.
[14] LI S, LIANG P, CHEN J et al. A dendrobin elősegíti a csontképződést a kanonikus Wnt/-catenin jelátviteli útvonalon keresztül, és megelőzi a posztmenopauzális csontritkulást.Front Pharmacol, 2025, 16: 1616070.
[15] ZHAO HY, YU F, WU W. Új perspektívák a posztmenopauzális osteoporosisról: a sirtuinok és az oxidatív stressz mechanizmusai és lehetséges terápiás stratégiái.Antioxidánsok (Bázel), 2025, 14(5): 605.
[16] RAI AD, SHERPA ML, SINGH A et al. Csont alkalikus foszfatáz és vizelet hidroxiprolin vizsgálata pre- és posztmenopauzás nőkben Sikkim államban és ennek összefüggése a csont ásványianyag-sűrűségével.J Midlife Health, 2021, 12(4): 304.
[17] 叶丽娟．恒古骨伤愈合剂治疗骨质疏松症的药效学研究．昆明:云南中医药大学,2024．
[18] DESAI S, BABARIA P, NAKARANI M et al. Osteoporotikus hatásúHemidesmus indicusLinn. petefészek-eltávolított patkányokon.J Ethnopharmacol, 2017, 199: 1.
[19] LI J, LU LY, LIU L et al. A csontvelő zsírszövetének egyedülálló szerepe az ovariectomia által kiváltott csontvesztésben egerekben.Endokrin, 2024, 83(1): 77.
[20] LIU XY, ZHANG SS, LU XM és mások. Metabonómiai vizsgálat a csontritkulás elleni hatásrólRhizoma Drynariaeés hatásmechanizmusa UPLC–MS/MS segítségével.J Ethnopharmacol, 2012, 139(1): 311.
[21] EISENHAUER A, MÜLLER M, HEUSER A et al. Kalcium-izotóp arányok a vérben és a vizeletben: új biomarker a csontritkulás diagnosztizálására.Bone Rep, 2019, 10: 100200.
[22] MEI ZD, DONG X, QIAN Y és mások. A metabolom és a csont ásványianyag-sűrűsége közötti kapcsolat egy kínai populációban.EBioMedicine, 2020, 62: 103111.
[23] MA YS, HOU ZJ, LI Y et al. Az eleutherosid E farmakológiai mechanizmusainak feltárása a posztmenopauzális csontritkulás ellen UPLC-Q/TOF-MS-alapú metabolomika segítségével.Front Pharmacol, 2020, 11: 1316.
[24] XU HC, NOZAKI K, YU ZN és társai. Titán implantátumok felületi funkcionalizálása szabályozott felszabadulású glutation konjugátummal az antioxidáns és az oszteogenezis érdekében.J Mater Res Technol, 2025, 34: 2872.
[25] LI X, WANG YF, GAO MT és társai. A menopauza utáni csontritkulásban szenvedő patkányok vese, csontvelője és csontja közötti metabolizmus által vezérelt kapcsolatok.Csont, 2022, 156: 116306.
[26] YANG KD, WANG XC, ZHANG C stb. A metformin javítja a HPRT1-célzott purin metabolizmust, és helyreállítja az NR4A1 által közvetített autofág fluxust azáltal, hogy modulálja a FoxO1 nukleocitoplazmatikus ingadozást a menopauza utáni csontritkulás kezelésére.Cell Death Dis, 2024, 15(11): 795.
[27] SAVIO LEB, LEITE-AGUIAR R, ALVES VS stb. Purinerg jelátvitel a redoxbiológia modulációjában.Redox Biol, 2021, 47: 102137.
[28] LIU DF, MA LY, ZHENG JH et al. Az isopsoralen javítja a glükokortikoidok által kiváltott csontritkulást azáltal, hogy szabályozza a purin metabolizmust és elősegíti a cGMP/PKG útvonal által közvetített oszteoblasztok differenciálódását.Curr Drug Metab, 2024, 25(4): 288.
[29] BELLONE F, CINQUEGRANI M, NICOTERA R et al. A K-vitamin szerepe a krónikus vesebetegségben: a csontok és a szív- és érrendszer egészségére összpontosítva.Int J Mol Sci, 2022, 23(9): 5282.
[30] MOSCHONIS G, HEUVEL EG VAN DEN, MAVROGIANNI C et al. A D-vitaminnal dúsított gouda típusú sajtfogyasztás hatása a csontanyagcsere biokémiai markereire posztmenopauzás nőknél Görögországban.Tápanyagok, 2021, 13(9): 2985.
[31] DAI ZL, KOH W P. B-vitaminok és csontok egészsége – a jelenlegi bizonyítékok áttekintése.Tápanyagok, 2015, 7(5): 3322.
[32] ZWICKENPFLUG W, HORNUNG F, HOLLAUS A et al. B3-vitamin és NAD+^++ bioszintézise: HepG2 sejtek inkubálása a miozmin alkaloiddal.J Sci Food Agric, 2024, 104(11): 6844.
[33] CHEN LJ, XING XK, ZHANG PF és társai. A NAD(H) és NADP(H) homeosztatikus szabályozása sejtekben.Genes Dis, 2024, 11(5): 101146.
[34] YOON H, PARK SG, KIM HJ és társai. A nikotinamid fokozza az oszteoblasztok differenciálódását a mitokondriális antioxidáns védelmi rendszer aktiválásával.Exp Mol Med, 2023, 55(7): 1531.
[35] DIAS P, SIATKA T, VOPRŠALOVÁ M, et al. A B-komplex vitaminok biológiai tulajdonságai, a 2. rész-B(6) és B(7) vitaminok (biotin, H-vitamin).Nutr Res Rev, 2025, 38(2): 791.
[36] DEIANA M, MALERBA G, CARBONARE LD és mások. A fizikai aktivitás megakadályozza a porcok lebomlását: egy metabolomikai vizsgálat pontosan rámutat a B6-vitamin szerepére.Sejtek, 2019, 8(11): 1374.
[37] WELAN R. A B6-vitamin hatása az oszteoporózisos törésekre.J Bone Metab, 2023, 30(2): 141.
[38] YANG F, DONG X, MA FX és társai. A tubson-2 főzet intervenciós hatásai petefészek-eltávolított patkányokon a hálózati farmakológia és a metabolomika kombinációjával meghatározva.Front Pharmacol, 2020, 11: 581991.
[39] CUI YB, YANG ZJ, YU GS stb. A Naringin elősegíti az oszteoblasztok differenciálódását és enyhíti az oszteoporózist petefészek-eltávolított egerekben.Sci Rep, 2025, 15(1): 12651.
[40] 陈泽彬,罗兰兰,石心怡,等．杜仲汤含药血清通过 L-VGCC促进成骨细胞增殖和分化的机制研究．中国中药杂志, 2025, 50(12): 3335.
[41] A YAN CP, WANG XK, JIANG K és mtsaiFront Cell Dev Biol, 2022, 10: 883228.
[42] 梁广胜,陈伟才,殷嫦嫦,等．淫羊藿总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞成鴨干细胞才BMP-2/Runx2/OSX 通路的影响．中国中西医结合杂志, 2016, 36(5): 614.