CD73 túlzott expressziója a podocitákban: A podocita sérülés új markere az emberi vesebetegségben
Feb 26, 2022
Absztrakt:A CD73 útvonal fontos gyulladáscsökkentő mechanizmus különféle betegségek esetén. Az egérmodelleken végzett megfigyelések azt sugallták, hogy a CD73-nak védő szerepe lehetvesekárosodás; azonban nincs közvetlen bizonyíték az emberben betöltött szerepérevesebetegséga mai napig leírták. Itt azt feltételeztük, hogy a podocita sérülése emberbenvesebetegségekmegváltoztatja a CD73 expresszióját, ami megkönnyítheti a podocitopátiák diagnosztizálását. Megvizsgáltuk a CD73 és egyik funkcionálisan fontos célpontja, a CC 2-es típusú kemokin receptor (CCR2) expresszióját podocitákban.vese39 podocitopátiában (beleértve fokális szegmentális glomerulosclerosisban (FSGS), minimális változási betegségben (MCD), membranosus glomerulonephritisben (MGN) és amiloidózisban szenvedő) és egy kontrollcsoport biopsziája. A podocita CD73 expressziója mindegyik betegségcsoportban szignifikánsan megnövekedett a kontrollokhoz képest (p < 0.0{{10}}1–p="">< 0,0001).="" ezenkívül="" markáns="" negatív="" korreláció="" volt="" a="" cd73="" és="" a="" ccr2="" expressziója="" között,="" amit="" immunhisztokémia="" és="" immunfluoreszcencia="" is="" megerősített="" (pearson="" r="−" 0,5068,="" p="0,0031;" pearson="" r="−" 0,4705,="" p="0,0313)," így="" a="" cd73="" védő="" szerepére="">vese sérülés.Végül azonosítjuk a CD73-at, mint a humán podocitopátiák új lehetséges diagnosztikai markereit, különösen az MCD-t, amely a fénymikroszkóppal és immunhisztokémiával felismerhető kóros jellemzők hiányáról volt hírhedt.
Kulcsszavak:podocita; minimális változási betegség; CD73; CCR2;vesekárosodás;veseelégtelenség
Bevezetés
Az adenozin-trifoszfát (ATP) mint mindenütt jelenlévő intracelluláris energiaforrás evolúciós döntő szerepét több mint három évtizeddel ezelőtt frissítették azzal a forradalmi elképzeléssel, hogy a purinerg rendszer tagjai (ATP, adenozin-di- és trifoszfát (ADP és AMP)) extracelluláris jeleket is továbbíthat a sejtinterakciók közvetítésére [1, 2]. Ez a koncepció annak megértéséhez vezetett, hogy a purinerg rendszer részt vesz az immunválaszok kialakításában a receptor expressziós profiljának modulációján, a citokin szekréción, a reaktív oxigénfajták (ROS) és intracelluláris patogén emésztés [3–7]. Az extracelluláris ATP átalakul/defoszforilálódik ADP-vé és AMP-vé a CD39-en (ekto-nukleozid-trifoszfát-difoszfohidroláz 1) keresztül, végül az AMP-t a CD73 (ekto{9}} [nukleotidáz) [nukleotidáz] adenozinná bontja. A CD73 membránhoz kötött vagy oldható formában lehet jelen A membránforma dimer-szerkezete két azonos 70 kD-os alegységből áll a plazmamembrán a C-terminális szerin és a glikozil-foszfatidil-inozitol (GPI) közötti kapcsolaton keresztül [9]. Figyelemre méltó, hogy az ATP és ADP CD39 szubsztrátjai a CD73 kompetitív gátlóinak tűnnek [9-11]. A CD73 expresszió tehát az adenozinszint beállításának kritikus útvonala az extracelluláris térben. A CD73 nem sejt- vagy szervspecifikus molekula; kifejeződése különböző szervek leukocitáin, endotéliumán, epiteliális vagy mezenchimális sejtjein (vese, tüdő, máj, vastagbél, agy és szív) és őssejtek jól dokumentált [12-14]. Az adenozin nitrogén-monoxid (NO) szintézis útvonalon keresztüli védő szerepét egy máj iszkémia által kiváltott károsodásban először Peralta és munkatársai számolták be. [15]. Ezekkel az adatokkal összhangban hatásáról kimutatták, hogy javítja az akut tüdőkárosodást, az allograft légúti kilökődést, az akut graft-versus-host betegséget és a szepszist [4,16–19].
A CISTANCHE JAVÍTJA A vese-/veseelégtelenséget
Amint azt számos egérmodell meggyőzően bizonyítja, a CD73 részt vehet a tubulo-glomeruláris kölcsönhatásban avese. Az ischaemia-reperfúziós károsodás során a CD73 által a tubuláris eredetű ATP-ből származó adenozin CD73 által közvetített képződése kimutatták, hogy a neutrofilek effektor funkciójának gátlásán keresztül mérsékli a gyulladást [20]. Ezen túlmenően a CD73-hiányos egerek autoimmun gyulladást mutatnak, amelyet csökkent podocitaszám és endothel fenestráció kísér [21]. Ez a jelenség a gyulladást elősegítő citokinek, például a tumor nekrózis faktor (TNF)-alfa vagy a kemokin CXC motívum ligand 2 (CXCL-2) szérumszintjének emelkedésével járt. Emberi környezetbenvesebetegség,azt feltételezték, hogy a podocita károsodás valószínűleg a patológiás ingerekre adott sejtválasz adaptív és destruktív mechanizmusainak keveréke, amely nem feltétlenül tükrözi az in vitro vagy állati modellekből származó megfigyeléseket. A podocita sérülés etiológiája a mechanikai stressztől (glomeruláris hiperfiltráció), oxidatív stressztől (például hipertóniás vagy diabéteszes nefropátia, toxikus sérülés, gyulladásos sejtinfiltráció vagy minimális változást mutató betegség állatmodelljei) az immunológiai stresszig (azaz immunkomplex és komplement által közvetített károsodás) változik. glomerulonephritis során) [22]. A glomerulonephritis gyulladásos háttere serkentheti a podocitákat különböző citokinek szintetizálására, potenciálisan a CC kemokin receptor 2 (CCR2) által közvetített jelátvitelen keresztül. Ennek ellenére keveset tudunk a CD73 emberben betöltött szerepérőlvesebetegség, különösen krónikus gyulladás és podocita sérülés esetén.
Jelen tanulmányban azt feltételeztük, hogy a CD73 szerepet játszik a humán glomeruláris betegségek patogenezisében, és elemeztük a podocita CD73 expresszióját emberi szervezetben.vesebiopsziák podocitopátiával összefüggő patológiás betegektől. Kimutattuk, hogy a CD73 podocita felszíni expressziója a podocita károsodás megbízható markere, így különösen alátámasztja a CD73 diagnosztikai értékét minimális változási betegségben (MCD). Ezenkívül negatív korrelációról számolunk be a podocita CCR2 és a CD73 expressziója között, ami arra utal, hogy a CD73 túlzott expressziója adaptív választ jelent a glomeruláris lézióra.
Eredmények
A podocita károsodás klinikai adatai és ultrastrukturális képalkotásaAz 1. táblázat felvázolja a vizsgálatba bevont esetek klinikai bemutatását az életkor, a nem, a kreatinin és a teljes proteinuria értékek tekintetében. Minden FSGS-beteg elsődleges NOS (másképpen nem meghatározott) formával rendelkezett. 12 MGN-beteg közül 5 volt foszfolipáz A2 receptor (PLA2R) pozitív (42 százalék). Az amiloidózisos csoportban 2 betegnél volt AA-amiloidózis (16,7 százalék) és 10 AL-amiloidózisban (83,3 százalék); 2 AL-amiloidózisban szenvedő betegnél a könnyű lánc kappa volt evidens (20 százalék), 8 betegnél pedig lambda-pozitív (az AL-amiloidózis csoport 80 százaléka). Az összes MCD-ben, FSGS-ben, MGN-ben és amiloidózisban szenvedő betegnél a podocita károsodás egyértelműen kimutatható volt elektronmikroszkóppal (1. ábra).
1. ábra Primer és szekunder podocita károsodás ultrastrukturális képe. ( a ) Podocita test elterjedése glomeruláris alapmembránon (nyíl) a lábnyúlványok visszahúzásával MCD esetén. (b) Kiterjedt podocita lábfolyamat kiürülése (nyíl) és citoplazmatikus vakuolizáció (csillag) elsődleges FSGS-ben szenvedő betegben. (c) A lábfolyamat kiürülése (nyíl), vakuolizáció és kiemelkedő organellumok (kettős nyíl) a mögöttes epimembrános elektronsűrű anyaggal (csillag) primer membrános glomerulonephritisben. (d) Amyloid-fibrillumok szubepiteliális felhalmozódása (kétfejű nyíl) egymást követő podocitaleválással (az irreverzibilis podocita károsodás jeleként) AL-amiloidózisban (lambda) szenvedő betegben. Az összes elektronmikroszkópos felvétel 4000-szoros nagyításban látható. Betétek – megfelelő fénymikroszkópos mikrofényképek (40 × /0,65 NA; skálasáv mérete: 50 µm (a, c, d) és 100 µm (b); PAS-festés).
A CD73 felszíni expressziója összefügg a podocita sérüléssel emberi vesebetegségben
Annak felderítésére, hogy a podociták expresszálják-e a CD73-at fiziológiás környezetben, és kiértékeljük a CD73 topodocita károsodásával összefüggő különböző betegségbeállítások mintázatát, elvégeztük a CD73 expressziójának immunhisztokémiai elemzését. Az ultrastrukturális analízis a podocita károsodást citoszkeletális szabálytalanságként igazolta, legalább a lábfej kiürülésével (1. ábra). Podocita lézió nélküli negatív kontrollcsoportunkban a CD73 szignifikáns podocita expressziója nem volt kimutatható annak ellenére, hogy egy belső kontroll (peritubuláris kapillárisok) pozitiv volt, amely jellemzően pozitívan festődik (2. ábra). Másrészt a podocita károsodási csoportok (MCD, FSGS, MGN és amiloidózis) statisztikailag igen szignifikáns podocita CD73 upregulációt mutattak (p < 0.{{1{{20}}}}="" 001);="" a="" szignifikáns="" növekedés="" konzisztens="" volt="" az="" egyedi="" entitások="" negatív="" kontrollokkal="" való="" összehasonlításakor="" is="" (p="" legalább="">< 0,001).="" érdekes="" módon="" a="" cd73="" upreguláció="" mértéke="" alacsonyabb="" volt="" az="" mcd="" csoportban,="" jóllehet="" szignifikánsan="" csak="" az="" mgn="" mintákkal="" összehasonlítva="" (p="0.0043)" (2.="" ábra).="" a="" podocita="" károsodási="" csoportokban="" nem="" volt="" összefüggés="" a="" szemikvantitatív="" cd73="" pontszám="" és="" a="" proteinuria="" között="" bináris="" (nefrotikus/nem="" nefrotikus)="" vagy="" kvantitatív="" (g/24="" óra)="" szinten="" (spearman="" r="−" 0,0807,="" p="0" .6302="" és="" spearman="" r="−" 0,076,="" p="0,6497;" 3a.="" ábra).="" összességében="" nem="" volt="" összefüggés="" a="" cd73="" pontszám="" és="" a="" kreatinin="" szint="" között="" (spearman="" r="0.0722," p="0.6259;" 3b.="" ábra).="" ezenkívül="" nem="" tudtunk="" kimutatni="" szignifikáns="" korrelációt="" a="" cd73="" expressziója="" és="" a="" magas="" vérnyomás="" (spearman="" r="−" 0,03024,="" p="0.8384)" vagy="" a="" cukorbetegség="" (spearman="" r="−" 0,1784,="" p="" {{45)="" között.="">
A podocita eredetű CD73 felszabályozása humán glomeruláris betegségben negatívan korrelál a CCR2 receptor expressziójával, és nem korrelál a nephrin és a podocin expressziójávalÉrtékelve a makrofág CCR2 expressziójának lelassulására vonatkozó publikált adatokat egy őssejtmodellben a CD73 túlzott expresszióját követően, feltételeztük, hogy a CD73 növekedése a podocita sérülés során fordítottan korrelál a gyulladást elősegítő CCR2 expressziójával, és immunhisztokémiai CCR2 analízist végeztünk. A kontrollcsoportban nem, vagy csak enyhe CCR2 expressziót tudtunk kimutatni, anélkül, hogy szignifikáns eltérést tapasztaltunk volna az azonos minták CD73 aláírásához képest. Ezzel szemben a felszíni CCR2 többnyire szignifikáns (még különböző intenzitású) felszabályozása volt megfigyelhető a podocita károsodási biopsziákból származó minták többségében, és általában a kontrollcsoporthoz képest magasabb volt (p=0.0206; Kiegészítő ábra S1). A betegségcsoportok e tekintetben nem különböztek szignifikánsan egymástól.
Tovább elemeztük a lehetséges korrelációt a CD73 és a CCR2 expressziós intenzitása között. Valójában a podocita-sérüléses biopsziás kohorsz CD73 és CCR2 pontszámainak összehasonlítása során jelentős negatív korreláció figyelhető meg (Spearman r=− 0.4821, p=0.{{18} }052), (4. ábra). Megjegyzendő, hogy a CD{11}}pozitív podocitákkal rendelkező glomerulusok nem csak a podocitákban, hanem a környező sejtekben is csökkent CCR2-expressziót mutattak, például a parietális hámsejtekben (4. ábra). Az inverz korrelációt a CD73/CCR2 immunfluoreszcens kofestődésének konfokális mikroszkópos értékelése igazolta sérült podocitákban (Spearman r=− 0,4478, p=0,0282), (5. ábra). A CD73-pozitivitás és a podocita-specifikus fehérje-expresszió (elvesztése) közötti esetleges összefüggés kezelésére további immunfluo-reszcens festéseket végeztünk a nephrin és a podocin esetében, és értékeltük expressziós mintázatukat a kontroll-, MCD- és FSGS-csoportokban (6a. ábra), valamint a társfestést. CD73-mal a podocita lézióval rendelkező mintákban (6b–e ábra). Nem tudtunk kimutatni szignifikáns korrelációt az egyik oldalon a podocin vagy a nephrin expressziójának átlagos fluoreszcencia intenzitása és a másik oldalon a CD73 átlagos expressziója között (n=39, Spearman r=0.212, p {{33}). }.1948 a podocin és n=60, Spearman r=0.01906, p=0.8851 a nephrin esetében).
Vita
Itt írjuk le először a CD73 expresszióját sérült podociták felszínén emberbenvesebetegség. Elemzésvese-A prominens podocitakárosodásban szenvedő betegek biopsziái, mint például MCD, FSGS, MGN és amiloidózis, a podocita CD73 expressziójának jelentős felszabályozásáról számolunk be ezekben a csoportokban a kontrollhoz képestvese,független a podocita károsodás etiológiájától. Ezenkívül fordított korrelációról számolunk be a CD73 és a CCR2 expressziója között a podocita károsodási csoportok podocitái által. Kimutatták, hogy az erősített podocita-specifikus CCR2 közvetíti a cukorbetegségetvesekárosodásegerekben [23]. Ezenkívül a CCR2 blokkolása az FSGS Adriamycin-indukálta egérmodelljében csökkenti a proteinuriát és a glomeruláris sérülést [24]. Lee és munkatársai nemrégiben végzett tanulmánya – szintén egérmodellel – azt jelzi, hogy a CCR2 kimerülése az oxidatív stressz és a lipid felhalmozódás blokkolása révén enyhítheti az elhízás által kiváltott albuminuriát [25]. Valójában egy egér szívburokszövetből származó mezenchimális őssejteket (MSC) alkalmazó in vitro rendszerben kimutatták, hogy a CD{7}}túlexpresszáló MSC-k gyulladásgátló aktivitása révén reparatív folyamatokat diktálnak, többek között a CCR{ gátlása miatt {9}}pozitív makrofág infiltráció [13]. Eredményeink és publikált adataink fényében tehát csábító az a feltételezés, hogy a podociták általi CD73 expresszió védelmet nyújthatvese sérülés, esetleg a CCR2-t gyengítő útvonalakon keresztül. A CCR2 jelátvitel szorosan összefügg a makrofágok adhéziójával és aktivációjával [26, 27]. Mivel a makrofágok befolyásolhatják a podocitopátiával összefüggő patogenezistvesebetegségek(mint az elsődleges MGN, ahol a CD68 plusz, a CCR2 plusz makrofágok beszűrődését a végstádium jelentős indikátoraként ismerték elveseelégtelenség[28]), további tanulmányok a monocita/makrofág tartalom, eredet (infiltráló vs. rezidens), aktivációs profilok (M1 – proinflammatorikus vs. M2 – alternatív módon aktiválva) és a CD73 expressziója közötti összefüggésről emberben.vesebetegségszükségesek ahhoz, hogy ellenőrizzük eredményeinket az egérmodellek korábbi adataival.
A hipoxiában, ischaemia-reperfúzióban vagy autoimmun szövetkárosodásban megfigyelhető gyulladásos mikromiliőben több sejt szabadítja fel a purinerg jelátviteli rendszer tagjait, túlnyomórészt pro-inflammatorikus ATP vagy ADP formájában [29, 30]. Ezekben a beállításokban az ekto-nukleotidáz CD73 és a termék adenozinja fontos tényező az immunválasz szabályozásában és elnémításában. Állatmodellekben a CD73 védő hatásúnak bizonyultveseischaemia reperfúziós sérülés és annak hiánya által kiváltott podocita diszfunkció, ami autoimmun gyulladáshoz ésvesebetegség[21, 31]. Más, ischaemiás reperfúziós sérülést alkalmazó egér in vivo kísérletek feltárták a CD73 fontos gyulladáscsökkentő hatását, amelyet a proximális tubuláris epiteliális sejtek expresszálnak, és döntő hatásátvesevédelem a diabéteszes nephropathia során az adenozin-endothel Adora2b receptor jelátvitel révén [20,32]. A podocitopátiák a proteinuriához vezető glomeruláris elváltozások leggyakoribb csoportja. Az MCD, az „elsődleges” podocitopátia prototípusa, a nephrosis proteinuria leggyakoribb oka 1 évesnél idősebb gyermekeknél [33, 34]. Az MCD patogenezisével kapcsolatos jelenlegi hipotézisek a citokinek és más immunmediátorok jelentős szerepére utalnak a podocita-glomeruláris alapmembrán integritásának megzavarásában [35-38]. A fénymikroszkópos látható változások hiánya és a súlyos proteinuria közötti eltérés az MCD jellemzője; A podocita károsodás elektronmikroszkópos ultrastrukturális bizonyítéka tehát a mai napig az MCD diagnózisának conditio sine qua nonja. Ez a diagnosztikai algoritmus hangsúlyozza a további első vonalbeli diagnosztikai eszközök jelentőségét ebben a tekintetben. A CD73 expressziójának vizsgálata, különösen az elektronmikroszkópos korlátozott elérhetőség mellett, segíthet a proteinuria glomeruláris (azaz podocitopátiás) és extraglomeruláris (pl. tubuláris vagy paraproteinémiás) forrásainak megkülönböztetésében. Vizsgálatunkban az immunhisztokémia és az immunfluoreszcencia összehasonlítása az utóbbi mellett szólna.
A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE-/VESEBETEGSÉGET
Számos publikáció meggyőzően dokumentálta a podocita-specifikus fehérjék aberráns eloszlását és elvesztését különbözővesebetegségolyan beállítások, amelyek magukban foglalják a podocita sérülést és a proteinuriát, a közelmúltban áttekintettek szerint [39]. Vizsgálatunkban a podocita-károsodás csoporton belül nem tudtunk kimutatni szignifikáns összefüggést a podocin/nephrin fluoreszcencia intenzitása és a CD73 expresszió intenzitása között. A specifikus korlátok azonban kizárják a podocin/nephrin vs. CD73 statisztikai adatok patofiziológiai értelmezését. Először is, a fluoreszcencia intenzitás értékeléséhez podocitákat választottunk ki a konfokális mikroszkópos technikai nagyítási és felbontási kapacitások felhasználásával. Bár ezek a feltételek könnyen lehetővé teszik a podocita testek kimutatását, a főbb folyamatok és különösen a lábfej folyamatai továbbra is homályosak, ezért valószínűleg nem jelölik/elemzik őket. Másodszor, a CD73 és a podocita-specifikus fehérjék teljes glomerulusokban való expressziója közötti összefüggés nem igazolható: bár a podocin és a nephrin ezen a szinten történő értékelése jogos lenne (mivel ésszerűen feltételezhető, hogy más glomeruláris sejt nem expresszálja ezeket a fehérjéket), ez nem CD73-ra állítják, amelyet legalább részben az endotélsejtek expresszálnak. Harmadszor, az átlagos fluoreszcencia intenzitás önmagában a podocita sérülés független markereként való értékelése megkérdőjelezhető, mivel nem fedi le a podocin és a nephrin patológiás, szemcsés eloszlási mintázatát a glomeruluson belül, amit a 6. ábrán egyértelműen megfigyelhettünk. Ezért nem vagyunk hajlandóak hogy a CD73-podocin és CD73-nephrin korreláció hiányát elemzésünkben e markerek eltérő molekuláris útvonalainak tulajdonítsuk. További podocita in vitro és állatkísérletek szükségesek a jelátviteli kaszkádok közötti esetleges interferencia feltárásához.
Összességében, felismerve a kis mintaméretet vizsgálatunk fő korlátjaként, itt bemutatjuk a sérült podociták következetes CD73 túlzott expresszióját, és a CD73-at javasoljuk a podocitopátia új diagnosztikai markereként. Minimális elváltozású betegség esetén eredményeink segíthetnek a sérült podociták azonosításában, és kevésbé idő- és költségigényes diagnosztikai folyamatot eredményezhetnek. Ezen túlmenően eredményeink összhangban vannak az egérkísérleti megközelítésekből származó publikált adatokkal, és védő kölcsönhatást sugallnak a CD73 és a CCR2 között emberben.vesebetegség. További többközpontú vizsgálatokra van szükség nagyobb betegcsoportokkal a CD73 jelátviteli mechanizmusainak kezeléséhez emberbenvesebetegség és annak prognosztikai értéke. Hasonlóképpen nagyobb kohorszszámra lenne szükség a betegség súlyossága és a CD73 expressziója közötti lehetséges korreláció megállapításához.
Anyag és módszerek
Tanulmányi kohorszA tanulmányban 49 különböző betegtől származó, összesen 49 biopsziát diagnosztizáltak 2018. január 1. és 2019. december 31. között a mannheimi egyetemi kórházban, a Heidelbergi Egyetemen. További kiválasztási kritériumok voltak a reprezentatív biopszia, amely lehetővé tette hármas diagnosztika elvégzését immunhisztokémiai és EM segítségével, megfelelő klinikai információ, egyértelmű diagnózis és elegendő anyag ehhez a vizsgálathoz. Valamennyi beteg felnőtt és kaukázusi származású volt. A vizsgálatok 39 biopsziát tartalmaztak különböző etiológiájú podocita sérülésben szenvedő betegektől (7 biopsziát primer fokális szegmentális glomerulosclerosisban (FSGS) szenvedő betegektől; 8 minimális változásos betegségből (MCD); 12 membranosus glomerulonephritisben (MGN) szenvedő betegektől; 12 amyloidosisos betegektől). A negatív kontrollok voltakvese10 podocita lézió és proteinuria nélküli beteg biopsziája (6 beteg enyhe nephrosclerosisban, 2 beteg interstitialis nephritisben és 2 beteg kóros elváltozások nélkül). Az összes fent említett biopsziát bevontuk a podocita CD73 expressziójának elemzésébe; a CCR2 esetében, az elégtelen számú nem szklerotikus glomerulussal rendelkező paraffin szakaszok kizárása után (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">
Szövettan, immunhisztokémia, immunfluoreszcencia és elektronmikroszkópiaAz 1 µm-es sorozatmetszetek paraffinba ágyazottan készültekvesebiopsziák és hematoxilin/eozin (H/E), periodikus sav-Schiff (PAS), Masson-féle trikróm festés, valamint standard rutin immunhisztokémia diagnosztikai célokra történő festése. A formalinnal fixált paraffinba ágyazott biopsziák immunhisztokémiai és immunfluoreszcens festését manuálisan végeztük nyúl anti-humán CD73 monoklonális antitest (D7F9A klón, Cell Signaling, Frankfurt am Main, Németország) és egér monoklonális anti-humán CCR2 antitest (7A7 klón; Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság), nyúl poliklonális anti-humán antitest nephrin ellen (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) és nyúl anti-humán podocin antitest (Sigma, Saint Louis, MO, USA), a gyártó protokollja szerint. Az összes biopsziát bevontuk a podocita CD73 expressziójának immunhisztokémiai elemzésébe; a CCR2 esetében nem elegendő számú nem szklerotikus glomerulussal rendelkező paraffin metszetek (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">
A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE/VESE MŰKÖDÉSÉT
Fénymikroszkópos és morfometriai elemzésekA képfelvétel és elemzés az M8 PreciPoint pásztázó mikroszkóppal, Olympus PlanCN 40 × /0.65 objektívvel és MicroPoint szoftverrel (v.5, május 2016; PreciPoint, Freising) történt. , Németország). A podocita CD73 felszíni expressziójának szemikvantitatív értékelését immunhisztokémiai festés során 0-3 pontozási skála segítségével értékeltük (0 – nincs expresszió; 1 – fokális szegmentális pozitivitás (<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">A podociták 50 százaléka pozitív<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50 százalék glomerulus). A CD73 pozitív és negatív podocitákat CCR2 koexpresszióra elemeztük egy intenzitáson alapuló szemikvantitatív pontozási rendszer segítségével (0 – nincs expresszió, 1 – gyenge expresszió, 2 – közepes expresszió és 3 – erős expresszió a biopsziás belső CCR2 pozitív kontroll szerint) endotélium és beszűrődő immunsejtek). Az értékelést két patológus (SP és ZP) egymástól függetlenül, vak módszerrel végezte.
Konfokális mikroszkópiaA CD73 (Alexa Fluor 488), a CCR2 (Alexa Fluor 594) és a podociták sejtmagjai (DAPI) képei egymás után készültek az Olympus FV1000 motoros konfokális mikroszkóppal, amely HeNe 594 nm-es érzékelővel van felszerelve, 488 nm-es argon és egy 405 nm-es UV-dióda lézer és fotosokszorozó csövek (PMT), amelyeket a FluoView szoftver vezérel, a 60 × /1,35 UPlanSApo objektív használatával. A 12-bites képeket 512 × 512 pixeles képkockákkal és 0,41 µm-es pixelmérettel az áttekintésekhez és 0,10 µm-es pixelméretet a nagy felbontáshoz úgy kaptuk, hogy a mikroszkóp összes beállítását állandóan tartották. A képeket tovább dolgozták fel és elemezték egy saját fejlesztésű ImageJ makró segítségével (elérés dátuma: 2020. december 15.). Rövidesen a képeket az egyes podocitákra szegmentáltuk, küszöbértéket alkalmaztunk, és megmértük az átlagos intenzitást, statisztikailag elemeztük és ábrázoltuk. Az összes képet állandó beállításokkal dolgozták fel, és ugyanazzal a pszeudoszínnel jelenítették meg, egyformán lineárisan igazítva az egyes csatornákhoz az egyesített képeken.
Statisztikai elemzésekA statisztikai elemzéseket aGraphPadPrismv használatával végeztük. 8.4.3 szoftver (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Minden adatot átlag ± SEM-ként adunk meg. A statisztikai különbségeket páros vagy nem párosított t-próbával, valamint Pearson korrelációs analízissel számítottuk ki.
