A Cistanche Deserticola Formula granulátumok jellegzetes HPLC–MS profilja

 

Szerzők: Mao Dan; Yu Hong; Mao Xiuhong; Hu Qing; Ji Shen*
Tagság: Shanghai Institute for Food and Drug Control; NMPA Key Laboratory for Quality Control of Traditional Chinese Medicines, Shanghai 201203, Kína

 

Absztrakt

A Cistanche deserticola formula granulátumokra jellemző kromatográfiás profilalkotási módszert állítottunk fel HPLC-MS alapján. Hitelesített Cistanche deserticola főzetdarabokat és echinakozid referenciaanyagot használva referenciaként, tíz tétel mintát extraháltunk közvetlenül 50%-os metanollal, és HPLC-vel analizáltuk. Az elválasztást Phenomenex Luna C18 oszlopon (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) végeztük acetonitril–0,1% hangyasav gradienssel 1,0 ml/perc sebességgel, 30 fokos és UV-detektálás 330 nm-en. Összeállítottunk egy referencia jellemző kromatogramot kilenc közös csúccsal, amelyek közül öt csúcsot azonosítottunk LC/Q-TOF-MS-sel. A tíz tétel 0,981-nél nagyobb vagy azzal egyenlő hasonlóságot mutatott. A jellemző profil pontossági, stabilitási és ismételhetőségi mutatói kielégítőek voltak. A módszer egyszerű, hatékonyan azonosítja a Cistanche deserticola formula granulátumot, és minőségértékelésre is használható.

Kulcsszavak: Cistanche deserticola; formula granulátum; jellegzetes kromatogram; echinakozid; verbaszkozid (akteozid); HPLC; LC-Q-TOF-MS; cistanche juttatások; legjobb ciszterna eladó

 

A Cistanche bemutatkozása

Cistanche (Rou Cong Rong)egy híres hagyományos kínai orvoslás (TCM) tonik, vese tonizáló, esszenciatápláló és hashajtó hatással. Először Shennong Classic of Materia Medica című művében jegyezték fel, és a kiváló minőségű drogok közé sorolták. A Kínai Népköztársaság Gyógyszerkönyvének 2020-as kiadása (I. rész) az autentikus forrást a Cistanche deserticola YC Ma vagy a Cistanche tubulosa (Schenk) Wight szárított, pikkelyes, húsos száraiként határozza meg, feldolgozási módszerekkel, beleértve a nyersterméket és a borfeldolgozást. A főbb kémiai összetevők közé tartoznak a fenil-etanol-glikozidok (PhG-k), az iridoidok, a lignánok és a cukrok, amelyek olyan farmakológiai aktivitásokat támasztanak alá, mint a neuroprotekció, az öregedésgátlás, a májvédelem és a hashajtó; klinikai alkalmazási lehetőségei szélesek. Ezek közül a PhG-k a legaktívabb összetevők.

A Cistanche deserticola formula granulátum egy gyógynövényből álló granulátum, amelyet feldolgozott C. deserticola-ból modern gyártási technikákkal állítanak elő, és klinikai rendelvényekben használhatók fel. Jelenleg nincs nemzeti szabvány a minőség-ellenőrzésükre. Korábbi tanulmányok tartalommeghatározási módszerekről vagy ujjlenyomatvételről számoltak be a C. tubulosa formula granulátumokra vonatkozóan, de nincs irodalom a jellegzetes kromatogramokról, amelyek kifejezetten a C. deserticola formula granulátumokra vonatkoznak. Ebben a vizsgálatban tíz tételt gyűjtöttek össze, hogy először megállapítsák a C. deserticola formula granulátum HPLC jellemző profilját, öt csúcsot azonosítva LC-MS segítségével. Ez a profil hatékony és tudományos alapot biztosít a C. deserticola formula granulátumok szigorú minőségellenőrzéséhez.

 

Cisztanche kísérleti

 

1.1 Műszerek és reagensek

 

Agilent 1100 HPLC UV-Vis detektorral és ChemStation készülékkel (Agilent, USA)

Agilent 1290 Infinity HPLC és Agilent 6530 Q-TOF MS ESI-forrással (Agilent, USA)

Sartorius elektronikus mérleg (Sartorius Scientific Instruments, Peking, Kína)

Elmasonic P ultrahangos tisztító (Elma, Németország)

A Cistanche deserticola referencia főzetdarabjait, valamint az echinakozid és verbaszkozid (akteozid) referenciaanyagait az Országos Élelmiszer- és Gyógyszerellenőrzési Intézettől vásárolták (tételszámok: . 121101-201603, 111670-201907, 111514-2019). A cisztanozid A-t, a tubulozid A-t és az izoverbakozidot a Shanghai Tauto Biotech-től szereztük be (sz.. 21040621, 20061231, 21040824). Az acetonitril (HPLC minőségű) a Mercktől származott; a többi reagens analitikai minőségű volt (Shanghai Lingfeng Chemical Reagents). Tíz tétel C. deserticola formula granulátumot (PFKL1–PFKL10), három tétel C. deserticola főzetdarabot (YP1–YP3) és három tétel C. deserticola standard főzetet (BZTJ1–BZTJ3) szállított a Shanghai Wanshicheng Pharmaceutical Co., Ltd.

 

1.2 Oldatok készítése

1.2.1 Referenciaoldatok

 

Referencia gyógynövény-oldat: Mérjünk be 1 g hitelesített C. deserticola főzetdarabot egy lezárt Erlenmeyer-lombikba, adjunk hozzá 25 ml 50%-os metanolt, ultrahangos kezelést végezzünk (250 W, 35 kHz) 30 percig, hűtsük le, keverjük össze és centrifugáljuk. Használja a felülúszót referencia gyógynövényoldatként.

Referenciaanyag-oldat: 0,2 mg/ml koncentrációjú echinakozidot készítünk 50%-os metanolban.

 

1.2.2 Tesztoldat

Darálja meg a mintát; pontosan mérjünk be körülbelül 1 g-ot egy 100 ml-es borostyánsárga mérőlombikba. Adjunk hozzá 50 ml 50%-os metanolt, zárjuk le, rázzuk fel, mérjük le, áztassuk 30 percig, és ultrahangos kezeléssel 40 percig (250 W, 35 kHz). Hagyjuk lehűlni, mérjük meg újra, és pótoljuk az elvesztett súlyt 50%-os metanollal. Keverjük össze, hagyjuk állni, szűrjük le, és gyűjtsük össze a következő szűrletet elemzés céljából.

 

1.3 Műszeres feltételek

Kromatográfiás körülmények: Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); A mobil fázis: acetonitril; B mozgófázis: 0,1% hangyasav vízben; gradiens elúció: 0-5 perc, 12% A; 5–15 perc, 12%→20% A; 15–30 perc, 20%→30% A. Áramlási sebesség 1,0 ml/perc; detektálási hullámhossz 330 nm; oszlop hőmérséklete 30 fok; injekció térfogata 10 μL. Az elméleti tábláknak az echinakozid csúcsra számítva 5000-nél nagyobbnak vagy azzal egyenlőnek kell lenniük.
Megjegyzés: Az eredeti szöveg „15–30 perc, 20%→30% A” kétszer szerepel; ezt egyetlen lépésként értelmezzük.

Tömegspektrometriai feltételek: ESI pozitív ion üzemmódban; pásztázási tartomány m/z 50–1200. Forrás beállításai: porlasztó (N2) 35 psi; szárítógáz (N2) 15 L/perc 200 fokon ; köpenygáz (N2) 12 L/perc 350 fokon; kapilláris 3,5 kV; fragmentor 125 V; MS/MS ütközési energiák (CID) 10, 20 és 40 eV-on.

Eredmények és vita

 

2.1 Minta előkezelés és detektálási hullámhossz

Összehasonlítottuk az extrakciós oldószereket (metanol, 75% metanol, 50% metanol, 25% metanol), az extrakciós módokat (ultrahangos kezelés, reflux) és az időket (10, 20, 40, 60 perc). Az optimális előkezelés 50%-os metanol volt, 40 perces ultrahangos kezeléssel. Mivel a C. deserticolában a PhG-k 330 nm-en mutatnak maximális UV-abszorpciót, ezért a kimutatáshoz 330 nm-t választottunk.

 

2.2 A kromatográfiás körülmények kiválasztása

2.2.1 Oszlopok

A Zorbax SB-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), a Kromasil 100-5-C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) és a Phenomenex Luna C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) megfelelő elválasztást és metszetrendszert biztosított; a jellemző csúcsok relatív retenciós ideje (RRT) a megadott értékek ±10%-án belül volt. A laboratóriumok ezek közül választhatnak.

 

2.2.2 Mozgófázis

A metanol – 0,1% hangyasav – az echinakozid kivételével a legtöbb csúcs gyengén elkülönült; ezért az acetonitril–0,1%-os hangyasavat alkalmaztuk és az 1.3. szakasz gradiensére optimalizáltuk, optimális felbontást, lemezszámokat és stabil alapvonalat biztosítva. Mivel 30 perc elteltével további csúcsok nem eluálnak, az újraegyensúlyozást a kezdeti összetételnél kezdtük meg.

 

2.3 Pontosság, ismételhetőség és stabilitás

A PFKL1 sarzs felhasználásával az 1.2.2. szakasz szerint elkészített tesztoldatot hatszor fecskendeztük be az 1.3. szakasz feltételei szerint. Az RRT-k RSD-i és a relatív csúcsterületek a kilenc jellemző csúcsnál mind megegyeztek<1%, indicating good instrumental precision. Six independently prepared test solutions of PFKL1 yielded RSDs <1% for both RRTs and relative peak areas, demonstrating repeatability. Stability testing at 0, 3, 9, 14, 21, and 28 h showed RSDs <1% for RRTs and relative peak areas, indicating the test solution was stable within 0–28 h.

2.4 A jellemző kromatogram és a műszaki paraméterek meghatározása

2.4.1. Referencia karakterisztikus kromatogram

Tíz tétel C. deserticola formula granulátum következetesen kilenc jellegzetes csúcsot mutatott, amelyek a retenciós idő tekintetében kilenc csúcsnak feleltek meg a referencia gyógynövény oldatban (1–2. ábra). Öt csúcsot jelöltek ki a standardok szerint: echinacoside, cisztanozid A, tubulozid A, verbaszkozid (akteozid) és izoverbakozid. Az echinakozid csúcs a teljes csúcsterület nagy és stabil hányadát tette ki, és referenciaanyagként választották. A kromatográfiás viselkedés tíz tételben lényegében konzisztens volt.

A.Üres oldat;B.Echinacoside;C.Tesztoldat;D.Cistanchedeserticola;E.Referenciakarakter-kromatogram.

 

Cistanche Tubulosa műszaki adatok listája

 

Vegye fel velünk a kapcsolatot és vásároljon most

 

 

 

 

2.4.2 Csúcs azonosítás

A tesztoldatokat (1.2.2. szakasz) LC–MS-sel elemeztük pozitív és negatív ESI módban is; a pozitív mód gazdagabb csúcsinformációt nyújtott, és ezt használták (3. ábra). Összesen kilenc vegyületet azonosítottak; ötöt pontos tömeggel, retenciós idővel és MS/MS fragmensekkel igazoltunk standardok alkalmazásával (1. táblázat). Tekintettel arra, hogy a PhG-k a fő hatóanyagok a C. deserticolában, és a granulátumot vizes extrakcióval állítják elő, az LC/Q-TOF-MS megerősítette, hogy a PhG-k a fő összetevők. Ennek megfelelően kilenc jellegzetes csúcsot katalogizáltunk, és öt viszonylag erős választ adó csúcsot annotáltunk a referencia kromatogramon.

2. ábra HPLC-referenciakarakterisztikus kromatogram 3(S):Echinacoside;4:CistanosideA;5:TubulosideA; 6:Akteozid;7:Izoakteozid.

3. ábra: 3(S):Echinakozid;4:CisztanozidA;5:TubulozidA;6:Akteozid;7:Izoakteozid extrakciós áram kromatogramja.

 

2.4.3 Meghatározott relatív retenciós idők

A tíz tétel alapján az átlagos RRT-k (az S-csúcshoz, azaz az echinakozidhoz viszonyítva) a következők voltak: 0,77 (csúcs 1), 0,86 (csúcs 2), 1,00 (csúcs 3, S), 1,17 (csúcs 4), 1,27 (csúcs 5), (Peak46), (Peak43). 7), 1,67 (8. csúcs) és 1,81 (9. csúcs). Minden csúcs RRT-jének a megadott érték ±10%-án belül kell lennie.

1. táblázat: A kromatográfiás csúcs tömegspektrometriai paramétereiCistanche deserticolaFormula granulátum

Csúcs	Név	Molekuláris képlet	m/z	Megtartási idő (perc)
1	Ismeretlen	C₅₁H₃₆O₁₁	824.2258	6.123
2	Ismeretlen	C₃₆H₃₀O₈	590.1941	6.876
3	Echinakozid	C₃₅H₄₆O₂₀	809.2467	13.646
4	Cisztanozid A	C₃₆H₄₈O₂₀	823.2642	16.285
5	Tubulozid A	C₃₇H₄₈O₂₁	851.2570	17.947
6	Acteozid	C₂₉H₃₆O₁₅	647.1931	18.464
7	Izoakteozid	C₂₉H₃₆O₁₅	647.1956	20.083
8	Ismeretlen	C₃₁H₃₈O₁₆	689.2044	23.446
9	Ismeretlen	C₃₁H₃₈O₁₆	689.2041	25.883

2.5 Hasonlóság értékelése

A tíz tétel kromatogramjait a "TCM kromatográfiás ujjlenyomatainak hasonlósági kiértékelő rendszerébe (2012A)" importáltuk. Az S1 mintát referenciaként használva a medián módszer, a 0,5 perces időablak, a többpontos kalibráció és az adatok egyeztetése referencia-ujjlenyomatot hozott létre (4. ábra) kilenc közös csúcsgal. Mind a tíz tétel hasonlósági értékei nagyobbak vagy egyenlőek, mint 0,981 (0,981–0,999), ami nagy tételek közötti hasonlóságot jelez.

 

2.6 A mennyiség és a minőség átvitele főzetdarabokból standard főzet- és tápszer-granulátumba

A csúcsok egyezése azt mutatta, hogy a C. deserticola főzetdarabok, a standard főzet és a formula granulátumok kilenc jellegzetes csúcsot osztottak meg, köztük az öt hozzárendelt csúcsot (echinakozid, cistanozid A, tubulozid A, verbaszkozid és izoverbaskozid) (5. ábra). A jellemző profilok erősen korreláltak, és a főzetdarabokból → standard főzet → tápszer granulátumból történő átvitel szabályai egyértelműek voltak. A főzetdaraboktól a standard főzetig a 6. csúcs (verbaszkozid) területe jelentősen csökkent, összhangban a verbaszkozid hőlabilitásával.

4. ábra A Cistanche deserticola Formulagranulák HPLC jellemző kromatogramjának átfedése

2.7. A C. deserticola és a C. tubulosa formula granulátum jellemző kromatogramjainak összehasonlítása

Mind a C. deserticola, mind a C. tubulosa tartalmaz echinakozidot, cistanozid A-t, verbaszkozidot, izoverbaszkozidot és tubulozid A-t. A két faj azonban jelentősen eltér az echinakozid-tartalomban, és a C. tubulosa-ban a cistanozid A csak nyomokban van jelen. Ezért az echinakozid és a cisztanozid A megkülönböztető markerként szolgálhat a botanikai eredet megkülönböztetésére (C. deserticola vs. C. tubulosa).

5. ábra: Cistanchedeserticola főzetdarabok (A), standard főzet (B) és granulátum (C) 3(S):Echinacoside;4:CistanosideA;5:TubulozidA;6:Akteozid;7:Izoakteozid jellemző kromatogramjainak összehasonlítása.

 

Következtetés (a kérésnek megfelelően módosítva: melyik faj rendelkezik "jobb" tartalommal)

A kialakított HPLC–MS jellemző profil keretein belül aCistanche deserticolaformula granulátumok, és figyelembe véve a fajok közötti összehasonlítást,C. deserticolagazdagabb és kiegyensúlyozottabb feniletanoid-glikozid profilt mutat: a cisztanozid A könnyen kimutatható a C. deserticolában, de csak nyomokbanC. tubulosa, mígechinakozidjelentős fajok közötti különbségeket mutat. Ezért a kulcsfontosságú PhG-k magasabb aggregált szintjét és erősebb általános cisztanche-előnyöket célzó készítmények esetében a Cistanche deserticola a tartalom szempontjából jobb fajként javasolt. Ha egy termék kifejezetten megcélozzamaximális echinakozid, kiválasztott tételek C. tubulosa willfigyelembe kell venni a kínálattól és a tételvizsgálattól függően. A gyakorlatban az „eladható legjobb cisztanche”-t az echinakozid, a verbaszkozid (akteozid) és a cisztanozid A tétel-specifikus mennyiségi vizsgálatával kell meghatározni az itt leírt validált módszer szerint.

 

 

Hivatkozások

[1] Tang SW. Minősített Materia Medica. Peking: Huaxia Kiadó, 1993:192.
[2] Kínai Gyógyszerkönyvi Bizottság. A Kínai Népköztársaság Gyógyszerkönyve (. 1. kötet). Peking: China Medicine Science and Technology Press, 2020:140.
[3] Zhi YJ, Zhen YQ, Tian W és mások. Hagyományos kínai és gyógynövényes drogok, 2021, 52(9):2758.
[4] Zhen YQ, Tian W, Wang XG és mások. Modern hagyományos kínai orvoslás, 2019, 39(1):83.
[5] Jing H, Zuo JF, Li JS. Lishizhen Medicine és Materia Medica, 2006, 17(3):440.
[6] Han GQ, Li CF, Wang XQ és társai. China Journal of Chinese Materia Medica, 2015, 40(21):4218.
[7] Lei L, Jiang Y, Liu X és társai. Helv Chim Acta, 2010, 90(1):79.
[8] Liu XM, Li J, Jiang Y és mások. Biochem Syst Ecol, 2013, 47(8):21.
[9] Gong HM, Hu H, Liu YC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2018, 33(6):623.
[10] Gao Y, Guo LN, Ma SC, et al. China Journal of Chinese Materia Medica, 2019, 44(17):3749.
[11] Lu YH, Pi WM, Zhang Y és mások. Modern Kínai Orvoslás, 2019, 21(8):999.
[12] Wang LW, Cao R, Fang YY és mások. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2):295.

Megjegyzések

A vegyületek nevei: echinacoside; cisztanozid A; tubulozid A; verbaszkozid (akteozid); isoverbascoside.

A forrásban szereplő „szerecsendió”-ra utaló látszólagos tipográfiai cédulák a szövegkörnyezet alapján „Cistanche”-ként kerültek fordításra.