Hogyan lehet tanulmányozni a herba Cistanches genetikai sokféleségét?
Mar 14, 2022
A RAPD tanulmánya a Herba Cistanches genetikai sokféleségéről
Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da
(Kínai Materia Medica Intézet, Kínai Kínai Orvostudományi Akadémia, Peking 100700)
Absztrakt
Célja:A lakosság tanulmányozásáragenetikai sokféleségnak,-nekCistanche deserticolaésCistanche tubulosa.
Mód:Két vadon élő populációCistanche deserticolaés négy vadon élő populációjaCistanche tubulosaRAPD elemezte, és agenetikai sokféleséga populációk közül a POPGENE 1.31-es szoftververziójával elemeztük.
Eredmények:A polimorf lókuszok átlagos százalékos arányaCistanche deserticola47,37 százalék volt, a két populáció polimorf lókuszai 39,47 százalék és 35,53 százalék, Nei átlagos géndiverzitása pedig 0.135 8 volt. Shannoné több volt. Az állapotinformációs index 0.207 2, a géndifferenciációs együttható pedig Gst {{1{{20}}}.254 6. A polimorf lókuszok átlagos százalékos aránya Cistanche-ban 27,59 százalék volt, és a polimorf lókuszok százalékos aránya az egyes populációkban 19,54 százalék és 25,29 százalék között mozgott, amelyből az Andier populációban volt a legmagasabb, 25,29 százalék, és a Nei átlagos géndiverzitása 0 volt. { {21}}, Shannon polimorfizmus információs indexe 0,1258, géndifferenciációs együttható Gst =0.175 5.
Következtetés:Cistanche deserticolaésCistanche tubulosabizonyos különbségek vannak a populációk között. Azgenetikai sokféleségA Desert Cistanche szignifikánsan magasabb, mint a Cistanche tubulosa, és két ökotípusra differenciálódott.
Kulcsszavak: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD; genetikai sokféleség
[Kínai könyvtári osztályozási szám] S 567 [Dokumentumazonosító kód] A [Cikkszám] 1001-5302 (2004) 08-0727-04
A Cistanche a Lidanaceae család Cistanche nemzetségébe tartozó parazita növény, más néven Dayun, amely értékes kínai gyógyászati anyag. Hazámban a Cistanche deserticola fő forrásnövényei a következőkCistanche deserticolaYCMa és C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. A Cistanche deserticola tápnövényei a Haloxylon ammodendron és a Haloxylon ammodendron, amelyek főként az Alashan League-ben, Belső-Mongóliában, Észak-Hszincsiangban, Qinghaiban, Gansuban és más helyeken találhatók. A Cistanche deserticola elterjedése megegyezik a gazdanövényekével. Hazámban a Cistanche cistanche csak a Hszincsiang-i Tianshan-hegységtől délre fekvő Taklimakan-sivatag körüli megyékben található, és elterjedése nincs teljesen szinkronban a fogadó Tamarix-szal. Más régiók, mint például Észak-Hszincsiang, Gansu, Qinghai, Ningxia, Belső-Mongólia, Shaanxi és a Tamarix növények más helyei nem parazita Cistanche Tubula[2]. Az elmúlt években a Cisztanche iránti kereslet gyors növekedése miatt, ami erőforrásainak kihalását eredményezte, a vadon élő ciszternák erőforrásai csak néhány főbb termőterületre zsugorodtak. Mindkettő a veszélyeztetett védett növényfajok közé tartozik hazámban [3], köztükCistanche deserticolabekerült a CITES II. függelékébe [4].
A Cistanche mesterséges nemesítésével kapcsolatos kutatások több éves kutatómunka után sikeresek, a nagyarányú promóció és telepítés stádiumában van. Fenntartható használatának kulcsa azonban, hogy miként lehet megakadályozni a Cistanche fajok ipari termelés során bekövetkező hanyatlását, hogyan lehet mielőbb helyreállítani a korlátozott vadállományt, és megőrizni az értékes vadon élő csíraplazma erőforrásokat. Ami a Cistanche védett örökségét illeti [beérkezés dátuma], 2004-03-11 [alapprojekt] Tudományos és Technológiai Minisztérium szociális jóléti projektje (2001.109.); Tudományos és Technológiai Minisztérium „Tizedik ötéves terv” projekt (2001BA701A09a) [Levelező szerző] * Huang Luqi, Tel:( 010) 64014411-2955, E-mail: huangluqi @263.net Az átvitel vizsgálata még mindig folyamatban van üres. Ez a tanulmány RAPD technológiát használ két vadon élő populáció tanulmányozásáraCistanche deserticolaés 4 vadon élő populációjaCistanche tubulosa, és elemezze mindkettőt A különbség agenetikai sokféleségvárhatóan fontos kísérleti genetikai alapot biztosít a Cistanche, egy értékes kínai gyógyszer védelméhez.
1. Anyag és módszer
1.1 Anyagok
Cistanche deserticolaa hszincsiangi Jimsar megyéből és az Ősi Alxa Liga Jilantai területéről gyűjtötték Belső-Mongóliában. A Cistanche populációkat Minfeng megyéből és Yutian megyéből (Xinjiang) gyűjtötték. Minfeng megye jelenleg az a terület, ahol a legnagyobb a Cistanche cistanche terméshozama, a legnagyobb sűrűségű és viszonylag teljes természetes erdőközösségekkel. A Yutian megyei Andil, Sawuzek, Yatongguz és Daheyan mintavételi helyek a fő termelési területek, amelyek az Andir folyóban, a Yeyike folyóban, a Yatongguzi folyóban és a Kelaniyában találhatók. A folyó alsó szakaszán a populációk közötti távolság több mint 50 km. Minden populáció véletlenszerűen kiválasztott 19-30 személyt. A mintákat gyorsan szilikagélen szárítottuk, és DNS-extrakcióhoz használtuk (1. táblázat).
1. táblázat Mintavétel a Cistanche deserticola és a Cistanche tubulosa populációiból és termőterületeiről
1.2 DNS-kivonás
A teljes DNS extrakciós módszer magas sótartalmú, alacsony pH-jú módszert alkalmaz [5]. A DNS-mintát spektrofotométernek vetettük alá a DNS-templát koncentrációjának kimutatására, majd 1 százalékos agarózgél-elektroforézist, EB-festést, ultraibolya fény alatti megfigyelést és fényképezést, tiszta sávokkal ellátott elektroforézis DNS-t, és kevesebb farokot használtunk a RAPD elemzéshez.
1.3 RAPD primerek szűrése
Mivel a kísérlet azt találta, hogy ugyanaz a primer nem kielégítő hatással van mindkettő egyidejű amplifikációjára.Cistanche deserticolaés Cistanche tubulosa, a primereket egymástól függetlenül szűrtük. Az amplifikációhoz és szűréshez 150 random primert (10 bp), a Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd. 25 μl-es reakciórendszerét használtuk; mindegyik primer 2 populációsablont és 1 sterilizált kétszer desztillált vizet használt vakkontrollként, és 10 primert kapott a tiszta sávokkal, erős polimorfizmussal és jó ismételhetőségű Cistanche deserticola amplifikálására: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }}; 10 primer aCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.
1.4 PCR-amplifikáció és termékdetektálás
A kiválasztott primereket a templát DNS-ének amplifikálására használjukCistanche deserticolaésCistanche tubulosaPCR-rel. A genomi DNS-t templátként 50 ng·μL -1-re hígítottuk a mért koncentrációnak megfelelően. A teljes reakciótérfogat 25 μL, ebből 10 × PCR puffer 2,5 μL, Mg2 plusz 1,5 μL, Taq (5 U·μL -1) 0,2 μL, dNTP keverék (mindegyik 2,5 mM) 1 μL, 5 μM Primer 1 μL, templát DNS 1 μL, sterilizált kétszer desztillált víz 18,8 μL, a fenti PCR amplifikációs oldat a Shanghai Sangon terméke. Az amplifikációt PTC-100 hőcikluson végeztük. Az amplifikációs program 94 fokos elődenaturáció volt 5 percig, majd 40 ciklus. Mindegyik ciklus 94 fokos 45 s-ot, 34 fokot 1 percet, 72 fokot 1 percet 30 s-ot tartalmazott, végül pedig a Hosszabbítást 72 fokon 5 percig. Az amplifikált termékeket 2,0%-os (EB-t tartalmazó) agaróz gélen elektroforézisnek vetjük alá 1×TAE pufferben, majd a SYNGENE gél képalkotó rendszerben megfigyeljük és fényképezzük.
1.5 Statisztika és adatok elemzése
Az elektroforézis spektrumában a reakciótermék megfelelő pozícióját a gélen összehasonlítjuk a molekulatömeg-standardnak megfelelően, és megbecsüljük az amplifikált termék molekulatömegét. A sávot tartalmazó sávot 1-ként, a sáv nélküli sávot pedig 0-ként rögzítjük, 0/1-es mátrixgráfot képezve, és beírva a számítógépbe, a POPGENE32 segítségével a polimorf helyek százalékos arányának kiszámításához. (PPL) az egyes populációkban, Nei géndiverzitási indexe (H), Shannon polimorfizmus információs indexe (I), géndifferenciációs együttható (Gst), géndiverzitás (Ht),Genetikai sokféleség(Hs), Nei (1978) genetikai azonosságát (I) és genetikai távolságát (D) egy populáción belül, valamint a klaszteranalízist UPGMA módszerrel végeztük.
2. Eredmények és elemzés
2.1 A Cistanche genetikai sokfélesége
Minden minta 200 és 2 200 bp közötti molekulatömegű sávokat kapott (1., 2. ábra). Összesen 76 lókuszt mutattak ki 60 mintában 2 populációbólCistanche deserticola, ebből 36 polimorf lókusz volt, ami 47,37 százalékot tesz ki, H=0.135 8, I=0.207 2. Közülük Jimsar PPL-je 39,47 százalék, Gilantyé pedig 35,53 százalék. H jelentése 0. 0 95 3 és 0.1 070, I pedig 0.15 12 és 0.163 7. Összesen 87 lókuszt mutattak ki {{20}} egyedben Cistanche 4 populációjából, amelyek közül 24 polimorf lókusz volt, ami 27,59 százalékot tesz ki, H=0.084 8, I=0.1278. A legmagasabb PPL Andil volt, 25,29 százalék, míg a PPL alacsonyabb volt Savuzekben és Yatungusiban (mindkettő 19,54 százalék). H jelentése 0.062 1 -0.080 0, I 0.095 0 -0.116. A H és I mérete összhangban van az egyes populációk PPL-jének mérettrendjével, és az együtthatók Andierben a legnagyobbak, ezt követi Dayan. Ugyanazon PPL esetén Savuzek H=0.{{40}} Az I=0.097 0 összeg valamivel nagyobb, mint a 0.{{44 }} és 0.095 0 Yatunguska (2. táblázat).
1. ábra: Néhány sivatagi minta RAPD-vel erősített sávjaCistanche deserticola, primer S490 1-10. Garantie minták; 11-20. Jimpster minták M-DNS Marker (200 - 2 000 bp)
2. ábra: A Cistanche Tubulosa, S2 042 1-20 primer néhány mintájának RAPD-vel amplifikált sávja. Xinjiang Andier minta M-DNS marker (200 - 2 000 bp)
2. táblázat Agenetikai sokféleségnak,-nekCistanche deserticolaésCistanche tubulosapopulációk
2.2 A Cistanche genetikai variációs elemzése
A szintnek megfelelőengenetikai sokféleségpopulációkban (Hs), a populációk közötti különbségtételben (Dst), valamint a populációk közötti genetikai különbségek arányában a teljes genetikai különbségekben (Gst) látható, hogy a Cistanche deserticola Ht teljes genetikai sokfélesége=0.{{ 1}}, ahol Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, ebből Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (3. táblázat). A fenti eredmények azt mutatják, hogy a populációk között van bizonyos fokú genetikai eltérés. A Cistanche deserticola sivatagi populációi közötti eltérés a teljes variáció 25,46 százalékát, a Cistanche tubulosa populációk változatossága pedig a teljes variáció 17,55 százalékát tette ki.
3. táblázat: Genetikai variációs elemzésCistanche deserticolaésCistanche tubulosa.
2.3 Genetikai távolság- és klaszteranalízis a Cistanche deserticola populációk között
A két populáció genetikai távolságaCistanche deserticolaa {{0}}.080 0, a genetikai azonosság pedig 0.9231. Cistanche négy populációjának genetikai távolsága 0.012 0-0.031 5 volt, a genetikai azonosság pedig 0.9690-0.988 1 (4. táblázat) . A Cistanche deserticola és cistanche tubulosa egyedek csoportosítása azt mutatja, hogy a Cistanche deserticola populáció szerint két jól elkülöníthető csoportba sorolható, míg a cistanche tubulosa különböző egyedei nem csoportosíthatók populációnként, ami szintén azt jelzi, hogy a Cistanche deserticola genetikai differenciálódása. lakosságszáma viszonylag magas. Nagy, de a genetikai differenciálódás a Cistanche tubulosa populációi között kicsi.
4. táblázat: Genetikai azonosság (bal alsó) és genetikai távolság (jobb felső sarokban).cistanche tubulosa.
3. Vita
3.1 A Cistanche genetikai sokfélesége
A szintjegenetikai sokféleségA növények biológiai jellemzőitől, élőhelyeitől, eredetétől és evolúciójától elválaszthatatlan. Közülük a tenyésztési rendszer, az elterjedési tartomány, az életforma, valamint a pollen- és magszórási módszerek a legnagyobb hatással [6]. Ge Song et al., 165 nemzetség 499 növényfaj allozim adatainak statisztikai eredményei szerint. [7], a Cistanche polimorfizmusának fajszinten körülbelül 50 százaléknak, a populáció szintjén pedig körülbelül 40 százaléknak kell lennie. 0,17 körül. Az ebben a kísérletben kapott polimorfizmus szintjei mind alacsonyabbak ezeknél az átlagos értékeknél. Ugyanakkor, összehasonlítva a RAPD módszerekkel kapott polimorf lókuszok szintjével több gyakori veszélyeztetett növény esetében, mint például a veszélyeztetett ezüstfenyő[18] 32 százaléka, a törpe bazsarózsa 22,5 százaléka és a lila bazsarózsa 27,6 százaléka. [9] ] Látható, hogy a genetikai sokféleség aCistanche deserticola valamivel alacsonyabb az átlagosnál, míg a Cistanche tubulosa genetikai diverzitása már eleve rendkívül alacsony.
3.2 A Cistanche alacsony genetikai diverzitásának okai
A Cistanche egy sajátos élősködő növény, amely egyidejűleg szűk sivatagi területeken is elterjedt. Ezért az egyedi életstílus és a viszonylag szűk lakóterület lehet az oka annak, hogy agenetikai sokféleséga Cistanche általában alacsonyabb, mint a közönséges növényeké.
A különbség agenetikai sokféleségA Cistanche deserticola és a Cistanche tubulosa között összefüggés lehet a kettő eloszlási tartományának különbségével és azzal, hogy szinkronban vannak-e a gazdaszervezet eloszlásával. A Cistanche tubulosa elterjedési területe lényegesen kisebb, mint a Cistanche deserticoláé, elterjedése pedig rendkívül nincs összhangban a tápnövényével. Tanulmányok kimutatták, hogy a Tamarix fajok között nagy a sokféleség. Például Zhang Juan et al. beszámoltak arról, hogy a Tamarix sibiricus genetikai diverzitása elérte a 98,7 százalékot [10], míg a Cistanche genetikai diverzitása rendkívül gyenge, ami a hosszú távú evolúciót jelzi. A Cistanche tubulosa komoly szűk keresztmetszeteken ment át a történelem során, ami nagy mennyiségűgenetikai sokféleség.
Ugyanakkor a vizsgálatok szerint kiderült, hogy egyik semCistanche deserticolaAz emberi települések 20 km-es körzetében feltárhatók és normálisan virágozhattak. A Cistanche nagy és kis gödreit ásták ki, különösen a Cistanche csővirág fő termőterületein. Ezért nagy mennyiségű feltárás okozta. A származás hiánya és az élőhelyek pusztulása lehet a fő ember által előidézett oka az alacsony szintnekgenetikai sokféleséga Cistanche.
3.3 A Cistanche genetikai differenciálódása
Hszincsiang és Belső-Mongólia közötti földrajzi távolság miatt a földrajzi elszigeteltség okozta a különbséget és az elszigeteltségetCistanche deserticolapopulációk, és a két populáció a helyi élőhelyi viszonyokhoz való alkalmazkodásuk miatt eltérő genetikailag eltérő ökotípust alkotott. Szűk elterjedési tartománya és a populációk közötti gyakori géncsere miatt a populációk közötti genetikai differenciálódás kisebb, mint a Cistanche deserticola esetében.
3.4 Ajánlások a Cistanche védelmére
Genetikai sokféleséga fajok hosszú távú fennmaradásának előfeltétele a kihalás elkerülése érdekében. A csökkentésegenetikai sokféleségcsökkenteni fogja a lakosság azon képességét, hogy alkalmazkodjanak a környezeti változásokhoz mind rövid, mind hosszú távon [11]. Ezért a Cistanche genetikai sokféleségének védelme nagyon fontos e ritka és értékes kínai orvoslás védelmében. Mivel a Cistanche egy speciális ökológiai típusú faj, ezért elsősorban in situ kell védeni, és genetikai sokféleségének megfelelően kell kialakítani a Cistanche természetvédelmi bázist. Például azértCistanche tubulosa, mivel a genetikai diverzitás főként a populáción belülről származik, a nagy genetikai diverzitással rendelkező populációk lesznek a kiemelt védelmi objektumok [12], mint például a Minfeng-féle Angier és a Yutian-Daheyan lehet Cisztanche természetes védelmi bázisaként szerepel. Ami pedig aCistanche deserticola, Belső-Mongólia és Hszincsiang populációi jelentős változásokon mentek keresztül, ezért a kísérleti kutatásokat tovább kell erősíteni a védelem szempontjából kiemelt populációk meghatározásához. Ezzel egyidejűleg alapkutatást kell végezni Cistanche szaporodásbiológiájával és beporzási ökológiájával kapcsolatban, hogy információkat nyújtsanak a további védelméhez.
Hivatkozások
[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei és mások. AzonosításaCistancheés kereskedelmi gyógyászati anyagok vizsgálata. Chinese Medicinal Materials, 1997, 20(3):117.
[2] Liu Mingting. A Tamarix növények átfogó kutatása és általános alkalmazása. Lanzhou: Lanzhou University Press, 1995.
[3] Fu Guoli. A kínai növények vörös könyve. Peking: Science Press, 1992.
[4] A Kínai Népköztársaság Veszélyeztetett Fajok Behozatalának és Exportjának Irodai Hivatala, a Kínai Népköztársaság Veszélyeztetett Fajok Tudományos Bizottsága. Egyezmény a veszélyeztetett vadon élő állat- és növényfajok nemzetközi kereskedelméről (CITES), II. függelék. 2003.41.
[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding és mások. Több veszélyeztetett növény és rokonaik teljes DNS-ének kinyerése és azonosítása. Acta Botany, 1994, 36:528.
[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Növénynemesítési rendszer, genetikai felépítés és védelmegenetikai sokféleség. Biodiverzitás, 1996, 4(2): 92.
[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Növényevolúciós biológia. Wuhan: Wuhan University Press, 1994.
[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming és mások. Az ezüstfenyő genetikai diverzitásának RAPD elemzése. Chinese Science (C), 1997, 40(2): 145.
[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen és mások. Előzetes jelentés a törpe bazsarózsa és a lila bazsarózsa RAPD elemzéséről. Chinese Journal of Plant Taxonomy, 1995, 33(4): 350.
[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. Előzetes tanulmány aGenetikai sokféleséga Tamarix lándzsás természetes populációi. Yunnan Botanical Research, 2003, 25(5):557.
[11] Ellstrand NC, Elam D R. A kis populációméret populációgenetikai következményei: A növényvédelemre gyakorolt hatás. Annual Review Ecology and Systematics, 1993, 34:217.
[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. A populációgenetika elve és alkalmazása a ritka és veszélyeztetett növények védelmében. Biodiverzitás, 1999, 7(4): 340.
Feladó: China Journal of Chinese Materia Medica; Vol. 29. szám, 2004. augusztus 8
