A Cistanche Deserticola poliszacharid gyengíti az oszteoklasztogenezist és a csontreszorpciót a RANKL jelátvitel és a reaktív oxigénfajok termelésének gátlásán keresztül

Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song et al

Az oszteoporózis egy anyagcsere-betegség, amelyet osteopenia és a csontok mikroszerkezeti romlása jellemez. Az oszteoklasztok az elsődleges effektor sejtek, amelyek lebontják a csontmátrixot, és abnormális működésük csontritkulás kialakulásához vezet. A sejtmetabolizmus során a reaktív oxigénfajták (ROS) felhalmozódása elősegíti az oszteoklasztok proliferációját és differenciálódását, ezért fontos szerepet játszik a csontritkulásban.Cistanchedeserticolapoliszacharid(CDP) daganatellenes, gyulladásgátló és antioxidáns hatással rendelkezik. A CDP osteoclastokra gyakorolt ​​hatása azonban nem világos. Ebben a vizsgálatban tartarát-rezisztens savas foszfatáz festést, immunfluoreszcenciát, reverz transzkripciós polimeráz láncreakciót és Western blot analízist használtak annak bizonyítására, hogy a CDP.(Cistanchedeserticolapoliszacharid)gátolta az oszteoklasztogenezist és a hidroxiapatit reszorpciót. Ezen kívül a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)gátolta az oszteoklaszt marker gének, köztük a Ctsk, Mmp9 és Acp5 expresszióját is, és nem volt hatással a nukleáris faktor κB (RANK) expressziójának receptor aktivátorára. A mechanikai elemzések kimutatták, hogy a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)növeli az antioxidáns enzimek expresszióját, hogy gyengítse a RANKL által közvetített ROS termelést az oszteoklasztokban, és gátolja az aktivált T-sejtek nukleáris faktorát és a mitogén által aktivált protein kináz aktiválását. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a CDP gyógyszerjelölt lehet a túlzott oszteoklasztaktivitás által okozott csontritkulás kezelésére.

KULCSSZAVAKcsontfelszívódás,Cistanchedeserticolapoliszacharid, MAPK, oszteoklaszt, reaktív oxigénfajták

cistanche testépítés

1|BEVEZETÉS

Az oszteoblasztok által közvetített csontképződés és az oszteoklasztok által közvetített csontreszorpció közötti egyensúly létfontosságú szerepet játszik a csont metabolikus homeosztázisának fenntartásában (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Ha a csontfelszívódás meghaladja a csontképződést, akkor csontritkulás lép fel, amelyet a csonttömeg csökkenése és a csont mikroszerkezeti károsodása jellemez (Ikeda, 2008). A csontritkulás gyakori betegség idős egyének és posztmenopauzás nők körében, és patogenezise nem teljesen tisztázott (Cooper és Melton, 1992). Az ösztrogénhiány a csontritkulás elsődleges oka (Manolagas, O'Brien és Almeida, 2013). Ezenkívül a nukleáris faktor κB ligandum (RANKL) receptor aktivátora indukálhatja a reaktív oxigénfajtákat (ROS), és az oszteoklasztképződéssel hozható összefüggésbe (Yip et al., 2005), és így hozzájárulhat az oszteoporózis kialakulásához (Manolagas, 2010). Egyes tanulmányok azt találták, hogy a Nrf2-antioxidáns hiánya növeli a ROS-szintet és elősegíti a RANKL által kiváltott oszteoklasztok differenciálódását (Hyeon, Lee, Yang és Jeong, 2013). Ezért az oszteoklasztok differenciálódása során a ROS-termelés csökkentését az oszteoporózis kezelésének terápiás stratégiájaként kell értékelni.

Az oszteoklasztok a monocita vagy makrofág hematopoietikus vonalból származnak, és az egyetlen többmagvú sejtek, amelyek csontreszorpciót hajtanak végre (Teitelbaum, 2000). Ezért az oszteoklasztképződéssel kapcsolatos kutatások nagy jelentőséggel bírnak a csontanyagcsere-betegségek hatékony kezelésének kidolgozásában (Lorenzo, 2017). Az oszteoblasztok és aktivált T-sejtek által termelt makrofágkolónia-stimuláló faktor (M‐CSF) és RANKL fontos citokinek, amelyek szabályozzák az oszteoklasztogenezist (Kim és Kim, 2016; Teitelbaum és Ross, 2003). A RANKL indukálja az aktivált T-sejtek nukleáris faktorának (NFATc1) expresszióját, amely egy kritikus transzkripciós faktor, amely az oszteoklasztképződés során aktív (Ishida et al., 2002). Az aktivált NFATc1 elősegíti az oszteoklaszt marker gének, például a tartarát-rezisztens savas foszfatáz (TRAcP) és a katepszin K (CTSK) expresszióját, amelyek szabályozzák az oszteoklasztogenezist és az oszteoklasztok működését (Balkan et al., 2009; Crotti és mtsai, 2008).

Cistanchedeserticolapoliszacharid(CDP) a húsos szárából izoláljákCistancheés immunszabályozással, daganatellenes, öregedésgátló és egyéb farmakológiai hatásokkal rendelkezik (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo és Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)gátló hatást gyakorolt ​​a lipopoliszacharidok által kiváltott nitrogén-monoxid (NO) termelésére egér mikroglia sejtekben (BV-2 sejtek; Nan és mtsai, 2013). Ezen kívül egy fenil-etanolban gazdag kivonat (ECD).Cistanchefokozta az egerek úszási képességét azáltal, hogy csökkentette az izomkárosodást, késleltette a tejsav felhalmozódását és javította az energiatárolást (Cai et al., 2010). A CDP osteoclast funkcióra és aktivitásra gyakorolt ​​hatása azonban továbbra sem ismert.

Ebben a tanulmányban kimutattuk, hogy a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)gátolja a RANKL által kiváltott oszteoklasztok differenciálódását és a csontreszorpciót. A mögöttes mechanizmus a CDP volt(Cistanchedeserticolapoliszacharid)fokozza az antioxidáns enzimek expresszióját a ROS termelés gyengítése érdekében, majd elnyomja a RANKL által aktivált NFAT és a mitogén által aktivált protein kináz (MAPK) jelátviteli kaszkádokat. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)a túlzott oszteoklasztikus csontreszorpció által okozott csontritkulás kezelésére alkalmazható.

maca ginseng cistanche

2|ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

2.1|Anyagok

CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)(tisztaság > 98 százalék) a Solarbio-tól (Peking, Kína) vásároltuk, és 1 mM törzskoncentrációban állítottuk elő foszfáttal pufferelt sóoldatban (PBS). Az antitestek a c‐Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, foszforilált (p)‐ERK, p‐p38, p‐JNK és ‐actin ellenanyagok specifikusak a Santa-tól Cruz Biotechnology (San Jose, CA). A V-ATPáz d2 elleni antitesteket a korábban leírtak szerint termelték (H. Feng et al., 2009). A 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-5-(3-karboxi-metoxi-fenil)-2-(4-szulfofenil)-2H-tetrazólium (MTS) és luciferáz vizsgálati rendszert a Promega (Sydney, Australia) cégtől szerezték be. . A rekombináns M-CSF-et az R&D Systemstől (Minneapolis, MN) vásároltuk. A rekombináns GST-rRANKL fehérjét a korábban leírtak szerint expresszáltuk és tisztítottuk (Xu et al., 2000).

2.2|Sejttenyésztés

A RAW264.7 sejteket (egér makrofág sejtek) az American Type Culture Collection-től (ATCC, Manassas, VA) szereztük be, és módosított minimális esszenciális tápközegben (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Ausztrália) tenyésztettük, amelyet 10% magzati szarvasmarha szérummal (2 mM) egészítettünk ki. L-glutamin, 100 U/ml penicillin és 100 ug/ml sztreptomicin (teljes táptalaj). Csontvelőből származó monocitákat (BMM-eket) izoláltak 6 hetes C57BL/6J egerekből, amelyeket a Nyugat-Ausztráliai Egyetem Állat-etikai Bizottsága által jóváhagyott eljárások szerint (RA/3/100/1244) eutanáziáztak. A hosszú csontokat lágy szövetektől mentesen kimetszettük, és a csontvelőt kiöblítettük a combcsontról és a sípcsontról, majd komplett tápközegben tenyésztettük M-CSF (50 ng/ml) jelenlétében.

2,3|Osteoclastogenesis vizsgálat

A BMM-eket 96 lyukú tenyésztőlemezekre szélesztettük 6 × 103 sejt/lyuk sűrűségben, és M-CSF-et (50 ng/ml) és GST-rRANKL-t (100 ng/ml) tartalmazó komplett tápközeggel kezeltük a változó koncentrációjú CDP hiánya(Cistanchedeserticolapoliszacharid). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>három magot) oszteoklasztként azonosították.

2,4|Citotoxicitási vizsgálatok

A BMM-eket 96 lyukú lemezekre oltottuk 6 × 103 sejt/lyuk mennyiségben, és egy éjszakán át hagytuk tapadni. A következő napon a sejteket különböző koncentrációjú CDP-vel inkubáltuk(Cistanchedeserticolapoliszacharid). További 48 óra elteltével hozzáadtuk az MTS-oldatot (20 µl/lyuk), és a sejtekkel 2 órán át inkubáltuk. A 490 nm-en mért abszorbanciát mikrolemez-leolvasóval (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA) határoztuk meg.

2,5|Immunfluoreszcens festés

A BMM-eket 6 × 103 sejt/lyuk sűrűségben oltottuk be M-CSF (50 ng/ml) jelenlétében egy éjszakán át. A sejteket ezután M-CSF-fel és GST-rRANKL-lel (100 ng/ml) stimuláltuk, amíg az érett oszteoklasztok meg nem képződtek. Az oszteoklasztokat ezután különböző koncentrációjú CDP-vel kezeltük(Cistanchedeserticolapoliszacharid)48 órán át, majd 4 százalékos paraformaldehiddel rögzítjük, 0,1 százalék Triton X‐100-PBS-sel permeabilizáljuk, és 3 százalék marhaszérum albuminnal PBS-ben blokkoljuk. Az előkészített sejteket rodaminnal konjugált falloidinnal inkubáltuk 45 percig sötétben, hogy megfestjük az F-aktint. A sejteket ezután PBS-sel mostuk, a sejtmagokat 4',6-diamidino-2-fenil-indollal (DAPI) ellenfestettük, és fedőlemezekkel rögzítettük a konfokális mikroszkópiához.

cistanche tapasztalat

2,6|Hidroxiapatit reszorpciós vizsgálat

Az oszteoklasztaktivitás mérésére a hatlyukú kollagénnel bevont lemezeken (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) tenyésztett BMM-eket (1 × 105 sejt lyukanként) GST-rRANKL-lel (100 ng/ml) és M-CSF-fel (50 ng/ml) stimuláltuk. ml), amíg az érett oszteoklasztok nem keletkeztek (Zhou et al., 2016). A sejteket ezután óvatosan leválasztottuk a lemezről sejtdisszociációs oldattal (Sigma-Aldrich), és azonos számú érett oszteoklasztot oltottunk hidroxiapatittal bevont 96 lyukú lemezek egyes üregeibe (Corning Osteoassay, Corning, NY). Az érett oszteoklasztokat GST-rRANKL-t és M-CSF-et tartalmazó tápközegben inkubáltuk CDP-vel vagy anélkül.(Cistanchedeserticolapoliszacharid)a feltüntetett koncentrációkban. 48 óra elteltével a lyukak felét immunhisztokémiailag megfestettük TRAcP aktivitásra, a fent leírtak szerint, hogy meghatározzuk a többmagvú sejtek számát mérőhelyenként. A fennmaradó lyukakat 10 percig fehérítettük, hogy eltávolítsuk a sejteket, és lehetővé tegyük a felszívódott területek mérését. A felszívódott területeket szabványos fénymikroszkóppal fényképeztük le, és az Image J szoftvert (National Institutes of Health, Bethesda, MD) használtuk az oszteoklasztok által felszívódott hidroxiapatit felület százalékos területének mennyiségi meghatározására.

2,7|Luciferáz riporter vizsgálatok

Az NFATc1 transzkripciós aktivációjának vizsgálatához a RAW264.7 sejteket stabilan transzfektáltuk egy NFATc1-re reagáló luciferáz riporter konstrukcióval (Cheng és mtsai, 2018; van der Kraan és mtsai, 2013). A transzfektált sejteket 48 lyukú lemezeken tenyésztettük 1,5 × 105 sejt/lyuk sűrűségben, és különböző koncentrációjú CDP-vel előkezeltük.(Cistanchedeserticolapoliszacharid)1 óráig. Az előkezelést követően a sejteket GST-rRANKL-lel (100 ng/ml) stimuláltuk 24 órán keresztül, és a luciferáz aktivitást a luciferáz riporter vizsgálati rendszerrel mértük a gyártó protokollja szerint (Promega).

2,8|Kvantitatív reverz transzkripciós-polimeráz láncreakció (RT-PCR) elemzés

A teljes RNS-t Trizol reagenssel izoláltuk a sejtekből a gyártó protokollja szerint (Thermo Fisher Scientific). A komplementer DNS-t Moloney rágcsáló leukémia vírus reverz transzkriptáz segítségével szintetizáltuk 1 ug RNS templáttal és oligo-dT primerekkel. A specifikus szekvenciák polimeráz láncreakciós amplifikációját a következő programmal végeztük: 94 fok 5 percig, majd 30 ciklus 94 fok 40 másodpercig, 60 fok 40 másodpercig és 72 fok 40 másodpercig, és egy utolsó kiterjesztési lépés 5 perc 72 fokon. A specifikus primerek részletes információi az 1. táblázatban láthatók. A relatív hírvivő RNS-szinteket a Hmbs housekeeping gén expressziójára való normalizálással számítottuk ki.

2,9|Western blot analízis

A BMM-eket M-CSF-et tartalmazó komplett tápközegben tenyésztettük hatlyukú lemezeken, és stimuláltuk GST-rRANKL-lel (100 ng/ml) a megadott ideig. A sejteket radioimmunprecipitációs lízispufferben lizáltuk, és a fehérjéket nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel rezolváltuk, és poli(vinilidén-fluorid) membránokra vittük át (GE Healthcare, Silverwater, Ausztrália). A membránokat 5 százalékos sovány tejben blokkoltuk 1 órán át, majd különféle specifikus primer antitestekkel szondáztuk, enyhe rázatással egy éjszakán át 4 fokon. A membránokat mostuk, majd torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel inkubáltuk. Az ellenanyag-reaktivitást ezután fokozott kemilumineszcenciás reagenssel (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) detektáltuk, és Image‐quant LAS 4000 (GE Healthcare) készülékkel tettük láthatóvá.

2.10|Intracelluláris ROS kimutatás

Az intracelluláris ROS-szinteket egy 2',7'-diklórfluoreszcein-diacetát celluláris ROS-detektáló tesztkészlettel (Abcam, Melbourne, Ausztrália) detektáltuk. A BMM-eket (5 × 103 sejt per lyuk) 96 lyukú lemezeken tenyésztettük, és RANKL-lel (100 ng/ml), M-CSF-fel (50 ng/ml) és CDP-vel kezeltük 72 órán keresztül. Az intracelluláris ROS szinteket 2′,7′′-diklórfluoreszcein-diacetáttal mértük, amely ROS jelenlétében fluoreszcens DCF-vé oxidálódik. A sejteket Hank-pufferben mostuk, és sötétben 30 percig 10 µM DCFH-DA-val inkubáltuk. A képeket konfokális mikroszkóppal készítettük.

2,11|statisztikai elemzések

Minden adat legalább három, három párhuzamosban végzett kísérletre vonatkozik, hacsak másképp nem jelezzük. Az adatokat átlag ± SD-ben fejezzük ki. Az eredmények közötti különbségek szignifikanciájának meghatározására egyirányú varianciaanalízist, majd Student–Newman–Keuls post hoc tesztet használtunk, ahol a p < 0,05="" értéket="" tekintettük="">

3|EREDMÉNYEK

3.1|A CDP gátolja a RANKL által kiváltott oszteoklasztogenezist és oszteoklaszt fúziót

Annak megállapítására, hogy a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)gátolni tudja a RANKL által kiváltott oszteoklaszt képződést, először végeztünk egy oszteoklasztogenezis vizsgálatot egér BMM-ekkel (Liu et al., 2013; Song és mtsai, 2016). A BMM-eket RANKL-lel és M-CSF-fel kezeltük 5 napig, növekvő CDP-koncentráció mellett. A CDP csökkentette a TRAcP-pozitív többmagvú sejtek számát a CDP koncentrációjával(Cistanchedeserticolapoliszacharid)elérte az 5 µM vagy magasabb értéket (1a, b ábra). A CDP értékeléséhez(Cistanchedeserticolapoliszacharid)toxicitást, és megerősítjük, hogy ezek az eredmények nem a sejthalált vagy a sejtszámot tükrözik, MTS vizsgálatot végeztünk. A BMM-eket RANKL-lel és M-CSF-fel kezelték 48 órán keresztül, különböző dózisú CDP-vel.(Cistanchedeserticolapoliszacharid). A CDP nem volt hatással a BMM proliferációjára 15 µM vagy annál kisebb koncentrációban (1c. ábra).

A CDP hatásainak tesztelése(Cistanchedeserticolapoliszacharid)az oszteoklaszt fúzió során az oszteoklasztokat RANKL és M-CSF kezeléssel indukáltuk, változó dózisú CDP-vel vagy anélkül(Cistanchedeserticolapoliszacharid). Az oszteoklasztokat rodamin-falloidinnel és DAPI-val festettük meg, hogy meghatározzuk az oszteoklasztonkénti sejtmagok számát (2a. ábra). Mind az oszteoklasztok száma, mind az egy oszteoklasztra jutó sejtmagok átlagos száma csökkent a CDP után(Cistanchedeserticolapoliszacharid)kezelés (5–10 µM; 2b, c ábra). Ezért a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)dózisfüggő módon gátló hatást gyakorolt ​​a RANKL által kiváltott oszteoklasztogenezisre és oszteoklaszt fúzióra.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)gyengíti a RANKL által kiváltott oszteoklasztikus hidroxiapatit reszorpciós aktivitást

A CDP hatásának kimutatására hidroxiapatit reszorpciós vizsgálatot végeztünk(Cistanchedeserticolapoliszacharid)az oszteoklaszt funkcióra (3a. ábra). 24 órás inkubáció után az oszteoklasztok száma lyukonként nem változott, míg a hidroxiapatit reszorpciós területe szignifikánsan csökkent 5 és 10 µM CDP-kezelés hatására a kontrollcsoportokhoz képest (3b, c ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)erős gátló hatása van mind az oszteoklasztképződésre, mind az oszteoklaszt reszorpciós aktivitásra, citotoxikus hatás nélkül.

3,3|CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)gátolja az oszteoklaszt marker gén expresszióját

A CDP gátló hatásának további vizsgálata(Cistanchedeserticolapoliszacharid)az oszteoklasztogenezis és az oszteoklasztikus csontreszorpció miatt a BMM-eket RANKL-lel és M-CSF-fel kezelték 5 napon keresztül, változó CDP-koncentráció mellett.(Cistanchedeserticolapoliszacharid). Ezután RT-PCR-t végeztek az oszteoklaszt marker gének expressziójának kimutatására. Az oszteoklasztogenezis során kulcsfontosságú transzkripciós faktor, az Nfatc1 expresszióját a CDP gátolta(Cistanchedeserticolapoliszacharid)dózisfüggő módon (4a. ábra). Ezen kívül a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)(5 és 10 µM) csökkentette a csontreszorpcióval kapcsolatos gének, köztük az Mmp9, a Ctsk és az Acp5 expresszióját (4b–d ábra).

3.4|A CDP elnyomja az NFATc1 aktivitást és a downstream fehérje expressziót

A CDP hatásának vizsgálata(Cistanchedeserticolapoliszacharid)A RANKL-indukált NFATc1 aktivitáson luciferáz riporter vizsgálatot végeztek. Kezelés CDP-vel(Cistanchedeserticolapoliszacharid)5 µM és magasabb koncentrációknál szignifikánsan gátolta a RANKL által kiváltott NFATc1 aktivitást (5a. ábra). Ezenkívül a Western blot analízis azt mutatta, hogy a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)szignifikánsan elnyomta az NFATc1 és c‐Fos fehérje expresszióját a RANKL-lel és M‐CSF-fel 3 és 5 napig kezelt BMM-ekben (5b. ábra). Ezenkívül az oszteoklaszt funkcióval kapcsolatos fehérjék, mint például a V-ATPáz-d2 és a CTSK expressziója csökkent CDP jelenlétében.(Cistanchedeserticolapoliszacharid)a kontrollcsoportokhoz képest. A CDP azonban nem volt hatással a RANK expressziójára (5b. ábra).

3,5|A CDP elősegíti az antioxidáns enzimek expresszióját a ROS termelés megfékezésére a RANKL által kiváltott oszteoklasztogenezis során

A CDP-függő oszteoklasztogenezis gátlás mögött meghúzódó mechanizmus feltárása érdekében a BMM-eket RANKL-lel (100 ng/ml) és M-CSF-fel (50 ng/ml) PBS-sel vagy CDP-vel együtt kezelték.(Cistanchedeserticolapoliszacharid)72 órán keresztül. Megvizsgáltuk a CDP hatását a RANKL által stimulált intracelluláris ROS termelésre. Az intracelluláris ROS szintet növelte a RANKL kezelés, amelyet CDP (5 és 10 µM; 6a ábra) gyengített. Mind a ROS-pozitív sejtek számát, mind a ROS festődés intenzitását a CDP-kezelés dózisfüggő módon csökkentette (6b, c ábra). Western blot analízis kimutatta, hogy a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)elősegítette a tioredoxin (TRX1) és a glutation-reduktáz (GSR) expresszióját, miközben elnyomta az indukálható nitrogén-monoxid-szintáz (NOS2) expresszióját olyan BMM-ekben, amelyeket RANKL-lel és M-CSF-fel kezeltek 3 napig (6d. ábra).

Hogy tovább vizsgálja, ha CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)Az oszteoklasztok differenciálódását a ROS termelés csökkentésével elnyomtuk, majd a BMM-eket peroxiddal (10 µM) kezeltük, hogy utánozzuk a sejtek magas ROS státuszát. A BMM-eket RANKL és M-CSF indukálta 3 napon keresztül, és a Western blot analízis és az RT-PCR eredményei azt mutatták, hogy a peroxid elősegítette az NFATc1 és c-Fos expresszióját a kontroll csoportokhoz képest. Az 5. ábrán látható eredményekkel összhangban az NFATc1 és a c‐Fos expresszióját a CDP elnyomta.(Cistanchedeserticolapoliszacharid)míg a peroxid megmentette a CDP gátló hatását (6e, f ábra). Ezek az adatok azt mutatták, hogy a CDP elnyomta az NFATc1 és a c-Fos expresszióját a ROS termelés megfékezésével.

3,6|CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)elnyomja a MAPK útvonalakat a RANKL által kiváltott oszteoklasztogenezis során

Ezt követően a CDP hatását vizsgáltuk(Cistanchedeserticolapoliszacharid)kezelés a RANKL által közvetített TRAF6 expresszión és a MAPK útvonal aktiválásán. Szérummentes tápközegben 2 órás inkubálást követően a BMM-eket RANKL-lel stimuláltuk, CDP-vel vagy anélkül, 60 percig. A CDP-vel (10 µM) végzett stimuláció nem volt hatással a TRAF6 expressziójára, és gyengítette a JNK2 és ERK1/2 foszforilációját 10 és 20 percnél (7. ábra). Ezenkívül a CDP jelentősen gátolta a p38 foszforilációját(Cistanchedeserticolapoliszacharid)60 perces kezelés a kontrollcsoportokhoz képest (7. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)elnyomja a RANKL-indukálta MAPK jelátviteli útvonalakat, összhangban az oszteoklasztok képződését és aktivitását gátló hatásával.

4|VITA

A "sivatagi ginzeng" néven ismert Cistanche a közelmúltban nagy figyelmet keltett az immunitás moduláló képessége és az öregedés és az oxidatív stressz során védelmet nyújtó képessége miatt (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). A fenilpropanoiddal szubsztituált glikozidokról, a Cistanche fő aktív összetevőiről kimutatták, hogy gátolják a NO aktivitását a makrofágokban (Ahn, Chae, Chin és Kim, 2017). Ezen kívül aCistancheAz extraktum csökkentette az oxidatív stresszt a reperfundált szívizomban ischaemiát követően, és jelentős szerepet játszott a szívvédelemhez vezető apoptotikus utak gátlásában (Yu, Li és Cao, 2016). A Cistanche fontos összetevőjeként a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)számos farmakológiai funkciót lát el. Jelenlegi vizsgálatunk azt találta, hogy a CDP elnyomta a RANKL által aktivált oszteoklasztok differenciálódását és aktivációját azáltal, hogy gyengítette a ROS termelést, valamint az NFAT és MAPK aktivációt.

Savas foszfatázként a TRAcP számos sejtben megtalálható, és bőségesen fordul elő oszteoklasztokban és alveoláris makrofágokban (Snipes, Lam, Dodd, Gray és Cohen, 1986). A TRAcP az oszteoklasztok jellegzetes enzime, expressziója szorosan összefügg az oszteoklasztok működésével, amelyet az oszteoklasztaktivitás és a csontreszorpció indikátorának tekintenek (Minkin, 1982). Tanulmányunkban a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)gátolta a TRAcP-pozitív sejtek számát, ami azt jelzi, hogy a RANKL által kiváltott oszteoklasztogenezist blokkolta a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid). A csontmátrix oszteoklasztok általi lebontása a katepszin K-tól (CTSK) és az MMP-től függ (Gruber, 2015). Itt a CDP jelentősen csökkentette az oszteoklaszt funkcionális gének, például az Mmp9, a Ctsk és az Acp5 expresszióját.

Az oszteoklasztok differenciálódását és működését többféle jelátviteli útvonal szabályozza (Boyle, Simonet és Lacey, 2003). A RANK-hoz való kötődés után a RANKL a TRAF6 adapterfehérjét toborozza, hogy aktiválja az NFATc1 expresszióját, amely fontos transzkripciós faktor az oszteoklasztképződéshez, és befolyásolja az oszteoklaszt-specifikus génexpressziót, beleértve a TRAcP-t és a CTSK-t (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). Ebben a tanulmányban azt találtuk, hogy a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)nem volt hatással a RANK és TRAF6 expressziójára oszteoklasztokban. Azonban a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)gátolta a RANKL által kiváltott NFATc1 aktivációt a BMM-ek oszteoklasztogenezise során. Emellett kimutatták, hogy a mitokondriumok által az elektronok szállítása során termelt ROS elősegítette az oszteoklasztok proliferációját és differenciálódását, valamint szabályozta a csontmátrix lebomlását (Ha et al., 2004). Egy közelmúltbeli tanulmány kimutatta, hogy a RANKL indukálta a Bach1 nukleáris importját és gyengítette az Nrf2 által közvetített antioxidáns enzimtermelést, ezáltal fokozva az intracelluláris ROS expressziót és az oszteoklasztogenezist egerekben (Kanzaki és mtsai, 2017). Ezenkívül a homocisztein által fokozott intracelluláris ROS-képződés fokozta az oszteoklasztok képződését és aktivitását (Koh et al., 2006). Vizsgálatunk kimutatta, hogy a CDP csökkentette a ROS felhalmozódását az oszteoklasztokban azáltal, hogy gátolta a NOS2 expresszióját, és elősegítette az antioxidáns enzimek, például a TRX1 és a glutation-reduktáz expresszióját. Amikor a BMM-eket peroxiddal kezeltük az intracelluláris ROS felhalmozódás fokozása érdekében, az eredmények, amelyek szerint a megnövekedett ROS javíthatja az NFATc1 expresszióját, azt mutatta, hogy a ROS az NFATc1-től felfelé található. Azt is megállapítottuk, hogy a peroxid megmentette a CDP NFATc1 expresszióra gyakorolt ​​gátló hatását. Tehát adataink arra utalnak, hogy a CDP elnyomja a ROS felhalmozódását, hogy gátolja az NFATc1 expresszióját, majd az oszteoklasztok képződését és működését.

Az ERK, JNK és p38 a MAPK családba tartoznak, amely szintén részt vesz az oszteoklasztok differenciálódásának szabályozásában (Seger és Krebs, 1995). A RANKL aktiválja a MAPK útvonalat az ERK, JNK és p38 foszforilációjának fokozásával (Mizukami et al., 2002). Bebizonyítottuk, hogy a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)elnyomta a MAPK útvonal kulcsfontosságú fehérjéinek RANKL által közvetített foszforilációját, ezáltal hozzájárulva a CDP gátló hatásához az oszteoklaszt marker gének expressziójára. Tudomásunk szerint ez az első olyan tanulmány, amely a CDP gátló hatását mutatja be(Cistanchedeserticolapoliszacharid)a ROS termelésről, az NFAT és a MAPK aktiválásáról, amelyek a CDP új hatásmechanizmusait képviselik in vitro.

Összefoglalva bemutattuk, hogy a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)gyengíti az oszteoklasztogenezist és a hidroxiapatit reszorpciót, valamint az oszteoklaszt marker gének, köztük a Ctsk, Mmp9 és Acp5 expresszióját. CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)képes volt elnyomni a RANKL által közvetített ROS termelést, valamint az NFAT és MAPK aktiválását (8. ábra). Eredményeink együttesen arra utalnak, hogy a CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)gyógyszerjelölt lehet az oszteoklasztokkal kapcsolatos állapotok kezelésére, amelyeket ROS túltermelés kísér.

8. ÁBRA A CDP sematikus diagramja(Cistanchedeserticolapoliszacharid)funkciója az oszteoklasztok differenciálódásában. CDP(Cistanchedeserticolapoliszacharid)gátolja a RANKL által kiváltott ROS termelést, valamint az NFATc1 és MAPK aktivációt, ezáltal gátolja az oszteoklasztogenezist. CDP,Cistanchedeserticolapoliszacharid; MAPK, mitogén által aktivált protein kináz; NFATc1, az aktivált T-sejt nukleáris faktora; RANKL, a nukleáris faktor κB ligandum receptor aktivátora; ROS, reaktív oxigénfajták [Színes ábra megtekinthető a wileyonlinelibrary.com oldalon]

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a tanulmányt a Kínai Természettudományi Alapítvány (81572164), a Kínai Nemzeti Kulcstechnológiai Kutatási és Fejlesztési Program (2017YFC1103300), a Guangxi tartomány Természettudományi Alapítványa (2016GXNSFAA380295) és a Guangxi Egyetem Tudományos és Technológiai Kutatási Projektje támogatta. tartomány (KY2015YB054). Részben támogatja a Guangxi Tudományos Kutatási és Technológiai Fejlesztési Terv Projekt (GKG13349003, 1598013-15), a Nyugat-Ausztráliai Orvosi és Egészségügyi Kutatási Infrastruktúra Alap, az Arthritis Australia Foundation, a University of Western Australia (UWA) kutatási együttműködési díjai és a Australian Health and Medical Research Council (NHMRC, 1107828 és 1027932).

ÖSSZEFÉRHETETLENSÉG

A szerzők kijelentik, hogy nem áll fenn összeférhetetlenség

Tól től: 'Cistanchedeserticolapoliszacharidgyengíti az oszteoklasztogenezist és a csontreszorpciót azáltal, hogy gátolja a RANKL jelátvitelt és a reaktív oxigénfajták termelését Dezhi Song és munkatársai

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684