Miért van hatással a Cistanche a PC12 sejtek apoptózisára?

A Cistanche hatása a PC12 sejtek apoptózisára

Érintkezés:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tien Csiyu¹, Chen Jianzong¹, Chen Xiaoli², Yang Hao³

¹Hagyományos Kínai Orvostudományi Tanszék,²Xijing Kórház Gyógyszertári Osztálya,³PLA Neurobiológiai Intézet, Negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem, Hszian 710033, Kína

Elvont

CÉL:AzCistancheaz 1- metil-4-fenilpiridinium (MPP+)-indukáltPC12 sejtek apoptózisa.

MÓDSZEREK: PC12 cellákcsak 200 μmol/l MPP+-nak vagy MPP+-nak voltak kitéve, különböző koncentrációkkal kombinálvaCistancheúj-zélandi fehér nyúl szérum. AzCistancheraa PC12 sejtek apoptózisaáramlási citometriával, elektronmikroszkópiával és fluoreszcens mikroszkópiával detektálták.

EREDMÉNYEK:A nyulakból gyűjtött szérumok egyenértékű dózisban táplálkoznakCistanchevagy kétszeresen egyenértékű dózisbanCistanchenyilvánvalóan védőhatása voltPC12 cellákés aa PC12 sejtek apoptózis arányaezzel a két szérummal inkubáltak 2,8%, illetve 10,2% volt, amelyek nyilvánvalóan alacsonyabbak voltak, mint aPC12 cellákcsak MPP+ kezeléssel(18 .6 %, P<0>

KÖVETKEZTETÉS:Cistancheképes megvédeniPC12 celláktólapoptózisaz MPP+ által indukált.

Kulcsszavak:CistancheDeserticola, 1-metil-4-fenilpiri- dinium,PC12 cellák,apoptózis

Bevezetés

A Parkinson-kór patogenezise (Parkinson-kór, PD) a substantia nigra dopaminerg neuronok károsodása és elvesztése, ésapoptózisfontos ok lehet. Áramlási citometriát (FACS), transzmissziós elektronmikroszkópiát, valamint a nukleáris Alakanalízis fluoreszcencia festését és más módszereket használunk a kínai orvoslás kimutatásáraCistanchegyógyszeres szérum és neurotoxin 1-metil-4-fenilpiridinium (1-metil-4-fenilpiridinium, M PP +) kezelt PC12 sejtek, hogy feltárják a Cistanche neuronokra gyakorolt hatását A hatás védőmechanizmusa.

AzCistanchea PC12 sejtek apoptózisáról

1. Anyagok és módszerek

1.1 Anyagok

PC12 celláka Japán Élettudományi Alapítványtól vásárolták meg; Az RP-MI1640 táptalajt, a borjúszérumot és a patkányfarkú kollagént a Gibco-tól vásárolták; Az MPP+, a melléklet V-FITC, a PI, a PBS, a sejttenyésztő lombikok és a tenyészlemezek a Sigma-tól vásárolták; Kínai orvoslásCistanchea Xi'an Decoction Piece Factory-tól vásárolták; Az új-zélandi nagyfülű fehér nyúlat (hím, testtömeg 2,5 ~ 3 kg) az iskolai állatközpont biztosította; A Hoechst33342-t a Biyuntian Company-tól vásárolták meg; A paraformaldehid belföldön tiszta volt; LD4- 2-es típusú centrifuga (Pekingi Orvosi Centrifugagyár) Műszerek Fluoreszcens mikroszkóp (Laika cég), fordított mikroszkóp (Olympus cég), JEM-2000EX transzmissziós elektronmikroszkóp (Japán), CO2 állandó hőmérsékletű inkubátor (Here-cus HERAcell, Németország), Coulter EPICS áramlási citométer (Beck-man Coulter, USA).

1.2 Módszer

PC12 cellákRPMI1640 sejttenyésztő táptalajban termesztettük, amely 100 ml/l borjúszérumot tartalmazott. A sejttenyésztő lombikot és a tenyészlemezt használat előtt 0,2 g/l patkányfarkkolénnel borították be. A tenyésztett sejteket 37 °C-ra helyeztük, egy 50 ml/l CO2-es inkubátorban cseréljük ki a táptalajt 3 napra. Amikor az egyrétegű tenyészsejtek hamarosan összeolvadnak, emésztsük meg 1,25 g/l tripszinnel és szubkultúrával. Amikor a szubkultúra sejtek belépnek a logaritmikus növekedési fázisba, hozzáadhat gyógyszereket. A nyúl testtömege szerint az állat egyenértékű dózisát a testfelületnek megfelelően alakítják át. A hagyományos kínai orvoslásCistanchefagyasztva szárított porként állítják elő, amelyet használat közben desztillált vízzel hígítanak, és az állatot naponta kétszer, 3 napon keresztül adják be (Chinese Experimental Formula Chinese Journal of Science, 1998; 4:13-15), 1 órával az utolsó ig után, nyaki vérleadás, egy éjszakán át 4 °C-on, centrifugálás 2500 r/percen 25 percen keresztül, szérumszétválasztás, inaktiválás 56 °C-on, 30 percen és 0-n. Sterilizálás 22 μm-es szűrőmembránnal és tárolás -20 °C-on. Ugyanilyen körülmények között vakbontó kontrollszérumot, 1/2, 1 és 2-szer egyenértékű dózisú szérumot készítettünk. A kísérletet 5 csoportra osztottuk: az A csoport egy vaknyúl szérumcsoport volt, a B csoport a szérum + MPP + csoport egyenértékdózisának 2-szerese (a gavage dózis cistanche nyers gyógyszer 6,4 g/kg), a C csoport a szérum + MPP + csoport egyenértékdózisa (a gavage dózis cistanche nyers gyógyszer 3,2 g/kg), a D csoport a szérum + MPP + csoport félig egyenértékű dózisa (dózisban Cistanche nyers gyógyszer 1,6 g/kg), az E csoport egy vak nyúlszérum + MPP + csoport. Szubkultúra 12 órán keresztül A jövőben figyeljük meg a sejteket fordított mikroszkóp alatt, és adjuk hozzá a hatóanyagot az összefolyás előtt. Az egyes csoportok szérumtartalma 10%. 3 napos tenyésztés után mpp + -ot adunk a végső 200 μmol/l koncentrációhoz.

1.2.1 PC12 sejtes fluoreszcens festés megfigyelése

A hoechst33342 hozzáadása a kulturálthozPC12 cellák10 mg/l végső koncentrációban inkubáljuk 37 °C-on 30 percig, keverjünk össze 40 g/l paraformaldehidet és a táptalajt 13°-on: hogy a paraformaldehid végső koncentrációja 10 g/l legyen 5-10 percig tartó rögzítés után öntsük el a felülúszót, mossuk át PBS-sel, és figyeljük meg fluoreszcens mikroszkóp alatt.

1.2.2 Megfigyelés transzmissziós elektronmikroszkóppal

24 órás gyógyszeres kezelés után a sejteket összegyűjtöttük és centrifugacsőbe vittük, 1500 r/perc, 4 °C-on 5 percig centrifugáltuk, és kétszer 10 mmol/l PBS-sel mossuk. Centrifugáljuk 1500 r/perc sebességgel, 4 °C-on 5 percig, dobjuk el a felülúszót, lassan adjunk hozzá 25 ml/l glutaaldehidet a cső fala mentén, és rögzítsük 4 °C-on 2 órán keresztül, húzzuk le a sejtcsomókat egyenes pipettával, mossuk le 3-szor PBS-sel, 5 percig minden alkalommal, rögzítsük 1 órán át ozmiumsav után 4 °C-on, lejtés utáni aceton dehidratálással, epoxigyanta áztatás és beágyazás, LKB-2188 ultravékony mikrotómával szeletelve, uranil-acetát-ólom-citráttal festve, transzmissziós elektronmikroszkóppal megfigyelve és fényképezve.

1.2.3 Áramlási citometria kimutatás

M PP + kezelés 24 órán keresztül, emésztés 106 tapadóPC12 cellák1,25 g/l tripszinnel mossuk át kétszer PBS-sel, adjunk hozzá 490 μL kötő puffert, alaposan keverjük össze a sejteket, és adjunk hozzá 5 μL Annexin V-FI TC Mix 10 μL oldott PI-t a sejtszuszpenzióban, óvatosan keverjük össze, helyezzük a kémcsövet 4 °C-ra, tegyük a kémcsövet 4 °C-ra, sötétben inkubáljuk 10 percig, és végezzük el a kimutatást áramlási citométeren. Minden csoportnak 4 replikált kútja van.

Statisztikai feldolgozás: Az adatokat x ±, a több csoport összehasonlítását a Kruskal-Wallis teszt, a páronkénti összehasonlítást pedig a Mann-Whitney teszt, valamint a P<0.05 is="" considered="" as="" a="" significant="">

A Cistanche hatása a PC12 sejtek apoptózisára

2. Eredmények

2.1 PC12 sejtek fluoreszcens mikroszkóp megfigyelése

Általában termesztettPC12 cellákegyenletes fluoreszcenciát bocsát ki, miután a Hoechst33342 megfestette, és sűrűn festett szemcsés tömegfluoreszcencia és pontozott fehér fluoreszcencia látható az apoptotikus sejtmagban. A normál csoport legtöbb sejtjének magja viszonylag egyenletes. Kék fluoreszcencia, halványan látható pont alakú kondenzált pont alakú fluoreszcencia, sűrített pont alakú fluoreszcenciája gyengébb, mint az MPP + kontrollsejtek. A normálisan termesztett sejtek egyenletes kék fluoreszcenciát mutatnak a Hoechst festése után, és a mag morfológiája szabályos (1A ábra); Az MPP+ után a nukleáris kromatin koncentráltnak vagy erősen kondenzáltnak tűnik, szabálytalan pontfluoreszcenciát mutat, vagy marginalizált; késői sejtmagok fragmentumokra oszlottak (1B ábra). Egyenértékdózis és az egyenértékdózis 2-szerese A sejtek aCistanchea gyógyszeres szérum + M PP + csoport közel volt a normálishoz (1C, D ábra).

Ábra 1PC12 cellákHoechst33342(Ho) festéssel megfestve

A :Kontroll:A kromatin egyenletesen oszlik el és rendszeresen festett ; B : kezelt MPP+ :A kromatin kondenzációja és margózása a nukleáris membránon; C :EgyenértékűCistanche+ MPP+ kezelés ed;D :Kétszeres ekvivalens Cistanche + MPP+ kezelt , a kromatin normális.

2.2 Megfigyelés vetítési elektronmikroszkóppal

Általában tenyésztettPC12 cellákegységes nukleáris kromatinnal, tiszta és teljes nukleáris membránnal, bőséges citoplazmatikus mitokondriumokkal és teljes organellákkal rendelkeznek (2A ábra). Az MPP+ kezelés után a PC12 sejtek jelentősen megváltoztak, a sejtmembrán ép, a felületi mikrovilli eltűnt, a citoplazma koncentrálódik, a kromatin kondenzálódik, megtört, erősen kondenzálódik és összegyűlik a nukleáris membrán belső felületén, megmutatva aapoptózis, főleg korai és közepes stádiumú apoptotikus sejtekben (2B, C ábra). Apoptotikus sejtek minden olyan csoportban, amelyCistanchea szérumok nyilvánvalóan csökkennek, a nukleáris kromatin egyenletesen oszlik el, a nukleáris membrán tiszta és teljes, és az organellák épek, közel a 2A ábrán látható sejthez.

2.3 Áramlási citometriai vizsgálati eredmények

A sejtmembrán belső oldalán található foszfatidil-szerin (PS) a sejtmembrán külső oldalára vándorolt aapoptózis. Az egyes csoportok apoptotikus aránya (2,3 ± 0,11)%, (2,8 ± 0,21)%, (10,2 ± 0,60)%, (16,0 ± 0,87)% és (18,6 ± 0,67) % volt. A B, C, D csoport rang-összeg tesztanalízise a P E csoporttal összehasonlítva<0.05. there="" is="" a="" significant="" difference="" between="" serum-containing="" chinese="" medicine="" and="" the="" blank="" serum="">

2. ábraPC12 cellákultrastruktúra EM ×6000

V: MPP + egyenletesen diszpergált kromatin nélkül enyhén elektrondús citoplazma, normál organell szerkezet és ép sejtmembrán; B, C: 200 μmol/ L M PP +-nak van kitéve. Korai apoptotikus fázis, perifériás kromatin kondenzáció, majdnem normális citoplazma szerkezet(B). Késő poszt-ot- ic fázis, további kromatin kondenzáció, megnövekedett citoplazmatikus elektronsűrűség, a normál organell szerkezet hiánya és a sejtmembrán integritásának megzavarása(C).

3. Megbeszélés

Az M PP + neurotoxicitása a többkomponensű hatás összetett folyamata, amely magában foglalja a mitokondriumok és a szinaptikus vezikulák dopaminnal való helyettesítésének akadályozását reaktív oxigénfajok előállítása érdekében [1]. Jelenleg úgy gondolják, hogy a legtöbbjük a mitokondriális sejthez kapcsolódikapoptózisés endogén A dopamin neurotoxikus hatása apoptózissal összefüggő [,2] A substantia nigra dopamin sejtvonal SN4741 apoptózisának megfigyelése során M PP + -val megfigyelhető a Kaszpáz-1 és Kaszpáz-3 [3] .1 μmol / L MPP+ a mellékvese neuroblasztóma SH-SY5Y sejtjeire hat, és néhány nap múlva növelheti az apoptózissal kapcsolatos Bcl-2 fehérje expresszióját [4].Cistanchea család Cistanche nemzetségének (Cistanche) száraz, pikkelyes leveleCistanche. A cistanche húsos szára jó gyógyító hatással van az Alzheimer-kór és a PD kezelésére. A cistanche összes glikozidja hatékonyan képes megtisztítani a különböző aktív oxigénmentes gyököket, és megvédheti az OH által okozott DNS-oxidációt. [5]. Sheng et al. [6] kutatás megerősítette, hogy Cistanche A tubulkozid B kivonat csillapíthatja az MPP+-indukált citotoxicitást, gyengítheti a reaktív oxigénfajok felhalmozódását a sejtben, és antagonista hatást gyakorolhat az MPP+-indukált mpp+-indukáltraapoptózisés oxidatív stressz. Megfigyeltük, hogyCistancheantagonista hatással van az MPP+-indukált PC12-re A sejt hatásaapoptózis, és azPC12 cellákaz adag növekedésével nő.

A Cistanche hatása a PC12 sejtek apoptózisára

Utalás

[1] Lotharius J, O Malley KL . A parkinsonizmust kiváltó 1-metil-4-fenil-piridinium hatóanyag intracelluláris dopamin oxidációt vált ki. A toxicitás új mechanizmusa [J]. J Biol Chem, 2000;275 (49):38581-38588 .

[2] Maruyama W, Naoi M. Parkinson-kórban elhunyt sejthalál [J]. J Neurol, 2002;249(S Suppl 2):6-10.

[3] Chun HS, Gibson GE, DeGiorgio LA, et a l. Az MPP(+) által kiváltott dopaminerg sejthalál, az oxidálószer és a specifikus neurotoxikus anyagok közös molekuláris mechanizmusa [J]. J Neurochem, 2001;76(4): 1010-1021.

[4] Veech GA, Dennis J, Keeney PM és mtsai. A megzavart mitokondriális elektron transzport funkció fokozza az anti-apoptotikus Bcl-2 és Bcl-XL fehérje expresszióját SH-SY5Y neuroblasztóma és Parkinson-kór cibrid sejtekben oxidatív stresszen keresztül [J]. J Neu- rosti Res, 2000;6(1):693-700.

[5] Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Lia és mtsai. Szabad gyökök in vitro vizsgálata és védőhatások az OH·által kiváltott DNS-károsodásra, amelyet az összes glikozid okozCistanche[J]. Kínai Gyógyszerészeti Folyóirat, 2001; 36(1): 29-32. Wang XW , Ji ang XY, Wu LY, et a l. Az összes cist hüvelyk glikozid vizsgálata, amely kiküszöböli a szabad gyököket és védi a sérült DNS-t in vitro [J]. Áll Pharm, 2001;36(1):29-32.

[6] Sheng G, Pu X, Lei L és mtsai. Tubuloside BcistancheA salsa megmenti a PC12 neuronális sejteket az 1-metil-4-fenilpiri- diniumion-indukáltaapoptózisés oxidatív stressz[ J]. Play nta Med, 2002;68(11):966-970.

Feladó: A Negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem folyóirata (J Fourth Mil Med Univ) 2004; 25(10)

Cikk azonosítója: 1000-2790 (2004) 10-0955-03