A kenyai vadon élő Cistanche növények fajazonosítása és kémiai összetételének elemzése
May 14, 2025
Absztrakt:Ez a tanulmány növényi morfológiai, szövettani és DNS-vonalkódolási technikákat alkalmazott a vadon élő Cistanche fajok azonosítására Kenyában. A fő aktív komponensek, köztük a fenil-etanol-glikozidok, cukoralkoholok és betain tartalmát a kenyai vadon élő Cistanche-ban HPLC módszerrel határozták meg. Közben elvégezték az ujjlenyomat-elemzést. Az eredmények azt mutatták, hogy a Kenyából gyűjtött vadon élő Cistanche növényt Cistanche senegalensis (Reut.) Beck néven azonosították. A hatóanyagok tartalma, mint plechinakozid,cisztanozid A, akteozid, izoakteozid, és 2'-acetil-lakteozid a kenyai C. senegalensisben alacsonyabb volt, mint a hazai C. tubulosa, de magasabb, mint a hazai C. deserticola esetében. A betain tartalma hasonló volt a hazai C. deserticolához, de nem tartalmaz glükózt. Az ujjlenyomat jellemzői jobban hasonlítanak a hazai C. tubulosa jellemzőihez. Ez a tanulmány alapot biztosít a kenyai Cistanche erőforrások védelméhez, mélyreható kutatásához és fejlesztéséhez.
Kulcsszavak: Cistanches Herba; Cistanche senegalensis (Reut.) Beck; Kenya; fajok azonosítása; DNS vonalkódolás; tartalom meghatározása
Cistanche deserticolaYC Ma
Cistanche, a hagyományos kínai orvoslás nagyra értékelt gyógynövénye, a sivatagi növények szárított, pikkelyes, zamatos száraira utal, mint pl.Cistanche deserticolaYC MaésCistanche tubulosa(Schenk) Wight, mind az Orobanchaceae család tagja. A vese yang tonizálásáról, az esszenciát és a vért tápláló, valamint a beleket a székrekedés enyhítésére szolgáló nedvesítő képességéről híres Cistanche-t évszázadok óta ünneplik a kínai gyógynövényszövegekben. Legkorábbi gyógyászati feljegyzése az ókori klasszikusban jelenik megShennong klasszikus Materia Medica, ahol a Cistanche a "kiváló minőségű" gyógynövények közé tartozik. A történelem során számos hagyományos orvosi szöveg dokumentálta a Cistanche hatalmas előnyeit, és kiérdemelte a "sivatagi ginzeng" becenevet.
A Cistanche változatos farmakológiai hatásai bioaktív vegyületeinek sokaságának tulajdonítható. Közülük a feniletanoid-glikozidok az elsődleges hatóanyagok, amelyek felelősek a Cistanche vese-tonizáló és csontvelő-tápláló hatásáért. Ezek a vegyületek – mint például az echinakozid és az akteozid – neuroprotektív, demenciaellenes, öregedésgátló és májvédő hatást mutatnak. Nevezetesen, az echinakozid és az akteozid a Cistanche minőség-ellenőrzésére használt két referenciavegyület, a Kínai Gyógyszerkönyv 2020-as kiadása szerint. Ezen túlmenően, a Cistanche hashajtó hatása főként oligoszacharid alkoholkomponenseinek köszönhető, beleértve a betaint, mannitot, fruktózt, glükózt és szacharózt. Ezt az öt összetevőt széles körben elismerik, mint a Cistanche azon képességét, amely képes nedvesíteni a beleket és elősegíti a bélmozgást.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight
Kínában a Cistanche főbb fajai közé tartozikCistanche deserticolaYC Ma,Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight,Cistanche salsa(CA Mey.) G., ésCistanche sinensisG. Beck. Ezek a fajok olyan régiókban honosak, mint Belső-Mongólia, Ningxia, Gansu és Hszincsiang. Északnyugat-Kínán túl a Cistanche fajok Eurázsia, valamint Észak- és Kelet-Afrika száraz és sivatagi régióiban is elterjedtek, beleértve az olyan országokat, mint Irán, Afganisztán, Kenya, Pakisztán és Mongólia.
A Kelet-Afrikában található, az Egyenlítőn átnyúló Kenya többnyire 1500 méteres átlagos tengerszint feletti magasságú hegyvidékekből áll, de északi területei sivatagi vagy félsivatagosak. A kenyai bennszülött népek már régóta használnak gyógynövényeket gyógyításra. A régió gazdag gyógynövényekkel büszkélkedhet – például a fogkefe fa kérgéből és gyökereiből származó kivonatokkal (Salvadora persicaL.) gyulladáscsökkentő és antibakteriális tulajdonságaikról ismertek, és gyakran használják fogfájás és fertőzések kezelésére. A szantálfa kérge (Osyris lanceolataHochst. & Steud.) hasmenés kezelésére, míg a maszáj csalán főzetét (Urtica massaicaEnyhebr.) leveleit gyomorfájdalmakra használják. Ez a gazdag hagyomány elősegítette az élénk gyógynövénykultúrát, ám a gazdasági fejlődés kihívásai miatt ezeknek a gyógynövényeknek a felhasználását nem dokumentálták teljes körűen vagy nem vizsgálták szisztematikusan.
Érdekes módon a Cistanche fajokat gyakran gyomnövénynek tekintik Afrikában, és nem kaptak sok figyelmet vagy kutatást. Valójában szinte nincs publikált tanulmány az afrikai Cisztancháról. A Kelet-Afrikai Közösség száraz és félszáraz földjei regionális fejlesztési osztálya felkérésére kutatócsoportunk terepvizsgálatot végzett Kenyában a helyi Cistanche erőforrások feltárására. Vadon élő Cistanche példányokat gyűjtöttünk, botanikai azonosítást végeztünk, és elemeztük elsődleges bioaktív vegyületeiket. A cél az volt, hogy megértsük a kenyai Cistanche fajdiverzitását és fejlődési potenciálját, és tudományos alapot nyújtsunk ezen értékes sivatagi növények további kutatásához és hasznosításához.
Cistanche tubulosa szárított egész gyökér Eladó Kínában
Anyagok és módszerek
Növényi anyagok
A kenyai vadon élő Cistanche példányokat 2023 augusztusában gyűjtötték Pengfei Tu és Yong Jiang professzorok, a Pekingi Egyetem Gyógyszertudományi Iskolájából a kenyai Kajiadoban (01 fok 50'01" D; 36 fok 47'00" K). Két vadon élő Cistanche növényt összegyűjtöttünk, és K1-gyel és K2-vel jelöltük, valamint gazdanövényük gyökereit (lásd az 1. ábrát). A gazdanövényt Kennedy Matheka, a Kenya Nemzeti Múzeumok Kelet-Afrikai Herbáriumának kutatója azonosította.Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz, az Amaranthaceae családba tartozó. Minták aCistanche deserticolaésCistanche tubulosaa Hszincsiang Ujgur Autonóm Régióban lévő Turpan városból és Yutian megyéből gyűjtötték be, és Pengfei Tu professzor hitelesítette őket, mint friss zamatos szárakat.Cistanche deserticolaYC Ma ésCistanche tubulosa(Schrenk) Wight. Az összes utalványmintát laboratóriumunkban őrizzük.
Hangszerek
Waters Arc HPLC rendszer
Quintix125D-1CN elektronikus mérleg (Sartorius, Peking)
Olympus BX-50 optikai mikroszkóp (Olympus, Japán)
NanoZoomer-SQ panoráma diaszkenner (Hamamatsu Photonics, Japán)
KQ500DE digitális ultrahangos tisztító (Kunshan Ultrasonic Instruments, Kína)
MM400 DNS extrakciós daráló (Retsch, Németország)
PCR hőciklus (Analytik Jena, Németország)
DYY-8C elektroforézis készülék és tartály (Liuyi műszergyár, Peking)
MINI Space 1000 gél képalkotó rendszer (Tanon, Shanghai)
Állandó hőmérsékletű inkubátor (Yiheng, Shanghai)
Reagensek
Az echinakozidot (tétel: DST191008-038), az akteozidot (DSTDL006101), az izoakteozidot (DST210601-060), a D-mannitot (DSTDG006201) a Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.-től vásároltuk; A tubulozid A (MUST-15040115), 2'-acetil-lakteozid (MUST-15071504), betain (MUST-23082505), vízmentes D-glükóz (MUST-23030214), fruktóz (MUST-23031403) és szacharóz (MUST-23082505) a Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.-től származott. OCEANPAK), hangyasav (HPLC minőségű, VOKA reagensek) mind kromatográfiás tisztaságúak voltak. A molekuláris analízishez növényi genomiális DNS extrakciós készletet (DP305, Tiangen Biotech, Kína) és ultratiszta vizet használtunk.
A zamatos szármetszetek előkészítése, festése és megfigyelése
A [10] hivatkozásban leírt módszert követve a friss Cistanche zamatos szárakat megfelelő méretűre vágtuk, és FAA fixálóban (70% etanol: jégecet: formaldehid=90:5:5) tartósították. A visszamaradt fixálószer eltávolítása érdekében folyó vízzel történő mosás után a szöveteket hidrogén-fluoriddal meglágyítottuk, Safraninnal megfestettük, dehidratáltuk, paraffinba ágyaztuk és metszetekre vágtuk. Felszerelés után a tárgylemezeket megsütöttük, paraffint megolvasztottak, és a metszeteket 95%-os etanolos Fast Green oldattal megfestették, majd semleges gyantával lezárták. A szöveti morfológiát mikroszkóp alatt figyelték meg, és a jól kialakított metszeteket panorámaszkennerrel pásztázták, hogy nagy felbontású képeket kapjanak.
DNS-kivonás, PCR-amplifikáció és szekvenálás
A Cistanche-mintákból és a gazdanövény gyökereiből származó teljes DNS-t növényi genomi DNS extrakciós készlettel (Tiangen) extraháltuk a gyártó protokollja szerint. A DNS-koncentrációkat és az OD260/OD280 arányokat mikrotérfogatú UV-spektrofotométerrel mértük a minőség értékelésére a folytatás előtt.
A PCR amplifikáció a riboszomális DNS belső átírt spacer 2 (ITS2) régióját és a kloroplaszt psbA-trnH gént célozta meg molekuláris azonosítás céljából [11]. A primer szekvenciák a következők voltak:
ITS2 előre: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'
ITS2 fordított: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'
psbA-trnH előre: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'
psbA-trnH fordított: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'
A PCR-reakciók (25 μL) 12,5 μL 2× Taq Master Mix-et, 1 μL forward és reverse primert (2,5 μmol·L⁻¹), 2 μL DNS templátot és 8,5 μL ddH2O-t tartalmaztak. ITS2 erősítés: 94 fok 5 perc; majd 35–40 ciklus 94 fok 30 s, 56 fok 30 s, 72 fok 45 s; végső meghosszabbítás 72 fokon 10 perc. psbA-trnH amplifikáció: 95 fok 4 perc; 35 ciklus: 94 fok 30 s, 55 fok 1 perc, 72 fok 1 perc; végső meghosszabbítás 72 fokon 10 perc. A PCR-termékeket gélelektroforézissel elemeztük, és a célsávokat Sanger kétirányú szekvenálásnak vetettük alá. A szekvencia kromatogramokat CodonCode Aligner (v3.7.1, CodonCode Co., USA) segítségével elemeztük, hogy megkapjuk a cél DNS-szekvenciákat, amelyeket a kínai Materia Medica DNS vonalkód rendszerrel és a GenBank adatbázisban található BLAST elemzéssel azonosítottunk. A filogenetikai fákat MEGA X szoftverrel állítottuk elő a fajok azonosítására.
Öt fenil-etanol-glikozid mennyiségi meghatározása
Öt fenil-etanoid-glikozid tartalmát korábban bevált módszerekkel határoztuk meg [13]. Referenciaoldatok elkészítése: pontosan mérjük le az echinakozidot, a tubulozid A-t, az akteozidot, az izoakteozidot és a 2'-acetil-lakteozidot, és oldjuk fel 50%-os metanolban, hogy előre meghatározott koncentrációjú vegyes standardoldatot készítsünk. Kromatográfiás körülmények: Phenomenex Luna C18 oszlop (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); A mozgófázis: acetonitril–metanol (6:1, v:v); B mozgófázis: 0,1% hangyasav puffer; gradiens elúció: 0-5 perc, 10%-18% A; 5–15 perc, 18–24 % A; 15–20 perc, 24–26 % A; 20–28 perc, 26–30 % A; 28–35 perc, 30–35 % A. Áramlási sebesség: 1,0 mL·min⁻¹; oszlophőmérséklet: 30 fok ; detektálási hullámhossz: 330 nm. Módszer: fecskendezzen be 10 μL standard- és mintaoldatot a HPLC-be elemzés céljából.
A betain, mannit, fruktóz, glükóz és szacharóz mennyiségi meghatározása
Ezeket a komponenseket a korábbi módszerek szerint határoztuk meg [14]. Referenciaoldatok: pontosan mérjük le a betaint, a mannitot, a fruktózt, a glükózt és a szacharózt, oldjuk fel vízben a vegyes standard oldat elkészítéséhez. Mintaoldatok: hígítsa fel a Cistanche mintaoldatot (a fentiek szerint elkészítve) 50%-os metanollal az eredeti koncentráció 1/5-ére, jól keverje össze, és szűrje át egy 0,22 μm-es mikroporózus membránon. Kromatográfiás körülmények: Shodex ASHAIPAK NH2P-50 4E oszlop (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mozgófázis: acetonitril–víz (77:23); áramlási sebesség: 0,7 ml·perc-1; oszlophőmérséklet: 25 fok ; érzékelés párolgási fényszórás detektorral (ELSD): a drift cső hőmérséklete 100 fok, a vivőgáz áramlása 3 L·min⁻¹. A számszerűsítést 5 μL és 10 μL standard oldat és 5 μL mintaoldat befecskendezésével végeztük, és a tartalom kiszámítását a külső standard kétpontos logaritmikus egyenlet segítségével végeztük.
Ujjlenyomat hasonlóság értékelése
A mintaoldatokat a fent leírtak szerint készítettük el, és a HPLC körülményei és módszerei megegyeztek a fenil-etanol-glikozid mennyiségi meghatározásával. A kromatográfiás adatokat a „hagyományos kínai orvoslás kromatográfiás ujjlenyomat-hasonlóság-értékelő rendszerébe (2012-es kiadás) importáltuk”. A K1 minta kromatogramját használták referenciaként, öt fenil-etanol-glikozid-csúccsal többpontos korrekcióhoz, átfedő és referencia kromatogramok létrehozásához, valamint az ujjlenyomat-hasonlóság kiszámításához.
Eredmények és elemzés
1. A Cistanche morfológiai azonosítása
A Kenyában gyűjtött vadon élő Cistanche példányok jellegzetes morfológiai jellemzőket mutatnak. A virágzat tüskés, egy hosszú tojásdad-lándzsa alakú fellevelével és két kis karvalyával, amelyek mindkét oldala kopasz. A csésze csőszerű, csúcsán öt tompa lebeny található. A corolla cső alakú, 3-4 cm hosszú, a csésze hosszának körülbelül 2,5-szerese, csúcsán öt lebenyű, szélein meghajlott. A korolla sárga színű (1A, B ábra), szárításkor barnára színeződik. A szálak körülbelül 3 cm hosszúak, a tövénél néhány finom szőr található. A stílus valamivel hosszabb, mint a porzók, a stigma pedig csaknem gömb alakú, sima és csupasz. Négy porzó van, hosszú tojásdad portokokkal, melyeket sűrűn borítanak hosszú gyapjas szőrök; a portok töve hirtelen hegyes. Ez a funkció összhangban van a leírásávalCistanche deserticolaésCistanche salsaa "Kína flórájában"; ezzel szemben a portok alapjaCistanche tubulosatompa és lekerekített, ami határozottan megkülönbözteti ugyanazon nemzetség többi fajától [7].
Ezenkívül a tápnövény,Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz, egy sok ágú cserje. Fiatal ágait halványsárga vagy fehér gyapjas szőrök sűrűn borítják. A levelek szélesen lapát alakúak, keskeny alappal (1D, E ábra). A virágzat a kocsány mentén sűrűn csoportosul, amelyet a virágzati tengellyel együtt szürkésfehér vagy halványszürke vagy fehér gyapjas szőr borít.
A vadon élő Cistanche zamatos szára lapított-hengeres, halványsárga vagy barnás felületű, sűrűn borított tűszerű, húsos pikkelyekkel, sorokba rendezve. A textúra szilárd, de enyhén rugalmas (2A ábra). A zamatos szár keresztmetszete halványsárga vagy barnás, szabad szemmel is láthatóak elszórtan halványbarna érkötegek (2B. ábra). Mikroszkóp alatt a vaszkuláris kötegek tojásdadnak vagy fusiformnak tűnnek, xilémből és floémből állnak, gyakran különálló, szétszórt kötegekként, vagy párokba vagy triókba csoportosulva, különböző irányokba orientált floemokkal (2C, D ábra). A Kínai Gyógyszerkönyv 2025-ös kiadása szerint a keresztmetszete aCistanche deserticolabarnás, halványbarna pontszerű érkötegei hullámos gyűrűben vannak elrendezve, és gyakran belső hajtogatott gyűrű alakú köteget alkotnak; ezzel szembenCistanche tubulosaszétszórt pontszerű vaszkuláris kötegeket jelenít meg, ami kulcsfontosságú megkülönböztető jellemzője a kétféle Cistanche-szelet azonosításának [1]. A kenyai vadon élő Cistanche keresztmetszetében is szétszórt pontszerű érkötegek láthatók, amelyek összhangban vannak aCistanche tubulosa.
2. ábra A kenyai vadon élő Cistanche növény (K2) megjelenése és keresztmetszeti jellemzői. V: A szár megjelenése; B: A húsos szár keresztmetszete; C: A húsos szár paraffinos része (szafranin-gyors zöld festés); D: Az érköteg nagyított képe a paraffin szakaszban
