A Cistanche Tubulosa-ból származó szacharóz-szintáz génklónozása, funkcionális azonosítása, szerkezeti és expressziós elemzése Ⅱ

Eredmények és elemzések

1 Szacharóz-szintáz gének bányászata és klónozása Cistanche tubulosa-ban

The amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 was used as a template[16], and sequence alignment was performed in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data, which were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>légi rész.

Ezért a Cistanche tubulosa különböző részeinek transzkripciós adataiban a kezdeti szűrés során kapott két jelölt szacharóz szintáz gén expressziós szintű FPKM értékeit Z-Score segítségével normalizáltuk, és differenciálanalízist végeztünk (1A. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a CtSus gén expressziós szintje a haustóriumban volt a legmagasabb, a föld alatti részen pedig magasabb volt, mint a légi részen, ami összhangban van a glikozidvegyületek felhalmozódási mintázatával a Cistanche tubulosa különböző részein. míg a CtSus1 gén expressziós szintje a haustóriumban alacsony volt. Ezért a fenti eredmények alapján a CtSus gént kiválasztottuk a későbbi szekvencia-amplifikációra, exogén expresszióra és funkcionális azonosításra. Cistanche tubulosa cDNS-t használva templátként, egysávos terméket kaptunk ~2500 bp-nál a PCR-amplifikáció után (1B. ábra). A PCR-terméket kinyertük a gélből, és a klónozó vektorhoz ligáltuk, és a célgén teljes hosszúságú kódoló régióját szekvenálással kaptuk meg. A CtSus szekvencia hossza 2418 bp volt.

1. ábra C. tubulosa-ból származó CtSus gén feltárása és klónozása, valamint az általa kódolt fehérje bioinformatikai elemzése. A: A CtSus és CtSus1 gének expressziós szintjei a C. tubulosan különböző részein az FPKM értékeik alapján Z-pontszámként normalizálva; B: CtSus génamplifikációja; M: DNS marker; C: a CtSus fehérje konzervatív doménje, amelyet a SMART jósolt; D: CtSus és szacharóz-szintázok többszörös szekvencia-illesztése más növényekből, köztük az Arabidopsis thaliana-ból, a Solanumtuberosum-ból és az Albuca bracteata-ból. A szacharóz szintézis domént és a cukortranszfer domént piros, illetve kék dobozok jelölik; E: CtSus és más növényekből származó szacharózszintázok filogenetikai elemzése; F: CtSus heterológ expressziójának SDS-PAGE elemzése pCold™ I vektor alkalmazásával E. coliban. 1. sáv: Protein marker; 2. sáv: felülúszó frakció; 3. sáv: Csapadékfrakció. A piros nyíl a CtSus fehérjét mutatja. G: Egyetlen klón kolónia-PCR-je, amely mindkét rekombináns plazmidot tartalmazza. M: DNS-marker; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

A HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVATES BAESES EGYÜTTMŰKÖDIK A PEKINGI EGYETEMEL

A Wecistanche támogató szolgáltatása – a legnagyobb kínai exportőr:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

KATTINTSON A RÉSZLETEKÉRT

2 A CtSus gén és kódolt fehérje bioinformatikai elemzése

2.1 A CtSus fizikai-kémiai tulajdonságainak elemzése és a transzmembrán domén szerkezetének előrejelzése

A CtSus által kódolt fehérje fizikai-kémiai tulajdonságait ProtParam online szoftverrel elemeztük. A fehérje 805 aminosavat tartalmaz, molekulaképlete C4189H6548N1104O1187S28, relatív molekulatömege 92266,44; az elméleti izoelektromos pont 6.00; a II. instabilitási együttható 35,45, ami stabil fehérje; a teljes átlagos hidrofilitás (GRAVY) –0,187, ami egy hidrofil fehérje. Az MHMM 2.0-t használták a szacharóz-szintáz CtSus transzmembrán doménjének előrejelzésére, és az eredmények azt mutatták, hogy az e gén által kódolt fehérje nem rendelkezik transzmembrán doménnel.

A HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVATES BAESES EGYÜTTMŰKÖDIK A PEKINGI EGYETEMEL

2.2 A CtSus konzervatív szerkezetének és szekvencia-illesztésének előrejelzése

A SMART online szoftvert használták a CtSus fehérje konzervatív doménjeinek előrejelzésére (1C. ábra). A fehérje két konzervatív domént tartalmaz. Az N-terminális (8-553. aminosav) a szacharóz-szintáz domén, amely képes katalizálni az UDP és a szacharóz reverzibilis reakcióját UDP-glükóz és D-fruktóz előállítására; a C-terminális (557-739. aminosavak) a glikoziltranszferáz doménhez tartozik (1D. ábra). DNAMAN szoftvert használtunk a CtSus fehérjeszekvenciának az NCBI adatbázisban található szacharóz-szintáz aminosavszekvenciájához való igazítására (2. táblázat). Az eredmények azt mutatták, hogy a CtSus aminosavszekvenciája nagy hasonlóságot mutat más növények szacharóz-szintáz szekvenciáival. A legnagyobb hasonlóság a CtSus és a szezámból (Sesamum indicum) származó szacharóz-szintáz szekvenciája között 94,78% volt, és a hasonlóság más növények szacharóz-szintáz szekvenciáival is 65% feletti volt, ami azt jelzi, hogy a növényekből származó szacharóz-szintáz szekvenciája magas. megőrzése.

2. táblázat Aminosavszekvencia hasonlóságok a CtSus és a más növényekből azonosított szacharóz szintázok között

2.3 Filogenetikai elemzés

A MEGA szoftverrel szerkesztett filogenetikai fát a Cistanche tubulosa CtSus szacharóz-szintáza és más növények szacharóz-szintázai közötti filogenetikai kapcsolat elemzésére használták. Az eredményeket az 1E. ábra mutatja. A növényekből származó szacharóz-szintázok külön evolúciós ágakat mutatnak a kétszikűekben (I. és II. régió) és az egyszikűekben (III. régió). A CtSus a kétszikű ágban található, és a CtSus-szal szoros rokonságban álló szekvenciák mind Lamiaceae növényekből származnak (Cistanche tubulosa egy Lamiaceae Orobanchaceae növény), míg a másik ág főként Solanales növényekből áll, ami tovább jelzi a magas konzervációt és homológiát. a növényi eredetű szacharóz szintáz gének a növények evolúciójában ugyanabban a sorrendben. Közülük az Orobanchaceae növény Phelipanche ramosa PrSus (AEN79500.1) szacharóz-szintáza áll a legközelebb a CtSus-hoz.

3 A CtSus exogén expressziós és aktivitási analízise

3.1 A CtSus gén exogén expressziója

A szekvenálással ellenőrzött pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus és pCold™ I-CtSus plazmidokat az expressziós kompetens E. coli Transetta (DE3) sejtbe vittük át, és a pozitív klónokat szűrtük. telep PCR-rel a szekvenálás ellenőrzéséhez. A kapott rekombináns expressziós törzseket alacsony hőmérsékleten IPTG-vel indukáltuk fehérje expresszióra, és a baktériumokat centrifugálással gyűjtöttük össze. A lízispuffert hozzáadtuk a baktériumok megtörésére, hogy megkapjuk a felülúszót és a csapadékot, és SDS-PAGE-t végeztünk a kimutatáshoz. Az eredmények azt mutatták, hogy amikor pET-28a és pET-24b expressziós vektorként használták, a CtSus nem expresszálódott E. coliban, míg a pCold™ I expressziós vektorként tiszta CtSus volt. rekombináns fehérjesávot detektáltunk a ~100 kDa régióban, ami összhangban volt az elméletileg előre jelzett 92,2 kDa relatív molekulatömegével (1F ábra).

A HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVATES BAESES EGYÜTTMŰKÖDIK A PEKINGI EGYETEMEL

3.2 Teljes sejt transzformáció

A CtSus katalitikus funkciójának előzetes igazolására elkészítettük a CtSus és az UGT71BD1 glikoziltranszferáz gén koexpressziós törzsét. Az UGT71BD1-et Cistanche tubulosa-ból klónozták és azonosították, és egy UDP-glükozil-transzferáz, amely széles körben képes aromás vegyületeket, például fenil-etanol-glikozidokat, különböző típusú flavonoidokat, sztilbént és kumarint receptorként elfogadni, és katalizálja az UDP-szubsztrátcsoport glükozilációs reakcióját fenol-hidrox-glükokóz segítségével. cukordonorként[18]. A CtSus bevezetése elméletileg elegendő mennyiségű glikozil donor UDP-glükózt biztosíthat az UGT71BD1 által katalizált glükozilációs reakcióhoz, ezáltal elősegítve a reakció egyensúlyának elmozdulását a glikozilációs termékek képződése felé, ezáltal növelve a glikozilációs termékek hozamát. A pCold™ I-CtSus plazmidot és a pET-28a-UGT71BD1 plazmidot egyidejűleg transzformáltuk expressziós kompetens E. coli Transetta (DE3) plazmidba. A mindkét rekombináns plazmidot tartalmazó egyedi klónokat telep-PCR-rel szűrtük, és szekvenálás-ellenőrzéssel pozitív rekombináns expressziós törzseket kaptunk (1G. ábra). A kettős gén koexpresszióját in vitro indukáltuk, és a pET-28aUGT71BD1 egygén expressziós törzset használtuk kontrollcsoportként. A CtSus UDP-glükóz donor képződését katalizáló aktivitását előzetesen teljes sejt transzformációval igazoltuk. A HPLC és a nagyfelbontású tömegspektrometria eredményei azt mutatták, hogy amikor a teljes sejt transzformációs reakciót aesculetin 1-vel és resveratrol 2-vel mint szubsztráttal hajtották végre, 24 órás transzformáció után nyilvánvaló glikozilációs termékek keletkezését észlelték, amint az a 2. ábrán látható.

2. ábra: Az 1. vagy 2. szubsztrát teljes sejtes biotranszformációja UGT71BD1-et hordozó rekombináns törzzsel vagy UGT71BD1-et CtSus-szal összekapcsoló rekombináns törzzsel. A: Az 1. szubsztrát teljes sejtes biotranszformációjának HPLC-kromatogramja. A detektálási hullámhossz 360 nm; B: az 1a termék HRESI-MS és MS2 spektruma; C: a 2. szubsztrát teljes sejtes biotranszformációjának HPLC kromatogramja; A detektálási hullámhossz 330 nm volt. D: A 2a és 2b termékek HRESI-MS spektrumai

Ha 1-et (m/z 179.{2}} [M+H]+, molekulaképlet C9H6O4) használtunk szubsztrátként, az 1a termék kromatográfiás csúcs (m/z 41.{10}} [M+H] +, előrejelzett C15H16O9) molekulaképletet 5,39 percnél detektáltuk, ami összhangban volt a szubsztrát és a kontrolltermék UV-abszorpciójával. Ugyanakkor az 1a MS2-spektrumában az m/z 179.{19}} [M+H]+ fragmentumcsúcsot detektáltuk, amely az 1a glükózmolekula (162 Da) elvesztésével jött létre. hogy az 1a a glükózmolekulához kapcsolódó 1. szubsztrát terméke volt. Az átváltási arányt a csúcsterület integrálásával számítottuk ki. Azt találták, hogy az 1. szubsztrátot katalizáló, az 1a glikozilált termék előállítására katalizáló UGT71BD1 teljes sejtek konverziós aránya 71,87%, míg a CtSus hozzáadása 95,84%-ra növelte a reakció konverziós sebességét, ami 1,3-szorosa a kontrollcsoporténak. Ha a szubsztrát a 2. vegyület volt (m/z 227.072 5 [MH]-, molekulaképlet C14H12O3), a termék kromatográfiás csúcsa 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, előrejelzett molekula). A C20H22O8 képlet) és a 2b (m/z 575.{56}} [M+Na]+, becsült molekulaképlet: 26H32O13) 10,32, illetve 6,52 percnél volt kimutatható, amelyek összhangban voltak a szubsztrát jellemző UV-abszorpciójával, ill. a kontroll termék. A 227.071 3 [MH]- fragmenscsúcsot detektáltuk, ami egy glükózmolekula (162 Da) elvesztésével jött létre, jelezve, hogy a 2a a 2. szubsztrát terméke, amely egy glükózmolekulához kapcsolódik. A szakirodalmi adatokkal [18] és a tömegspektrometriás előrejelzési információkkal összehasonlítva megállapították, hogy a 2b termék a 2. szubsztrát terméke, amely két glükózmolekulához kapcsolódik. Az átváltási arányt az integrált csúcsterület felhasználásával számítottuk ki. Azt találtuk, hogy a CtSus hozzáadása 64,01%-ról 78,51%-ra növelheti a 2. szubsztrát glikozilezési reakciójának konverziós sebességét, amelyből a 2a monoszacharid termék hozama 45,09%-ról 63,58%-ra, a 2b diszacharid termék hozama pedig 18,92%-ról 14,93%-ra változott.

3

A HETIAN DICHEN CISTANCHE CULTIVATES BAESES EGYÜTTMŰKÖDIK A PEKINGI EGYETEMEL

3.3 CtSus

Rekombináns fehérjetisztítás és in vitro enzimkatalitikus aktivitás azonosítása A teljes sejtkonverziós kísérlet eredményei arra utaltak, hogy a CtSus katalizálja az aktív glükóz donor UDP-glükóz termelését. A katalitikus aktivitás in vitro enzimatikus katalízissel történő további igazolása érdekében a pCold™ expressziós rendszerben lévő CtSus gén fúziós fehérjét elválasztottuk és affinitáskromatográfiával tisztítottuk. Az eredmények azt mutatták, hogy amikor a pCold™ I-t expressziós vektorként alkalmaztuk, a rekombináns fehérje nagy mennyiségben expresszálódott, de leginkább a csapadékban. Amikor pCold™ TF-et használtunk expressziós vektorként, a CtSus gén nagy mennyiségben expresszálódott E. coliban (3A. ábra). A fúziós fehérjét HisTrap FF affinitáskromatográfiával tisztítottuk az in vitro enzimatikus reakcióhoz. Az eredményeket a 3B. ábra mutatja. Amikor szacharózt és UDP-t használtunk szubsztrátként, a negatív kontrollcsoporthoz képest új termékcsúcsot észleltünk 10,32 percnél. Retenciós ideje és UV-abszorpciója összhangban volt az UDP-glükózéval. A termék a standardhoz képest UDP-glükóznak bizonyult. Mivel azonban a pCold™ TF expressziós vektor által expresszált fúziós fehérje nagy trigger faktorban oldható címkét tartalmaz (a címkefehérje mérete 48 kDa), nagy hatással lesz a fehérje katalitikus aktivitására. Ezért a fúziós fehérje címkéjét a Xa faktor enzim tovább hasította, és az exogén jelölések nélküli CtSus fehérjét megtisztítottuk (3A. ábra). A fehérjét in vitro enzimatikus katalízisnek vetettük alá, és az eredmények azt mutatták, hogy az UDP-glükóz hozama 3,53%-ról 10,66%-ra nőtt (3B. ábra). A fenti eredmények megerősítették a CtSus aktivitását az UDP-glükóz termelésének katalizálásában in vitro enzimatikus katalízisen keresztül, és azt is kimutatták, hogy egy nagy affinitású tag jelenléte elősegíti a CtSus oldható expresszióját, de jelentősen befolyásolja a az enzim in vitro katalitikus aktivitása.

3. ábra A CtSus heterológ expressziója és funkcionális azonosítása. A: CtSus fehérjék SDS-PAGE elemzése. 1. sáv: Protein marker; 2. sáv: Rekombináns CtSus trigger faktorral; 3. sáv: Trigger13faktor tag hasítása Xa faktor proteáz segítségével, hogy a piros nyíllal jelölt CtSus fehérjét kapjuk. B: Invitro enzimes vizsgálatok fúziós fehérjét és trigger faktormentes CtSus fehérjéket használva az UDP-glükóz szintézisének katalizálására szacharóz, illetve UDP jelenlétében, referencia standard UDP-glükózzal. Ugyanilyen körülmények között főtt fehérjét használtunk kontrollcsoportként. A detektálási hullámhossz 260 nm volt