A Cistanche Tubulosa védi a dopaminerg neuronokat az apoptózis és a gliasejtekből származó neurotróf faktor szabályozása révén: in vivo és in vitro-Ⅰ

BEVEZETÉS

A Parkinson-kór (PD) egy gyakori neurodegeneratív betegség, amely idős embereknél fordul elő, és a substantia nigra (SN) dopaminerg neuronjainak kóros megnyilvánulása a degeneráció következtében. A betegség súlyossága összefüggésben áll a dopamin (DA) neuronális sejtveszteséggel az SN-ben, ami összhangban van azzal a nézettel, hogy a neurodegeneratív folyamat sok éven keresztül halad előre, mielőtt bármilyen tünet jelentkezne.Sawle és Myers, 1993). A betegség progresszív jellege érdekes terápiás beavatkozási lehetőségeket sugall a mögöttes neurodegeneratív folyamat blokkolásával. Ezért jelentős érdeklődésre tart számot a neurotróf faktorok terápia által kiváltott erős és specifikus hatásainak keresése a DA neuronok túlélésére.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A DOPAMINERG NEURONOK VÉDÉÉÉRT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

A neurotróf faktorok esszenciális fehérjék, beleértve az idegnövekedési faktort (NGF), az agyból származó neurotróf faktort (BDNF) és a gliasejtekből származó neurotróf faktort (GDNF), amelyek elősegítik az idegek növekedését, a neurológiai fejlődést, az axonális irányítást és az idegsejtek működését. A dopaminerg neuronokat védő és elősegítő neurotróf faktorok közül a GDNF rendelkezik a legerősebb hatással (Hong et al., 2008; Rangasamy és mtsai, 2010; Allen és mtsai, 2013). A GDNF-ről kimutatták, hogy erős neurotróf hatást fejt ki a DA neuronokra in vitro (Lin et al., 1993), és in vivo neuroprotektív hatást fejt ki. Kimutatták, hogy a GDNF megmenti a nigrális DA neuronokat a lézió által kiváltott sejthaláltól patkányokban végzett műtéti vagy toxinok által kiváltott axotómia után (Beck és mtsai, 1995; Kearns és Gash, 1995; Sauer et al., 1995) és részben azután is. szisztémás beadásaN-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP)egerekben (Tomac et al., 1995). A dopaminerg neuronok degenerációjának hátterében a neuronális apoptózis megnövekedett gyakorisága és a neurotróf faktorok csökkent védőhatása áll, amelyeket potenciálisan különböző kóros tényezők váltanak ki (Holden et al., 2006).

A C. tubulosa a Cistanche nemzetséghez tartozó számos növényből származó gyógynövény. Ez a vesehiány-szindróma fő terápiás lehetősége, amely szorosan kapcsolódik az androgén hormonokhoz a hagyományos kínai orvoslásban (TCM). A mai napig számos klinikai és alapkutatás mutatta ki a C. tubulosa-n a neurodegeneratív betegségek hatását. A TCM vese-tonizáló receptek azonosítása a PD kezelésben így alternatív klinikai kezelést jelenthet a PD számára.Echinakozid (ECH)a C. tubulosa gyógynövényben található fő bioaktív komponens. Tanulmányok kimutatták a Cistanche és az ECH glikozidjainak terápiás hatásait,verbascoside(VER) és icariin (ICA) Alzheimer-kórban (AD), PD-ben és más vaszkuláris demenciában szenvedő betegekben (Urano és Tohda, 2010; Wang és mtsai, 2013; Wu és mtsai, 2014). Wu és mtsai. (2014) azt sugallta, hogy az elegendő ECH-t és akteozidot tartalmazó C. tubulosa kivonatok javították az A -42 által okozott kognitív diszfunkciót az amiloid lerakódás blokkolásával és a kolinerg és hippocampalis dopaminerg neuronális működés visszafordításával. Tao et al. (2015) azt találtafeniletanoid glikozidokA C. tubulosa-ból származó (Ph Gs-Ct) patkánymodellek agyszövetében csökkentette az AQP4 fehérje- és mRNS-expresszióját.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA KIVONATOS NAGYOK JAVÍTJÁK MEMÓRIÁT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a kínai gyógynövényvegyületek, köztük a C. tubulosa, az epimedium és a rhizoma polygonati három összetevője, enyhítették a dopaminerg neuronok károsodását és növelték a dopamin szintjét a neurotróf faktorok expressziójának szabályozásával (Wu et al., 2013). Így még nem ismert, hogy a C. tubulosa által kiváltott neuroprotektív hatások hosszan tartóak-e, és hogy a nigrális DA neuronok GDNF beadásával történő megmentése milyen mértékben teszi lehetővé a PD állatok szimptomatológiája szempontjából lényeges motorikus viselkedések jelentős megőrzését. Ebben a tanulmányban egy TCM vesetonizáló receptet, a C. tubulosa nanoport használtak, amely nemzeti szabadalmat kapott (szabadalom száma: 2011103028541) Kínában, és korábban bizonyos terápiás hatást mutatott ki PD-ben. Ezért jelen tanulmány célja a C. tubulosa kezelés neuroprotektív és regeneratív hatásainak vizsgálata, valamint a MES23.5 sejtek és a viselkedési definitív patkányok apoptózisának, valamint a GDNF szabályozásának vizsgálata céltesztek sorozatával mérve. .

ANYAG ÉS MÓDSZER

Anyagok, reagensek és berendezések

A C. tubulosát a Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd.-től vásárolták, Peking, Kína. Az ECH, a VER és az ICA a kínai Nemzeti Élelmiszer- és Gyógyszerellenőrzési Intézettől származott. A MES23.5 dopaminerg neuronális sejtvonalat Biao Chen professzor ajándékozta, a Pekingi Fővárosi Orvostudományi Egyetem Neurobiológiai Laboratóriumának munkatársa. Ötven C57BL/6 hím egeret (egyenként 20–25 g tömegű) vásároltunk a Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.-től (engedélyszám: SCXK2012-0002), Shanghai, Kína.

Az MPP+-t, az MTT-t és a glutamint a Sigma-Aldrich-től (Carlsbad, CA, USA) vásároltuk; A DMEM/F12 táptalajt és a magzati szarvasmarha-szérumot a Gibco Co.-tól (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) vásároltuk; és az MPTP-t, a DA standardot és a homovanillinsav (HVA) standardot a Sigma-Aldrich-től (Carlsbad, CA, USA) vásároltuk. -aktin, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF család receptor alfa (GFR 1) és Ret antitesteket a Cell Signaling Technology, Inc.-től (Beverly, MA, USA) vásároltunk; A 3,3'-diaminobenzidin (DAB) festőreagens készletet a Fuzhou Maixin Biotech., Ltd.-től (Fujian, Kína) vásároltuk; és az SDS-PAGE gélminta-előkészítő készletet, az ultraszenzitív fokozott kemilumineszcenciás (ECL) detektáló készletet és a bicinkoninsav (BCA) tesztet a Beyotime Institute of Biotechnology-tól (Peking, Kína) vásároltuk.

Ez a tanulmány a következő eszközöket használta: ELX800 mikrolemez-olvasó (Bio Tek Winooski, VT, USA); CO2 inkubátor (Heraeus, Hanau, Németország); Gel DOC 2000 gél képalkotó elemző rendszer, elektroforézis cella és elektroforézis tartály (Bio-Rad, Hercules, CA, USA); DU-650 fehérjeanalizátor (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA); 5417R nagy sebességű hűtött centrifuga (Eppendorf, Hamburg, Németország); SXQM kettős bolygóműves golyósmalom (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, Kína); MM400 keverőmalom (Retsch GmbH, Haan, Németország); Agilent 1200 nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); PowerPac Basic elektroforézis, PowerPac Basic transzmembrán transzfer rendszer, Universal Hood II kemilumineszcens képalkotó, S1000 Thermal Cycler RNS reverz transzkripciós rendszer (Bio-Rad); Motic Med 6.0 szövet- és sejtképelemző rendszer (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, Kína).

ElőkészítéseC. tubulosaNanopor

A C. tubulosát lemértük, majd tisztítottuk és dehidratáltuk. Hagyományos porítást követően a C. tubulosa finom port áttörtük egy 200-hálós szitán, és fagyasztva szárítottuk. A C. tubulosa nanopor előállításához szabályozott hőmérsékletű vákuum- és nagyenergiájú golyósmalmot használtunk. Először nyers C. tubulosa nanoport helyeztek egy vákuumgolyós őrlőtartályba, amelyet keményfém őrlőgolyókkal töltöttek meg. Az őrlőgolyók és a C. tubulosa nanopor közötti arány 15:1 és 5:1 között változott. Finom por előállításához a nagy energiájú golyósmalom sebességét és időtartamát 300 fordulat / percre, illetve 20 percre állítottuk be. A finom port lemértük nanoméretű anyagok feldolgozásához, és keverőmalomban dolgoztuk fel 25/s frekvenciával és 20s oszcillációval három ismétlésig. PBS-t használtunk a 25 mg/ml-es törzsoldat feloldásához és elkészítéséhez, majd 30 perces ultrahangos kezelést, autoklávozást és végül -20 °C-on történő tárolást.

Az aktív komponensek minőségellenőrzéseC. tubulosaHPLC-vel

Az ECH és VER gradiens elúciót tartalmazott töltőanyagként oktadecil-szilán kötésű szilícium-dioxiddal, A mozgófázis metanollal és B mozgófázisként 0,1%-os hangyasav oldattal. A detektálási hullámhossz 330 nm volt. Az ICA gradiens elúciót tartalmazott töltőanyagként oktadecil-szilánhoz kötött szilícium-dioxiddal, mozgófázisként acetonitril-víz (30:70) elegyével. A detektálási hullámhossz 270 nm volt. A mintát, a kontrollt és a negatív kontrollt 10 µl-ként mértük a teszthez.

Sejtkultúra és MTT-vizsgálat az MPP életképességének mérésére+- Kezelt sejtek

A MES23.5 sejteket 5% magzati borjúszérummal, 1% glutaminnal, 2% 50× Sato-oldattal és 2% penicillin/sztreptomicint tartalmazó DMEM/F12 táptalajjal oltottuk be. Ezeket 37°C-on inkubáltuk 5%-os CO2 inkubátorban, telített páratartalom mellett. A sejteket izoláltuk és 0,25%-os tripszinnel passzáltuk, és a sejtszuszpenziót a logaritmikus növekedési fázisban összegyűjtöttük. Az 1 × 105 sűrűségű izolált sejteket polilizinnel bevont 96-lyukú lemezekre oltottuk, majd különböző végső koncentrációkat (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 és 800 µmol/L) adtunk hozzá. ) az MPP+ adathordozón. A normál tápközeggel 24 és 48 órán át inkubált MES23.5 sejteket használtunk negatív kontrollként az in vitro kísérletekben. A különböző kezelési csoportokból származó sejteket MTT reagenssel 4 órán át inkubáltuk. Az üregekben lévő oldatot ezt követően eldobtuk, és 150 µl DMSO-t adtunk hozzá, és 10 percig oszcilláltuk. Az egyes minták abszorbanciáját 570 nm hullámhosszon mértük automatikus mikrolemez-leolvasóval. A sejtek életképességének százalékos aránya (%)=a kísérleti csoport átlagos abszorbanciája/a negatív kontrollcsoport átlagos abszorbanciája × 100%.

A megfelelő koncentrációjú MPP+ táptalajt hozzáadtuk az 24-órás kezeléshez MES23.5 sejtekben, ugyanazt a megközelítést alkalmazva, mint az in vitro tenyészetnél. A kezelés után az üregben lévő oldatot eldobjuk. Különböző koncentrációjú (10, 50, 100, 200, 250, 500 és 1000 µg/ml) C. tubulosa nanoport tartalmazó tápközeget adtunk a különböző lyukakban lévő MES23.5 sejtekhez, és 24 és 48 órán keresztül inkubáltuk. A normál tápközeggel 24 és 48 órán át inkubált MES23.5 sejteket negatív kontrollként használtuk. Az MPP+ tápközeggel inkubált MES23.5 sejteket használtuk vivőanyagként. A méréseket minden mintánál háromszor végeztük. A megfelelő kezelési és kontrollcsoportok abszorbanciáját mértük a sejtek életképességének kiszámításához.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA KIVONAT FÁRADTSÁG ELLENI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

TH expresszió immuncitokémiával mérve

Amikor a C. tubulosa nanopor 100, 200 és 250 µg/ml-ben volt, a sejtek túlélési aránya jelentősen megnőtt (2G. ábra). Így a következő kísérletekben a három koncentrációt teszteltük: alacsony dózisú, közepes dózisú és nagy dózisú csoportokat. Mindegyik C. tubulosa csoport esetében három replikációt teszteltünk. Sterilizált, polilizin bevonatú fedőlemezeket helyeztünk 6-lyuklemezekre. Ezután 5 × 104 sejtet oltottunk be minden lyukba, és 24 órán át inkubáltuk. A normál kontrollcsoportban a hagyományos friss tápközeget cseréltük ki, a többi kezelt csoportban pedig 100 µmol/L végső koncentrációjú MPP+ táptalajt cseréltünk le, hogy 24 órán át inkubáljuk. Ezután a hagyományos friss tápközeget kicseréltük a normál kontroll- és vivőanyag-csoportokban, és 100, 200 és 250 µg/ml C. tubulosa nanopor végső koncentrációját 24 órán át inkubáltuk a sejtekkel alacsony, közepes és nagy dózisban. C. tubulosa kezelési csoportok, ill. A különböző csoportokban lévő MES23.5 sejteket háromszor mostuk PBS-ben, hogy eltávolítsuk a felülúszót, és tovább fixáljuk 4%-os paraformaldehidben 15 percig. PBS-sel történő mosás után a sejteket peroxidáz blokkolóval inkubáltuk 37 °C-on 30 percig, majd újra mostuk PBS-sel. A sejtpermeabilizáláshoz 0,2%-os Triton X{30}} oldatot használtunk 10 percig, majd PBS-sel mostuk. Minden mintához normál kecskeszérumot adtunk, és szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltuk. Ezután a normál kecskeszérumot eltávolítottuk, és a PBS-ben 1:400 arányban hígított elsődleges antitestet minden mintához adtuk, és 4 °C-on inkubáltuk egy éjszakán át. A negatív kontrollcsoport sejtjeit PBS-sel inkubáltuk 4 °C-on egy éjszakán át. PBS-sel történő mosás után a sejteket biotinnal jelölt másodlagos antitestekkel inkubáltuk a nedveskamrában 37 °C-on 20 percig. Ezután mindegyik mintát PBS-ben mostuk, és torma-peroxidáz-sztreptavidin konjugátumokkal (C munkaoldat) jelöltük 37 °C-on 20 percig. PBS-sel történő mosás után a sejteket DAB reagenssel festettük sötétben körülbelül 1-10 percig, és fénymikroszkóppal követtük a barna szín kialakulását. Ezután minden mintát kétszer mostuk desztillált vízben 1-2 percig, és a sejtmagokat hematoxilin oldattal 0,5-1 percig ellenfestettük. Miután minden egyes mintát alaposan leöblítettünk vízzel, a sejteket 1%-os sósav-alkoholba merítettük a differenciálódás érdekében és 1%-os vizes ammóniába, majd a sejteket alaposan megmostuk vízzel. Az egyes minták sejtjeit ezután 70%-os etanolban 2 percig, 80%-os etanolban 2 percig, 90%-os etanolban 2 percig, kétszer 95%-os etanolban 2 percig, és kétszer 100%-os etanolban 2 percig dehidratáltuk. A sejteket ezután kétszer 2 percre xilololdatba merítettük, és semleges gyantával egy tárgylemezre helyeztük. Fénymikroszkóppal minden mintán 5-10 hatékony látómezőt készítettünk és véletlenszerűen kiválasztottunk, hogy meghatározzuk a kiválasztott fehérjék expresszióját a dopaminerg neuronokban, amit a barna részecskék intenzitása jelez, és félig mennyiségileg meghatározzuk a fehérjetartalmat annak átlagos szürkeértékével. .

A MES23.5 sejtek áramlási citometriával mért apoptózisi sebessége

A tapadó sejteket egyszer mostuk PBS-sel. A sejtek izolálásához megfelelő mennyiségű EDTA-mentes tripszin oldatot adtunk hozzá szobahőmérsékleten, és az oldatot óvatosan pipettáztuk, hogy lehetővé tegyük a tapadó sejtek leválását. Ezután sejttenyésztő tápközeget adtunk a tripszinezés leállítására. Az elegyet átvittük egy új centrifugacsőbe, majd 5 percig centrifugáltuk 1500 fordulat/perc sebességgel, hogy összegyűjtsük az izolált sejteket. A felülúszó eldobása után a sejtüledéket óvatosan újraszuszpendáltuk PBS-sel, és megszámoltuk a sejteket. Körülbelül 1 × 105-5 × 105 újraszuszpendált sejtet centrifugáltunk 5 percig 1500 fordulat/perc mellett, és a felülúszót elöntöttük. Öt mikroliter Annexin V-FITC kötőoldatot adtunk a sejtüledékhez, hogy a sejteket finoman újraszuszpendáljuk. További 5 µl Annexin V-FITC-t adtunk hozzá, és alaposan összekevertük. Öt mikroliter propidium-jodid oldatot használtunk a sejtfestéshez, szobahőmérsékleten 10 percig inkubálva röviddel az áramlási citometria előtt.

Western blot elemzésin vitro

A sejteket normál csoportra, MPP+ kezelési csoportra osztottuk, alacsony dózisúC. tubulosakezelési csoport, közepes dózisú C. tubulosa kezelési csoport és nagy dózisú C. tubulosa kezelési csoport. Mindegyikben mértük a Bcl2 és a Bax expresszióját. Összesen 1 × 105 sejtet használtunk üregenként a 6-lyuklemezen a modellezéshez és kezeléshez minden csoportban a sejtgyűjtés előtt. RIPA puffert, proteáz inhibitort és foszfatáz inhibitort tartalmazó vegyes lizátumot adtunk hozzá, hogy a sejteket 3 0 percig jégen lizáljuk. Centrifugálás után a felülúszót fehérjeanalízishez használtuk. A teljes protein mennyiségét BCA vizsgálattal határoztuk meg, és 10%-os SDS-PAGE-val választottuk el. Az elválasztott fehérjéket membránra vittük, és 5%-os sovány tejblokkoló pufferrel inkubáltuk szobahőmérsékleten 2 órán át. A membránt ezután elsődleges antitestben (Bcl-2 0,34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, 1:200 hígítás) 4 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk. Mosási lépés után a membránt másodlagos antitestben (0,5 mg/ml, 1:5000 hígítás) 4°C-on 1 órán át, majd ECL előhívóban 2 percig inkubáltuk a hagyományos előhíváshoz. Quantity One szoftvert használtunk a fehérje expresszió szemikvantitatív elemzésére.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA FOR ANTI FATIGUE PROTECT MÁJÁT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kísérleti állatmodellezés és gyógyszeradminisztráció

Ötven, specifikus kórokozótól mentes 8-hetes hím egeret véletlenszerűen öt csoportra osztottak: normál csoport, MPTP-kezeléssel kezelt csoport (Vehicle), alacsony dózisú C. tubulosa kezelési csoport, közepes dózisú C. tubulosa kezelés. csoport, valamint a nagy dózisú C. tubulosa kezelési csoport. Az állatokat 20–22 °C-on tartottuk, szabad hozzáférés mellett élelemhez és vízhez. A normál csoport egereit intraperitoneálisan azonos térfogatú normál sóoldattal injekcióztuk hét egymást követő napon. A többi kezelési csoportban lévő egereket intraperitoneálisan MPTP-vel (30 mg/kg/nap) injektáltuk hét egymást követő napon, hogy meghatározzuk a hordozóanyagot.

A PD modellezés során az alacsony dózisú, közepes dózisú és nagy dózisú C. tubulosa kezelési csoportba tartozó egerek intragasztrikusan 4 g/ttkg/nap, 8 g/ttkg/nap és 16 g/nap ekvivalens klinikai térfogatot kaptak. kg/dC. tubulosa nanopor, illetve 14 egymást követő napon keresztül. A kontroll- és a vivőanyag-csoportba tartozó egereknek intragasztrikusan ekvivalens térfogatú normál sóoldatot adtunk 14 egymást követő napon keresztül. Minden kísérleti eljárást jóváhagyott a Fujian University of TCM etikai bizottsága, és a laboratóriumi állatok felhasználására és gondozására vonatkozó nemzetközileg elfogadott elvek szerint végezték el. Ebben a vizsgálatban minden erőfeszítést megtettünk az állatok szenvedésének minimalizálására.