Citral-tartalmú illóolajok, mint potenciális tirozináz-gátlók: biológiailag irányított frakcionálási megközelítés

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Absztrakt:

A túlzott melanintermelés súlyos bőrgyógyászati ​​állapotokat, valamint kisebb esztétikai problémákat (pl. szeplők és szoláris lentigo) okoz. A tirozináz leszabályozása széles körben elterjedt megközelítés az ilyen rendellenességek kezelésében, és a növényi kivonatok gyakran értékes forrásnak bizonyultak.tirozinázinhibitorok. A citrál (neral és muskátli keveréke) fontos illatanyag, amely tirozináz-ellenes potenciált mutatott. Erősen koncentrált a Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. és Verbenaofficinalis L. illóolajaiban (EO-k). Azonban csak a L. cubeba EO-t vizsgálták potenciális bőrfehérítő szerként használható. Ez a munka in vitro értékelitirozinázezeknek az EO-knak a gátló aktivitását, valamint a bioassay-orientált frakcionálást alkalmazó tanulmányokat, hogy az eltérő kémiai összetételük befolyásolja-e az EO-k gátló hatását az EO-k komponensei közötti lehetséges szinergikus, additív és/vagy kompetitív kölcsönhatásokon keresztül. A C. schoenanthus EO és a M. officinalis EO gátló hatása elhanyagolható ( plusz )-citronellal mennyiségben összhangban volt citráltartalmukkal. Másrészt az L. cubeba és a V. officinalis EO-k gátoltáktirozinázlényegesen nagyobb mértékben, mivel mircenet tartalmaztak, ami hozzájárult az általános EO-tevékenységhez. Hasonló megfigyeléseket végeztek a M. officinalis EO-val, amely magas (plusz)-citronellal-tartalommal rendelkezik, ami növeli a citrális aktivitást.

Kulcsszavak:tirozinázgátlás; illóolajok; citrál

A cistanche fehérítő funkcióval rendelkezik

Bevezetés

TirozinázEz a kulcsenzim a melanin pigmentek bioszintézisében számos baktériumban, gombában, növényben, állatban és emberben. Emberben a tirozináz katalizálja a melanin bioszintetikus folyamatának sebességkorlátozó lépéseit. Ezt a bioszintézist számos enzimatikus és kémiai reakció jellemzi, amelyek melanin képződéshez vezetnek az L-tirozin aminosavból, és a tirozináz mikofenolát és difenol aktivitáson keresztül katalizálja annak o-dopakinonná történő hidroxilezését. Bár a melanogenezisben más enzimek is szerepet játszanak, csak a tirozináz által katalizált reakciók nem mennek végbe spontán módon, míg a fennmaradó lépések fiziológiás pH-n enzimaktivitás nélkül is lezajlanak [1]. Emiatt a tirozináz downreguláció nagyon elterjedt megközelítése a túlzott melaninszint csökkentésének. A tirozináz inhibitorok bőrfehérítő szerként való alkalmazása jelentős klinikai és kozmetikai előtérbe került [2].

Az EU piacán atirozinázA bőrfehérítő szerekként használt inhibitorok két fő kategóriába sorolhatók: az EU 1223/2009 kozmetikai rendelete értelmében tiltottak (azaz a hidrokinon és a mono-benzil-éter-hidrokinon) súlyos mellékhatásaik miatt, de amelyeket még mindig használnak a hiperpigmentáció orvosi kezelésében. felügyelet;és tirozináz-inhibitorok, amelyek kozmetikai termékekben használhatók (pl. arbutin, aloezin, kojsav) [2,3]. Ezt a második csoportot azonban továbbra is potenciálisan jelentős mellékhatások jellemzik; A kojsavval végzett klinikai vizsgálatok valóban rávilágítottak az alkalmazás utáni bőrpír, szúró érzés és kontakt ekcéma eseteire. Hasonlóképpen, az Európai Fogyasztóvédelmi Tudományos Bizottság aggodalmát fejezte ki az arbutinok kozmetikai összetevőként való használatával kapcsolatban [2] a glikozidos kötések hidrokinon felszabadulását eredményező esetleges hidrolízise miatt. Ezért van szükség új molekula templátokra és/vagy bioaktív vegyületek keverékeire a hiperpigmentáció kezelésére.

A növények értékes forrásai a bőrfehérítő szereknek, és az orvosilag és kozmetikailag leggyakrabban használt hatóanyagok közül ötből három növényspecifikus metabolit (pl. hidrokinon, -arbutin, aloezin). A mai napig a fenolos vegyületeket főként potenciálisként vizsgáltáktirozinázinhibitorok, és ezek közé tartoznak a flavonoidok (pl. kvercetin [4]), sztilbének (pl. resveratrol [1]), fenilpropanoidok (pl. fahéjaldehid [5] és eugenol [6]), valamint fenolsavak (pl. ánizssav és benzoesav [7]). A terpenoidok iránti érdeklődés lényegesen alacsonyabb volt, és viszonylag kevéssé vizsgálták őket, mint anti-tirozináz szerek.

A citral azon korlátozott számú, tirozináz-ellenes tulajdonságokkal rendelkező terpenoid származékok közé tartozik, amelyeket tanulmányoztak. Két izomer keveréke, a cisz- és transz-3,7-dimetil-2,6-oktadienál (azaz neral és geranial), amelyekről bizonyítottan blokkolnak. a gomba in vitro enzimaktivitásatirozináz[8]. Az italok, élelmiszerek és kozmetikumok illatos összetevőjeként betöltött fontossága mellett a citrál ígéretes in vitro biológiai aktivitást mutatott, beleértve a gombaellenes, antibakteriális, antioxidáns és gyulladáscsökkentő hatásokat [9–11]. Ráadásul a legújabb tanulmányok kiemelte, hogy a citrál potenciális terápiás jelentőséggel bír simaizom-lazítóként és helyi érzéstelenítőként, mivel elősegíti a légcső, a méh és az aorta simaizomzatának ellazulását, valamint gátolja az idegek ingerlékenységét állatmodellekben [12–15].

A citralt számos botanikai faj illóolajából (EO-k) nyerik, köztük a Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. és Verbena officinalis L. A szerzők legjobbjai szerint Tudomásunk szerint csak a L. cubeba EO-t vizsgáltáktirozinázgátló aktivitás [16]. Ezért ennek a tanulmánynak a célja a C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis és V. officinalis EO-k tirozináz gátló aktivitásának értékelése egy in vitro kolorimetriás vizsgálat segítségével, hogy felmérje, hogy a különböző kémiai összetételek befolyásolják-e az általános EO-gátló aktivitást bármilyen módon. lehetséges szinergikus, additív és/vagy kompetitív kölcsönhatások összetevőik között. Ez a tanulmány abioassay-vezérelt frakcionálási megközelítést alkalmaz az EO-k összetevőinek és enantiomerjeik átfogó értékelésére, ha királisak, amelyek hozzájárulnak a tirozináz gombaforrással szembeni EO-gátló aktivitásához, ami jó modellrendszer a kórokozók előzetes szűrésére.tirozinázinhibitorok [17].

2. Eredmények és megbeszélés

2.1. A vizsgált illóolaj kémiai összetétele és citráltartalma

Annak érdekében, hogy átfogóan jellemezzük az összes lehetséges EO-komponenst, amely hozzájárul a vizsgált biológiai aktivitáshoz, a vizsgált EO-kat GC-vel elemeztük, mind FID, mind MS kimutatással. Meghatároztuk az összes kimutatott vegyület normalizált relatív százalékos abundanciáit (amelyeket a C13 belső standardra normalizált abszolút területekből számoltunk válaszfaktorok [18,19] segítségével) és felhasználtuk az EO összetételek összehasonlítására. Az 1. ábra a vizsgált EO-k hagyományos oszloppal elemzett GC-MS profilját mutatja be. Az 1. táblázat minden vizsgált EO-ra felsorolja azokat a vegyületeket, amelyek normalizált százalékos abundanciája 0,1 felett volt, míg a teljes EO kémiai összetételét a Kiegészítő anyagok (S1-S5 táblázatok) ismertetik.

A vizsgált EO-k mindegyike gazdag nerális (cisz{{0}}, 7-dimetil-2, 6-oktadienális) és gerániumban (transz-3,{ {5}}dimetil-2,6-oktadienál), amelyek a legelterjedtebb vegyületek. A termikus/geránium arány nagyon hasonló volt az összes vizsgált EO-ban, és 0,74 ± 0,05-nek felelt meg. A C. schoenanthus és a L. cubeba EO-k mutatják a legmagasabb ideg- és muskátli-tartalmat, amely a teljes EO-összetételük átlagosan 60 százalékát teszi ki, és ez 1.{14}}szer nagyobb, mint a V. officinalis EO-ban és a három M. officinalis EO (azaz 1., 2. és 3. minta). Az összes EO-ban közös további oxigéntartalmú vegyületek a 6-metil-5-hepten-1-on, a linalool és a citronellal. Ez utóbbi szignifikánsan nagyobb a M. officinalis EO 1-ben, mint a többi vizsgált EO-ban, beleértve a M. officinalis EO2-t és 3-at is.

A szénhidrogén frakció abundanciája jelentősen eltér a különböző EO-kban.M. Az officinalis EO 1 csak transz- -kariofilént és -humulént tartalmaz szeszkviterpén-szénhidrogénként, amelyek a teljes EO 2,7, illetve 0,13 százalékát teszik ki. A C. schoenanthus EO valamivel gazdagabb szénhidrogén frakciót tartalmaz, mint a M. officinalis EO 1 (azaz 7.0 százalék), mindkét monoterpént (azaz kamfént, cisz{{1{{20) tartalmazza. }}}}ocimen, limonén, -pinén, transz- -ocimen, -tujen) és szeszkviterpének (azaz transz- -kariofillén, -kadinén, δ-kadinén, germakrén D, -elemén) mérsékelten összegeket. Az L. cubeba és a V.officinalis EO-ban a szénhidrogén frakció a teljes EO 20 százalékát teszi ki, és a limonén a legnagyobb mennyiségben előforduló vegyület (azaz 15,0 és 10,9 százalék), ezt követi a -pinén, pinén , szabinén, transz- -kariofilén, -mircén, kamfén és -kopén. Végül a M.officinalis EO 2 és 3 jellemző a legmagasabb szénhidrogén-frakciótartalommal (38,8, illetve 31,8 százalék az összes EO-hoz képest). Mindkét mintában a szénhidrogén-frakció főként szeszkviterpéneket tartalmaz, nevezetesen transz- -kariofilént (27,8 százalék, illetve 20,0 százalék) és -humulént (3,0 százalék és 2,6 százalék), valamint egy redukált monoterpén-frakciót, amelyet főként a limonén jellemez. 4,2 százalék, illetve 3,2 százalék).

Három különböző években termelt L. cubeba, V. officinalis és C. schoenanthus Eos mintát, valamint három különböző gyártótól származó M. officinalis EO mintát vizsgáltunk. A C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis és V. officinalis GC-MS analízise nem tárt fel szignifikáns minőségi és mennyiségi különbségeket a három különböző gyártási évből származó minta kémiai összetételében. Ez az optimális tárolási feltételeknek tudható be, azaz borostyán-üveg tartályban 4 ◦C-on, sötétben, elhanyagolható fejtérrel. Másrészt a GC-MS elemzések szignifikáns különbségeket mutattak ki a citronellal és a transz{4 }}kariofilén a három vizsgált M. officinalis EO-ban. A M. officinalis EO 1, 2 és 3 esetében a citronella 19,6 százalékot ért el, 0,26 százalékot és 0,31 százalékot. Ezzel szemben, amint azt korábban leírtuk, a transz- -kariofilén lényegesen nagyobb mennyiségben fordul elő a M. officinalis EO 2-ben és 3-ban, mint a M. officinalis EO 1-ben. Ezek az eredmények összhangban vannak Seidler-Lozykawska és munkatársai által közölt eredményekkel. aki kiemelte a citrál, citronella és transz{19}}kariofillén mennyiségének jelentős különbségeit az európai botanikus kertekből származó 22 kiválasztott M. officinalis genotípusból nyert EO-kban [20].

Valódi mennyiségi meghatározást végeztünk a külső standard kalibrációval, hogy pontosan kiértékeljük a potenciális bioaktív speciális vegyületek (pl. neral, muskátli, limonén, -mircén és citronellal) mennyiségét. A 2. és 3. táblázat a SIM-hez használt diagnosztikai ionokat (m/z) mutatja be. A vizsgált markervegyületek MS mennyiségi meghatározása a kalibrációs tartománnyal, a kalibrációs görbe egyenletével, az egyes analitok korrelációs értékeivel és regressziós standard hibájával, valamint a mennyiségi eredményekkel együtt.

2.2. A vizsgált illóolajok in vitro gátló hatása gomba tirozináz ellen

A korábban leírtak szerint a C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba és V. officinalis EO-i magas citralszintet mutatnak, amelyet a tirozináz gombás forrásával szembeni nem kompetitív gátló aktivitás jellemez [8,16,21]. . Ez a tanulmány az in vitro vizsgálatot céloztatirozinázezeknek az EO-knak a gátló aktivitását annak feltárására, hogy gátlóaktivitásuk csak citráltartalmuknak tulajdonítható-e, vagy vannak-e más bioaktív vegyületek, amelyek befolyásolják az EO-k gátló hatását.

GombatirozinázItt alkalmazták a humán tirozinázzal való nagy homológiája, viszonylag alacsony költsége és könnyen hozzáférhetősége miatt, ami jó modellrendszerré teszi a tirozináz inhibitorok előzetes szűrésére [17]. Az in vitro pontosságtirozináza gátlási tesztet az ismételhetőség (az enzimatikus gátlási vizsgálat ugyanazon a napon történő ötszöri végrehajtásával) és a közepes pontosság (az enzimatikus gátlási vizsgálat négyhetente ötszöri megismétlésével hat hónapon keresztül) szempontjából értékelték. A 4. táblázat a pozitív kontrollként használt kojsavval és L. cubeba EO-val végzett gátlási tesztek variációs koefficiensét (CV) mutatja be. Az eredmények kielégítőek voltak, mivel a CV soha nem haladta meg a 7 százalékot az ismételhetőség és a 10 százalék a közepes pontosság tekintetében. A 4. táblázat bemutatja a pozitív kontrollként használt kojicsavval és L. cubeba EO-val végzett gátlási tesztek variációs együtthatóját. Hasonló pontossági értékeket kaptunk az összes vizsgált EO-ra.

A citrál koncentráció-válasz görbéjét úgy vizsgáltuk, hogy a megfigyelt gátlóaktivitást a reakcióelegyben lévő koncentráció függvényében ábrázoltuk. Az összes EO-t 166,7 µg/ml koncentrációban teszteltük, amely az EO-tól függetlenül a koncentráció-válasz görbe linearitási tartományán belüli citralkoncentrációt eredményezett (y=0,3956x plusz 1,8094,R{{7}). },9951, regressziós hiba: 2,08448, linearitási tartomány: 6,7–166,7 µg/ml), és nem okozott oldhatósági problémákat a reakcióelegyben.

A 2. ábrán bemutatott dobozdiagram a százalékos arányt mutatjatirozinázgátlás minden egyes EO esetében. A L. cubeba, V. officinalis és C. schoenanthus EO-k esetében a 2. ábrán közölt eredmények megfelelnek a 2020 EO-k gomba tirozináz gátló aktivitásának, mivel a varianciaanalízis nem mutatott ki statisztikailag szignifikáns különbséget a különböző EO-k között gyártási éve (p > 0,05). A L. cubeba és a C. schoenanthus EO-k esetében ezek az eredmények jól egyeznek a kvantitatív GCMS elemzések eredményeivel, amelyek szinte azonos citrális mennyiséget mutattak ki a különböző gyártási évek EO-iban. A V. officinalis EO 2020-as tétele valamivel nagyobb citralmennyiséget tartalmaz, mint a 2019-es és 2018-as tételek. A citrálkoncentráció-válasz görbe szerint azonban a 2020-as tétel citrálfeleslege nem elegendő statisztikailag szignifikánsan nagyobb százalékos enzimgátlás meghatározásához, figyelembe véve a véletlenszerűséget. a mérésekhez kapcsolódó hiba. További részletekért lásd az S1 ábrát a kiegészítő anyagban. Másrészt a varianciaanalízis (ANOVA), majd a Tukey–Kramer utólagos teszt kimutatta, hogy a három tesztelt M. officinalis EO, amelyeket különböző gyártók biztosítottak, gátolta a gombát.tirozinázkülönböző mértékben, amelyeket a következő bekezdésekben ismertetünk részletesebben. A legnagyobb gátló aktivitást az L.cubeba, M. officinalis 1 és V. officinalis EO-i esetében figyelték meg, amelyek 59 ± 6 százalékban, 55 ± 7 százalékban és 52 ± 6 százalékban gátoltáktirozináz166,7 µg/ml koncentrációban vizsgálva. Statisztikailag szignifikáns (p < 0,05)="" alacsonyabb="" aktivitást="" figyeltek="" meg="" a="" c.="" schoenanthus="" és="" m.="" officinalis="" 2="" és="" 3="" eo-i="" esetében,="" amelyek="" enzimgátló="" aktivitása="" 42="" ±="" 5="" százalék,="" 40="" ±="" 5="" százalék="" és="" 38="" ±="" 6="" volt.="" százalék,="" ill.="" az="" 5.="" táblázat="" megadja="" azt="" az="" inhibitorkoncentrációt,="" amely="" felére="" csökkentette="" az="" enzimaktivitást="" az="" adott="" kísérleti="" körülmények="" között="" (ic50)="" minden="" egyes="" vizsgált="" inhibitor="" (azaz="" eo-k,="" egyedi="" vegyületek="" és="" kojsav)="" esetében.="" az="" összes="" eo="" hatékonyan="" gátolta="" a="" gomba="" tirozinázt,="" és="" gátló="" aktivitást="" mutatott,="" amely="" átlagosan="" 100-szer="" alacsonyabb="" volt,="" mint="" a="" pozitív="" kontrollként="" használt="">

2.3. A citronon kívül további bioaktív komponensek azonosítása bioassay-vezérelt frakcionálással A 3. ábrán bemutatott hisztogram összehasonlítja a kísérletileg mért enzimatikus gátlások százalékos arányát azokkal az értékekkel, amelyek akkor várhatók, ha a neral és a muskátli (összességnek, azaz citrálnak tekintjük) csak a vizsgált EO-k hatóanyagai. Ezeket az értékeket a citrál koncentráció-válasz görbéből interpolációval mértük. Mint látható, a C. schoenanthus, M. officinalis 2 és M. officinalis 3 gátló aktivitást mutatott, amely összhangban volt citráltartalmukkal, míg a L. cubeba, M. officinalis 1 és V. officinalis EO-k gátolták a gombát. tirozinázt a vártnál nagyobb mértékben. Biológiailag irányított megközelítést alkalmaztak azon további vegyületek azonosítására, amelyek hozzájárulnak a citrális aktivitáshoz. Az L. cubeba, M. officinalis 1 és V. officinalis EO-k oxigén- és szénhidrogén-frakcióit gyorskromatográfiával izoláltuk, és egyedileg teszteltük gombafajtára.tirozinázgátló aktivitások. A fitokémiai frakciók gomba tirozináz gátló aktivitását tesztelték. A fitokémiai frakciók frakcióit ugyanolyan koncentrációban vizsgáltuk, mint a megfelelő EO 166,7 µg/ml-es vizsgálatakor (lásd Anyagok és módszerek szakaszt a 3.2. szakaszban). A 6. táblázat a neral, muskátli, citronellál, limonén, és -mircen a frakcionált EO-k oxigénes és szénhidrogén-frakcióiban.

Ami a L. cubeba és V. officinalis EO-kat illeti, mind az oxigénes, mind a szénhidrogén frakció gátolta a gomba tirozinázt, bár eltérő mértékben. Az oxigéntartalmú frakciók aktivitása (53 ± 3 százalék, illetve 44 ± 5 ​​százalék) teszi ki a legtöbb EO-anti-tirozinázpotenciállal, és összhangban voltak a megfelelő citráltartalommal, ami arra utal, hogy a citrálaktivitást elősegítő vegyületek a szénhidrogén-frakciók közé tartoznak. A L. cubeba és V. officinalis EO-k szénhidrogén-frakciói meglehetősen hasonló kémiai összetételűek. limonén (68,4 és 50,3 százalék), transz- -kariofilén (12.0 és 7,8 százalék), -pinén (1,7 és 7,5 százalék), A -pinén (2,5 és 12,9%), a szabinén (2,7 és 3,8%) és a -mircén (2,0 és 2,4%) a legnagyobb mennyiségben előforduló vegyületek mindkét frakcióban, és meglehetősen hasonló mennyiségben vannak jelen, kivéve: -pinén és -pinén, amelyek a V. officinalis EO szénhidrogén frakciójában uralkodnak.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 százalék mindkét EO-ban), limonén (97, illetve 94 százalék L. cubeba és V. officinalis EO esetében) és szabinén (87 százalék mindkét EO-ban), míg a -pinén esetében eltérő enantiomer felesleget figyeltek meg ((-)- enantiomer: 38 százalék L. cubebaEO-ban és 73 százalék V. officinalis EO-ban) és -pinén ((-)-enantiomer: 67 százalék L. cubeba EO-ban és 88 százalék V. officinalis EO-ban). Mindkét EO-ban a (-)-limonén a teljes frakció több mint 50 százalékát teszi ki. Bár a korábbi tanulmányok a gomba tirozináz elleni gátló hatásáról számoltak be annak nagy mennyisége miatt [22,23], a (-)-limonén itt nem mutatott tirozináz gátló hatást. Hasonló eredményeket kaptunk a (plusz)-limonén, a racém keverék, valamint a (-)-transz- -kariofilén, (±)- -pinén és (±)- -pinén vegyületek esetében is. . A Sabinene-t nem tesztelték, mivel már bizonyított, hogy elhanyagolható mennyiségű gombát tartalmaztirozinázgátló hatások [8]. A korábbi eredményekkel [8] összhangban a mircen csökkentette a gomba tirozináz aktivitását. A 166,7 µg/ml L. cubeba és V. officinalis EO-knál megfigyelt koncentrációban vizsgálva a -mircén aktivitás áthidalta az EO-k várt gátló hatásai közötti rést, ha a citral volt az egyetlen aktív vegyület és a kísérleti eredmények között. Ellentétben Matsuura et al. [8], a mircen erősebb gomba tirozináz inhibitornak bizonyult, mint a citrál, mivel IC50-értéke majdnem tízszer alacsonyabb volt (13,3 µg/ml vs. 121,8 µg/ml). Ez a különbség a különböző használt hordozóknak tulajdonítható; Matsuura et al. csak a gomba tirozináz difenoláz aktivitását vizsgálták, mivel szubsztrátként L-DOPA-t használtak, míg ebben a vizsgálatban L-tirozint használtak. A jelenlegi eredmények arra utalnak, hogy a mircen hatékonyabban gátolja a gomba tirozináz monofenoláz aktivitását, mint a difenoláz.

A M. officinalis EO 1 kis szénhidrogén frakciót mutat, amely a teljes mennyiség kevesebb mint 3 százalékát teszi ki, és nincs tirozináz gátló aktivitása. A M. officinalisEO 1 oxigénnel dúsított frakció azonban nagyobb mértékben gátolta a gomba tirozinázt, mint az citráltartalma alapján várható lenne (3. ábra). Ez a frakció jelentős mennyiségű citronellalt is tartalmaz a neral és muskátli mellett, és a királis analízis azt mutatta ki, hogy a citronellal magas enantiomer tisztaságú a (plusz) enantiomer javára (98,3%). Ha egymástól függetlenül vizsgáljuk, 166,7 µg/ml koncentrációban a (plusz)-citronellal elhanyagolható mértékben gátolta a gomba tirozinázt, bár aktivitása szignifikánsan megnőtt, ha citrállal kombinálva tesztelték. Ezek az eredmények magyarázatot adhatnak a gombák százalékos arányában megfigyelt különbségekretirozinázgátlása a különböző M. officinalis EO-kban. Az M. officinalis EO 2 és 3 nagyon alacsony citronella tartalommal bír, ez lehet az oka annak, hogy gátló hatásuk lényegesen alacsonyabb, mint a M. officinalis EO 1-é.

3. Anyagok és módszerek

3.1. Reagensek

Dimetil-szulfoxid (DMSO), gomba tirozináz Agaricus bisporusból (JE Lange)Imbach, L-tirozin, kojsav, citrál, citronellal, -mircén, ( plusz )-limonén, (-)-limonén, (±)-limonén, ( ±)- és a pinént a Merck Life Science Srl-től (Milánó, Olaszország) vásároltuk. A Litsea cubeba, Verbena officinalis és Cymbopogon schoenanthus EO-kat az Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Olaszország) szállította. Mindegyikhez három különböző évjáratú tételt (azaz 2020, 2019, 2018) teszteltek. Három Melissa officinalis EO mintát vizsgáltak meg; az egyiket az Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), egyet az ErboristeriaMagentina Srl biztosította, míg az utolsót egy helyi boltból vásárolták, és a SpecchiasolS.rl-től (Bussolengo, Olaszország). A szövegben a szerzők a Melissaofficinalis különböző EO-it M. officinalis 1., 2. és 3. EO-ként említik. A megadott EO-k az Európai Gyógyszerkönyvben [24] leírt eljárásokat követve készültek. A Melissa officinalis és a Verbena officinalis EO-kat hidrodesztillációval állítottuk elő a levelekből, illetve a növények légi részeiből; hasonlóan a Litsea cubeba és a Cymbopogon schoenanthus EO-kat a friss gyümölcsök, illetve a friss légi részek vízgőz-desztillációjával kaptuk. Minden egyes EO-t egyedileg elemeztünk GC-MS-sel, amint azt a megfelelő gyártó megvásárolta/ellátta, minden tárolási évben, és közvetlenül a gomba-tirozináz gátló aktivitásának vizsgálata előtt.

3.2. In vitro tirozináz gátló vizsgálat

AztirozinázAz EO-k és az izolált vegyületek gátló hatását in vitro vizsgálták Zengh és munkatársai által optimalizált kolorimetriás leolvasáson alapuló enzimes vizsgálattal. [25], kis módosításokkal. Az EO-k tirozináz gátló aktivitását, valamint a megfelelő szénhidrogén- és oxigéntartalmú frakcióikat, valamint tiszta vegyületeket in vitro vizsgálták kolorimetriás leolvasáson alapuló enzimvizsgálattal, amelyet Zengh és munkatársai optimalizáltak. [25], kis módosításokkal: a vizsgálatot szobahőmérsékleten éstirozináza gátlást a kontroll és a minta abszorbanciájának figyelembevételével mértük 6 perc inkubáció után, nem pedig 20 perc után, hogy az enzimreakció lineáris része alatt működjön, ami pontosabb gátlási eredményeket biztosít [26,27]. A vizsgálathoz Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach gomba tirozinjait választottuk ki. Szubsztrátként L-tirozint használtunk, ami azt jelenti, hogy a tirozináz monofenoláz és a difenoláz aktivitása közötti különbségtétel nélkül vizsgáltuk a teljes tirozináz gátló aktivitást. A fotometriás méréseket 475 nm-en egy Thermo spectronic Genesys6-on végeztük, és a kojinsavat használtuk pozitív kontroll inhibitorként. A vizsgált potenciális inhibitorok (EO-k, EO izolált frakciók, EO egyedi vegyületek és kojicasav) oldatait DMSO-ban készítettem. A 7. táblázat bemutatja az egyes vizsgált potenciális inhibitorok tesztelt koncentrációit. A gombatirozinázA 200 U/mL (27,9 µg/ml) oldatot nátrium-foszfát pufferben (pH 6,8) készítettük, és 9 ml-es alikvotokat -18 ◦C-on tároltunk, és közvetlenül a kísérletek előtt felengedtük. A tirozin oldatot 0,1 mg/ml nátrium-foszfát pufferben (pH 6,8) készítettem, és naponta megújították. A reakcióelegy komponenseit a következő sorrendben helyeztük az üvegbe: 1 ml gomba tirozináz oldat 200 U/ml; 1 ml nátrium-foszfát pufferoldat; 10 µl EO/egyetlen vegyület/kojisav oldat; és végül 1 ml 0,1 mg/ml tirozin oldatot. A végső DMSO százalékos arány a reakcióelegyben 0,3% volt. A vizsgálatot egy lezárt 4 ml-es fiolában végeztük, hogy elkerüljük az EO komponensek elvesztését a környező környezetbe, és minimalizáljuk azok kibocsátását a reakcióelegy feletti fejtérbe. A reakcióelegyet termosztatikus vízfürdőben 25 °C-on 6 percig inkubáltuk. Ezt követően a 475 nm-en mért abszorbanciát regisztráltuk, mivel ez a hullámhossz lehetővé teszi a dopakrom azonosítását. A tirozináz aktivitás 100 százalékának megfelelő abszorbanciát úgy mértük, hogy az EO-kat/egyedi vegyület/kojisav oldatot 10 µl tiszta DMSO-val helyettesítettük. Az üres oldatokat a következőképpen készítettük el: 2 ml nátrium-foszfát pufferoldat, 10 µL EO/egyedi vegyület. /kojisav/DMSO oldat és 1 ml 0,1 mg/ml tirozinoldat. A tirozináz gátlás százalékos arányát az alábbi egyenlet szerint mértük: százalékos gátlás=∆A (kontroll) − ∆A (minta) / ∆A (kontroll) × 100, ∆A (kontroll) vagy (minta) {{ 33}} A475 (Control) vagy (Sample) − A475 (Üres vezérlő) vagy (Sample Blank).

3.3. Flash oszlopkromatográfia

Az EO frakcionálást a Sepachrom (Rho, Milánó, Olaszország) PuriFlash450 flash oszlopkromatográfiás rendszerén végeztük, amely UV és ELSD detektorokkal is felszerelt. A frakcionált EO mennyisége: 900,0 mg. Állófázis: gömb alakú szilikagél részecskék, 50 µm, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) a Sepachrom cégtől származott; mozgófázis: petroléter (A) és etil-acetát (B); áramlási sebesség 25 ml/perc. A lineáris gradiens elúciót 100%-tól A-tól 80%-ig és 20%-ig B-ig vettük át 20 perc alatt.

3.4. Elemzési feltételek

Az EOs oldatokat és a hozzájuk tartozó frakciókat 50 mg/ml koncentrációjú ciklohexánban készítettük, és GC-MS-sel analizáltuk. A citral, citronella, -mircén és limonén mennyiségét minden EO-ban és a megfelelő izolált frakciókban külső standard kalibrációs módszerrel határoztuk meg. A megfelelő kalibrációs szinteket inciklohexánnal készítettük el, és GC-MS-sel analizáltuk. Tridekán (C13) 1.0 mg/ml belső standardként az analitjelek normalizálására szolgált. A 2. táblázat összefoglalja az egyes számszerűsített vegyület figyelembe vett koncentrációtartományát.

A GC-MS elemzéseket egy Gerstel MPS-2 többcélú mintavevővel (Mülheim an der Ruhr, Németország) végezték, amely egy Agilent 6890 N GC-re volt csatlakoztatva, amely egy 5975 MSD-hez és egy ChemStation E-verzióval van felszerelve. 02.02.1431 adatfeldolgozó rendszer (AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, USA). GC körülmények: injektor hőmérséklet: 250 ◦C; befecskendezési mód: osztott; arány: 1/20; vivőgáz: hélium; állandó áramlási sebesség: 1 ml/perc; oszlopok: Mega5 (95% polidimetil-sziloxán, 5% fenil) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, hossza 25 m, a MEGA cégtől (Legnano, Olaszország). Hőmérséklet program: 50 ◦C//3 ◦C/perc//180 ◦C//10 ◦C/perc//250 ◦C(5 perc). MSD feltételek: MS EI üzemmódban működik (70 eV); szkennelési tartomány: 35-350 amu; várakozási idő 40 ms; ionforrás hőmérséklete: 230 ◦C; kvadrupol hőmérséklet: 150 ◦C; átvezető vezeték hőmérséklete: 280 ◦C. Az EO-markereket úgy azonosították, hogy összehasonlították a C9-C25 szénhidrogén-keverékhez viszonyított linearretenciós indexeiket (IT), valamint a tömegspektrumukat az autentikus mintákéval vagy a kereskedelemben kapható tömegspektrum könyvtárakkal (Adams, 2007). Az EO királis analízisét ugyanazon analízis körülményeinek alkalmazásával végeztük 2,3-di-O-metil-6-Ot-butil-dimetil-szilil- -CD-n (2,3DM6TBDMS -CD) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, hossza 25 m a MEGA-tól. Hőmérséklet-programok: 40 ◦C(1 perc)//2 ◦C/perc//220 ◦C (5 perc).

A GC-FID elemzéseket ugyanazon a készüléken végeztük. GC feltételek: befecskendező hőmérséklet: 250 ◦C; befecskendezési mód: osztott; arány: 1/20; vivőgáz: hidrogén; áramlási sebesség: 1 ml/perc. Hőmérséklet-programok: 40 ◦C (1 perc)//2 ◦C/perc//220 ◦C (5 perc).

4. Konklúziók

A vizsgálat célja (1) az in vitro gomba átfogó vizsgálata volttirozináza Cymbopogon schoenanthus, a Litsea cubeba, a Melissa officinalis és a Verbena officinalis EO-k gátló hatásait, és (2) annak megállapítására, hogy biológiai aktivitásuk csak citráltartalmuknak tulajdonítható-e, vagy vannak-e további bioaktív monoterpének, amelyek hozzájárulnak a vizsgált biológiai aktivitáshoz. bioassay-vezérelt frakcionálási megközelítés. Ez a tanulmány kimutatta, hogy L. cubeba és V. officinalis EO-k esetében a -mircén kis mennyisége ellenére hozzájárul az EO-k gátló aktivitásához, és kimutatták, hogy nagyobb gátló ereje van a citrálnak. A második fő megállapítás az volt, hogy (plusz)-citronellal fokozott citromgombatirozinázgátló ereje, potenciálisan viaszinergikus kölcsönhatás, mivel önmagában nem mutatott aktivitást. Ez utóbbi megállapítás magyarázatot ad arra, hogy az elhanyagolható (plusz)-citronella mennyiséget hordozó M. officinalis EO-k esetében miért volt a gátló hatás összhangban lévő citráltartalmukkal, míg a M. officinalis EO-ra, amely viszonylag magas (plusz)-citronella-tartalommal rendelkezik, ennek ellenkezője igaz. bár további vizsgálatokra van szükség a -mircén és citrál, valamint a citronella és a citrál között előforduló kölcsönhatások típusának pontos meghatározásához, valamint ezen EO-k és egyes vegyületek gátló hatásának értékeléséhez az emberi szervezetben.tirozináz, ennek a tanulmánynak az eredményei segíthetnek az EO-k vagy a dúsított EO-k olyan keverékeinek ésszerű megtervezésében, amelyek javítják biológiai hatékonyságukat, és növelik adjuváns potenciáljukat a hiperpigmentáció kezelésében.

Hivatkozások

1. Pillaiyar, T.; Manickam, M.; Namasivayam, V. Bőrfehérítő szerek: A tirozináz inhibitorok gyógyszerkémiai perspektívája.J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2017, 32, 403–425. [CrossRef]

2. Desmedt, B.; Courselle, P.; De Beer, JO; Rogiers, V.; Grosber, M.; Deconinck, E.; De Paepe, K. A bőrfehérítő szerek áttekintése, betekintést nyerve az európai illegális kozmetikai piacba. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 2016, 30, 943–950. [CrossRef] [PubMed]

3. Desmedt, B.; Van Hoeck, E.; Rogiers, V.; Courselle, P.; De Beer, JO; De Paepe, K.; Deconinck, E. Feltehetően illegális bőrfehérítő kozmetikumok jellemzése. J. Pharm. Biomed. Anális. 2014, 90, 85–91. [CrossRef] [PubMed]

4. Kubo, I.; Ikuyo, KH Flavonolok sáfrányvirágból: Tirozináz gátló aktivitás és gátlási mechanizmus. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4121–4125. [CrossRef]

5. Chang, C.-TT; Chang, W.-LL; Hsu, J.-CC; Shih, Y.; Chou, S.-TT A Cinnamomum cassia illóolaj kémiai összetétele és tirozináz gátló hatása. Bot. Stud. 2013, 54, 2–8. [CrossRef]

6. Garcia-Molina, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; Garcia-Molina, F.; García-Ruiz, PA; Garcia-Canovas, F. A tirozináz onorto-szubsztituált fenolok hatása: Lehetséges hatás a barnulásra és a melanogenezisre. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 6447–6453. [CrossRef]

7. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Tirozináz-inhibitorok köményből. J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 5338–5341. [CrossRef]

8. Matsuura, R.; Ukeda, H.; Sawamura, M. Citrus illóolajok tirozináz gátló hatása. J. Agric. Food Chem. 2006,54, 2309–2313. [CrossRef]

9. Lertsatitthanakorn, P.; Taweechaisupapong, S.; Aromdee, C.; Khunkitti, W. Az aknekontrollra használt illóolajok in vitro bioaktivitásai. Int. J. Aromather. 2006, 16, 43–49. [CrossRef]

10. Bouzenna, H.; Hfaiedh, N.; Giroux-Metges, M.-A.; Elfeki, A.; Talarmin, H. A citrál biológiai tulajdonságai és lehetséges védőhatásai az aszpirin által okozott citotoxicitás ellen az IEC-6 sejtekben. Biomed. Pharmacother. 2017, 87, 653–660. [CrossRef]

11. Lee, HJ; Jeong, HS; Kim, DJ; Nem, YH; Yuk, DY; Hong, JT A citrál NO termelést gátló hatása az iNOS expresszió és az NF-κB aktiváció elnyomásával RAW264.7 sejtekben. Boltív. Pharm. Res. 2008, 31, 342–349. [CrossRef]

12. Carvalho, PMM; Macêdo, CAF; Ribeiro, TF; Silva, AA; Da Silva, RER; de Morais, LP; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Barbosa, R. A Lippia alba (Mill.) NE Brown illóolaj és fő összetevői, a citrál és a limonén hatása patkányok légcsősima izmára. Biotechnol. Rep. 2018, 17, 31–34. [CrossRef] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L.; Silva, AdA; da Silva, RER; Costa, RHSd; Monteiro, Á.B.; Barbosa, CRdS; Amorim, TdS; deMenezes, IRA; Kerntopf, MR; Barbosa, R. A Lippia alba illóolaj és fő összetevői, a citrál és a limonén tokolitikus aktivitása patkányok izolált méhén. Chem. Biol. Egymásra hat. 2019, 297, 155–159. [CrossRef]

14. Da Silva, RER; de Morais, LP; Silva, AA; Bastos, CMS; Pereira-Gonçalves, Á.; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. A Lippia alba illóolaj és fő összetevője, a citrál érrelaxáns hatása az izolált patkány aorta kontraktilitására. Biomed. Pharmacother. 2018, 108, 792–798. [CrossRef] [PubMed]

15. Sousa, főigazgatóság; Sousa, SDG; Silva, RER; Silva-Alves, KS; Ferreira-da-Silva, FW; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. A Lippia alba illóolaja és fő alkotórésze, a citrál blokkolja a patkány ülőidegeinek ingerlékenységét. Braz. J. Med. Biol. Res. 2015, 48, 697–702. [CrossRef] [PubMed]

16. Huang, X.-W.; Feng, Y.-C.; Huang, Y.; Li, H.-L. A Kínából származó Litsea cubeba gyümölcsökből kivont illóolaj lehetséges kozmetikai alkalmazása. J. Essent. Oil Res. 2013, 25, 112–119. [CrossRef]

17. Zolghadri, S.; Bahrami, A.; Hassan Khan, MT; Munoz-Munoz, J.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Canovas, F.; Saboury, AA Átfogó áttekintés a tirozináz inhibitorokról. J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2019, 34, 279–309. [CrossRef]

18. Bicchi, C.; Liberto, E.; Matteodo, M.; Sgorbini, B.; Mondello, L.; Zellner, Bd; Costa, R.; Rubiolo, P. Az illóolajok kvantitatív elemzése: Összetett feladat. Íz Fragr. J. 2008, 23, 382–391. [CrossRef]

19. Rubiolo, P.; Sgorbini, B.; Liberto, E.; Cordero, C.; Bicchi, C. Illóolajok és illékony anyagok: Minta-előkészítés és -elemzés. A felülvizsgálat.Flavour Fragr. J. 2010, 25, 282–290. [CrossRef]

20. Seidler-Łozykowska, K.; Bocianowski, J.; Król, D. A választott citromfű (Melissa officinalis L.) genotípusok morfológiai és kémiai tulajdonságainak variabilitásának értékelése. Ind. Crops Prod. 2013, 49, 515–520. [CrossRef]

21. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Az olívaolaj ízesítő vegyületek tirozináz inhibitor aktivitása. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4574–4578.[CrossRef] [PubMed]

22. Fiocco, D.; Arciuli, M.; Aréna, képviselő; Benvenuti, S.; Gallone, A. Különböző illóolajok kémiai összetétele és anti-melanogén potenciálja. Íz Fragr. J. 2016, 31, 255–261. [CrossRef]

23. Hu, JJ; Li, X.; Liu, XH; Zhang, WP A citrom illóolaj gátló hatása a gomba tirozináz aktivitására in vitro. Mod. FoodSci. Technol. 2015, 31, 97–105. [CrossRef]

24. Európa Tanács. Európai Gyógyszerkönyv, 10. kiadás; Európa Tanács: Strasburg, Franciaország, 2020; ISBN 978-92-871-8921-9.

25. Zheng, ZP; Tan, HY; Chen, J.; Wang, M. Tyrosinase inhibitors in the twigs of Cudrania tricuspidata and theirstructure-activity relation study. Fitoterápia 2013, 84, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

26. Williams, KP; Scott, JE Enzyme Assay Design for High-Throughput Screening. Nagy áteresztőképességű szűrésben. Molekuláris Biológiai módszerek (módszerek és protokollok); Janzen, WP, Paul, B., szerk.; Humana Press: Clifton, NJ, USA, 2009; 565. kötet, pp. 107–126.

27. Brooks, HB; Geeganage, S.; Kahl, SD; Montrose, C.; Sittampalam, S.; Smith, MC; Weidner, JR A HTS enzimatikus vizsgálatainak alapjai. In Assay Guidance Manual; Markossian, S., Sittampalam, S., Grossman, A., szerk.; Eli Lilly & Company és a National Center for Advancing Translational Sciences: Bethesda, MD, USA, 2004