A Clec12a enyhíti a gyulladást, miközben korlátozza a kolitogén kommenzális kiterjedését

ÖSSZEFOGLALÁS

A mikrobiota szabályozása kritikus fontosságú a bélrendszer egészsége szempontjából, de a veleszületett immunitás által alkalmazott mechanizmusok továbbra is tisztázatlanok. Itt megmutatjuk, hogy a C-típusú lektin receptor, a Clec12a hiányos egerekben súlyos vastagbélgyulladás alakult ki, amely a mikrobiotától függött. Csíramentes egereken végzett széklet-mikrobióta transzplantációs (FMT) vizsgálatok kimutatták, hogy a Clec12a-/- egerekben kolitogén mikrobióta alakult ki, amelyet a Gram-pozitív szervezet, a Faecalibaculum rágcsálók elterjedése jellemez. A F. rodentiummal végzett kezelés elegendő volt a vastagbélgyulladás súlyosbodásához vad típusú egerekben. A bélben lévő makrofágok expresszálják a Clec12a legmagasabb szintjét. A Clec12a-/- makrofágokban végzett citokin- és szekvenálási analízis fokozott gyulladást, de a fagocitózissal kapcsolatos gének jelentős csökkenését mutatta ki. Valójában a Clec12a-/- makrofágok nem képesek F. rodentium felvételére. A tisztított Clec12a nagyobb mértékben kötődött Gram-pozitív organizmusokhoz, például F. rodentiumhoz. Így adataink a Clec12a-t egy veleszületett immunfelügyeleti mechanizmusként azonosítják, amely nyilvánvaló gyulladás nélkül szabályozza a potenciálisan káros kommenzálisok terjedését.

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

BEVEZETÉS

A mikrobiota összetétele és funkciója nagymértékben befolyásolhatja az emlősök egészségét és betegségeit (Fassarella et al., 2021). Ezt jól dokumentálták a gyulladásos bélbetegség (IBD) esetében, ahol az IBD legtöbb egérmodellje érzékeny a mikrobiota összetételének változásaira (Gkouskou et al., 2014). A mikrobiota stabilitását befolyásoló és utasító tényezők megértése fontos lesz a mikrobiota alapú terápiák kifejlesztése során (Sharma et al., 2020; Sorbara és Pamer, 2022). A mikrobiotát számos paraméter befolyásolja, beleértve az étrendet, a gyógyszereket és az immunrendszert. Az elmúlt években kimutatták, hogy az adaptív immunkomponensek, különösen az IgA, befolyásolják a mikrobiota összetételét (Nakajima et al., 2018; Okai és mtsai, 2016; Yang és Palm, 2020). Kevesebbet tudunk azonban arról, hogy a specifikus veleszületett immunreceptorok hogyan befolyásolják a homeosztatikus mikrobiota összetételét.

A mikrobiális felismerést és a nyálkahártya immunitását szabályozó gének genetikai polimorfizmusai jelentős kockázati allélek az IBD számára, beleértve az ATG16L1 autofágia fehérjét (Cadwell és mtsai, 2008; Liu et al., 2015; Rioux és mtsai, 2007; Wellcome Trust Case Control, 2007). ). Egy közelmúltbeli tanulmányban, amely az ATG16L1T300A polimorfizmusban szenvedő egyének mieloid génexpressziós változásait vizsgálta, a gátló C-típusú lektin receptor (CLR), a Clec12a kimutatták, hogy ezekben a sejtekben szignifikánsan elnyomott (Begun és mtsai, 2015). Ugyanez a tanulmány kimutatta, hogy a Clec12a a patogén fertőzés védelmében működik az autofágia útvonalhoz való kapcsolódás révén. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az IBD-ben szenvedő egyénekben a Clec12a csökkent szabályozása befolyásolhatja a betegség súlyosságát és/vagy fejlődését. E bizonyítékok ellenére keveset tudunk a Clec12a által a vastagbélgyulladás során kifejtett immunszabályozási mechanizmusokról.

A C-típusú lektinek az oldható vagy membránhoz kötött molekulák sokféle csoportját alkotják, amelyek képesek megkötni mind a gazdaszervezetből, mind a mikrobiális eredetű lipideket, fehérjéket és szénhidrátokat (Brown et al., 2018). A Mincle (Clec4e) és a Dectin-1 (Clec7a) két CLR, amelyek a mikrobiota specifikus tagjait befolyásolják a bél homeosztázisának fenntartása érdekében (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez és mtsai, 2019). Azonban több mint 1,000 különböző C-típusú lektinnel még sok felfedeznivaló van ezen a fehérjecsaládon belül. A Clec12a a természetes gyilkos receptorok családjába tartozik, és egyike annak a két C-típusú lektinnek, amelyek immun-tirozint gátló motívumot (ITIM) tartalmaznak, amely képes korlátozni a gyulladásos jelátviteli útvonalakat (Brown et al., 2018; Marshall és mtsai, 2004). . A Clec12a felismeri a húgysavat, amely a sejtkárosodás jele (Neumann et al., 2014). A Clec12a a legerősebben a veleszületett immunsejtekben expresszálódik, és a neutrofilekben csökkenti az aktivációt és csökkenti a gyulladásos citokintermelést a húgysav felismerésekor (Neumann et al., 2014). Ezzel szemben a Clec12a elősegíti a gyulladást azáltal, hogy lehetővé teszi a mononukleáris fagociták (MNP-k) átvándorlását a vér-agy gáton a sclerosis multiplex autoimmun modellje során, és potencírozza az I. típusú interferon jelátvitelt a vírusfertőzésre adott válaszként (Li et al., 2019; Sagar et al. ., 2017). A Clec12a képes felismerni a plazmodiális terméket, a hemozoint is, amelyről kimutatták, hogy a Plasmodium fertőzést követően növeli a CD{29}} T-sejtek számát az agyban (Raulf et al., 2019). Így a Clec12a egy szokatlan CLR-t képvisel, amely számos szerepet játszik az immunitásban és egyedi jelátviteli képességekben, de a bélben betöltött szerepe ismeretlen.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Korábban kimutattuk, hogy a specifikus bélgombák a purin metabolit, a húgysav indukálásával súlyosbítják a vastagbélgyulladást (Chiaro és mtsai, 2017). Ezenkívül a purin metabolizmusát nemrégiben összefüggésbe hozták az emberi bélbetegséggel (Zhu et al., 2019). Ezek az adatok együttesen arra utalnak, hogy a húgysav kimutatása releváns lehet az IBD szempontjából. Ennek alapján a Clec12a bélrendszeri funkciójának feltárását tűztük ki célul. Azt találtuk, hogy a Clec12a-hiányos állatok nagyon érzékenyek a vastagbélgyulladásra, ami a Clec12a hiányában kialakult mikrobiota összetételétől függ. A Clec12a-/- mikrobióta WT-csíramentes állatokba való FMT-je elegendő volt a vastagbélgyulladás súlyosbításához, és a colitogén mikrobióta kialakulása a Clec12a-/- állatokban független az adaptív immunitástól. A releváns mikrobák azonosítása érdekében, amelyek súlyosbíthatják a vastagbélgyulladást, a Clec12a-/- állatokat különféle antibiotikumokkal kezelték, és azok, amelyek a gram-pozitív baktériumokat célozták, enyhítették a betegséget. A 16S rDNS szekvenálással megállapították, hogy a Faecalibaculum rodentium szignifikánsan nagyobb mennyiségben fordul elő a Clec12a-/- állatokban, és az F. rodentium szájszondája elegendő volt a betegség patológiájának súlyosbításához WT állatokban. A Clec12a-/- állatok immunprofilja a homeosztatikus mieloid sejtek jelentős csökkenését mutatta ki a vastagbélben. Az F. rodentiummal kezelt makrofágok RNS-szekvenálása kimutatta, hogy a Clec12a elősegíti a fagocitózist. Mivel kimutatták, hogy a Clec12a több ligandumhoz kötődik, megkérdeztük, hogy a Clec12a kötődne-e a mikrobiota különböző tagjaihoz. Egy Clec12a-Fc fúziós fehérje segítségével azonosítjuk, hogy a Clec12a kötődik leginkább a mikrobiota gram-pozitív tagjaihoz. Ezek az adatok együttesen egy olyan modellre utalnak, amelyben a Clec12a közvetlen kötődésen és fagocitózison keresztül szabályozza a mikrobiota kolitogén tagjait, miközben megakadályozza a gyulladásos válaszokat. Azokban a forgatókönyvekben, ahol a Clec12a expressziója csökken, a gram-pozitív patobionták kiterjedhetnek és elősegíthetik a gyulladást. Így tanulmányaink a Clec12a-t fontos gyulladáscsökkentőként azonosítják a homeosztázis és az egészséges mikrobiota fenntartása érdekében.

EREDMÉNYEK

A Clec12a-/- állatok az adaptív immunrendszertől függetlenül nagyon érzékenyek a vastagbélgyulladásra

Clec12a expressziójának csökkenéséről számoltak be IBD-ben szenvedő egyéneknél, és kimutattuk, hogy a Clec12a egyik ligandja, a húgysav termelésének blokkolása javíthatja a vastagbélgyulladást (Begun és mtsai, 2015; Chiaro és mtsai, 2017; Liu et al. ., 2015). A Clec12a-t azonban még nem vizsgálták vastagbélgyulladás állatmodelljein. Ebből a célból a WT és Clec12a-/- C57BL/6 egereket akut DSS vastagbélgyulladással fertőztük meg. A Clec12a-/- állatok szignifikánsan többet fogytak, rövidebb vastagbeleket mutattak, és szignifikánsan megnőtt az LCN2 gyulladásos marker a székletben a WT állatokhoz képest, ami a gyulladás és a betegség súlyosbodását jelzi (1A-C. ábra). Ezt támasztja alá a szövettani analízis fokozott epiteliális károsodást, kriptavesztést és immunsejtek beáramlását a Clec12a-/- állatokban a WT-hez képest (1D, E ábra). A DSS colitis modell eredményeivel összhangban a CD4+ CD45RBhi sejtek átvitele TCRb-/-; A Clec12a-/- kettős kiütéses egerek idővel kisebb súlygyarapodást és rövidebb vastagbeleket eredményeztek, mint a TCRb-/- egerekbe átvitt T-sejtek (1F, G ábra). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a Clec12a elvesztése súlyosbodó bélbetegséghez vezet.

A jelentések szerint a Clec12a nagyrészt a veleszületett immunsejtekben expresszálódik, és nagyon alacsony expressziót jelentettek a CD8+ T-sejtekben. Ezért annak meghatározására, hogy az adaptív immunitás szerepet játszik-e a Clec12a-/- állatoknál megfigyelt súlyosbodó betegségben, a Clec12a-/- állatokat Rag-/- állatokkal keresztezték, hogy eltávolítsák mind a T-, mind a B-sejteket. Ismét a Clec12a-/- állatoknál rosszabbodott a betegség a WT-állatokhoz képest, mivel többet fogytak, és rövidebb vastagbelük volt, mint a WT-kontrolloknak (1H, I. ábra). Hasonlóképpen a Clec12a-/-; A Rag-/- rosszabbodott bélbetegségben szenvedett a Rag-/- kontrollokhoz képest, és annyi súlyt vesztett, és rövidebb vastagbelük volt, mint a WT és a Rag-/-, mint a Clec12a-/- (1H, I. ábra). Korábban már beszámoltunk arról, hogy a S. cerevisiae-vel történő orális kezelés növeli a húgysavszintet, és rontja a vastagbélgyulladást. Azonban nem figyeltek meg különbséget a szérum vagy a széklet húgysavszintjében a WT-ben a Clec12a-/- állatokkal szemben, ami arra utal, hogy a Clec12A-/- esetében megfigyelt fokozott betegség nem a megnövekedett húgysav következménye (S1. ábra). Így a Clec12a-/- állatokban megfigyelt súlyosbodott vastagbélgyulladás független az adaptív immunrendszertől.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

A Clec12a-/- állatokban a vastagbélgyulladás súlyosbodása a mikrobiotától függ

Ismeretes, hogy a vastagbélgyulladást részben a mikrobiota összetételének változásai okozzák (Kubinak és mtsai, 2015; Ray és Dittel, 2015). Annak megállapítására, hogy a Clec12a-/- állatokban van-e olyan mikrobióta, amely elősegíti a vastagbélgyulladás súlyosbodását, FMT-ket végeztünk WT vagy Clec12a-/- egerekből csíramentes WT állatokba. Négy héttel a transzplantáció után az állatok felét együtt helyezték el, míg a másik fele külön maradt. Ezután mindegyik csoportban akut DSS vastagbélgyulladást váltottunk ki (2A. ábra). Azok az állatok, amelyek Clec12a-/- FMT-t kaptak és együtt tartottak állatokat, szignifikánsan többet fogytak (2B. ábra), és lényegesen rövidebb vastagbelük volt (2C. ábra), mint azok, amelyek FMT-t kaptak WT egerektől. Ezenkívül a szövettani elemzés nagyobb hámkárosodást és gyulladásos beáramlást mutatott ki Clec12a-/- mikrobiotával történő átültetés után (2D, E ábra). A kialakult mikrobiális közösségek megkülönböztethetőek voltak a csoportok között, amint azt Bray-Curtis (PERMANOVA, p=0.0001), súlyozatlan (PERMANOVA, p=0.0062) és súlyozott génszekvenálással határozták meg. Unifrac távolságok (PERMANOVA, p=0.0001). A csoporton belüli mikrobióta eltérések az együtt tartott állatokban voltak a legnagyobbak ugyanazok a mérőszámok alapján, amelyek az egyes FMT genotípusokból származó mikrobák megszerzését jelzik (2. FH ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a Clec12a-/- állatokban a súlyosbodott vastagbélgyulladást Clec12a hiányában dúsított specifikus mikrobák okozzák; és ezek a mikrobák váltak a kolitogén fenotípus domináns mozgatórugóivá, még kialakult WT mikrobiota jelenlétében is.

A Clec12a-/- állatokban kialakult mikrobiota összetétele független az adaptív immunitástól

Az immunrendszer fontos szerepet játszik a mikrobiota összetételének meghatározásában. Az FMT kísérlet kimutatta, hogy a Clec12a-/- a mikrobiota összetételének megváltozásához vezet, ami elősegíti a vastagbélgyulladás rosszabbodását. Először azt akartuk meghatározni, hogy az immunkompartmenten belüli Clec12a-/- hiány képes-e átalakítani a bél mikrobiótát. Ebből a célból a WT vagy Clec12a-/- egerekből származó csontvelőt halálosan besugárzott WT SPF recipiens egerekbe vittük át a mikrobiota standardizálása érdekében, amelyet egy 8-hetes immunrekonstitúciós periódus követett (3A. ábra). Ezalatt az átültetett immunrendszereknek van idejük kifejlődni a recipiensen belül, eltérően alakítva ezzel a mikrobiota összetételét. Annak megállapítására, hogy a mikrobióta prokolitogén változásai ennek az immunszobrászatnak a következményei-e, FMT-ket végeztünk WT vagy Clec12a-/- kiméra egerek ürülékének felhasználásával, és DSS vastagbélgyulladást indukáltunk (3A. ábra). Noha nem történt jelentős változás a súlycsökkenésben (3B. ábra), a Clec12a-/- kiméra egerekből FMT-t kapott állatok vastagbélei szignifikánsan rövidebbek voltak a WT egerektől származó FMT-t kapó állatokhoz képest (3C. ábra), ami a betegség súlyosbodását jelzi. Ezen túlmenően, amikor a WT és a Clec12a-/- FMT recipienseket együtt helyezték el, a vastagbél jelentősen rövidebb volt a WT FMT-t kapó állatokhoz képest (3C. ábra). Így a Clec12a-/- hiány a hematopoietikus kompartmentben domináns colitogén mikrobiota kialakulásához vezet.

Annak további alátámasztására, hogy az adaptív immunrendszer nélkülözhetetlen a kolitogén mikrobióta kialakulásához Clec12a-/- állatokban, FMT-t végeztünk Rag-/- vagy Rag-/- ürülék felhasználásával; Clec12a-/- - a korábban leírtak szerint. Rag-/--t kapott állatok; A Clec12a-/- FMT többet fogyott, és szignifikánsan rövidebb vastagbelük volt, mint azoknak az állatoknak, amelyek Rag-/- állatoktól kaptak FMT-t, ráadásul az együtt tartott állatoknál is súlyosbodott a betegség (3D, E ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a Clec12a hiánya a veleszületett immunrendszerben elegendő egy olyan mikrobiota kialakulásához, amely képes súlyosbítani a vastagbélgyulladást.

A Clec12a elnyomja a Faecalibaculum rodentium terjedését

Különböző antibiotikumok sorozatát alkalmaztuk a Clec12a-/- állatokon belüli betegségeket okozó releváns organizmusok azonosítására. Először is, az eritromicint, ampicillint, neomicint és gentamicint tartalmazó, széles spektrumú antibiotikumok erős koktéljával történő kezelés jelentősen csökkentette a betegség súlyosságát mind a Clec12a-/-, mind a WT állatokban, ami arra utal, hogy a mikrobiota baktériumpopulációja releváns volt a betegség szempontjából. 4A ábra; S2 ábra). Ezután tovább szűkítettük, hogy mely baktériumpopulációk a legrelevánsabbak a betegség szempontjából, különböző antibiotikumok alkalmazásával, amelyek egyedi baktérium taxonokat céloznak meg. Pontosabban, a gentamicint, egy aminoglikozidot, amely a gram-negatív baktériumokat célozza meg, és a cefalotint, egy cefalosporint, amely elsősorban a gram-pozitív baktériumokat célozza meg. Ezeket a gyógyszereket Clec12a-/- állatoknak adták be DSS colitis alatt. Míg a gentamicinnel végzett kezelés nem változtatott a betegség súlyosságában, a cefalotint kapó állatok megtartották súlyukat, és szignifikánsan hosszabb vastagbelük volt, mint az ál-kezelt állatoké (4B, C ábra), ami azt jelzi, hogy a Clec12a-/- mikrobiótában élő gram-pozitív szervezetek játszanak. fontos szerepet játszik a betegség patológiájának súlyosbodásában.

Ezt követően az SPF WT és a Clec12a-/- széklet 16S rRNS-gén szekvenálását végeztük el a mikrobiota összetételi változásainak profilálására. A WT és a Clec12a-/- állatok szignifikánsan eltérően csoportosultak mind a nem filogenetikai, mind a filogenetikai abundanciával súlyozott metrikák, Bray-Curtis és súlyozott UniFrac alapján (S3A-C ábra). Az alfa-diverzitási mérőszámok nem mutattak ki szignifikáns különbségeket a gazdagságban (megfigyelt jellemzők), ami azt jelzi, hogy a Clec12a-/- nem tartalmazott több fajt (4D. ábra). Az egyenletességi és Shannon-diverzitási indexek azonban növekedtek Clec12a hiányában, ami azt jelzi, hogy a baktériumok arányos eloszlása ​​a Clec12a-/- egerekben megváltozott (4E, F ábra), és tovább támasztja alá, hogy a Clec12a fontos a bélben lévő mikrobiota szerkezetének szabályozásában.

A mikrobiomák összetételének (ANCOM) elemzése feltárta, hogy az eltérően bőséges ASV-k (amplikon szekvencia-variánsok) közül a Faecalibaculum nemzetségbe (Erysipelotrichaceae család) besorolt ​​ASV szignifikánsan kiterjedt a Clec12a-/- székletben a WT-hez képest (ábra). 4G, H). A BLAST az elemzésünkből származó ASV reprezentatív szekvenciát használva 100%-os azonosságot mutatott a Faecalibaculum rodentium baktériumból származó szekvenciákkal. Ezek az adatok bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a Clec12a-/- állat Gram-pozitív baktériumai felelősek a colitogén fenotípusért, és kifejezetten a Gram-pozitív szervezetet, az F. rodentiumot okozzák a betegség súlyosbodásával.

Ennek alapján teszteltük azt a hipotézist, hogy a F. rodentium súlyosbíthatja a vastagbélgyulladást. A WT SPF állatokat 1 x 108 CFU élő vagy fix F. rodentiummal előkezeltük orális szondán keresztül, és a kezelést minden nap folytattuk a DSS akut modellje alatt, hogy biztosítsuk az F. rodentium kolonizáció magas szintjét. Azok az állatok, amelyek élő és fixált F. rodentiumot is kaptak, többet fogytak, és jelentősen rövidebb vastagbelük volt, mint a vivőanyaggal kezelt állatoké (4I. ábra, J), ami azt jelzi, hogy az F. rodentium megnövekedett szintje ronthatja a betegséget.

A Clec12a korlátozza a makrofágok gyulladásos válaszát, miközben fokozza a fagocitózist

A Clec12a sejtes expressziójának meghatározásához betegség hiányában többszínű áramlási citometria segítségével profiloztuk a veleszületett és adaptív immunsejteket a lamina propriában (LP). A korábbi jelentésekkel összhangban a Clec12a túlnyomórészt a mieloid vonalra korlátozódik, és a limfocitákon alig vagy egyáltalán nem expresszálódik (5A. ábra) (Han és mtsai, 2004; Pyz és mtsai, 2008; Sobanov és mtsai, 2001). Az intestinalis neutrofilek, makrofágok és dendritikus sejtek hasonló szintű Clec12a expressziót mutattak (S4A ábra), míg a makrofágokban volt a legnagyobb százalékban a Clec12a-t expresszáló bélszövetben (5A. ábra). Tekintettel arra, hogy a makrofágok kettős szerepet játszanak a gyulladás előmozdításában a klasszikus aktiváción keresztül, de a szövetkárosodásra válaszul reparatív mechanizmusokat is indítanak, megkérdeztük, hogy a Clec12a hogyan befolyásolhatja ezt a dichotómiát a vastagbélgyulladás során. Míg a makrofágok meglehetősen sokfélék, a CD38 és az EGR2 expressziója alapján nagyjából M1 gyulladásos és M2 reparatív makrofágokra oszthatók. Megmutatjuk, hogy a Clec12a-/- állatokban a vastagbél LP-ben megnövekedett M1 makrofágok és csökkent M2 makrofágok alakultak ki a vastagbélgyulladás során (5. B, C ábra, S4B. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a Clec12a szabályozza a makrofág válaszokat a bélben.

Annak érdekében, hogy jobban megértsük, hogyan befolyásolja a Clec12a a makrofágok biológiáját a mikrobiális ligandumok hatására, a WT-ből vagy Clec12a-/- állatokból izolált csontvelő-eredetű makrofágokat (BMDM-eket) számos gyakori mikrobiális ligandummal kezelték, beleértve az LPS-t, a Pam3CysK-t és a Flagellint. Mindezen mintákon citokinanalízist végeztünk. A vizsgált citokinek közül sok nem indukálódott ilyen körülmények között, azonban ezekben a tenyészetekben következetesen kimutattak MCP-1, IL-27, IFN-b, TNF-a és IL{10}} ( 5D ábra). A Clec12a-/- BMDM-ekben ezeknek a citokineknek az expressziója szignifikánsan magasabb volt számos mikrobiális ligandum hatására, és a legnagyobb különbséget a Pam3CysK TLR2 agonistára adott válaszként észlelték. Ezek az adatok összhangban vannak a Clec12a ismert szerepével a gyulladásos válaszok enyhítésében steril gyulladás során (Neumann és mtsai, 2014).

cistanche növény-növelő immunrendszer

Az RNS-seq-et F. rodentiummal kezelt WT-ből vagy Clec12a-/--ből származó BMDM-eken végeztük annak meghatározására, hogy a Clec12a hogyan szabályozza ezeknek a sejteknek a specifikus bakteriális szervezetre adott válaszait. A különbségi választ úgy értékeltük, hogy összehasonlítottuk az F. rodentiumnak kitett Clec12a-/- BMDM-eket a vivőanyag-kontrollokhoz képest a WT BMDM-ekkel. A differenciálisan expresszált gének dúsítási analízise azt mutatta, hogy a Clec12a-hiányos makrofágokban jelentősen megnőtt a sejtciklus szabályozásában részt vevő gének száma, amikor F. rodentiummal fertőzték meg őket (S5A ábra). A sejtciklus szorosan összefügg a fagocitózissal, és a fagocitózishoz és a gyulladásos válaszhoz kapcsolódó gének számában is jelentős csökkenés következett be (5E. ábra) (Luo et al., 2005). A Clec12a-n és a Salmonellán végzett közelmúltbeli tanulmányokkal összhangban ezek az adatok arra utalnak, hogy a fagocitózis hibás Clec12a hiányában a normál bélben élő F. rodentium hatására (Begun et al., 2015). Ennek tesztelésére peritoneális makrofágokat gyűjtöttünk WT és Clec12a-/- állatokból, és együtt tenyésztettük Sybr®-zölddel jelölt F. rodentiummal. A Clec12a-/- makrofágokban szignifikánsan kevesebb mikroba volt sejtenként (5F, G ábra; S5B ábra), ami azt jelzi, hogy a Clec12a hiánya kevesebb organizmus felvételéhez vezet, és összhangban van az RNS-seq adatkészletben lévő fagocitózis csökkenésével. Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy a Clec12a kettős szerepet játszik: enyhíti a közös mikrobiális ligandumokra adott nyílt gyulladásos válaszokat, miközben elősegíti a makrofág baktériumok felvételét.

A Clec12a elsősorban a gram-pozitív kommenzálisokhoz kötődik

Mivel a fagocitózist mikrobák kötődése indítja be, majd internalizáció és elpusztítás, feltételeztük, hogy a Clec12a képes volt kötődni a mikrobiota specifikus tagjaihoz, például a F. rodentiumhoz. Ennek a lehetőségnek a megoldására létrehoztak egy fúziós fehérjét, amely tartalmazza az egér Clec12a extracelluláris kötődoménjét és a humán IgG1 Fc részét (Clec12a-Fc) (6A ábra) (Maglinao és mtsai, 2014; Neumann és mtsai, 2014; Raulf et al., 2019). A fehérjét megtisztítottuk és szűrtük, hogy kötődjön a homeosztatikus bélrendszerben ismerten jelen lévő Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok csoportjához, beleértve a F. rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria animalis, Akkermansia muciniphila, Bacteriodes uniformis, és a gomba commensal Candida albicans áramlási citometriával. A Salmonella enterica is szerepelt, mivel korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy a Clec12a kapcsolatba hozható a S. enterica sejtbe való bejutásával (Begun et al., 2015). A Clec12a különböző mértékben kötődött számos filogenetikailag különböző baktériumhoz, köztük a F. rodentiumhoz, de nem a gombákhoz, a C. albicanshoz (6B. ábra). A Clec12a leginkább a Gram-pozitív F. rodentium mikroorganizmusokhoz és a Roseburia sp. Lachnospiraceae család egy tagjához kötődött, és a legkevésbé a B. animalis-szal, a B. uniformis-szal és a S. enterica-val lép kölcsönhatásba (6B. ábra), ami azt jelzi, hogy a Clec12a doboz kötődnek a mikrobiota meghatározott tagjaihoz, előnyben részesítve a gram-pozitív szervezeteket. Összességében adataink azonosítják a Clec12a-t, mint az immunrendszer által alkalmazott mechanizmust a bél mikrobiális közösségének felmérésére és a mikrobiota metszésére a közvetlen kötődés és fagocitózis révén, miközben megakadályozza a nagyszámú gram-pozitív mikrobákkal szembeni nyilvánvaló gyulladásos válaszokat, amelyek kritikusak a bél egészségének megőrzésében.

VITA

A bélen belüli homeosztázishoz olyan mechanizmusokra van szükség, amelyek korlátozzák a kommenzális mikrobákat anélkül, hogy károsító gyulladást okoznának (Macpherson et al., 2000). Az elmúlt években az IgA az egyik kritikus módja annak, hogy a bél immunitása kontrollt gyakoroljon a mikrobiota felett (Pabst és Slack, 2020). Valójában az IgA képes közvetlenül kötődni a mikrobákhoz és/vagy termékeikhez, és eltávolítani azokat a bélből anélkül, hogy prototípusos gyulladást váltana ki. Más, ezekkel a kettős tulajdonságokkal rendelkező immunmolekulákat a mai napig nem vizsgáltak. A C-típusú lektinek a fehérjék változatos osztályát foglalják magukban, amelyek különféle fehérje-, szénhidrát- és lipidmolekulákat képesek felismerni mikrobiális és gazdatermékekből (Brown és mtsai, 2018; Drouin et al., 2020). Azonban keveset tanulmányoztak a bél immunitásával és a mikrobiotával összefüggésben (Iliev és mtsai, 2012; Martinez-Lopez és mtsai, 2019). Így tudomásunk szerint ez az első bizonyíték arra vonatkozóan, hogy a Clec12a hiánya megváltoztatja a mikrobiota összetételét, amely a betegség súlyosságát befolyásolja.

A cistanche jótékony hatású – erősíti az immunrendszert

A Clec12a-t nagyrészt a mononátrium-urát (MSU) vagy a húgysav felismerésével összefüggésben tanulmányozták, ami gyakran a sejthalál jele (Kono és mtsai, 2010; Neumann és mtsai, 2014). A húgysav az NLRP3 gyulladáson keresztül képes gyulladásos válaszokat aktiválni, így a sejthalál során bekövetkező szövetpusztulás megelőzése érdekében ezt a gyulladást kontrollálni kell (Martinon et al., 2006). Kimutatták, hogy a Clec12a egyensúlyba hozza ezt a gyulladásos választ a Syk jelátvitel leszabályozásán keresztül (Marshall és mtsai, 2004). Ezzel összhangban a Clec12a deléció a steril gyulladás modelljében és az ízületi gyulladás autoinflammatorikus modelljében fokozott neutrofil aktivációt és súlyosbodó betegséget okoz, ami a Clec12a-t fontos gyulladásos fékré teszi (Redelinghuys et al., 2016). A közelmúltban azonban a Clec12a-ról azt is kimutatták, hogy fokozza az I. típusú interferon jelátvitelt a vírusfertőzésre adott válaszként, és közvetíti a Salmonella felvételét az antibakteriális autofágia útvonalon keresztül (Begun és mtsai, 2015; Li és mtsai, 2019). Ez azt mutatja, hogy a Clec12a nem kizárólag a gyulladás korlátozására szolgál, hanem a kontextustól függően többféle szerepet is betölthet. A bél abban különbözik, hogy betegség hiányában is nagyszámú immunsejt található. Ez a mikrobiota jelenlétének köszönhető, amely fontos szerepet játszik az immunrendszer fejlődésében és a patogén organizmusok megtelepedésének megakadályozásában. A mikrobiota ugyanazokkal a felszíni mintázatokkal rendelkezik, amelyeket a TLR-ek észlelnek, amelyek a kórokozókat is felismerik, ezért a bélrendszer immunrendszerének szigorú szabályozási mechanizmusokkal kell rendelkeznie, hogy megakadályozza a gyulladást ezen idegen organizmusokkal szemben (Blander et al., 2017).

Eredetileg azért érdeklődtünk a Clec12a iránt, mert megállapítottuk, hogy egy bélgomba, a Saccharomyces cerevisiae a húgysav rontja a vastagbélgyulladást (Chiaro et al., 2017). Ezenkívül más tanulmányok kimutatták, hogy a mikrobiota befolyásolhatja a bélbetegségeket a purin metabolizmus indukciója révén, amelynek végterméke emlősökben a húgysav (Zhu et al., 2019). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a húgysav érzékelésére szolgáló mechanizmusok, mint például a Clec12a, befolyásolhatják a bél homeosztázisát. Nem észleltünk azonban változást a szérumban vagy a székletben a húgysav szintjében, ami azt jelzi, hogy a Clec12a-/- állatok betegségének fokozott súlyosságát nem a megnövekedett húgysav okozta. A Clec12a-/- vastagbélgyulladás fokozott súlyosságát azonban a mikrobiota összetétele okozza. Így adataink alapján a Clec12a-/- csökkent expressziója befolyásolhatja az IBD-s betegek mikrobiota összetételét (Jason L. Kubinak, 2015; Rehman et al., 2011; Vijay Kumar és mtsai, 2010). Érdekes módon azt találtuk, hogy a gram-pozitív organizmusokat célzó antibiotikumok képesek voltak enyhíteni a vastagbélgyulladás súlyosságát Clec12a-/- állatokban. Ez ellentétben áll több olyan jelentéssel, amelyek a bélgyulladás során kiterjedt Gram-negatív Enterobacteriaceae-t azonosítottak, így ez azon kevés tanulmányok egyike, amelyek kimutatták a vastagbélgyulladás kialakulásával kapcsolatos Gram-pozitív szervezetek növekedését. Bár valószínűleg nem az egyetlen organizmus, amely ebben a modellben befolyásolja a vastagbélgyulladás súlyosságát, a F. rodentium drámai elterjedését figyelték meg a Clec12a-/- állatokban. A F. rodentium a Firmicutes (Bacillota) phyla Gram-pozitív, oxidáz- és kataláz-negatív tagja (Chang et al., 2015). Az F. rodentium napi bevezetése még WT egerekbe is fokozza a vastagbélgyulladást, ami alátámasztja, hogy az F. rodentium megnövekedett szintje a bélben káros, és valószínűleg a vastagbélgyulladás súlyosságát okozza a Clec12a-/--ben. Egy nemrégiben készült jelentés kimutatta, hogy a F. rodentium növelheti a hámcserét, és elnyomhatja a hámszöveten belüli enzimek expresszióját, amelyek leszabályozzák a gyulladásos válaszokat, és így összhangban van azzal a súlyosbodó betegséggel, amelyet akkor tapasztalunk, amikor a F. rodentium kiterjed a bélben (Cao et al., 2022). Mivel az embereket a F. rodentiumhoz hasonló organizmus kolonizálja (Zagato et al., 2020), további vizsgálatoknak kell tisztáznia ezeknek a F. rodentium-szerű baktériumoknak a vastagbélgyulladással kapcsolatos emberi élettani aspektusaira gyakorolt ​​hatását.

A Clec12a veleszületett immunsejtek között betöltött szerepét alátámasztva megfigyeltük, hogy a colitogén mikrobiota még mindig kialakul az adaptív immunrendszerrel nem rendelkező Clec12a-/- állatokban. A bélben a Clec12a-t expresszáló sejtek legnagyobb százaléka makrofág volt, ami arra késztetett bennünket, hogy ezekben a sejtekben a Clec12a funkcióra összpontosítsunk. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a Clec12a az I. típusú interferontermelés fontos közvetítője a vírusfertőzésre válaszul (Li et al., 2019). Nem vizsgálták azonban, hogy a Clec12a hogyan befolyásolja a bakteriális ligandumok széles spektrumára adott válaszokat; ez nagyon fontos a bélben, ahol rengeteg TLR ligand létezik. Itt megmutatjuk, hogy a Clec12a a bélben zajló makrofág-reakciók mérséklésére szolgál, és valószínűleg biztosítja a homeosztázist a mikrobiotára adott válaszként. A F. rodentiummal inkubált makrofágok RNS-szekvenciája rávilágított arra, hogy a Clec12a hiány sejtciklus- és fagocitózis-hibákhoz vezet válaszul ezekre a kommenzális baktériumokra. Egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy a Clec12a-/- makrofágok csökkentették az autofágiát a Salmonella hatására (Begun és mtsai, 2015). Adataink kiegészítik és kiterjesztik ezeket az eredményeket, hogy magukban foglalják azt is, hogy a Clec12a a nem invazív kommenzális organizmusok szabályozásában is működik. Mások kimutatták, hogy a F. rodentium befolyásolja a hámbiológiát, ami azt sugallja, hogy a F. rodentium a gazdaszervezet közvetlen közelében található, ezért az immunrendszernek szigorúan ellenőriznie kell. Adataink alátámasztják, hogy a Clec12a a fagocitózis szabályozásán keresztül szabályozza az F. rodentiumot. A fagocitózist egy ligandum vagy mikroba fizikai kötődése indítja el, és a C-típusú lektinek több ligandumhoz is kapcsolódhatnak, ami arra vezetett, hogy megvizsgáljuk, hogy a Clec12a képes-e közvetlenül kapcsolódni a bélben élő baktériumokhoz. Érdekes módon a Clec12a leginkább a Gram-pozitív F. rodentium és Roseburia szervezetekhez kötődik, és sokkal kevésbé kötődik az A. muciniphila és B. uniformis Gram-negatív organizmusokhoz, és egyáltalán nem a C. albicanshoz. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a Clec12a hajlamos megkötni a mikrobiota specifikus tagjait. Ez lehetővé teszi számunkra, hogy olyan modellt építsünk fel, amelyben a Clec12a bekapcsolódása és az azt követő fagocitózis szabályozhatja a mikrobiota bizonyos tagjait, és megakadályozhatja a terjeszkedésük potenciálisan káros hatásait. Ez rávilágít a Clec12a kettős funkciójára, amely képes megfékezni a gyulladást a mikrobiális ligandumokkal szemben, miközben felismeri és szabályozza a mikrobiota specifikus tagjait. Így a Clec12a a veleszületett immunrendszer egyedülálló módja annak, hogy biztosítsa a homeosztázist a gyomor-bél traktusban.

ÁBRA LEGENDÁK

1. ábra. A Clec12a az adaptív immunrendszertől függetlenül visszafogja a bélbetegségeket

(A) A vastagbélgyulladás súlyosságának felmérése érdekében a WT vagy Clec12a-/- C57BL/6 specifikus patogénmentes (SPF) egereket ad libitum 2,5%-os dextrán-nátrium-szulfáttal (DSS) kezeltük 7 napon át ivóvízben. A százalékos súlycsökkenést naponta értékelték. Átlag +/- SEM, az adatokat három független kísérletből gyűjtöttük össze a Two-way ANOVA és a Śídák-féle többszörös összehasonlító teszt segítségével.

(B) A jelzett állatok vastagbélhosszát (cm) leöléskor mértük. A szórásdiagram az átlagos +/- SEM, az adatokat három független kísérletből gyűjtöttük össze páratlan t-próbával. Minden pont egy egeret jelent

(C) A jelzett állatok székletlipokalint-2 (ng/ml) mértük a gyulladás leolvasásaként. Az oszlopdiagram az átlag +/- SEM, az adatokat két független kísérletből gyűjtöttük össze páratlan t-próbával. Minden pont egy egeret jelent

(D) Reprezentatív H&E-festett vastagbélmetszetek a jelzett állatokból DSS-indukált vastagbélgyulladás után.

(E) A jelzett állatok szövettani pontszámait vastagbélmetszetekből hoztuk létre

(D). Az oszlopdiagram az átlag +/- SEM, párosítatlan t-próbával összehasonlítva. Minden pont egy egeret jelent.

(F) A vastagbélgyulladás T-sejt-transzfer modelljét hajtottuk végre a krónikus vastagbélgyulladás értékelésére. A TCRb-/- és Clec12a-/- ;TCRb-/- állatok súlyát hetente mértük. A grafikon a jelzett állatok százalékos súlyvesztését mutatja a kísérlet során. Átlag +/- SEM, összehasonlítva a 2-módú ANOVA-val.

(G) Az (I) jelzett állatok telephosszát leöléskor mértük. Az oszlopdiagram az átlag +/- SEM, párosítatlan t-próbával összehasonlítva. Minden pont egy egeret jelent.

(H) WT, Clec12a-/-, Rag-/- vagy Rag-/-; A Clec12a-/- C57BL/6 SPF egereket akut vastagbélgyulladásra értékeltük. A jelzett állatokat ad libitum 2,5% DSS-vel láttuk el 7 napig. A százalékos súlycsökkenést naponta értékelték. Átlag +/- SEM, az adatok két független kísérletet reprezentálnak. Kétirányú ANOVA és Śídák többszörös összehasonlító tesztje.

(I) A jelzett állatok vastagbélhosszát (cm) leöléskor mértük. Az oszlopdiagram az átlag +/- SEM, az adatok két független, páratlan t-próbát alkalmazó kísérletet reprezentálnak. Minden pont egy egeret jelent * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

2. ábra. A Clec12a-/- állatokban kialakult mikrobióta súlyosbodott vastagbélgyulladást okoz

A) A széklet mikrobiota transzplantációját (FMT) úgy végeztük, hogy WT vagy Clec12a állatok bélsár felülúszóját csíramentes WT egerekbe vittük át. A mikrobiótákat négy hétig hagytuk homogenizálni, majd a WTFMT egerek felét és a Clec12a-/-FMT egerek felét együtt helyeztük el, és további négy hétig hagytuk keveredni. Ezután minden csoport ad libitum 2,5% DSS-t kapott az ivóvizében, és a 7. napon feláldozta őket.

B) A jelzett állatok százalékos súlyvesztését naponta értékeltük. A grafikon az átlag +/- SEM-et ábrázolja, az adatokat két független kísérletből gyűjtöttük össze Two-way ANOVA és Śídák többszörös összehasonlító tesztje segítségével.

C) A feltüntetett állatok vastagbélhosszát (cm) leöléskor mértük. A szórásdiagram az átlagos +/- SEM, összehasonlítva az Ordinary One-Way ANOVA és a Dunnett többszörös összehasonlítás teszttel. Minden pont egy egeret jelent.

D) A jelzett állatok reprezentatív H&E-festett vastagbélmetszete FMT és DSS-indukált vastagbélgyulladás után.

E) A szövettani pontszámokat a (D) vastagbélmetszetekből állítottuk elő. Az oszlopdiagram az átlag +/- SEM, párosítatlan t-próbával összehasonlítva. Minden pont egy egeret jelent.

F) Súlyozott Unifrac távolságok a WTFMT, Clec12a-/- FMT vagy együtt tartott állatok 16S rRNS-gén szekvenálásától. Box és whisker diagramok, amelyek az összes pontot mutatják (páronkénti távolság-összehasonlítás), és összehasonlítják Kruskal-Wallis teszttel.

G) Súlyozatlan Unifrac távolságok a WTFMT, Clec12a-/- FMT vagy együtt tartott állatok 16S rRNS-gén szekvenálásától. Box és whisker diagramok, amelyek az összes pontot mutatják (páronkénti távolság-összehasonlítás), és összehasonlítják Kruskal-Wallis teszttel.

H) Bray-Curtis távolság a WTFMT, Clec12a-/- FMT vagy együtt tartott állatok 16S rRNS-gén szekvenálásától. Box és whisker diagramok, amelyek az összes pontot mutatják (páronkénti távolság-összehasonlítás), és összehasonlítják Kruskal-Wallis teszttel.

3. ábra: A Clec12a-/- állatokban kialakult mikrobiota összetétele független az adaptív immunitástól

A) A csontvelő-rekonstitúciót és az azt követő FMT-t bemutató sematikus diagram. A C57Bl/6 WT egereket halálosan besugároztuk, és WT-vel vagy Clec12a-/- csontvelővel rekonstituáltuk. 8 hét elteltével ezekből az egerekből ürüléket vettünk, és WT-csíramentes egerekbe vittük át az (A) pontban leírtak szerint. Az eredetileg helyreállított kiméra állatokat ezután ad libitum 2,5% DSS-t adtunk az ivóvizükhöz.

B) Az (F)-ből származó FMT egerek százalékos súlyvesztését naponta értékeltük. Átlag +/- SEM, kétutas ANOVA és Tukey többszörös összehasonlító teszt használatával.

C) A feltüntetett állatok vastagbélhosszát (cm) leöléskor mértük. A szórásdiagram az átlag +/- SEM, páratlan t-próba. Minden pont egy egeret jelent

D) FMT-ket végeztünk az adaptív immunrendszer mikrobiális formálódásban és a vastagbélgyulladás súlyosságában betöltött szerepének felmérésére a Rag-/- vagy Rag-/- bélsár felülúszójának átvitelével; Clec12a-/- SPF állatokat WT csíramentes egerekbe az (A) pontban leírtak szerint. Az egereket 2,5%-os DSS-sel kezeltük 7 napig. A százalékos súlycsökkenést naponta értékelték. A grafikon az átlag +/- SEM, kétutas ANOVA és Tukey többszörös összehasonlító teszt alkalmazásával.

E) Az (F)-ben jelzett állatok vastagbélhosszát (cm) leöléskor mértük. Átlag +/-, SEM összehasonlítás a szokásos egyutas ANOVA és Dunnet többszörös összehasonlító teszt segítségével. Minden pont egy egeret jelent. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

4. ábra. A Clec12a korlátozza a Faecalibaculum rágcsálók, a vastagbélgyulladást súlyosbító mikroba elterjedését

A) A WT vagy Clec12a-/- C57BL/6 SPF egerek antibiotikum-koktélt (A) (neomicin, gentamicin, ampicillin, eritromicin), cefalotint vagy gentamicint (B, C) kaptak 0 koncentrációban. 5g/l tizennégy napig. Hét nap elteltével az állatoknak 2,5% DSS-t adtak az ivóvizükben az elpusztításig. A feltüntetett állatok vastagbélhosszát (cm) leöléskor mértük. A szórásdiagram az átlag +/- SEM, páratlan t-próba. Minden pont egy egeret jelent.

B) A jelzett állatok százalékos súlyvesztését naponta értékeltük. A grafikon az átlag +/- SEM, kétutas ANOVA és Tukey többszörös összehasonlító teszt alkalmazásával

C) A feltüntetett állatok vastagbélhossza (cm) leöléskor mérve. A szórásdiagram az átlag +/- SEM, páratlan t-próba. Minden pont egy egeret jelent.

D) WT vagy Clec12a-/- széklet megfigyelt jellemzői, 16S rRNS szekvenálás alfa diverzitása. Átlag +/- SEM, összehasonlítva a Mann-Whitney teszttel.

E) Pielou Evenness WT-ből vagy Clec12a-/- ürülékből, 16S rRNS szekvenálás alfa-diverzitás. Átlag +/- SEM, összehasonlítva a Mann-Whitney teszttel.

F) Shannon Entropy Mean +/- SEM, összehasonlítás a Mann-Whitney teszttel.

G) ANCOM elemzés WT és Clec12a-/- székletből. A taxonómiai nevek az ASV-k legjobb osztályozásai a Genome Taxonomy Database (GTDB) segítségével.

H) Faecalibaculum rodentium ASV-k relatív abundanciája. Összehasonlítva Mann Whitney * p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

I) C57Bl/6 WT SPF egereket 1x108 CFU F. rodentiummal előkezeltünk orális szondán keresztül három napig. Az állatok ezután 2,5% DSS-t kaptak ivóvizükben 7 napon keresztül, miközben továbbra is naponta kaptak F. rodentiumot. A százalékos súlycsökkenést naponta értékelték. Átlag +/- SEM, Az adatokat négy különálló kísérletből egyesítjük, kétutas ANOVA és Tukey többszörös összehasonlító teszt alkalmazásával.

J) A jelzett állatok vastagbélhosszát (cm) leöléskor mértük. Az oszlopdiagram az átlag +/- SEM. Az adatokat négy különálló kísérletből gyűjtöttük össze, összehasonlítva az Ordinary One-Way ANOVA Dunnet többszörös korrekciós teszttel. Minden pont egy egeret jelent. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

5. ábra: A Clec12a korlátozza a gyulladást és elősegíti a fagocitózist a makrofágokban.

A) Az immunfenotipizálást áramlási citometriával végeztük a vastagbél lamina propriából (cLP) izolált sejteken WT és Clec12a-/- állatokon. A hőtérkép a Clec12a expressziójának gyakoriságát mutatja veleszületett és adaptív immunsejteken

B) Az oszlopdiagram a kapu előtti, CD38+ sejtek (M1 makrofágok) gyakoriságát mutatja a jelzett állatok cLP-jéből. Átlag +/- SEM, összehasonlítva páratlan t-teszttel. Minden pont egy egeret jelent.

C) Az oszlopdiagram a kapu előtti EGR2+ sejtek (M2 makrofágok) gyakoriságát mutatja a jelzett állatok cLP-jéből. Átlag +/- SEM, összehasonlítva páratlan t-teszttel. Minden pont egy egeret jelent.

D) A BMDM-eket WT és Clec12a-/- hosszú csontokból gyűjtöttük ki, és M-CSF (20 ng/ml) jelenlétében tenyésztettük 7 napig. A 8. napon a BMDM-eket LPS-sel (100 ng/ml), MDP-vel (10 mg/ml), Pam3cysk-vel (1 mg/ml) vagy Flagellinnel (1 mg/ml) 24 órán át pulzáltattuk. A tápközeget összegyűjtöttük, és megvizsgáltuk a citokintermelést. A hőtérkép a jelzett citokinek Log2-szeres változását mutatja a Clec12a-/--ből a WT-hez képest.

E) WT és Clec12a-/- egerekből származó BMDM-eket izoláltunk és tenyésztettünk az (A) szerint, majd együtt tenyésztettük F. rodentiummal 10 MOI mellett 24 órán át. A BMDM-ek mosása után az RNS-t összegyűjtöttük és előkészítettük az RNS-szekvenáláshoz. A 10 legjobb egyszerűsített GO kifejezés (biológiai folyamat) a Clec12a-/- csökkentett kategóriák között gazdagítva

F) Peritoneális makrofágokat izoláltunk WT és Clec12a-/- egerekből, majd Sybr zöldre festett F. rodentiummal együtt tenyésztettük a fagocitózis meghatározására. Balra: WT makrofágok. Jobb oldalon: Clec12a-/- makrofágok. Reprezentatív képek fényes mezőből (bal oldali oszlopok), fluoreszcenciából (középső oszlopok) és egyesített (jobb oldali oszlopok) képei láthatók. A sárga nyílhegyek a makrofágok által elnyelt F. rodentium sejtek példáit jelölik. skálasáv=20 µm. A képek két külön kísérletet reprezentálnak.

G) Az oszlopdiagram sejtenként mutatja az élőlényeket, ahogy az (F) is látható. 250 WT sejtet és 269 Clec12a-/- sejtet számoltunk meg, hogy meghatározzuk a sejtenkénti F. rodentium mennyiségét.

6. ábra: A Clec12a közvetlenül kötődik a mikrobiota specifikus tagjaihoz.

A) A Clec12a-humán IgG1-Fc fúziós fehérjét vagy üres vektort ábrázoló sematikus diagram (csak Fc rész) B) Az áramlási citometrikus analízis hisztogramja, amely a Clec12a-Fc különböző baktériumokhoz vagy C. albicanshoz való differenciális kötődését mutatja.

KIEGÉSZÍTŐ ÁBRALEGENDÁK

Kiegészítő 1. ábra. A Clec12a hiánya nem zavarja a húgysavszintet.

A) A jelzett állatok szérum húgysavtartalmát (µM) mértük a WT és a Clec12a-/- C57Bl/6 egerek közötti purin metabolizmus értékelésére. A szórásdiagram az átlag +/- SEM, az adatokat három független kísérletből gyűjtöttük össze páratlan t-próbával. Minden pont egy egeret jelent.

B) Megmértük a jelzett állatok széklet húgysavát (µM), hogy megmérjük a húgysav bélből történő kiválasztását a WT és a Clec12a-/- C57Bl/6 egerek között. A szórásdiagram az átlag +/- SEM, az adatokat három független kísérletből gyűjtöttük össze páratlan t-próbával. Minden pont egy egeret jelent.

Kiegészítő 2. ábra. A WT és a Clec12a-/- mikrobióták differenciált betegségeket okoznak

A neomicint, gentamicint, ampicillint és eritromicint tartalmazó antibiotikumos koktéllal kezelt WT és Clec12a-/- állatok százalékos súlycsökkenése.

Kiegészítő 3. ábra. A mikrobiota összetételét a Clec12a befolyásolja.

A) Az első 3 tengely PCoA diagramja a Bray-Curtis távolságokon alapul, amelyek az általános mikrobióta kapcsolatokat mutatják, valamint a megfelelő doboz és whisker diagramok, amelyek számszerűsítik az egyes csoportokon belüli eltérést, és összehasonlítják a Mann-Whitney teszttel.

B) A súlyozott Unifrac-távolságokon alapuló PCoA-grafikonok és a megfelelő box- és whisker-diagramok, amelyek számszerűsítik a csoporton belüli eltéréseket, összehasonlítva páratlan Mann-Whitney teszttel.

C) A WT és Clec12a-/- széklet mikrobióta PERMANOVA-teszt eredményeit tartalmazó táblázat Bray-Curtis és súlyozott Unifrac távolságokkal.

Kiegészítő 4. ábra: A makrofágokban lévő Clec12a korlátozza a gyulladást.

A) A hegedűgrafikák az (A)-ban látható immunsejtek fluoreszcens intenzitásának (MFI) geometriai átlagát ábrázolják. Átlag +/- SEM, Kruskal-Wallis teszt Dunn-korrekcióval többszörös összehasonlításhoz. A betűk olyan csoportokat jelölnek, amelyek jelentősen különböznek egymástól.

B) Reprezentatív áramlási citometriai diagramok M1 és M2 makrofágokról WT vagy Clec12a-/- egerek cLP-jéből DSS colitis után. A sejtek előkapuzott élő, CD45+, Ly6C-, CD11b+, MHCII+ és CD64+ esetén. Az 5A. ábráról

Kiegészítő 5. ábra. A Clec12a stabilizálja a sejtciklus szabályozását és szabályozza a fagocitózist a makrofágokban.

A) A 10 legjobb egyszerűsített GO kifejezés (Biológiai folyamat) kategória, amely a Clec12a-/- fokozottan szabályozott gének között gazdagodott a WT-hez képest az F. rodentium hatására. F. rodentiummal együtt tenyésztett WT és Clec12a-/- egerekből származó BMDM-eket izoláltunk és elemeztünk a 7A. ábra szerint.

B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >200 makrofágot számoltunk meg. Az oszlopdiagram az F. rodentium átlagos számát mutatja 4 különálló üregből, hogy megmutassa a számlálás konzisztenciáját és a hatást a mérőhelyek között. Átlag +/- SEM összehasonlítás páratlan t-teszttel.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Szeretnénk megköszönni Gordon Brownnak, hogy biztosította a Clec12a-/- állatokat ehhez a projekthez. Ezt a munkát a Helen Hay Whitney Alapítvány (KSO), a Utah Egyetem NRSA Microbial Pathogenesis T32 Training Grant (KSO), CCFA Senior Research Award (JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 és NCCAM R01124317 és NCCAM Edwardin (R01AT01LR) (NCCAM R01AT01LR) támogatta. Jr. Foundation (JLR), NSF CAREER díj (IOS-1253278) (JLR), Packard Fellowship in Science and Engineering (JLR), Burroughs Welcome Investigator in Pathogenesis Award (JLR), American Asthma Foundation (JLR), Margolis Alapítvány (JLR), az MS Society Center támogatása (JLR) és a WM Keck Alapítvány (JLR) NIH New Innovator Award DP2GM111099-01 (RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), az American Cancer Society Research Grant (RMO), a Kimmel Scholar Award (RMO), az R01AG047956 (RMO) és a NIAID R01AI141202 (ASI). Ezt a munkát a National Cancer Institute mellett a University of Utah Flow Cytometry Facility is támogatta az 5P30CA042014-24 számú díj révén. Hálásan köszönjük a Utah Egyetem Nagyteljesítményű Számítástechnikai Központjának támogatását és erőforrásait.

SZERZŐI HOZZÁJÁRULÁSOK

A TRC segített a tanulmány kidolgozásában, elvégezte a legtöbb egér- és immunológiai kísérletet, az adatokat számokká gyűjtötte össze, és segített megírni a kéziratot. Az RB csíramentes kísérleteket végzett, és minden csíramentes állatot fenntartott. Az ESV segített az immunológiai bél lamina propria kísérletekben. A KSO segített az egérbetakarításban, betekintést és iránymutatást nyújtott. A KMB segített az egérgyűjtésben és az áramlási citometriában. Az MCN segített az egér betakarításában. A WV segítséget nyújtott a fúziós fehérje konstrukciójának felépítésében és a tisztításban. TJ segítséget nyújtott a fagocitózis vizsgálatokhoz. JH fagocitózismikroszkópos tárgylemezeket elemzett. Az MH segítséget nyújtott a fúziós fehérje tisztításához és felhasználásához. A KAK baktériumizolátumokat biztosít. A ROC immunológiai szakértelmet és betekintést nyújtott. A WZS segített a tanulmány megalkotásában, bioinformatikai elemzéseket végzett, segített az ábrák elkészítésében és a statisztikák elkészítésében, valamint segített a kézirat megírásában. A JLR segített a tanulmány kidolgozásában és irányításában, felügyelte a kísérleti tervezést és az eredményeket, szervezett együttműködőket és reagenseket, finanszírozást szerzett a tanulmányhoz, és segített megírni a kéziratot.

MÓD

Egér törzsek

Az itt használt összes egérvonal C57BL/6 háttéren volt. A Clec12a-/- egereket Gordon Brown (Medical Research Council Center for Medical Mycology, Exeter) biztosította, és genotípusuk a korábban leírt protokoll szerint volt (Redelinghuys et al. 2016). A Rag2-/- és a TCRb-/- (Jackson Laboratories, 002118) a Jackson Laboratories-tól szereztük be, és több generáción keresztül tartottuk fenn egérkolóniánkon. Minden in vivo vastagbélgyulladásos kísérlethez 8-{12}}hetes ivarú egereket használtunk. Hím és nőstény egereket egyaránt használtunk. Az egereket specifikus patogénmentes körülmények között tartottuk.

Baktérium és gomba törzsek

A következő organizmusokat a DSMZ-German Collection of Microorganism and Cell Cultures GmbH-tól szereztük be: Faecalibaculum rodentium (DSM# 103405); Akkermansia mucinophilia DSMZ (DSM# 26127); Bifidobacterium animalis DSMZ (DSM# 26074). A Bacteroides uniformis-t az American Type Culture Collection-től (ATCC® 8492™) szereztük be. Egy Roseburia sp-t (JLR.KK002 törzsjelölés) izoláltunk Schaedler-agaron olyan C57BL/6 egerekből, amelyek spóraképzővel dúsított mikrobiótát hordoztak. A spóraképző dúsítást a korábban leírtak szerint végeztük, és az egereket több generáción keresztül tartottuk fenn ezzel a mikrobiotával a gnotobiotikus létesítményünkben, mielőtt a JLR.KK002-t izolálták a székletből (Browne és mtsai, 2016). Mi PCR-amplifikáltuk és Sanger szekvenáltuk a 16S rRNS gént, majd osztályoztuk a SILVA ACT szolgáltatással és a SILVA adatbázissal (Pruesse et al., 2012). Salmonella typhimurimum ST2 törzset használtunk. Candida albicans sc5314 törzset használtunk. Az alábbiakban ismertetjük a PhyLo11b szintetikus közösségben használt baktériumtörzseket.

DSS-indukált kísérleti vastagbélgyulladás

A vastagbélgyulladást 2,5% vagy 3% (w/v) 36,000-50,000MW dextrán-nátrium-szulfát (DSS) (MP Biomedicals) hozzáadásával váltottuk ki az ivóvízben 7 napon keresztül. A vastagbélgyulladás súlyosságát naponta ellenőrizték a testtömeg, a széklet konzisztenciájának és a széklet vérének változásai alapján. A monocita megmentési kísérlethez minden egér 2,5% DSS-t kapott 5 napig, majd rendszeres vizet adtunk; A súlymérést a 10. napig folytattuk, amikor az állatokat begyűjtöttük. Súlyossági küszöbként a 20%-nál nagyobb súlycsökkenést határozták meg. A kísérleti végpontokon az MLN-eket és a vastagbelet eltávolítottuk. A vastagbél hosszát a vakbéltől a végbélig mértük. A szöveteket ezután szövettani, RNS-kivonási vagy áramlási citometriai elemzés céljából feldolgoztuk.

Vastagbél-szövettan és pontozás

Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).

Lipocalin-2 (LCN-2) ELISA

A protokoll végrehajtása a gyártó protokollja szerint történt (Fischer Scientific DY1857-05). Röviden összegyűjtöttük az ürüléket, lemértük és 1X HBSS-ben pépesítettük 100 mg/ml koncentrációban. A mintákat ezután 50 x g-vel centrifugáltuk 5 percig, hogy eltávolítsuk a nagy törmeléket. A felülúszót ezután eltávolítjuk, új csőbe helyezzük, és 8000 xg-vel 5 percig centrifugáljuk a baktériumok pelletálása érdekében. Ezt a felülúszót ezután az állatok betegségének megfelelően hígították, de általában 1:100- 500 (egészséges) – 1:500-1000 (DSS-kezelt) közötti arány. A húgysav mérése A húgysav koncentrációját a gyártó utasításai szerint végeztük (Invitrogen™ Amplex™ Red Uric/Uricase activity assay kit, cat# A22181). Röviden, a vért WT vagy Clec12a-/- egerekből szívpunkcióval gyűjtöttük arany felső szérumleválasztó csövekbe. A csöveket 30 percig hagytuk megalvadni, majd 10 percig 1300 xg-n centrifugáltuk. A szérumot eltávolítottuk, és 1,5 ml-es Eppendorf-csövekbe helyezték, gyorsfagyasztották, és a tesztelésig -80 Celsius-fokon tárolták. A széklet húgysav meghatározását WT és Clec12-/- egerek friss székletpelleteinek kinyerésével végezték. A pelleteket lemértük és feljegyeztük, majd 1 ml 1x reakciópufferben pépesítettük. Fizikai cefrézés után a csöveket 50 x g-vel 5 percig centrifugáltuk, hogy eltávolítsuk a nagy törmeléket. A maradék széklet iszapot húgysavra vizsgáltuk.

T-sejt transzfer kísérleti vastagbélgyulladás

A WT lépeket izoláltuk és 10% magzati szarvasmarha-szérumot, penicillint és sztreptomicint tartalmazó RPMI-ben pépesítettük. A sejteket 367 xg-vel centrifugáltuk a sejtek izolálására. A kapott pelletet ezután 1x RBC lízis pufferben szuszpendáltuk 5 percig, sötétben, szobahőmérsékleten. A kapott fehérvérsejteket ezután Miltenyi CD4+ MACS oszlopon engedtük át a CD4+ T-sejtek izolálására. A T-sejteket ezután CD4-gyel és CDRB-vel megfestettük, és FACS Aria Fusion (BD Biosciences) készüléken válogattuk. A CD4+ CDRBhi sejteket összegyűjtöttük és TCRb-/- vagy TCRb-/--be adagoltuk; Clec12a-/- egerek intraperitoneálisan (IP). Minden egér 5 x 105 sejtet kapott. A vastagbélgyulladás súlyosságát és fejlődését hetente nyomon követték a súlycsökkenés értékelésével. A kísérleti végpontnál az MLN-eket és a vastagbeleket eltávolítottuk, és a vastagbeleket a vakbéltől a végbélig mértük a betegség súlyosságának felmérésére.

Leukociták izolálása a vastagbél lamina propriából

Az egerek vastagbeleit a hozzájuk kapcsolódó vakbéllel összegyűjtöttük, és 1X PBS-be helyeztük jégen lévő 6-lyuklemezekre. A láthatóan megmaradt zsírt és kötőszövetet eltávolítottuk, és a vakbelet levágtuk a vastagbélről. A vastagbeleket szétnyitottuk, a nyálkát és a székletet pedig óvatosan eltávolítottuk a vastagbélből, mielőtt visszahelyeztük a 6-lyuklemezre. Miután az összes vastagbelet szétfeszítették és kikapartuk, mindegyik vastagbelet egy Petri-csésze fedelén felkockáztuk egy borotvapenge segítségével, és egy külön 50 ml-es csőbe helyeztük. 10 ml előmelegített disszociációs oldatot (1X HBSS Ca+ és Mg+ nélkül, 1,5 mM DTT, 10 mM HEPES és 30 mM EDTA) adtunk hozzá, és a csöveket röviden vortexeltük. A vastagbeleket körülbelül 25 percig inkubáltuk. 37 °C-on, 150 ford./perc rázatással, amíg az oldatok zavarossá nem váltak az IEC elválasztástól. A mintákat háromszor ráztuk, és 15 másodpercig vortexeltük, majd 100 mM-es szűrőre öntöttük 50 ml-es kúpos felületre, hogy eltávolítsuk a nem immunsejteket, például az IEC-ket, és a szűrőket röviden öblítjük 2 ml jéghideg 1X PBS-sel. A visszamaradt szövetet csipesszel összegyűjtöttük a szűrőn, és áthelyeztük egy új 50 ml-es kúposba. 15 ml előmelegített emésztőoldat (1X HBSS Ca+-mal és Mg-vel, 5% FBS, 50 U/ml Dispase II [Millipore-Sigma, katalógusszám 4942078001], 0,5 mg/ml DNAse I [Worthington Biochemical, kat. # LS002139] és 0,5 mg/ml kollagenáz D-t [Millipore-Sigma, katalógusszám 11088866001]) adtunk hozzá, a mintákat rövid ideig vortexeltük, majd 45 percig inkubáltuk. 37 °C-on 150 ford./perc rázatással, vagy amíg az oldat zavarossá nem válik. A mintákat ezután háromszor rázattuk, és 15 másodpercig vortexeltük. A fennmaradó immun-cLP-sejtek összegyűjtéséhez az emésztett szövetet 40 mM-es szűrőre öntöttük egy 50 ml-es kúpos csőre, amely 10 ml 1X PBS-t tartalmazott. A mintákat ezután öblítjük és szűrjük 2 ml jéghideg 1X PBS-sel, majd 800 x g-vel 10 percig 4 °C-on centrifugáljuk. Ezután a felülúszót eltávolítottuk és vákuumban eldobtuk. A sejteket ezután 500 ml teljes RPMI-ben újraszuszpendáltuk, és tripánkék kizárásos festéssel számoltuk.

Áramlási citometria

A cLP-ből izolált leukocitákat 510-es zombifestékkel (AmCyan) 10 percig szobahőmérsékleten, sötétben festettük életképességre. A mintákat ezután az Fc-receptort CD-16/32-vel blokkoltuk 20 percig 4 fokos hőmérsékleten, sötétben. 367 xg-vel 5 percig lefelé centrifugálás után a dekantált sejteket 30 percig festettük sötétben 4 fokon. Minden antitestet 1:250 hígításban használtunk, hacsak másként nem jelezzük. A Myleloid panel a következőkből állt: CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-PE- Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR2-APC (intracelluláris, 1:50). A T-sejteket a következőkkel különböztették meg: Zombie dye 510 (AmCyan), CD45-BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp3-APC (intracelluláris 1:50), IL{{ 50}}PE (intracelluláris 1:50), IFN-g (BV605) (intracelluláris 1:50), RORgt-PE610 (intracelluláris 1:50), IL-17A-BV785 (intracelluláris 1:50). A festés után a sejteket kétszer 5 percig mostuk oszloppufferrel (1X HBSS Ca2+, Mg2+ és HEPES, EDTA, FBS nélkül). A sejteket O/N fixáltuk 2% PFA-val, ha nem volt szükség intracelluláris festésre, majd oszloppufferben kétszer mostuk, mielőtt az áramlási citométeren futtattuk volna. Ha intracelluláris festésre volt szükség, a FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer készletet (Tonbo Biosciences) és a protokollt követték. Ezután az összes mintát 300 ul oszloppufferben újraszuszpendáltuk, és UltraComp eBeads (ThermoFisher Scientific) kompenzálás után BD LSR Fortessa-n futtattuk, és egyetlen festési kontrollt használtunk.

IgA festő baktériumok

A baktériumokat ürülékpelletekből izoláltuk Ca2+ és Mg{1}} tartalmú HBSS-be, 100 mg széklet/ml HBSS koncentrációban. Az összetört ürüléket ezután 50 x g-vel 5 percig centrifugáltuk, hogy eltávolítsuk a nagy törmeléket. A felülúszót eltávolítottuk és egy új csőbe helyeztük. Ezt azután 8000 xg-vel 5 percig centrifugáltuk, hogy baktériumokat pelletezzen. A felülúszót eltávolítottuk, és a pelleteket Ca2+-ot és Mg{8}}-t tartalmazó HBSS-ben mostuk. Végül a pelleteket 100 mg/ml koncentrációjú HBSS-ben reszuszpendáltuk, és ebből 10 ul-t egy 96-lyuk lemezre helyeztünk, és Ca2+ és Mg{13}} tartalmú HBSS-sel blokkoltuk. 10% FBS 20 percig szobahőmérsékleten. Ezután 100 ul anti-IgA-t (PE) adtunk közvetlenül a mintához, és 30 percig inkubáltuk 4 C-on, sötétben. A sejteket ezután HBSS+FBS oldattal kétszer mostuk, végül HBSS+1x Sybr®-zöldben szuszpendáltuk, és 20 percig sötétben szobahőmérsékleten inkubáltuk. A mintákat ezután közvetlenül az áramlási citométeren olvastuk le.

A csontvelő izolálása

A csontvelőt a korábban leírtak szerint izoláltuk. Röviden, a C57Bl/6 Wild típusú vagy Clec12a-/- állatok hosszú csontjait kivontuk és papírtörlővel megtisztítottuk gyengéd dörzsöléssel. Az állatok feldolgozása közben a tiszta csontokat jégen tartották. A csontok végeit enyhén levágták, hogy a csontvelő láthatóvá váljon. A csontot behelyeztük (a szabad végével lefelé) egy 0,5 ml-es Eppendorf-csőbe, amelyet egy 18 g-os tűvel átszúrtak. Ezt a 0,5 ml-es Eppendorf-csövet egy 1,5 ml-es Eppendorf-csőbe helyeztük, és 13,000 x g-vel 1 percig centrifugáltuk. A csontvelőn keresztül centrifugáltuk, majd RBC-lizáltuk, RBC-lízis pufferrel (Biolegend) a gyártó ajánlásai szerint. A vörösvértestek lízise után a sejteket komplett Dulbecco's Modified Eagle Mediumban (DMEM) szuszpendáltuk, amely 10% FBS-t, 1 mg/ml Pen/Strep-t, 10 mM HEPES-t, 1 x nem esszenciális aminosavat, 1 mM nátrium-piruvátot tartalmazott. A sejteket ezután 367 xg-vel 5 percig centrifugáltuk a sejtek pelletté alakításához. Az izolált sejteket ezután BMDM-ek kifejlesztésére vagy monociták további izolálására használtuk.

Csontvelőből származó makrofágok

A leukocitákat csontvelőizolálásból izoláltuk, komplett DMEM-ben szuszpendáltuk, és tripánkék kizárásos festéssel hemocitométeren számoltuk. A sejteket szövettenyésztéssel kezelt 10 cm-es edényekre szélesztettük 5-8 x 106 sejt/lemez koncentrációban 10 ml teljes tápközegben + M-CSF (20 ng/ml). Friss tápközeget, beleértve az M-CSF-et is, a 4. és 7. napon adtuk a meglévő táptalajokhoz. Teljesen differenciált BMDM-eket használtunk kísérleti használatra a következő napon: 7-9.

Monocita izolálás

A csontvelőt WT és Clec12a-/- állatokból gyűjtöttük be a korábban leírtak szerint. A monocitákat a Monocyte Isolation Kit (BM), egy egér (Miltenyi Biotec) és egy LS MACS oszlop segítségével izoláltuk a gyártó utasításai szerint.

F. rodentium BMDM ko-kultúra és RNAseq

Az F. rodentium tenyészeteket OD 600 nm-en (1 OD 600 nm=1 x 10^8 sejt/ml alkalmazásával) kvantifikáltuk, kétszer mostuk steril PBS-ben, és együtt tenyésztettük 1 x 106 sejt/ml teljesen differenciált BMDM-mel. 10 MOI a 6-lyukú szövettenyésztő lemezeken. 24 órás együtttenyésztés után a táptalajt összegyűjtöttük és -20 C-on tároltuk a további felhasználásig. A BMDM-eket hideg, steril PBS-sel kétszer mostuk. Qiazol (Qiagen katalógusszám 79306) RNS-stabilizáló reagenst ezután közvetlenül adtunk minden egyes lyukba. A lyukakat sejtkaparóval 1,5 Eppendorf-csövekbe gyűjtöttük, és -20 fokon lefagyasztottuk az RNS-kivonásig. Az RNS-kivonást egy Direct-zol RNS miniprep készlettel (Zymo Research katalógusszám R2070) végeztük a gyártó utasításai szerint, és a szekvenálási könyvtárakat a Huntsman Cancer Institute High-throughput Genomics maglétesítménye készítette. A teljes RNS-t először a NEBNext rRNS Depletion kit v2-vel (NEB, cat# E7400) hibridizáltuk, hogy csökkentsük a mintákból származó rRNS-t. A szálas RNS szekvenáló könyvtárakat a NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, katalógusszám E7760L) segítségével állítottuk elő. A tisztított könyvtárakat egy Agilent Technologies 4150 TapeStation-en minősítették D1000 ScreenTape teszttel (Agilent, kat. szám: 5067-5582 és 5067-5583). Az adapterrel módosított molekulák molaritását kvantitatív PCR-rel határoztuk meg a Kapa Biosystems Kapa Library Quant Kit (Roche, katalógusszám: 07960140001) segítségével. Az egyes könyvtárakat 5 nM-ra normalizáltuk az Illumina szekvenciaanalízis előkészítéseként, és NovaSeq 6000-en szekvenáltuk egy páros végű 150-ciklusú szekvenálási futtatással.

Citokin elemzés

A BMDM-et izoláltuk és a korábban leírtak szerint növesztettük. A teljesen differenciált BMDM-eket 1 x 105 sejt/lyuk mennyiségben szélesztettük 12-lyukú szövettenyésztő lemezekre. A BMDM-eket 100 ng/ml LPS-sel stimuláltuk; 1 ug/ml Pam3Cysk; vagy 1 ug/ml flagellint. A sejteket 24 órán át stimuláltuk, a tápközeget összegyűjtöttük, és -20 C-on tároltuk elemzés céljából. A citokineket a LEGENDplex™ Mouse Inflammation Panel (13-plex) (Biolegend, katalógusszám 740150) segítségével elemeztük. Az adatokat a LEGENDplex™ adatelemző szoftverrel elemeztük.

16s rRNS génszekvenálás

A székletszemcséket vagy a csípőbél tartalmát egyes egerekből gyűjtöttük össze, és azonnal lefagyasztottuk {{0}} fokon 2 ml-es csavaros kupakkal ellátott csövekben, amelyek 250 mg 0,15 mm-es gránátgyöngyöt tartalmaztak (MoBio, kat. {{5). }}). A DNS-t a Power Fecal DNS Isolation Kit (MoBio vagy QIAGEN) segítségével extraháltuk, a kit utasításai szerint, és 2 ciklust tartalmazott, 1 perces gyöngyverést 4 fokon egy Mini-Bead-Beater 16-on (BioSpec Products). A 16S rRNS gén V3 és V4 régióit egyetlen PCR körrel amplifikáltuk olyan primerek felhasználásával, amelyek tartalmazták (3'-től 5'-ig) a V3/4 régió 16S rRNS gén célzó szekvenciáját, majd egy 2- nukleotid párnát. az Illumina primer szekvenciákkal, egy 8- nukleotid indexszekvenciával és a fennmaradó Illumina adapterszekvenciával. A V3/4 16S-célzó szekvenciákat Takahashi-tól (Takahashi et al., 2014), az indexeket Kozichtól (Kozich et al., 2013) vettük. A teljes oligonukleotid szekvenciák a következők voltak (az indexeket X-ekkel jelöljük): Prok16SV34_For: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Rev: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. A PCR ciklus körülményei a következők voltak: 98 fokos kezdeti denaturáció 2 percig; 26 ciklus 20 mp 98 fokos denaturációval, 20 mp 51,5 fokos lágyítással, 20 mp 72 fokos kiterjesztéssel; és egyetlen végső 72 fokos meghosszabbítás 2 percig. Minden egyes PCR-t (minden mintánál három párhuzamosban végrehajtva) 25 ul térfogatban végeztünk Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, katalógusszám: M0492L), 5 pmol mindegyik primerből és 50 ng templát DNS felhasználásával. Az amplifikáció után minden mintából háromszoros PCR-t egyesítettünk, 5 ul-t agaróz gélen futtattunk az amplifikáció megerősítésére, és a fennmaradó térfogatot Axygen AxyPrep MAG PCR tisztító gyöngyökkel (Corning, kat. MAG-PCR-CL{53) tisztítottuk. }}) vízzel 62,5%-ra hígítva, hogy hatékonyan eltávolítsák a primer dimereket, amelyek előnyösen szekvenálhatók. A PCR-reakciók 1,8-szoros térfogatában hígított gyöngyöket adtunk hozzá, a gyártó előírásai szerint tisztítottuk, és a megtisztított amplikonokat 25 ul 10 mM Tris-Cl-dal (pH 8,0) eluáltuk. Az amplikonokat ezután egy pico green dsDNS vizsgálattal (ThermoFisher, cat #P11495) kvantifikáltuk mikrolemez-leolvasón, majd a megtisztított és indexelt egyedi szekvenálási könyvtárakat egyenletesen multiplexeltük (ng DNS-sel), és egy Illumina MiSeq műszerrel szekvenáltuk páros végén. 300 ciklus üzemmód a Huntsman Cancer Institute High-Throughput Genomics megosztott erőforrás-létesítményében.

Sorozatadatok bioinformatikai feldolgozása

A 16S rRNS gén nyers leolvasásait demultiplexeltük, lehetővé téve 0 eltéréseket az indexekben, majd a QIIME2 keretrendszeren belül feldolgoztuk és elemeztük (Bolyen és mtsai, 2019), amint azt korábban leírtuk (Stephens et al., 2021). Röviden, a demultiplexelt és minőségi szűrt szekvenciákat először a primer és linker szekvenciákból vágtuk le a Cutadapt plugin segítségével, majd DADA2-vel denoizáltuk (Callahan et al., 2016; Martin, 2011). A taxonómiákat ezután az ASV-okhoz rendelték hozzá a classifysklearn módszerrel a jellemző-osztályozó bővítményben, a GTDB referenciakészlettel (release89) szemben, amelyet az amplifikált V3/4 régióra vágtak, és a fit-classifier-naive-bayes módszerrel betanították (Bokulich et al. , 2018; Parks et al., 2018; Pedregosa és mtsai, 2011). A diverzitási mérőszámokat, a távolságokat és a permanova szerinti béta-diverzitás-csoportosítások statisztikai szignifikanciáját a QIIME2-n belül számították ki (Anderson, 2001).

A BMDM-ek RNS-szekvenciájánál a nyers leolvasásokat először minőségileg és adapterrel levágtuk, majd a transzkriptumok számát Salmon segítségével számszerűsítettük a GRCm38 összeállításból származó transzkriptomhoz képest (mm10) (Patro et al., 2{{). 16}}17). A transzkriptumszintű kvantifikációkat az R-be olvastuk be az időcsomag segítségével, és összegeztük a génszintű számlálásokat a DESeq2-vel végzett differenciális expressziós analízis előtt a „~ genotípus + kezelés + genotípus: kezelés” tervezési képlettel (Love et al., 2014; Love et al., 2020). Az F. rodentiumra adott differenciális válaszok az egyes genotípusok élő F. rodentium-kezelésre adott válasza közötti különbséget mutatják a vivőanyaggal kezelt sejtekhez képest. A szignifikánsan eltérően expresszálódó géneket úgy definiáltuk, mint amelyek korrigált p-értéke < 0,05 és log2-szeres változása > |0,58| (1,5-szeres változás). Ezt követően jelentősen csökkentett és felfelé szabályozott génlistákat használtak a génontológiai (GO) kifejezések gazdagításának tesztelésére a clusterProfiler csomag segítségével, beleértve az egyszerűsítés funkciót a GO kifejezések redundanciájának csökkentésére és a kulcsfontosságú biológiai folyamatok azonosítására (S, 2020; Wu et al. ., 2021).

F. rodentium DSS kihívás

Az F. rodentiumot a korábban leírtak szerint növesztettük, és 1 x 109 CFU/ml-re határoztuk meg steril PBS-ben. A F. rodentiumot úgy rögzítettük, hogy először kétszer mossuk steril PBS-ben, majd 10 percig 1 ml 10%-os Fomalin-PBS-ben reszuszpendáljuk. A sejteket ezután még kétszer mostuk 10 ml steril PBS-ben, hogy előkészítsük az orális szondát. A nem fixált sejteket úgy mostuk, mint a rögzített sejteket, és jégen tartottuk szondán keresztül. A WT C57BL/6 SPF egereket szájon át mértük 100 ul oldattal, amely önmagában PBS-t (vivőanyag), F. rodentiumot (élő) vagy F. rodentiumot (fixált) tartalmazott a -3. naptól a 10. napig. Az állatok 3,0%-ot kaptak. DSS a következő napon: 0-7; friss DSS vizet minden második nap cseréltek. Súlyossági küszöbként a 20%-nál nagyobb súlycsökkenést határozták meg. A kísérleti végpontokon az MLN-eket és a vastagbelet eltávolítottuk. A vastagbél hosszát a vakbéltől a végbélig mértük. A szöveteket ezután szövettani, RNS-kivonási vagy áramlási citometriai elemzés céljából feldolgoztuk.

Fagocitózis vizsgálat

A peritoneális makrofágokat úgy izoláltuk, hogy 5 ml steril PBS-t fecskendeztünk a peritoneális üregbe. A PBS-t az üregben néhány másodpercenként óvatosan megráztuk. 2 perc elteltével a PBS-t 28 gauge tűvel eltávolítottuk, és hideg, komplett DMEM-be adagoltuk. A sejteket 367 x g-vel centrifugáltuk, és teljes tápközegben mostuk. A sejteket ezután hemocitométerrel megszámoltuk, és 12-lyukú szövettenyésztő lemezekre szélesztettük 2,5 x 105 sejt/ml koncentrációban. A sejteket egy éjszakán át hagytuk tapadni. Másnap a lyukakat óvatosan keverjük össze, és a táptalajt leszívjuk. A tapadó sejteket ezután kétszer mostuk 500 ul hideg, steril PBS-sel. Ezután F. rodentiumot tartalmazó, 10 MOI-val előmelegített komplett DMEM-et adtunk a tapadó anyaghoz (makrofágokhoz). A lemezeket ezután óvatosan centrifugáltuk 200 xg-vel, szobahőmérsékleten három percig, majd standard sejttenyésztési körülmények között (37 °C, 5% CO2) 90 percig inkubáltuk. Az F. rodentiumot a csak RNS-szekvenáláshoz használt BMDM-ek együttes tenyésztéséhez leírtak szerint készítettük elő, mosás után a sejteket 1x Sybr® greenben (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3) 20 percig szobahőmérsékleten reszuszpendáltuk. A baktériumsejteket ezután 4000 fordulat/perc sebességgel 5 percig ülepítettük, teljes DMEM-mel újraszuszpendáltuk, és előmelegítettük a peritoneális makrofágokhoz. 90 perces együtttenyésztés után a táptalajt leszívtuk, és a sejteket kétszer mostuk hideg, steril PBS-sel. Sybr® zölddel festett F. rodentiumot tartalmazó tapadó sejteket 2%-os paraformaldehiddel (PFA) fixáltunk 10 percig. A PFA-t leszívtuk, és steril PBS-t helyeztünk a sejtekre. Ezután a sejteket leképeztük az F. rodentium fagocitózisára

Makrofág képelemzés

F. rodentiummal kezelt makrofág tenyészetekről fénymezős és fluoreszcens képeket EVOS m7000 Imaging System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) segítségével készítettünk. Minden tenyészetről három-öt külön randomizált képet készítettünk, amelyeket három párhuzamosban végeztünk.

Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).

CLEC12A-Fc fúziós fehérje konstrukció and purificatitovább

Az egér Clec12a extracelluláris doménjeit kódoló cDNS-eket PCR-rel amplifikáltuk C57Bl/6 WT SPF csontvelőből izolált fehérvérsejtekből, és szekvenálással igazoltuk. A cDNS-eket a humán IgG1-Fc C-terminálisához fuzionáltattuk a pFuse-hIgG1-Fc2 expressziós vektorban (InvivoGen). A Clec12a-t vagy üres vektort tartalmazó konstrukciókat DMEM +10% FBS-sel és Pen/strep-vel (1 mg/ml) tenyésztett Lx293 sejtekbe transzfektáltuk. A szekretált fúziós fehérjéket a transzfekció után 24-48 gyűjtöttük ki a táptalajból. A tápközeget 367 xg-vel 5 percig centrifugáltuk, hogy eltávolítsuk a törmeléket/elhalt sejteket, és a felülúszót -20 C-on lefagyasztottuk felhasználásig. A Clec12a-Fc vagy csak Fc fúziós fehérjéket Pierce™ Classic Magnetic IP/Co-IP Kittel (Thermo Fisher Scientific, katalógusszám: 88804), mennyiségileg Pierce™ BCA Protein Assay Kittel (Thermo Fisher Scientific katalógusszám: 23227) izoláltuk. és Western blottal igazolták, antiClec12a antitesttel (Novus Biologicals NBP2-27346SS).

Clec12a-Fc-kötési vizsgálat

A tisztított konstrukciókat 0,4 mg/ml-re hígítottuk HBSS-ben Ca2+ és Mg{3}}-val. A baktériumokat a megfelelő tápközegben és aerob körülmények között szaporítottuk, és OD 600 nm-rel normalizáltuk. A baktériumokat Ca2+ és Mg{6}} tartalmú HBSS-sel mostuk, majd HBSS-vel, Ca2+ és Mg{8}}% FBS-sel blokkoltuk 20 percig szobahőmérsékleten. Minden festési eljárás légköri körülmények között történt. 1 x 107 baktériumsejtet helyeztünk egy kerek fenekű 96-lyuklemezre, 3,000 xg-vel megpörgettük, és dekantáltuk. 50 ul konstrukciót helyeztünk baktériumsejtekre, óvatosan összekevertük, és 4 °C-on 1 órán át inkubáltuk. A baktériumsejteket Ca2+ és Mg2+ + 10% FBS tartalmú HBSS-sel mostuk kétszer. 50 ul kecske anti-humán Fc-t (PE) (ebioscience katalógusszám: 12-4998-82) adtunk a sejtekhez, és 4 °C-on inkubáltuk 1 órán át, sötétben. A sejteket ezután a korábbiak szerint mostuk, és 1x Sybr® zöldet (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3) tartalmazó Ca2+ és Mg{27}} HBSS-be helyeztük. A sejteket szobahőmérsékleten 20 percig sötétben inkubáltuk, és azonnal leolvastuk egy BD LSR Fortessa áramlási citométeren.

Besugárzás és a csontvelő helyreállítása

A csontvelőt WT és Clec12a-/- állatokból gyűjtöttük be a korábban leírtak szerint. A kapott recipiens egereket halálosan besugároztuk 500 Rads-mal a -1. napon, majd 400 Rads-mal a 0. napon. Négy órával az utolsó besugárzás után a recipiens egereket izoflurán érzéstelenítés alá helyeztük, és 100 ul izolált anyagot Steril PBS-ben (1 x 108 sejt/ml) szuszpendált csontvelősejteket 28,5 gauge tűn keresztül juttattunk a retro-orbitális térbe. Érdekelt bennünket a mikrobióta, így az állatokat nem kaptuk antibiotikumot, és 8 hét elteltével székletszemcséket gyűjtöttünk a mikrobiota GF állatokba való átviteléhez.

IRODALOM

Anderson, MJ (2001). Új módszer a nem-paraméteres többváltozós varianciaanalízishez. Austral Ecol. 26, 32-46. DOI 10.1111/j.{6}}.2001.01070.pp.x.

Begun, J., Lassen, KG, Jijon, HB, Baxt, LA, Goel, G., Heath, RJ, Ng, A., Tam, JM, Kuo, SY, Villablanca, EJ et al. (2015). A Crohn-betegség kockázati változatának integrált genomikája

azonosítja a CLEC12A szerepét az antibakteriális autofágiában. Cell Rep. 11, 1905-1918. 10.1016/j.celrep.2015.05.045.

Blanders, JM, Longman, RS, Iliev, ID, Sonnenberg, GF és Artis, D. (2017). A gyulladás szabályozása a mikrobiota kölcsönhatásaival a gazdaszervezettel. Nat. Immunol. 18, 851-860. 10.1038/ni.3780.

Bokulich, NA, Kaehler, BD, Rideout, JR, Dillon, M., Bolyen, E., Knight, R., Huttley, GA és Caporaso, JG (2018). Markergén-amplikon szekvenciák taxonómiai osztályozásának optimalizálása a QIIME 2 ''sq2-feature-classifier plugin segítségével. Mikrobióma 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.

Bolyen, E., Rideout, JR, Dillon, MR, Bokulich, N., Abnet, CC, Al-Ghalith, GA, Alexander, H., Alm, EJ, Arumugam, M., Asnicar, F. és munkatársai. (2019). Reprodukálható, interaktív, méretezhető és bővíthető mikrobióma adattudomány a QIIME 2 segítségével. Nat. Biotechnol. 37, 852-857. 10,1038/s41587-019-0209-9.

Brown, GD, Willment, JA és Whitehead, L. (2018). C-típusú lektinek az immunitásban és a homeosztázisban. Nat. Rev. Immunol. 18, 374-389. 10,1038/s41577-018-0004-8.

Browne, HP, Forster, SC, Anonye, ​​BO, Kumar, N., Neville, BA, Stares, MD, Goulding, D. és Lawley, TD (2016). A „tenyészthetetlen” emberi mikrobióta tenyésztése új taxonokat és kiterjedt sporulációt tár fel. Nature 533, 543-+. 10.1038/természet17645.

Cadwell, K., Liu, JY, Brown, SL, Miyoshi, H., Loh, J., Lennerz, JK, Kishi, C., Kc, W., Carrero, JA, Hunt, S. et al. (2008). Az autofágia és az Atg16l1 autofágia gén kulcsszerepe egér és emberi bél Paneth sejtekben. Nature 456, 259-263. 10.1038/természet07416.

Callahan, BJ, McMurdie, PJ, Rosen, MJ, Han, AW, Johnson, AJA és Holmes, SP (2016). DADA2: Nagy felbontású mintakövetkeztetés az Illumina amplikon adataiból. Nat. 13. módszer, 581-+. 10.1038/Nmeth.3869.

Cao, YG, Bae, S., Villarreal, J., Moy, M., Chun, E., Michaud, M., Lang, JK, Glickman, JN, Lobel, L. és Garrett, WS (2022). A Faecalibaculum rodentium átalakítja a retinsav jelátvitelt, hogy szabályozza az eozinofil függő bélhám homeosztázist. Sejtgazda és mikroba 30, 1295- 1310 e1298. 10.1016/j.chom.2022.07.015.

Chang, DH, Rhee, MS, Ahn, S., Bang, BH, Oh, JE, Lee, HK és Kim, BC (2015). Faecalibaculum rodentium gen. nov., sp. nov., laboratóriumi egér ürülékéből izolálva. Antonie Van Leeuwenhoek 108, 1309-1318. 10,1007/s10482-015-0583-3.

Chiaro, TR, Soto, R., Stephens, WZ, Kubinak, JL, Petersen, C., Gogokhia, L., Bell, R., Delgado, JC, Cox, J., Voth, W. et al. (2017). A bél mycobiota egyik tagja modulálja a gazdaszervezet purinanyagcseréjét, súlyosbítva a vastagbélgyulladást egerekben. Sci. Ford. Med. 9, .

Drouin, M., Saenz, J. és Chiffoleau, E. (2020). C-típusú lektinszerű receptorok: Fej vagy farok a sejthalál immunitásban. Elülső. Immunol. 11. ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251.

Fassarella, M., Blaak, EE, Penders, J., Nauta, A., Smidt, H. és Zoetendal, EG (2021). A bélmikrobióma stabilitása és ellenálló képessége: a perturbációkra adott válaszok tisztázása a bél egészségének módosítása érdekében. Gut 70, 595-605. 10.1136/gutjnl-2020-321747.

Gkouskou, KK, Deligianni, C., Tsatsanis, C. és Eliopoulos, AG (2014). A bél mikrobióta a gyulladásos bélbetegség egérmodelljeiben. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.

Han, YM, Zhang, MH, Li, N., Chen, TY, Zhang, Y., Wan, T. és Cao, XT (2004). A KLRL1, egy új gyilkos sejt lektinszerű receptor, gátolja a természetes ölősejtek citotoxicitását. Vér 104, 2858-2866. DOI 10,1182/vér-2004-03-0878.

Iliev, ID, Funari, VA, Taylor, KD, Nguyen, Q., Reyes, CN, Strom, SP, Brown, J., Becker, CA, Fleshner, PR, Dubinsky, M. et al. (2012). A kommenzális gombák és a C-típusú lektin receptor Dectin{2}} közötti kölcsönhatások befolyásolják a vastagbélgyulladást. Science 336, 1314-1317. 10.1126/tudomány.1221789.

Jason L. Kubinak, WZS, Ray Soto, Charisse Petersen, Tyson Chiaro, Lasha Gogokhia, Rickesha Bel1, Nadim J. Ajami, Joseph F. Petrosino, Linda Morrison4, Wayne K. Potts, Peter E. Jensen, Ryan M. O' Connell és June L. forduló (2015). Az MHC variáció egyénre szabott mikrobiális közösségeket alakít ki, amelyek szabályozzák az enterális fertőzésekre való fogékonyságot. Természet Kommunikáció. 0,1038/ncomms9642.

Kono, H., Chen, CJ, Ontiveros, F. és Rock, KL (2010). A húgysav elősegíti az akut gyulladásos választ a steril sejthalálra egerekben. J. Clin. Invest. 120, 1939-1949. 10.1172/Jci40124.

Kozich, JJ, Westcott, SL, Baxter, NT, Highlander, SK és Schloss, PD (2013). Kettős indexű szekvenálási stratégia és felügyeleti folyamat kidolgozása az amplikon szekvencia adatok elemzéséhez a MiSeq Illumina szekvenálási platformon. Applied and Environmental Microbiology 79, 5112-5120. 10.1128/Aem.{6}}.

Kubinak, JL, Petersen, C., Stephens, WZ, Soto, R., Bake, E., O'Connell, RM és Round, JL (2015). A MyD88 jelátvitel a T-sejtekben irányítja a mikrobiota IgA által közvetített szabályozását az egészség előmozdítása érdekében. Sejtgazda mikroba 17, 153-163. 10.1016/j.chom.2014.12.009.

Li, K., Neumann, K., Duhan, V., Namineni, S., Hansen, AL, Wartewig, T., Kurgyis, Z., Holm, CK, Heikenwalder, M., Lang, KS és Ruland, J. (2019). A Clec12A húgysavkristály receptor potencírozza az I. típusú interferon válaszokat. Proc Natl Acad Sci USA 116, 18544-18549. 10.1073/pnas.1821351116.

Liu, JZ, van Sommeren, S., Huang, H., Ng, SC, Alberts, R., Takahashi, A., Ripke, S., Lee, JC, Jostins, L., Shah, T. és társai . (2015). Az asszociációs elemzések 38 fogékony lókuszt azonosítanak a gyulladásos bélbetegségekre, és rávilágítanak a populációk közötti közös genetikai kockázatra. Nat. Közönséges petymeg. 47, 979-986. 10.1038/ng.3359.

Love, MI, Huber, W. és Anders, S. (2014). Az RNS-seq adatok szeres változásának és diszperziójának mérsékelt becslése DESeq2-vel. Genome Biol. 15. ARTN 550 10.1186/s13059-014-0550-8.

Love, MI, Soneson, C., Hickey, PF, Johnson, LK, Pierce, NT, Shepherd, L., Morgan, M. és Patro, R. (2020). Tximeta: Referenciaszekvencia-ellenőrző összegek a származás azonosításához az RNS-szekv. Plos Computational Biology 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.

Luo, Y., Tucker, SC és Casadevall, A. (2005). Az Fc- és komplement-receptor aktiválása serkenti a makrofág sejtek sejtciklusának előrehaladását a G1-től az SJ Immunol-ig. 174, 7226- 7233. 10.4049/jimmunol.174.11.7226.

Macpherson, AJ, Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, GR, Hengartner, H. és Zinkernagel, RM (2000). A bélnyálkahártya IgA-válaszának primitív T-sejt-független mechanizmusa a kommenzális baktériumokra. Science 288, 2222-+. DOI 10.1126/tudomány.288.5474.2222.

Maglinao, M., Eriksson, M., Schlegel, MK, Zimmermann, S., Johannssen, T., Gotze, S., Seeberger, PH és Lepenies, B. (2014). Platform a C-típusú lektinreceptorhoz kötő szénhidrátok és sejtspecifikus célzási és immunmodulációs potenciáljuk szűrésére. Journal of Controlled Release 175, 36-42. 10.1016/j.jconrel.2013.12.011.

Marshall, ASJ, Willment, JA, Lin, HH, Williams, DL, Gordon, S. és Brown, GD (2004). Egy új humán myeloid inhibitor c-típusú lektinszerű receptor (MICL) azonosítása és jellemzése, amely túlnyomórészt granulocitákon és monocitákon expresszálódik. J. Biol. Chem. 279, 14792-14802. 10.1074/jbc.M313127200.

Martin, M. (2011). A Cutadapt eltávolítja az adapterszekvenciákat a nagy áteresztőképességű szekvenálási leolvasásokból. EMBNet.journal 17. Martinez-Lopez, M., Iborra, S., Conde-Garrosa, R., Mastrangelo, A., Danne, C., Mann, ER, Reid, DM, Gaboriau-Routhiau, V., Chaparro , M., Lorenzo, MP, et al. (2019). A dendritikus sejtekben a Mincle-Syk tengely által végzett mikrobióta-érzékelés szabályozza az interleukin-17 és -22 termelést, és elősegíti a bélgát integritását. Immunity 50, 446-461 e449. 10.1016/j.immuni.2018.12.020.

Martinon, F., Petrilli, V., Mayor, A., Tardivel, A. és Tschopp, J. (2006). A köszvényhez kapcsolódó húgysavkristályok aktiválják a NALP3 gyulladást. Nature 440, 237-241. 10.1038/természet04516.

Nakajima, A., Vogelzang, A., Maruya, M., Miyajima, M., Murata, M., Son, A., Kuwahara, T., Tsuruyama, T., Yamada, S., Matsuura, M., et al. (2018). Az IgA szabályozza a bélmikrobióta összetételét és metabolikus funkcióját a baktériumok közötti szimbiózis elősegítésével. J. Exp. Med. 215, 2019-2034. 10.1084/jem.20180427.

Neumann, K., Castineiras-Vilarino, M., Hockendorf, U., Hannesschlager, N., Lemeer, S., Kupka, D., Meyermann, S., Lech, M., Anders, HJ, Kuster, B. , et al. (2014). A Clec12a a húgysavkristályok gátló receptora, amely a sejthalálra válaszul szabályozza a gyulladást. Immunity 40, 389-399. 10.1016/j.immuni.2013.12.015.

Okai, S., Usui, F., Yokota, S., Hori, IY, Hasegawa, M., Nakamura, T., Kurosawa, M., Okada, S., Yamamoto, K., Nishiyama, E., et al. (2016). A nagy affinitású monoklonális IgA szabályozza a bél mikrobiotáját, és megakadályozza a vastagbélgyulladást egerekben. Nat Microbiol 1, 16103. 10.1038/nmikrobiol.2016.103.

Pabst, O. és Slack, E. (2020). Az IgA és a bél mikrobiota: a specifikusság fontossága. Mucosal Immunol. 13, 12-21. 10,1038/s41385-019-0227-4.

Parks, DH, Chuvochina, M., Waite, DW, Rinke, C., Skarshewski, A., Chaumeil, PA és Hugenholtz, P. (2018). A genom filogenezisén alapuló szabványos bakteriális taxonómia lényegesen felülvizsgálja az életfát. Nat. Biotechnol. 36, 996-+. 10.1038/nbt.4229.

Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA és Kingsford, C. (2017). A Salmon gyors és torzítástudatos számszerűsítést biztosít az átirat-kifejezéshez. Nat. 14. módszer, 417-+. 10.1038/nmeth.4197.

Pedregosa, F., Varoquaux, G., Gramfort, A., Michel, V., Thirion, B., Grisel, O., Blondel, M., Prettenhofer, P., Weiss, R., Dubourg, V., et al. (2011). Scikit-learn: gépi tanulás Pythonban. J Mach Learn Res 12, 2825-2830.

Pyz, E., Huysamen, C., Marshall, AS, Gordon, S., Taylor, PR és Brown, GD (2008). Az egér MICL (CLEC12A) jellemzése és endogén ligandum bizonyítéka. Eur. J. Immunol. 38, 1157-1163. 10.1002/eji.200738057.

Raulf, MK, Johannssen, T., Matthiesen, S., Neumann, K., Hachenberg, S., Mayer-Lambertz, S., Steinbeis, F., Hegermann, J., Seeberger, PH, Baumgartner, W., et al. (2019). A CLEC12A C-típusú lektin receptor felismeri a plazmodiális hemozoint, és hozzájárul az agyi malária kialakulásához. Cell Rep. 28, 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015.

Ray, A. és Dittel, BN (2015). Az immunhiány és a vastagbélgyulladás betegségpenetrációja miatti dysbiosis közötti összefüggés a bél mikrobiotában. Immunology 146, 359-368. 10.1111/imm.12511.

Redelinghuys, P., Whitehead, L., Augello, A., Drummond, RA, Levesque, JM, Vautier, S., Reid, DM, Kerscher, B., Taylor, JA, Nigrovic, PA, et al. (2016). A MICL szabályozza a gyulladást rheumatoid arthritisben. Ann. Nyálka. Dis. 75, 1386-1391. 10.1136/annrheumdis-2014-206644.