A Pangenomika és a Transzkriptomika kombinált alap- és redundáns virulenciafolyamatokat tár fel egy gyorsan fejlődő gombás növényi kórokozóban
Dec 05, 2023
Absztrakt
Háttér
A gyorsan fejlődő kórokozók genomiális variációinak tanulmányozása potenciálisan lehetővé teszi az „alapbiológiájukat” támogató gének azonosítását, amelyek jelen vannak, működőképesek és minden törzsben expresszálódnak vagy „rugalmas biológia”, törzsenként változó. A rugalmas biológiát támogató gének "tartozéknak" tekinthetők, míg a "mag" génkészlet valószínűleg fontos a kórokozó fajbiológiájának közös jellemzői szempontjából, beleértve a virulenciát minden gazda genotípuson. A búza-patogén gomba, a Zymoseptoria tritici jelenti az egyik leggyorsabban fejlődő fenyegetést a globális élelmezésbiztonságra, és ez volt a tanulmány középpontjában.
A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert
Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez
【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Eredmények
18 európai terepi izolátumból álló pangenomot szerkesztettünk, amelyekből 12-t RNAseq transzkripciós profilozásnak is alávettünk a fertőzés során. Ezeket az adatokat kombinálva egy "core" génkészletet jósoltunk meg, amely 9807 szekvenciát tartalmaz, amelyek (1) minden izolátumban jelen voltak, (2) inaktiváló polimorfizmusok hiányoznak, és (3) minden izolátum expresszálódik. Egy nagy járulékos genomot is meghatároztak, amely az összes gén 45%-át tartalmazza. A genetikai és genomiális polimorfizmust kromoszómális és egyéni génskálán egyaránt osztályoztuk. Az alapvető funkciókhoz, köztük a virulenciához szükséges fehérjék szekvencia-variabilitása az átlagosnál alacsonyabb volt a maggének között. Mind a mag-, mind a járulékos genomok sok kisméretű, szekretált effektor fehérjét kódoltak, amelyek valószínűleg kölcsönhatásba lépnek a növényi immunitással. A vírusvektor által közvetített tranziens planta overexpressziójában 88 jelöltnél nem sikerült azonosítani egyet sem, amely a betegségre jellemző levélnekrózist indukálta volna. Az öt maggént nem tartalmazó, nem patogén deléciós mutáns funkcionális komplementációja azonban azt mutatta, hogy a teljes virulenciát helyreállították a legkisebb szekvenciapolimorfizmust és legmagasabb expressziót mutató egyetlen gén újbóli bejuttatásával.
Következtetések
Ezek az adatok alátámasztják a pangenomika és a transzkriptomika kombinált használatát olyan gének meghatározására, amelyek a gyorsan fejlődő kórokozók alapvető és potenciálisan kihasználható gyengeségeit jelentik.
Kulcsszavak
Foxtail mozaikvírus, Septoria tritici, Nekrotróf effektor, Esszenciális gének, Járulékos kromoszómák, Dothideomycetes,Kromoszóma instabilitás, Mycosphaerella spp
Háttér
Az állatokat és növényeket sújtó fertőző betegségek fenntartható leküzdését megkérdőjelezi az ok-okozati mikroorganizmusok evolúciója [1, 2]. A legnehezebben leküzdhető betegségek azok, amelyeket a leggyorsabban fejlődő fajok okoznak, amelyek gyorsan reagálnak a szelektív nyomásra, beleértve a természetes gazdaimmunitást, a kedvezőtlen környezeti feltételeket és/vagy a fertőzésellenes gyógyszereket [1, 3]. A mikrobiális kórokozók gyors fejlődésének lehetőségét számos jellemző határozza meg, többek között; (1) gyors életciklus és (2) szexuális szaporodást elősegítő mechanizmusok [4]. Ez utóbbi nagymértékű állandó genetikai variációhoz vezethet a kórokozó-populációkban, amelyek fenntarthatóak és felerősíthetők külső szelektív nyomással szemben. Míg egyes gének valószínűleg természetes genetikai szekvencia-variációt mutatnak, ami elősegíti evolúciójukat, más gének nem veszhetnek el (vagy nem inaktiválódhatnak mutáció következtében) anélkül, hogy ne befolyásolnák a kórokozók alkalmasságát. Az eukarióta és prokarióta növényi kórokozók esetében a gének közötti polimorfizmus szintjének ez a különbsége a "kétsebességű genomok" [5] megvalósításához vezetett, amelyek olyan összetevőket tartalmaznak, amelyek gyorsan fejlődnek, és úgy gondolják, hogy reagálnak a külső tényezőkre (gazdakör és immunitás stb.), míg a lassabban fejlődő készlet olyan géneket tartalmaz, amelyek alapvető háztartási és egyéb alapvető funkciókat látnak el. A kórokozó-genomok járulékos és magrészei "pangenommá" állíthatók össze, amelynek közel kell képviselnie a fajban jelenlévő gének teljes készletét [6]. A pangenomák mag- és járulékos részeinek mérete baktérium-, gomba- és oomycetes-fajon belül változik [7–13], és utalhat arra, hogy a mikrobapopulációk szelektív nyomásra gyorsan fejlődhetnek. Elképzelhető, hogy minél nagyobb a járulékos pangenom a maghoz képest, annál inkább képesek ezek a populációk a gyors fejlődésre. A búza ascomycete gombás kórokozója, a Zymoseptoria tritici a Septoria tritici blotch (STB) okozója, egy világszerte fontos, az élelmezésbiztonságot veszélyeztető betegség [14]. A kórokozót régóta a populációbiológiai és evolúciós vizsgálatok modellrendszerének tekintik [15–18]. Ennek az az oka, hogy a Z. tritici nagyarányú szexuális rekombinációval rendelkezik, amely nagy mennyiségű állandó genetikai diverzitást tart fenn populációin belül, és gyors alkalmazkodást tesz lehetővé mind globális, mind lokális szinten [17, 19–24]. Ennek eredményeképpen a Z. tritici-vel szemben rezisztenciát biztosító főbb búzagéneket gyorsan legyőzik [25]. Emellett a legtöbb széles körben használt, kereskedelmi forgalomban kapható gombaölő szer idővel elveszíti hatékonyságát [3]. E két tényező kombinációja veszélyt jelent a globális búzatermelésre, amelyet sürgősen kezelni kell. A Z. tritici a közelmúltban a kórokozó genomika új modelljeként is megjelent, számos jó minőségű genom-referencia már elérhető [26] a nagyszámú egyedi izolátumgenomból épített pangenomok mellett [27, 28]. A Z. tritici genomjának talán az egyik legérdekesebb jellemzője a 13 magkromoszóma (1-13) jelenléte, amely minden izolátumban megtalálható, de további 8 kisebb kiegészítő kromoszóma (14-21) jelenléte az izolátumok közötti jelenlét/hiány és szerkezeti polimorfizmus [26, 29]. Szerencsére az egyik közösségi referencia-izolátum, és az első, amelyet teljesen szekvenáltak, az 1980-as években gyűjtött holland terepi IPO323 izolátum 21 kromoszómát hordoz, ami az eddigi legnagyobb szám. Ezért az IPO323 kiváló viszonyítási alapként szolgál más izolátumok variációinak tanulmányozásához, és állványként szolgál a pangenomák felépítéséhez.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
A Z. tritici ivartalan fertőzési ciklusa számos rokon növényi kórokozóra jellemző, amelyek számos élelmiszernövényt érintenek [30]. Ezek a gombák, amelyek a Dothideomycetes rend Mycosphaerellaceae családjába tartoznak, jellemzően sztómákon keresztül támadják meg a növényi szöveteket [30, 31]. Ezután a növényi sejtek között egy hosszú, tünetmentes növekedési periódus következik, amely legalább 8 napig tart, és hirtelen nekrotikus levélléziók kialakulásával végződik, amely helyzet a Z. tritici esetében a növény "hiperaktivációja" eredményeként következik be. immunitás [32–34]. A növényi sejtpusztulás ezt követően új sporulációs struktúrák, piknídiumok kialakulásával jár a sztóma alatti üregekben, és az újonnan képződött piknidiospórák ezt követő extrudálásával és elterjedésével fröccsenő esőzések idején. Más Dothideomycetes gombákról kimutatták, hogy az érzékeny növényekben felismert fehérje "effektorok" szekréciója révén hiperaktiválják a növényi immunitást, ami sejt- és szövetelhalást (nekrózist vagy programozott sejthalált) eredményez. Ezek a nekrotróf gombák részesülnek ebből a válaszból, és az érintett effektor fehérjéket ma nekrotróf effektoroknak nevezik [35, 36]. Noha van néhány előzetes bizonyíték arra vonatkozóan, hogy a Z. tritici nekrotróf effektorokat is bevethet a tüneti növekedésre való átálláskor [37], ami a levelek elváltozásait idézi elő, ezt a hipotézist a mai napig nem tesztelték megbízhatóan. A jövőbeni búzatermesztés STB hatásaitól való megvédésének két, egymást kölcsönösen nem kizáró módja az, hogy (1) fokozza a természetes növényi betegségekkel szembeni ellenálló képességet, és (2) új molekuláris célpontokat azonosítson, amelyeket a betegségek elleni védekezésben ki lehet használni. Ideális esetben ezek lehetővé tennék a kórokozó szelektív védekezését, miközben az egyéb környezeti és ökológiai hatásokat a minimumra korlátozzák. A kórokozó genomika és különösen a pangenomika lehetőséget kínál mindkét stratégia bővítésére. Míg a pangenom kiegészítő, gyorsan fejlődő része által kódolt fehérjék sok olyan gént tartalmazhatnak, amelyek kölcsönhatásba lépnek a növényi immunitással (pl. effektorok), a maggenom olyan célpontokat tartalmazhat, amelyek kevésbé könnyen mutálódnak a negatív fitnesz (és virulencia) büntetések miatt. Emiatt a mezőgazdasági fungicidek általában a magfolyamatokat célozzák meg, amelyek feltehetően kevésbé változékonyak. Azonban, mint korábban említettük, még ezek a célpontok is fejlődhetnek bizonyos mértékig a kémiai gátlás elkerülése érdekében, amint azt számos jelenlegi fungicid célfehérjére vonatkozóan leírták [3, 14]. A legtöbb eddig használt gombaölő szer meglehetősen szűk molekuláris folyamatokat céloz meg (pl. szterin bioszintézis, légzés stb.) [3]. Potenciálisan sok más célpont is használható a gombás kórokozók szelektív leküzdésére, amelyek több omics adatkészlet kombinálásából és elemzéséből származhatnak. A nagy felfedezési potenciált hangsúlyozza, hogy jellemzően a patogén gombák (és általában a gombák) genomszekvenciájában azonosított összes gén 40%-a még mindig ismeretlen funkciójú. Különösen fontosak lehetnek azok, amelyek a patogén gombák maggenomjában jelen vannak és esetleg konzerváltak.
Pangenomics of rapidly evolving pathogens could be used to identify core, potentially specific gene sets, which could be exploited in future disease control [11]. The premise is that genes which are not evolving, in an otherwise rapidly evolving species, are most likely to be essential for either life or important for key virulence processes of the pathogen. Pangenomes themselves have, to date, largely been defined by sequencing genomic DNA from multiple members of a species. Whilst this is a critical and indispensable step in ascertaining the full potential of a species' genomics, gene expression support is perhaps overlooked for refinement of core and accessory gene calls, particularly in relation to biological processes such as pathogenicity/virulence. For example, if a core gene, predicted through genomic DNA sequence analysis, is not expressed by a successful pathogenic strain/ isolate during infection, it might be more appropriately considered accessory. Pangenome analyses on fungi and yeasts have recently emerged and have highlighted some major differences in the size of core and accessory gene components. For example, one recent study which analyzed the animal pathogenic yeasts, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, the free-living yeast, Saccharomyces cerevisiae, and the animal filamentous fungal pathogen Aspergillus fumigatus, predicted each to have >A magként jelölt gének 80%-a [10]. Más, növényi eredetű flamentális gombákon végzett elemzések azonban nagyobb járulékos génkomponenseket jósoltak, beleértve a Claviceps purpurea [38] kórokozójának ~38%-át és a Pyrenophora tritici-repentis [39] ~44%-át. A Z. tritici korábbi átfogó pángenomikai tanulmányaiban nagy számú izolátumot magában foglaló globális és történelmi populációkat használtak, amelyeket mind fragmentált, mind teljes genom léptékben szekvenáltak [27, 28]. Ezek a vizsgálatok egy nagy járulékos génkészletet (az összes gén ~40%-át) azonosították ehhez a fajhoz. Ezenkívül ez összefüggést mutatott a kiterjedt jelenléttel/hiányokkal és a kromoszómális szerkezeti polimorfizmusokkal, amelyek dinamikus ismétlődő elemeket is jelentenek (beleértve az áthelyezhető elemeket is). A további elemzések arra is utaltak, hogy sok járulékos gén is alacsonyabb mértékben expresszálódik (átlagosan), mint a maggének. Ezek a tanulmányok jelentik a Z. tritici faj pangenomjának szerkezetének "arany standardját", és az eddigi legátfogóbbak minden fonalas gomba esetében. A kérdés azonban továbbra is fennáll ennek és más fajoknak, hogy a pangenomika milyen mértékben használható a mag virulencia gének és folyamatok azonosítására. És az alapgénkészleteken belül vajon az aminosav-változásokat befolyásoló, populációra kiterjedő polimorfizmusok szintjei, valamint a génexpressziós szintek elárulják-e a kulcsfontosságú patogén virulencia gének azonosságát?
Ebben a tanulmányban a genomszekvenálást és az RNAseq-alapú transzkriptomikai megközelítéseket kombináltuk, hogy előállítsunk egy pangenomot a Z. tritici izolátumok közelmúltbeli európai gyűjteményéből. Fő célunk az volt, hogy megvizsgáljuk, hogy az izolátumok között alacsony aminosav-polimorfizmussal (vagyis kódoló szekvenciákban) kódoló fehérjéket kódoló maggenomban jelenlévő gének fontos funkciókat töltenek-e be, beleértve a búza magfertőzési folyamataiban is. A korábbi tanulmányokkal összhangban [27, 28] kimutattuk, hogy a Z. tritici rendkívül nagy járulékos genommal rendelkezik (az összes gén ~45%-a), ami alátámasztja gyorsan fejlődő állapotát. Továbbá olyan biológiai adatokat szolgáltatunk, amelyek egyértelműen alátámasztják a két omics módszer kombinált alkalmazásának hasznosságát új mag virulencia gének azonosítására. Ezzel szemben a nagy áteresztőképességű, vírus által közvetített funkcionális fehérje túlexpressziós szűrések nem tudtak azonosítani egyetlen olyan nekrotróf efector-jelöltet sem, amely a búzalevelekben betegségi elváltozásokat váltott volna ki, sem a magból, sem a járulékos pangenomból.
cistanche növény-növelő immunrendszer
Eredmények
Egy európai Z. tritici gyűjtemény virulencia-szűrői a földrajzilag független helyekről származó, hasonlóan agresszív törzseket azonosítanak
43 Z. tritici izolátum virulenciáját teszteltük 21, széles körben fogékony európai kenyérbúza-fajtán, így összesen 2709 adatpontot kaptunk (három replikációt is beleértve). Az elkülönítési információkat (kód és származási ország) az 1. kiegészítő fájl tartalmazza: S1 táblázat. Mindegyik interakciót kvantitatívan értékeltük a következő paraméterek tekintetében: (1) az inkubációs időszak hossza, (2) a teljes nekrózis eléréséhez szükséges idő (amikor az bekövetkezett), és (3) az ivartalan spórásodás szintje (1A. ábra). Mind a számítógépes, mind a vizuális betegségek pontozása alapján (lásd a Módszerek és a 2. kiegészítő fájlt: S1. ábra), az összes izolátumot a virulenciaprofiljaik alapján csoportosították a vizsgált fajtapanelen (1B. ábra). Az IPO323 pozitív kontroll izolátum, amely globális referenciaként szolgál [26] teljesen szekvenált genommal, kevésbé volt agresszív, mint a legtöbb vizsgált izolátum szinte minden fajtával szemben. Ezt az izolátumot ~1984-ben gyűjtötték, és azóta is raktárban tartják, alkalmanként búzaleveleken keresztül; ezért jelenleg nem világos, hogy ez a megfigyelés (legalábbis részben) a minta tárolásából származhatott-e az idő múlásával. Hét olyan izolátumot azonosítottunk, amelyek egyik búzafajtán sem voltak képesek betegségtüneteket produkálni (1B. ábra). Mivel ezek az izolátumok mind Spanyolországból vagy Olaszországból származnak, ahol a tetraploid (durum/tészta) búzát (Triticum durum L.) gyakrabban termesztik, valószínű, hogy ezek az izolátumok durumbúzára specifikusak voltak [40, 41]. Lényeges, hogy a hasonló virulenciaprofillal rendelkező izolátumok nem csoportosultak a gyűjtési helyükön, a keletről Szlovákiáig terjedő és egészen Nyugat-Írországig terjedő izolátumok csoportosultak (1B. ábra). Ez a megfigyelés jól egyezik az izolátumok között fennálló nagyfokú genetikai variációval és a korábbi tanulmányokkal, amelyek azt mutatták, hogy ez ugyanolyan magas egy búzalevél-lézió léptékében, mint a kontinenseken [42]. Sok agresszívebb, eltérő virulenciaprofillal rendelkező izolátumot választottunk ki ezt követően a genomi szekvenáláshoz (az 1B. ábrán "#"-vel kiemelve) és az RNAseq analízishez (az 1B. ábrán "+"-val kiemelve).
1. ábra Az európai izolátumgyűjtemény virulenciájának értékelése egy sor hexaploid (kenyér) búzafajtával szemben. A betegség tipikus progressziójának lefutása, amely a képernyőn értékelt paramétereket illusztrálja, beleértve az első látható tünetek megjelenéséig és a teljes levélnekrózis megjelenéséig eltelt időt az oltott területen. Az ábra a Riband búzafajta Z. tritici IPO323 izolátummal történt fertőzését mutatja. B Az izolátumok virulenciaprofilja a fajtapanelhez képest a levélnekrózis és a klorózis mértéke alapján. A méréseket vizuális értékeléssel, valamint LemnaTec és LemnaGrid képelemző szoftverrel végeztük, összehasonlítható végeredményekkel. Az izolátumokat a virulenciaadatok alapján rangsorolták és csoportosították. A # jellel kiemelt Z. tritici izolátumok genomját szekvenálták a pangenom létrehozása érdekében. A + jellel kiemelt izolátumokat RNAseq transzkriptomika segítségével is elemeztük. Megállapították, hogy a Panorama búzafajta (X-szel kiemelve) egyformán és teljes mértékben fogékony a legtöbb izolátumra, és az RNAseq levélfertőzés gazda genotípusaként választották ki. Megjegyzendő, hogy a hét izolátum külső csoportjára vonatkozó alacsony virulencia adatok az összes fajtával szemben valószínűleg abból fakadnak, hogy ezeket az izolátumokat a tetraploid búzán (Durum vagy Pasta) betegségek okozására alkalmazkodták. Az összes adat három fertőzött levélre vonatkozik, amelyeket két biológiai párhuzamos kísérletből (összesen 6 levél) vizsgáltunk/kölcsönhatásba léptünk. C SplitsTree elemzése a genomiális szekvenáláshoz kiválasztott izolátumok molekuláris filogeneziséről. Az izolátumok származási országa a rövidítésben látható (Pl=Lengyelország; GB=Nagy-Britannia; Be=Belgium; Cz=Cseh Köztársaság; Ge {{8 }} Németország; Sw=Svédország; Fr=Franciaország; Sl=Szlovákia; Ir=Írország). Az IPO323 referencia-izolátum, amelyet 1984-ben Hollandiából gyűjtöttek (Ne) szintén képviselik
Tizenhét európai izolátum genomszekvenciája és filogenetikai elemzése magas szintű genetikai sokféleséget mutat
We used Illumina HiSeq 250 bp paired-end read technology to assemble the gene space of seventeen new isolates (indicated by # in Fig. 1B). BUSCO analysis (core dataset Pezizomycotina) was then performed to assess the completeness of each genome assembly (Table 1). Scores >Az esetek 97%-a a géntér (kódoló régiók) jó összeállítását jelezte minden izolátum esetében. Néhány kiválasztott BUSCO gén hiányzott az összes összeállításból, ami azt sugallja, hogy a Z. tritici nem rendelkezik e gének ortológiájával. A megjósolt kódoló régiókat érintő genetikai variáció mértékének meghatározásához ezután SNPEf-analízist végeztünk minden egyes törzsre az IPO323 referencia-izolátum teljes genomjára épülő pangenom ellen (2. táblázat). Ez az elemzés kimutatta, hogy minden új törzs több mint 160,000 SNP-vel rendelkezik a származtatott pangenom ellen. Ezek között több mint 65 volt, 000 amelyek vagy potenciális fehérjefunkció-vesztést okoztak (nagy hatás, kereteltolódás, elveszett indítás, korai stopkodonok), vagy aminosav-változást idéztek elő a megjósolt fehérjékben (közepes). Ezek az adatok bizonyították a Z. tritici izolátumok közötti genetikai sokféleséget.
A 17 újonnan szekvenált törzsen és az IPO323-on kettéosztott faelemzést végeztünk annak megállapítására, hogy a hasonló fajtájú fertőzési mintázatú izolátumok között van-e valamilyen filogenetikai kapcsolat, és hogy ez összefüggésben van-e a származási országgal. A törzsfejlődést hat kódoló és nem kódoló szekvencia összefűzésével határoztuk meg (lásd Módszerek és 3. kiegészítő fájl: S1 adatok). A fa (1C. ábra) ismét szemlélteti, hogy nem volt egyértelmű kapcsolat a virulenciaprofilok és a szekvenált izolátumok mintavételi helye között, közeli rokon virulenciaprofilokkal (összehasonlítva az 1B. ábrával) a különböző európai országokból gyűjtött izolátumok esetében, amelyek azonban mégis filogenetikailag szorosan összefügg.
A Pangenom felépítése és elemzése 9807 "mag" és 8083 "kiegészítő" gént jósol
A genomszekvenciákon kívül 12 izolátumot választottunk ki az RNAseq-alapú transzkripciós profilalkotáshoz (az 1B. ábrán + jellel). Mindegyik izolátumot három párhuzamosban profiloztuk YPD táptalajban axenikus növekedés során, valamint a levélfertőzés két független szakaszában; Az oltás után 6 nappal (dpi) a középső tünetmentes fázist és 9 dpi-t a korai tünetek kialakulásának átmeneti szakaszában. Az univerzálisan fogékony Panorama búzafajtát használták a fertőzési vizsgálatokhoz, amelyeket minden izolátum teljesen meg tudott fertőzni megkülönböztethetetlen kinetikájával. Ezeket a transzkriptomadatokat az új genom-összeállításokkal kombinálva, valamint az IPO323 eredeti referenciaszekvenciáját használva vázként, meghatároztuk az európai izolátumok pangenomját, amely más izolátumokban jelen lévő szekvenciákat is tartalmaz, amelyeket az IPO323 nem mutatott ki. A pangenom felépítésének lépései és a gének "mag" vagy "tartozék" kategóriába sorolásának kritériumai a 2. ábrán láthatók. Fontos, hogy az inaktiváló (nagy hatás, funkcióvesztés-LoF) szekvencia polimorfizmus, jelenlét és hiány, megfontolások génexpresszió bizonyítékai is alátámasztották. Ezáltal egy génnek funkcionális formában kell jelen lennie, és minden izolátumnak expresszálnia kell, hogy a „mag” kategóriába sorolható legyen. Átfogó megközelítésünk (2. ábra) összesen 17 890 génből álló pangenomot definiált, köztük 2017-et, amelyek nem voltak jelen az IPO323-ban. A következő szűrési lépések a 9807-et a maggenomba sorolták be, és csak valamivel kisebb szám, a 8083 a tartozékkészletben található. Ez utóbbi a teljes pangenom körülbelül 45%-át teszi ki, ami enyhe növekedés a korábban leírtakhoz képest [28]. Bár ezek a számok általában jól egyeznek, a járulékos gének becslései az alkalmazott módszerek miatt (Panseq stb.) sokkal szubjektívebbek a torzításra, és nem feltételezhetjük, hogy a jövőbeni további elemzések esetleg nem csökkentik a járulékos génszámot például ortológiai alapú módszerekkel. megközelít. Az összes pangént több jellemző (szekréció, membrán asszociáció, lokalizáció és ciszteintartalom) és előrejelzett funkciók (BLAST, GO és Interpro megjegyzések) szempontjából elemezték. A táblázat tartalmazza az összes génre vonatkozó összes rendelkezésre álló információt (4. további fájl: S2 táblázat). A táblázat az RNAseq-eredetű génexpressziós szintek relatív átlagát is tartalmazza mind a 12 izolátumra vonatkozóan, a három vizsgált körülmény között. Összességében az élőlényen végzett korábbi pángenomikus vizsgálatokkal [27, 28] összevetve egyértelmű, hogy a Z. tritici rendelkezik a gombák eddigi legnagyobb számban vizsgált járulékos genetikai komponenseivel, ami valószínűleg a gyors fejlődést tükrözi. természet.
1. táblázat BUSCO elemzés új genomokon
2. táblázat Az SNP-hatás hatásainak összefoglalása minden új genom esetében az IPO323 referenciagénmodellekkel szemben
2. ábra Az újonnan épített európai Z. tritici pangenom "mag" és "kiegészítő" génhívásainak és számainak generálására használt lépések összefoglalása. A számok a folyamat egyes szakaszaiban azonosított gének számát jelentik
Az európai Z. tritici pangenom variációjának szerkezeti jellemzői
A tanulmány célja annak a hipotézisnek a tesztelése volt, miszerint a pangenomika hasznosítható fontos új gének azonosítására, amelyek nélkülözhetetlenek az élethez vagy a patogén organizmusok virulenciájához. Feltételeztük, hogy ezek olyan gének, amelyek a kórokozó minden törzsében jelen vannak és funkcionálnak, és expresszálódnak. Feltételeztük továbbá, hogy ezekben a génekben alacsonyabb szintű magas és közepes hatású SNP-mutációk találhatók, amelyek befolyásolják a kódoló szekvenciákat (kevésbé polimorfak), és bizonyos kromoszómák régióiba csoportosulhatnak.
SNP variációs adatokat (magas, mérsékelt és módosító – lásd a 4. további fájlt: S2 táblázat), valamint az összes gén átlagos expressziós adatait használtuk fel a kódoló polimorfizmus és expresszió átlagos szintjének kromoszómális alapon történő vizsgálatára, a 21 kromoszóma felhasználásával. állványként az IPO323-at. A módosító SNP-k olyan nukleotid változásokat képviselnek, amelyek nem idéznek elő aminosav változást. A 3A. ábra azt mutatja, hogy nem volt különösebb torzítás a mutációs gyakorisággal kapcsolatban, amikor a kumulatív magas, közepes és módosító SNP-ket a teljes kromoszómánkénti átlagos fehérjehossz jellemzőjeként fejezték ki. Ha azonban a módosító mutációkat, azaz azokat, amelyek nem okoznak aminosav változást, kihagytuk, egyértelmű volt, hogy a legkisebb 8 kromoszóma tartalmazott olyan géneket, amelyekben több magas és közepes SNP mutáció található (3B. ábra). Ezt a hatást tovább hangsúlyozták, amikor csak a nagy hatású SNP-ket elemeztük (3C. ábra). Az 1–13. magkromoszómán megfigyelhető szintekkel szemben (~20%), a nyolc legkisebb, 14–21. kromoszómán található gének 90%-a volt kitéve erős hatású, valószínűleg funkcióvesztéses mutációknak legalább egyben. izolátum (3C. ábra). Mind a 12 új izolátum kumulatív transzkripciós adatai a 14–21. kromoszómán jelenlévő gének viszonylag alacsony átlagos expresszióját is kimutatták (3D. ábra), amint azt korábban az IPO323 esetében megfigyelték [32, 43, 44]. Összességében ezek az adatok egyértelmű genomi kompartmentalizációt jeleznek, a legkisebb nyolc járulékos kromoszóma olyan szekvenciákat tartalmaz, amelyek erősen polimorfak, járulékosak és általában gyengén expresszálódnak.
A mag- vagy a járulékos genomban található összes gén összehasonlítása azt mutatta, hogy az utóbbiban lévő összes gén ~60%-a legalább egy törzsben található, amely nagy hatású (működésvesztés (LoF)) mutációt mutatott, és 47%-uk hiányzott a legalább egy törzset (4. további fájl: S2 táblázat). A járulékos kromoszómák elemzéséhez hasonlóan az egyes járulékos gének is nagyon gyengén fejeződtek ki a vizsgált izolátumokon (4. további fájl: S2 táblázat), és sokkal több ismeretlen funkciójú szekvenciát tartalmaztak (kb. 80%). Ezek a megfigyelések jól összehasonlíthatók a Z. tritici több évtizedes különbséggel gyűjtött globális gyűjteményeken végzett korábbi pángenomikai vizsgálatokkal [27, 28].
Az IPO323 referencia-izolátumban megjósolt összes génre, a többi 17 szekvenált izolátumra vonatkozóan génenkénti jelenlét- és hiányvariációs (PAV) elemzést is végeztünk. Ezeket a jelenlét/hiányadatokat pozícionáltuk minden egyes génre az IPO323-ban jelenlévő 21 kromoszómán keresztül. A 3E. és F. ábra a reprezentatív magkromoszómák adatait (1. és 7.), míg a 3G. és H. ábra a reprezentatív járulékos kromoszómák (13. és 14.) adatait mutatja. A fennmaradó kromoszómák adatai a 2. kiegészítő fájlban láthatók: S2 ábra. Ez az elemzés számos IPO323-ban jelenlévő gént azonosított, amelyek számos újraszekvenált izolátumból hiányoznak, és világosan megmutatja a különbséget az IPO323 "mag" kromoszómái között (amelyek minden Z. tritici törzsben megtalálhatók) az általános gén jelenlétében/hiányában. a 8 legkisebb "kiegészítő" kromoszómához képest. Az adatok különösen a 7. kromoszómán egy 1,7 Mb és 2,5 Mb közötti régiót emelnek ki, amely a génhiány magas gyakoriságát mutatja az új izolátumokban (3F. ábra). Érdekes módon ez a régió pontosan megegyezik azzal a genom-hellyel, amelyről korábban azt tapasztalták, hogy az IPO323-ban minimális vagy egyáltalán nem volt génexpresszió, akár a tenyészetben való növekedés során, akár a növényi fertőzés bármely fázisában [32, 43]. Ez a régió megegyezik egy kromoszóma-delécióval is, amelyet egy jemeni izolátumban figyeltek meg egy korábbi pangenom vizsgálatban [28]. Ezek az adatok együttesen megerősítik azt az elképzelést, hogy a Z. tritici egy gyorsan fejlődő organizmus, amely populációján belül magas szintű és különböző típusú genetikai és genomiális diverzitással rendelkezik.
A fehérje lokalizációs előrejelzései olyan géneket tárnak fel a járulékos pangenomban, amelyek a változó környezethez való alkalmazkodásban működhetnek
A WolfPsort fehérje lokalizációs előrejelzéseit a pangenom által kódolt összes fehérjére futtattuk. Ezután kiszámítottuk azoknak a fehérjéknek a relatív százalékos arányát, amelyek várhatóan az egyes szubcelluláris régiókban lokalizálódnak a mag- vagy járulékos pangenom összes fehérjeszámának jellemzőjeként (4. ábra). Számos lokalizációs kategória gazdagodott a maggenomban, ideértve a "citoplazmát", az "extracelluláris" és a "plazmamembránt", amelyek közül az utóbbi számos kulcsfontosságú transzport funkciót tartalmaz (4. ábra). Éppen ellenkezőleg, a "nukleusz" és a "mitokondrium" helyekhez a járulékos genomban a gének nagyobb százaléka társult (4. ábra). A járulékos genomot bizonyos cinkkötő doménekre dúsítottuk, amelyek transzkripciós rugalmasságot biztosíthatnak. Ennek a kategóriának a feldúsításáról egy korábbi pangenom-tanulmány is beszámolt, amely rávilágított arra, hogy a teljes csővezetékünk összehasonlítható eredményeket produkált [27, 28]. A "mitokondriális" dúsítás azért érdekes, mert léteznek a jóhiszemű mitokondriális fehérjék pszeudogénjei és paralógjai, amelyek célpontjai a gombaellenes kémia. A járulékos pangenom egyik egyértelmű példája a szukcinát-dehidrogenáz C alegység (SDHC3) paralógja, amelyről kimutatták, hogy állandó rezisztenciát közvetít az SDHI (szukcinát-dehidrogenáz inhibitor) gombaölő szerek egy alosztályával szemben a Z. triticiben [45]. A tizenhét szekvenált izolátum közül csak háromban azonosítottuk ennek a génnek a teljes szekvenciáját, és az RNAseq által később vizsgált 12 közül csak egyben mutattunk ki magas szintű génexpressziót (5B. ábra). Mindazonáltal az előző tanulmány és jelenlegi elemzésünk hangsúlyozta, hogy valóban vannak fontos funkciók a járulékos genomban, de ezek valószínűleg fontosabbak a változó környezethez való alkalmazkodáshoz, mint az alapvető életmódhoz.
3. ábra: A Pangenom szerkezeti jellemzői és jelenlét/hiány polimorfizmusok az IPO323 referencia-izolátum 21 kromoszómáján keresztül. A módosító, közepes (M) és nagy (H-funkcióvesztés-LoF) hatásváltozásokat eredményező kumulatív SNP-mutációk teljes száma a kromoszómánkénti átlagos fehérjehossz (aa) jellemzőjeként kifejezve. B A mérsékelt és nagy hatású változásokat okozó kumulatív SNP mutációk teljes száma a kromoszómánkénti átlagos fehérjehossz jellemzőjeként kifejezve. C A nagy hatású változásokat eredményező kumulatív SNP mutációk teljes száma a kromoszómánkénti átlagos fehérjehossz jellemzőjeként kifejezve. D A 21 kromoszómán lévő összes gén átlagos expressziója az összes izolátumban. E Az IPO323 izolátum 1. magkromoszómáján előre jelzett gének jelenléte és hiánya (PaV) polimorfizmusa a 17 újonnan szekvenált izolátumban. F PaV a 7. magkromoszómán lévő génekhez. G PaV a 15. járulékos kromoszómán lévő génekhez. G–F PaV a 15. járulékos kromoszómán lévő génekhez. Az adatok kiterjedt regionális eltérésekre mutatnak rá, és egyértelmű különbséget tesznek az általános szekvenciapolimorfizmusok szintjei és a jelenléte között. hiánya nyilvánvaló a mag- és a járulékos kromoszómákon
4. ábra A mag- és járulékos gének által kódolt fehérjék becsült lokalizációja. A WolfPsort által meghatározott százalékos előrejelzett fehérjelokalizáció összegzése a megjelölt kategóriákban a mag- és a járulékos pangenomban jelenlévő összes proteinhez viszonyítva
A járulékos genomban lévő effektorfehérjék expressziójában nagyobb a törzsek közötti variabilitás, mint a magban
A maggenom génjeinek több mint nyolc százaléka feltételezett szekretált fehérjéket kódolt, ami magasabb, mint a járulékos genom (~5%). A szekretált fehérjét kódoló járulékos genomban található gének azonban gyakrabban voltak ismeretlen funkciójúak, nem voltak felismerhető domének vagy katalitikus régiók. Ezek az ismeretlen funkciójú fehérjék a teljes járulékos szekréció ~75%-át tették ki, szemben a magszekréció 42%-ával. A maggenomban jelenlévő jelölt (és bizonyos esetekben validált) efektorok közül sok hasonló mintázatban és összehasonlítható szinten fejeződött ki mind a tizenkét RNASeq-vel elemzett izolátumban. Például a három LysM (Lizin) domént tartalmazó efector, a 3LysM, 1LysM és xLysM nagyon hasonló szinten és azonos mintázatban fejeződött ki minden törzsben (5C-E. ábra). A Te 3LysM effektor továbbra is a Z. tritici egyetlen fő szekretált virulencia-determinánsa, ahol ez a fehérje a kitin által kiváltott növényi immunitás elnyomására szolgál a korai fertőzés során [46, 47]. Ismeretes azonban, hogy mindhárom LysM efektor együtt dolgozik ennek érdekében [48]. Emiatt figyelemre méltó, hogy ezeknek a géneknek az expressziós eltérése nagyon kicsi volt az izolátumok között, ami megerősíti azt a feltételezést, hogy ez a védekezés elnyomása a fertőzés központi összetevője. Ezzel szemben a járulékos genomban talált effektorjelöltek mind a jelenléti, mind a távolléti variációt és az izolátumok közötti nagyon változó expressziót mutatták (5F-H ábra). Például az AvrStb6, a Z. triticiben azonosított első avirulencia effektor [49, 50] jelentős expressziós variációt mutat (5F. ábra), annak ellenére, hogy minden izolátumban jelen van. Ezt a szekvenciaváltozót, egy kisméretű, szekretált fehérjét a receptorszerű Stb6 kináz funkcionális alléljait tartalmazó búzafajták ismerik fel [25, 51]. Ez a felismerés betegségrezisztenciát biztosít minden olyan izolátummal szemben, amely ennek az efectornak egy adott allélját hordozza. Az AvrStb6 szignifikáns expressziós variációja volt az izolátumok között, és azonosítottunk egy izolátumot (Zt118), ahol a három vizsgált körülmény egyikében sem sikerült expressziót kimutatnunk. Emiatt az előrejelzési folyamatunkban az AvrStb6 a járulékos genomba került besorolásra. Sok más, jelenleg ismeretlen funkciójú effektorjelölt jelentős jelenlétet/hiányt és/vagy expressziós eltérést mutatott a járulékos genomban (5G és H ábra).
5. ábra Gének expressziós variációja a mag- és járulékos pangenomban, valamint egy tranziens vírus-túlexpressziós rendszer létrehozása a nekrotróf effektor szűrésekhez. Az ábrákon az adatok értelmezésének kulcsa látható. B A járulékos genomban jelenlévő szukcinát-dehidrogenáz C alegység paralógjának jelenléte/hiánya és génexpressziós variációja. C-E A ZtLysM efectorok, a 3LysM, 1LysM és xLysM expressziós profiljai, amelyek mindegyike jelen van a magpangenomban. F Az AvrStb6 avirulencia efector expressziós profilja. Az expresszió hiánya a 118-as izolátumban az efectort a járulékos pangenomba sorolja. G és H Példák további effektorjelöltekre a járulékos pangenomban.
A funkcionális képernyők nem szolgáltatnak bizonyítékot a nekrotróf effektor aktivitásra sem a magban, sem a járulékos pangenomban
A közelmúltban kifejlesztett vírusvektor által közvetített fehérje tranziens expressziós rendszert alkalmaztunk búza (és más gabonafélék és nem gabonanövények) számára, a Foxtail Mosaic vírus (FoMV) felhasználásával, hogy a Z. tritici efectors jelöltek közepes és nagy áteresztőképességű szűrését végezzük. a pangenomból. Kifejezetten arra törekedtünk, hogy megvizsgáljuk, képes-e valamelyik búzafajták nekrózisát kiváltani, ami arra utalhat, hogy „nekrotróf effektorként” működnek a betegség tüneteire való átmenet során [36, 52]. Ehhez a tanulmányhoz néhány módosítást végeztünk a korábban publikált rendszeren [53]. Az extracelluláris fehérjeszekréció ösztönzésére búzában a búza patogenezissel kapcsolatos protein 1 (TaPR1) szignálpeptid szekvenciáját használtuk, amely kodon-optimalizált Arabidopsis thaliana-ra, amelyet azután génszintézissel fuzionáltunk a keretben minden egyes gomba effektor szekvenciával. 5I). A TaPR1 szignálpeptid hatásosságát a funkcionális Z. tritici extracelluláris fehérjék kiválasztására az a képessége állapította meg, hogy a Z. tritici nekrózis és az etilént indukáló fehérje (ZtNLP) elé helyezve képes levélnekrózist kiváltani a dohányban, amely csak funkcionális. amikor az extracelluláris szekréciót célozzák (5. ábra Jl) [54]. Ezután megerősítettük, hogy a vektor képes túlzottan expresszálni a fehérjéket egy sor búzafajtában azáltal, hogy megjeleníti a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) lokális és szisztémás expresszióját a különböző búzafajták leveleiben (2. további fájl: S3. ábra). Végül megvizsgáltuk, hogy a rokon búzapatogén Parastagonospora nodorumból származó, jól jellemzett nekrotróf effektor SnToxA képes-e nekrózist indukálni a Tsn1 érzékenységi gént hordozó genotípusok búzaleveleiben [55]. Ahogy az várható volt, az SnToxA FoMV által közvetített túlzott expressziója a TaPR1 szignálpeptiddel csak a Tsn1-et hordozó búzafajtán (cv Halberd az 5K. ábrán) indukált nekrózist, és nem figyeltek meg tüneteket azokon a fajtákon, amelyekből hiányzik ez a fogékonysági gén (cv. Riband5K). ). A jelen adatok megerősítették, hogy a vírusvektor által közvetített túlzott expressziós rendszer alkalmas volt a jelölt Z. tritici effektorok nagyobb léptékű szűrésére a nekrotróf effektor aktivitással rendelkezők azonosítására. Összesen 88 jelöltet választottunk ki és szűrtünk öt búzafajtára (5. kiegészítő fájl: S3 táblázat). Ezek 66 fehérjét tartalmaztak a mag pangenomjában, és 22 fehérjét a kiegészítőből. A kiválasztott gének (5. további fájl: S3 táblázat) a törzsspecifikus polimorfizmusokat nem tartalmazó (monomorf) és magas növényi expressziójú maggénektől a járulékos genomban jelenlétet/hiányt és/vagy jelentős expressziós polimorfizmust mutató génekig terjedtek. Minden kísérletben párhuzamosan ToxA vs cv Halberd és cv Riband technikai kontrollokat futtattunk, és ezek mindig a várt eredményeket hozták. Ezzel szemben a 88 vizsgált Z. tritici túlzottan expresszált fehérje egyike sem okozott levélnekrózist egyik búzafajtán sem. Összefoglalva, ezek az eredmények nem szolgáltattak bizonyítékot a nekrotróf efectorokra, és ezért egyik tesztelt jelölt sem támasztja alá a fertőzés során a nekrotróf növekedésre való átállást.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
A kimutatott vagy előre jelzett, az élethez elengedhetetlen vagy kulcsfontosságú virulenciafunkciókkal rendelkező fehérjéket kódoló maggének alacsonyabb általános aminosav-polimorfizmust mutatnak
Szakirodalmi kutatást végeztünk, hogy azonosítsuk az összes olyan Z. tritici gént, amely funkcionális jellemzésnek volt alávetve, akár virulenciában, akár 2018-ig esszenciális génként. Ez egy 28 fehérjeszekvenciát tartalmazó listát generált (6. további fájl: S4 táblázat). Hasonlóképpen azonosítottunk egy listát 26 fehérjéről, amelyek funkcionálisan szintén jellemeztek, de kimutatták, hogy nem játszanak jelentős szerepet a virulenciában, vagy nem esszenciálisak (6. további fájl: S4 táblázat). Ezután megvizsgáltuk a kumulatív redundáns magas és közepes mutációk szintjét ezekben a génekben, és kifejeztük értékeiket az egyes fehérjehosszak jellemzőjeként, majd meghatároztuk a készlet átlagos értékeit. A 6. ábra rávilágít arra, hogy a virulenciát befolyásoló publikált gének statisztikailag szignifikánsan alacsonyabb gyakorisággal (p=0.007) mutatkoztak mutációval (polimorfizmussal), mint azoknál, amelyek funkcionálisan redundánsnak bizonyultak.
Kevés olyan tanulmány létezik, amelyek az élethez (esszenciális) gének meghatározását célozzák fonalas gombákban (az élesztőgombák kivételével), és az esszenciális gének adatbázisában (DEG) a mai napig csak egyetlen képviselő található, amely az Aspergillus fumigatus opportunista emberi kórokozóból származik. [56–58]. Kísérletileg azonosítottuk mind a 28 gén Z. tritici ortológját, amelyekről kimutattuk, hogy elengedhetetlenek az A. fumigatus életéhez, és ismét kiszámítottuk mindegyik szekvencia hosszához viszonyított relatív mutációs rátáját (7. további fájl, S5 táblázat). Ismét egyértelmű statisztikailag szignifikáns csökkenést (p{7}}.0148) találtunk a magas és közepes SNP mutációk gyakoriságában ezekben az esszenciális génekben, majd megfigyeltük azokat a géneket, amelyekről kiderült, hogy nem esszenciálisak sem a virulencia, sem az élet szempontjából ( 6. ábra). Ezzel szemben nem volt szignifikáns különbség (p=0.2128) a kísérletileg validált virulencia gének és az előre jelzett esszenciális gének mutációs rátája között (6. ábra). A jelen adatok együttesen alátámasztják azt az elképzelést, hogy a populációk aminosav-polimorfizmusainak szintje felhasználható a gének relatív fontosságának előrejelzésére a szervezet alapvető életmódjában.
6. ábra: Kísérletileg validált patogenitású és/vagy előre jelzett esszenciális gének elemzése a nem esszenciális géneknél alacsonyabb mutációs rátát mutat. Az átlagos magas és mérsékelt (H/M) mutációs ráták a fehérjehosszak (aa) jellemzőjeként kifejezve olyan génlisták esetében, amelyek korábban fehérjéket kódolnak; 1- kísérletileg megállapították, hogy semmilyen (vagy nagyon csekély) szerepet játszik a gomba virulenciájában; 2-kísérletileg elhatározták, hogy fontos szerepet játszanak a virulenciában és; 3-az előrejelzések szerint az Aspergillus fumigatusban kísérletileg jellemzett fehérjék ortológiája révén feltételezett, az élethez elengedhetetlen géneket kódolnak. A csillag (*) szimbólum statisztikailag szignifikáns különbséget jelez a mutációs ráták között a jelzett génkészletek között. A génlisták és a kapcsolódó polimorfizmus adatok a 6. kiegészítő fájlban: S4 táblázat láthatók
A kombinált prediktív megközelítés használhatóságát a kórokozó gyengeségének feltárására egy öt „mag” géndeléciós mutánson végzett genetikai komplementációs vizsgálatok támasztják alá.
A Z. tritici alkalmas a T-DNS véletlenszerű integrációján alapuló genetikai szűrések továbbítására az Agrobacterium által közvetített gombatranszformáción (AMT) keresztül. Korábbi munkánk egy Z. tritici T-DNS mutánst hozott létre, amely nem volt képes teljes betegséget okozni a fertőzött búzaleveleken (7A. ábra). Ez a mutáns, az úgynevezett 23-21 (a transzformáció 23. köre és a 21. szedett kolónia), normálisan vad típusként tudott növekedni tápanyagban gazdag agar táptalajon (YPD), de nem tudta kiterjeszteni a gombahifák összehasonlítható szintjét, ha egy talajon termesztették. tápanyagtól megfosztott tápközeg, beleértve a vizes agart (7A. ábra). A 23-21 teljes genom Illumina-alapú újraszekvenálását alkalmaztuk, hogy feltárjuk a potenciálisan kiváltó T-DNS beépülés helyét. Ez az elemzés egyetlen T-DNS-integrációt mutatott ki a 8. kromoszóma 899878. és 912699. pozíciója között, ami öt előre jelzett kódoló szekvencia delécióját/megszakítását okozza (7B. ábra). Az SNP és az indel analízis nem mutatott ki további címkézetlen mutációkat a 23-21 törzsben az IPO323 vad típusú genomszekvenciájához képest. A 23-21 T-DNS deléció hatékonyan eltávolított öt gént, amelyek mindegyike a maggenomban található, és a következő funkcionális (Interpro) előrejelzésekkel; gén 1=Citokróm P450; gén 2=S-adenozil-metionin-metiltranszferáz; gén 3=Cink (2) C6 típusú DNS-kötő fehérje; gén 4=Nukleozid-difoszfát kináz (NDK) és gén 5=glikozil-hidroláz 31 (7B. ábra). Megvizsgáltuk az egyes fehérjékben a magas és mérsékelt mutációk relatív számát a fehérje hosszának jellemzőjeként, amely feltárta, hogy a 4-es proteinben (NDK) sokkal kevesebb mutáció volt, amely befolyásolta az aminosavszekvencia változásait, mint a másik négy elemzett szekvenciában az izolált készletben. 7C és 2. kiegészítő fájl: S4 ábra). Ezután megvizsgáltuk mind az öt gén átlagos relatív expresszióját az összes vizsgált izolátumban. Azt is feltárta, hogy a 4. gén (amely az NDK-t kódolja) szignifikánsan erősebben expresszálódott, mint az összes többi jelölt (7D. ábra és 2. további fájl: S5. ábra). Feltételeztük tehát, hogy a legkevésbé polimorf és legmagasabban expresszálódó gén, a 4. gén, az NDK elvesztése felelős a virulencia elvesztéséért, és az ezzel összefüggő hiányosságokért a hifák kiterjesztésében. Ennek tesztelésére mind az öt jelölt gént külön-külön transzformáltuk vissza a 23-21 Z. tritici mutáns törzsbe, mindegyiket saját endogén promoter vezérli. Mindegyikből több transzformánst nyertünk, és újra teszteltük a virulenciát a búzaleveleken, valamint a fonalas hifák kiterjesztésének képességét vizes agaron. Ez azt mutatta, hogy az NDK gén önmagában történő újrabevezetése (4. gén) teljesen helyreállította mind a virulenciát, mind a hifális növekedést a vad típusú szintre (7E. ábra és 2. további fájl: S6. ábra). A másik négy jelölt mindegyikének újbóli bejuttatása nem okozott semmilyen változást az eredeti mutáns 23-21 törzs fenotípusában (7E. ábra). Annak biztosítására, hogy minden újra bevitt gén expresszálódjon a megfelelő komplementált törzsben, RT-PCR-t végeztünk mindegyik transzformánson és az eredeti 23-21 mutánson. Ez megerősítette az egyes transzkriptumok várható hiányát a 23-21 mutánsban, és megmutatta az egyes célgének megfelelő expresszióját a komplementált izolátumokban (7F. ábra). A Tus, az egyetlen gén újbóli bevezetése az öt jelölt közül a legkisebb populációs szintű polimorfizmussal és a legmagasabb relatív expresszióval helyreállította a hibás fenotípusokat ebben a búzapatogénben. Ez a kísérleti megfigyelés alátámasztja a pangenomika és a transzkriptomika kombinálásának hasznosságát a kulcsfontosságú funkcionális életjellemzők szempontjából potenciálisan fontos gének előrejelzésére.
7. ábra Az öt génből álló deléciós, nem patogén Z. tritici mutáns funkcionális komplementációs vizsgálatai alátámasztják a pangenom-eredetű mutációs ráta és expressziós szint elemzés együttes alkalmazását a fontos életstílus-gének előrejelzőjeként. A Z. tritici véletlenszerű T-DNS inszerciós mutáns "23-21" növekedési és fertőzési jellemzői. A törzs normálisan növekszik a gazdag tápanyagú agáron, de hibás a fonalas növekedésben a gyenge tápanyagú agaron, és súlyosan veszélyezteti a búzalevél betegséget okozó aktivitását. A méretarányok 1 cm-t képviselnek. B A(z) 23-21 törzs teljes genomjának újraszekvenálása egy 13 kb-os genomi régió T-DNS által közvetített delécióját tárja fel, amely megzavarja vagy törli öt előre jelzett gént a magpangenomból. C Megjeleníti az átlagos magas és közepes mutációs eseményeket a pangenomból származó egyes géneknél (1-5 jelöléssel) a kódolt fehérje hosszához (aa) viszonyítva.
Vita
A kombinált pangenomika és transzkriptomika fegyverként használható a gyorsan fejlődő kórokozók ellen
Pangenomics analyses have been performed on other fungi and yeasts including Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neoformans var. grubii, and Aspergillus fumigatus [10]. All four species are model organisms in eukaryotic genomics and the latter three can also cause human diseases. Recent pangenome analyses on each of these species revealed that > 80% of all genes detected were core and thus found in every strain [10]. Our current study, and those previously [27, 28], clearly highlight that Z. tritici has a larger (>az összes gén 40%-a) járulékos genom, mint ezeknél a fajoknál. Nem világos, hogy a Z. tritici és potenciálisan más növénypatogén gombák miért és hogyan tartanak fenn ilyen nagy járulékos komponenst. Például az IPO323-ban azonosított legkisebb nyolc kromoszóma nincs egyértelműen jelentős hatással a virulenciára vagy bármely más folyamatra, és jelenleg csak egy tanulmány utal arra, hogy a 14., 16., 18., 19. és 21. kromoszóma finom szerepet játszik a virulenciában. válogatott búzafajták [59]. Ennek ellenére ezeknek a kis kromoszómáknak a kombinációi megmaradnak a populációkban. Feltételezték, hogy olyan rekombinációs eseményeket biztosítanak, amelyek a gomba azon képességének hátterében, hogy gyorsan fejlődnek, hogy alkalmazkodjanak a környezeti terhelésekhez, potenciálisan kombinálva a transzponálható elemek nagy aktivitásával [60–62]. Hasonló eset érvelhet a nagy járulékos genom esetében is. Ezt támasztja alá a jelen tanulmányban említett két járulékos genomkomponens funkcionális jelentősége, az SDH C alegység paralógja és az AvrStb6, amelyek kulcsszerepet játszanak a külső környezet változó elemeivel való kölcsönhatásban (gombaölő szer alkalmazása és a megfelelő fajták). betegségrezisztencia gének) [25, 45]. Más biológiai folyamatokat is leírtak, amelyek szintén elveszhetnek az egyes Z. tritici izolátumokban egyértelmű alkalmassági hibák nélkül, beleértve a melanizáció (pigmentáció) szabályozását [63]. Vizsgálatunk rávilágított arra, hogy a járulékos, gyorsan fejlődő Z. tritici genom potenciálisan felhasználható ellene, ha ehelyett arra helyezzük a hangsúlyt, ami nem veszíthető el, vagy amelynek polimorfizmusa korlátozott. Ez a tanulmány arra törekedett, hogy ezt megtegye azáltal, hogy a maggéneket nemcsak minden izolátumban jelenlévőnek és működőképesnek tekinti, hanem minden izolátumban expresszálja is. Azt a megközelítést is alkalmaztuk, hogy megkíséreljük rangsorolni a génkészleteket a maggenomban az aminosavszekvencia variabilitás szintjei alapján. Természetesen vannak bizonyos figyelmeztetések az általunk alkalmazott módszerekkel kapcsolatban, különösen abban, hogy a redundáns (azonos típusú és pozíciójú) mutációkat nem lehet könnyen elválasztani hasonló számú mutációtól, amelyek az egyes izolátumok egyedi pozícióiban fordulhatnak elő (nem redundáns mutációk). Így módszerünk nem alkalmas a gyorsan fejlődő gének rangsorolására. Mindazonáltal a módszer lehetővé teszi, hogy könnyen azonosíthatóak legyenek a nem és alacsony variabilitással rendelkező gének az aminosav-változásokat befolyásoló polimorfizmusok alacsony aránya alapján. A megközelítés kimutatta, hogy a kísérletileg igazolt és előre megjósolt, az élethez elengedhetetlen gének vagy virulencia gének szignifikánsan kevesebb ilyen típusú polimorfizmust hordoztak az izolátumok között, mint azok, amelyek funkciói nélkülözhetetlenek ezekhez a folyamatokhoz. Végül kiterjesztettük ezt a megközelítést egy nukleozid-difoszfát kináz (NDK) új virulencia funkciójának azonosítására, amely a legkevesebb variációt mutatta az összes gén közül a 5-gén T-DNS deléciójában. Ezen eredmények alapján azt javasoljuk, hogy a pangenomikában azonosított maggének polimorfizmusának szintjei felhasználhatók legyenek a kódolt fehérjék fontos funkcióira következtetve, és ezáltal a gének a funkcionális elemzéshez prioritást állítsanak elő a növényvédelem és potenciálisan állategészségügy új célpontjainak azonosítása érdekében.
Új gyengeség a Z. tritici és a rokon kórokozók fertőzésbiológiájában?
Ez a tanulmány további specifikus betekintést nyújtott e fontos búzakórokozó fertőzésbiológiájába is. Először is, a mag- és a járulékos genomból kiválasztott 88 szekretált fehérje esetében nem találtak bizonyítékot a fő nekrotróf effektor aktivitások jelenlétére. Nem utasíthatjuk el annak lehetőségét, hogy nem a megfelelő fehérjéket választottuk ki, vagy hogy több effektor együtt tudott működni a növényi sejthalál előidézésében (ezt a hasonló expressziós profilok is sugallják). Ha ez utóbbi a helyzet, ez eltérne az egyedi nekrotróf effektorok egyértelmű jelentőségétől a rokon búzát fertőző gombákban, nevezetesen a Parastagonospora nodorum és a Pyrenophora fajokban [35]. Az is lehetséges, hogy az általunk tranziens FoMV rendszerből származó expressziós szintek alacsonyabbak, mint az olyan effektorokhoz szükségesek, amelyek felismerése kevésbé kifejezett, mint az SnToxAé. Mindazonáltal az itt bemutatott adatok nem támasztják alá azt az elképzelést, hogy a tünetekkel járó növekedésre és a növényi sejthalálra való átmenetet a fő (egyetlen) nekrotróf Z. tritici efectorok felismerése idézi elő. Ezért lehetséges, hogy ezeknek a fehérjéknek a tömeges termelése a tünetek megjelenésekor ehelyett a gombás hifák védelmét szolgálja a sejthalál és a növényi válasz nyilvánvaló hiperaktivációjától. Ezzel összhangban kimutatták, hogy az ebből és más gombákból kiválasztott effektorok képesek gátolni a növényi eredetű proteázokat, kitinázokat és más sejtfalat megtámadó enzimeket, amelyeket maguk is a növények indukálnak a védekezési reakciók során [46, 48, 64, 65 ]. Újabban kimutatták, hogy a gombás effektorok manipulálják és átalakítják a mikro- és mikrobiomákat [66, 67].
A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert
Az NDK virulenciában játszott kulcsszerepének azonosítása azonban jelentős. Ezeket a fehérjéket különböző prokarióta és eukarióta szervezetekből származó számos funkciónak tulajdonították. A gombák esetében egy jelentés szerint szerepet tulajdonítanak a növényi immunitás modulálásában [68], míg egy másik fajnál (A. fumigatus) az élethez elengedhetetlen funkciót mutattak ki [69]. Azonban ezeknek a fehérjéknek az elsődleges és konzervált funkciója a nukleozid-difoszfátok foszforilezése, általában ATP-t használva szubsztrátként, hogy más nukleozid-trifoszfátokat (NTP-k) állítsanak elő, amelyek a különböző sejtfolyamatok előmozdításához szükségesek [70, 71]. Ez különösen akkor fontos, ha a korlátozott erőforrások megnehezítenek bizonyos NTP-k más eszközökkel történő létrehozását. Tus, az NDK-k kulcsfontosságú mentési útvonal-tevékenységet jelentenek az NTP-k regenerációjában, amelyek valószínűleg akkor fontosak, ha az extracelluláris erőforrások korlátozottak. A közelmúltban a Z. tritici egyéb génfunkciós vizsgálataiból számos más mentési útvonal, és különösen a bioszintetikus útvonalak fontos szerepe derült ki. Például a lizin bioszintézise nélkülözhetetlen a fertőzéshez és a hifák növekedéséhez rossz tápanyagokon [72], csakúgy, mint a purin bioszintézise [73]. Ezek a funkciók redundánsak a teljes táptalajokon történő növekedéshez. A levélfelszíni kolonizáció nagyon korai szakaszára vonatkozó korábbi átírási adatok azt mutatták, hogy a gomba tápanyaghiányos környezetben van, és az intracelluláris készletek hasznosításától függ [33]. A korábbi funkcionális vizsgálatokkal és az NDK kulcsszerepével együtt egyértelmű, hogy a Z. tritici rendkívül sebezhető a kulcsfontosságú bioszintetikus és mentési útvonalak gátlásával szemben, amikor a levél felszínén van a korai kolonizáció során, és potenciálisan a fertőzés indukciójáig. 7-10 nappal később növényi sejthalál. Így új növényvédő szerek vagy stratégiák irányulhatnak ezeknek a folyamatoknak a gátlására, amelyek gyengeséget jelenthetnek a Z. tritici esetében, és potenciálisan sok más hasonló fertőzési móddal rendelkező rokon gomba esetében.
Következtetések
Ez a tanulmány kezdeti támogatást nyújt a pangenomika és a transzkriptomika kombinált használatához olyan gének meghatározásához, amelyek a gyorsan fejlődő kórokozók alapvető és potenciálisan kihasználható gyengeségeit képviselik. Elvileg azonban a megközelítések alkalmazhatók génprioritás meghatározására bármely biológiai rendszerben, ahol több genom és transzkriptom áll rendelkezésre. Arra számítunk, hogy ezek a megközelítések sokféle biológiai rendszerben előmozdíthatják az alapvető biológiai folyamatok felfedezését.
Hivatkozások
1. Fisher MC, Hawkins NJ, Sanglard D, Gurr SJ. A gombaellenes gyógyszerekkel szembeni rezisztencia világszerte kialakuló megjelenése kihívást jelent az emberi egészség és az élelmezésbiztonság szempontjából. Tudomány. 2018;360. https://doi.org/10.1126/science.aap7999.
2. Fisher MC, Henk DA, Briggs CJ, Brownstein JS, Madoff LC, McCraw SL és mások. Az állatok, növények és ökoszisztémák egészségét fenyegető új gombás veszélyek. Természet. 2012;484. https://doi.org/10.1038/nature10947.
3. Lucas JA, Hawkins NJ, Fraaije BA. A gombaölő szer rezisztencia kialakulása. Adv Appl Microbiol. 2015;90. https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2014.09.001.
4. Heitman J. Szexuális szaporodás és a mikrobiális kórokozók evolúciója. Curr Biol. 2006;16. https://doi.org/10.1016/j.cub.2006.07.064.
5. Dong S, Raffaele S, Kamoun S. A fonalas kórokozók kétsebességű genomja: keringő növényekkel. Curr Opin Genet Dev. 2015;35:57–65. https://doi.org/10.1016/J.GDE.2015.09.001.
6. Tettelin H, Masignani V, Cieslewicz MJ, Donati C, Medini D, Ward NL és mások. A Streptococcus aga-lactiae több patogén izolátumának genomelemzése: következmények a mikrobiális „pángenomra”. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102. https://doi.org/10.1073/pnas.0506758102.
7. Lefébure T, Stanhope MJ. A strep-coccus magjának és pángenomjának evolúciója: pozitív szelekció, rekombináció és genom összetétele. Genome Biol. 2007;8. https://doi.org/10.1186/gb-2007-8-5-r71.
8. Tian CF, Zhou YJ, Zhang YM, Li QQ, Zhang YZ, Li DF és mások. A rhizobia göbös szójabab összehasonlító genomikája azt sugallja, hogy az adaptációk során a származási specifikus gének kiterjedt toborzása lehetséges. Proc Natl Acad Sci US A. 2012;109. https://doi.org/10.1073/pnas.1120436109.
9. Syme RA, Tan KC, Rybak K, Friesen TL, McDonald BA, Oliver RP és mások. Panparastagonospora összehasonlító genomelemzés-effektor előrejelzés és genom evolúció. Genome Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy192.
10. McCarthy CGP, Fitzpatrick DA. Modell gombafajok pángenom elemzése. Microb. Genomika. 2019;5. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000243.
11. Yang X, Li Y, Zang J, Li Y, Bie P, Lu Y és mások. A pángenom elemzése a Brucella spp. maggénjeinek és esszenciális génjeinek azonosítására. Mol Gen Genomics. 2016;291. https://doi.org/10.1007/s00438-015-1154-z.
12. Barber AE, Sae-Ong T, Kang K, Seelbinder B, Li J, Walther G és munkatársai. Az Aspergillus-lus fumigatus pan-genom elemzése azonosítja az emberi fertőzéshez kapcsolódó genetikai változatokat. Nat Microbiol. 2021;6. https://doi.org/10.1038/ s41564-021-00993-x.
13. Zhang X, Liu B, Zou F, Shen D, Yin Z, Wang R és mások. A teljes genom újraszekvenálása feltárja a Phytophthora sojae természetes variációját és adaptív evolúcióját. Front Microbiol. 2019;10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019. 02792.
14. Torriani SFF, Melichar JPE, Mills C, Pain N, Sierotzki H, Courbot M. Zymoseptoria tritici: a búzatermelés fő veszélye, az ellenőrzés integrált megközelítései. Fungal Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.010.
15. Zhan J, Mundt CC, McDonald BA. A bevándorlás és az ivaros szaporodás mérése a Mycosphaerella graminicola szántóföldi populációiban. Fito-patológia. 1998;88. https://doi.org/10.1094/PHYTO.1998.88.12.1330.
16. Zhan J, Kema GHJ, Waalwijk C, McDonald BA. A Mycosphaerella graminicola búza kórokozójának párosodási típusú alléljainak megoszlása a lézióktól a kontinensekig terjedő térbeli skálákon. Fungal Genet Biol. 2002;36. https://doi. org/10.1016/S1087-1845(02)00013-0.
17. Stukenbrock EH, Banke S, Java-Nikkhah M, McDonald BA. A Mycosphaerella graminicola gombás búza kórokozó eredete és háziasítása szimpatrikus specifikációval. Mol Biol Evol. 2007;24. https://doi.org/10. 1016/S1087-1845(02)00013-0.
18. Linde CC, Zhan J, McDonald BA. A Mycosphaere-lla graminicola populációszerkezete: a lézióktól a kontinensekig. Fitopatológia. 2002;92. https://doi.org/10.1094/PHYTO.2002.92.9.946.
19. Croll D, McDonald BA. A patogén gombákhoz való lokális alkalmazkodás genetikai alapja mezőgazdasági ökoszisztémákban. Mol Ecol. 2017;26. https://doi.org/ 10.1111/mec.13870.
20. Croll D, Lendenmann MH, Stewart E, McDonald BA. A rekombinációs hotspotok hatása egy gombás növényi kórokozó genom evolúciójára. Genetika. 2015;201. https://doi.org/10.1534/genetics.115.180968.
21. Dutta A, Croll D, McDonald BA, Barrett LG. A virulencia és a szaporodás változásának fenntartása mezőgazdasági növényi kórokozó populációiban. Evol Appl. 2021;14. https://doi.org/10.1111/eva.13117.
22. Feurtey A, Stevens DM, Stephan W, Stukenbrock EH, Stajich J. Az interspecifikus géncsere magas genetikai variabilitást mutat be a crop patogénben. Genome Biol Evol. 2019;11. https://doi.org/10.1093/gbe/evz224.
23. Hartmann FE, Sánchez-Vallet A, McDonald BA, Croll D. A gombás búza kórokozója kiterjedt kromoszómális átrendeződésekkel evolved host specialization. ISME J. 2017;11. https://doi.org/10.1038/ismej.2016.196.
24. Fouché S, Plissonneau C, McDonald BA, Croll D. A meiosis a búza Zymoseptoria tritici kórokozója járulékos kromoszómájának átható másolatszám-variációjához és torz öröklődéséhez vezet. Genome Biol Evol. 2018;10. https://doi.org/10.1093/gbe/evy100.
25. Stephens C, Ölmez F, Blyth H, McDonald M, Bansal A, Burcu Turgay E, et al. Figyelemreméltó közelmúltbeli változások az AvrStb6 avirulenciagén genetikai sokféleségében a Zymoseptoria tritici búzapatogén globális populációiban. Mol Plant Pathol. 2021. https://doi.org/10.1111/mpp.13101.
26. Goodwin SB, M'Barek S, Dhillon B, Wittenberg AHJ, Crane CF, Hane JK és társai. A Mycosphaerella graminicola gombás búza kórokozó kész genomja feltárja az adagolás szerkezetét, a kromoszóma plaszticitását és a lopakodó patogenezist. PLoS Genet. 2011;7. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002070.
27. Badet T, Oggenfuss U, Abraham L, McDonald BA, Croll D. A 19-referenciaminőségű globális pangenom izolálása a Zymoseptoria tritici gombás búzapatogén számára. BMC Biol. 2020;18. https://doi.org/10.1186/ s12915-020-0744-3.
28. Plissonneau C, Hartmann FE, Croll D. A Zymoseptoria tritici búza kórokozójának Pangenome elemzései egy erősen képlékeny eukarióta genom szerkezeti alapjait tárják fel. BMC Biol. 2018;16. https://doi.org/10.1186/ s12915-017-0457-4.
29. Wittenberg AHJ, van der Lee TAJ, M'Barek SB, Ware SB, Goodwin SB, Kilian A és mások. A meiózis rendkívüli genomplaszticitást eredményez a Mycosphaerella graminicola haploid gombás növényi kórokozóban. PLoS One. 2009;4. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005863.
30. Steinberg G. A Zymoseptoria tritici sejtbiológiája: patogén sejtszerveződés és búzafertőzés. Fungal Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10. 1016/j.fgb.2015.04.002.
31. Kema GHJ, Yu DZ, Rijkenberg FHJ, Shaw MW, Baayen RP. A Mycosphaerella graminicola patogenezisének szövettana búzában. Fitopatológia. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-777.
32. Rudd JJ, Kanyuka K, Hassani-Pak K, Derbyshire M, Andongabo A, Devon-Shire J és mások. A búzán a Zymoseptoria tritici fertőzési ciklusának transzkriptum- és metabolitprofilja kétfázisú kölcsönhatást tár fel a növényi immunitással, amely magában foglalja a különböző patogén kromoszómális hozzájárulásokat és a hemibiotróf életmód-definíció eltérését. Plant Physiol. 2015;167. https://doi.org/10.1104/pp.114.255927.
33. Keon J, Antoniw J, Carzaniga R, Deller S, Ward JL, Baker JM és mások. A Mycosphaerella graminicola transzkripciós adaptációja érzékeny búzagazdaszervezetének programozott sejthalálához (PCD). Mol Plant-Microbe Interact. 2007;20. https://doi.org/10.1094/MPMI-20-2-0178.
34. Rudd JJ, Keon J, Hammond-Kosack KE. A búza mitogén által aktivált TaMPK3 és TaMPK6 protein kinázok több szinten eltérően szabályozottak a Mycosphaerella graminicolával való kompatibilis betegségkölcsönhatások során. Plant Physiol. 2008;147. https://doi.org/10.1104/pp.108. 119511.
35. Friesen TL, Faris JD. Az effektor-cél kölcsönhatások jellemzése nekrotróf patorendszerekben feltárja a gazdamanipuláció tendenciáit és variációit. Annu Rev Phytopathol. 2021;59. https://doi.org/10.1146/annur ev-phyto-120320-012807.
36. Friesen TL, Faris JD, Solomon PS, Oliver RP. Gazdaspecifikus toxinok: a nekrotróf patogenitás effektorai. Cell Microbiol. 2008;10. https://doi.org/10. 1111/j.{6}}.2008.01153.x.
37. Ben M'Barek S, Cordewener JHG, Tabib Ghafary SM, van der Lee TAJ, Liu Z, Mirzadi Gohari A és mások. Az FPLC és a folyadékkromatográfiás tömegspektrometria a Zymoseptoria tritici gombás búzapatogén tenyészet szűrletéből azonosítja a nekrózist kiváltó fehérjéket. Fungal Genet Biol. 2015;79. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2015.03.015.
38. Wyka S, Mondo S, Liu M, Nalam V, Broders K. A nagy járulékos genom és a magas rekombinációs ráta befolyásolhatja a Claviceps purpurea gombás növénypatogén globális elterjedését és széles gazdakörét. PLoS One. 2022;17. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
39. Moolhuijzen PM, lásd PT, Shi G, Powell HR, Cockram J, Jørgensen LN, et al. Globális pangenom a Pyrenophora triticirepentis búza gombás patogén számára és az efector fehérje szerkezeti homológiájának előrejelzése. Microb. Genomika. 2022;8. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0263496.
40. Kema GHJ, Sayoud R, Annone JG, Van Silfhout CH. A virulencia és rezisztencia genetikai variációja a búza-Mycosphaerella graminicola útrendszerben II. A kórokozóizolátumok és a gazdafajták közötti kölcsönhatások elemzése. Fitopatológia. 1996;86. https://doi.org/10.1094/Phyto-86-213.
41. Kema GHJ, Annone JG, Sayoud R., Van Silfhout CH, Van Ginkel M, De Bree J. Genetic variation for virulence and resistance in the wheat Mycosphaerella graminicola pathosystem I. Interactions between pathogen izolates and host cultivars. Fitopatológia. 1996;86. https://doi.org/ 10.1094/Phyto-86-200.
42. Zhan J, Pettway RE, McDonald BA. A Mycosphaerella graminicola búza kórokozójának globális genetikai szerkezetét nagy nukleáris diverzitás, alacsony mitokondriális diverzitás, szabályos rekombináció és génáramlás jellemzi. Fungal Genet Biol. 2003;38. https://doi.org/10.1016/S1087- 1845(02)00538-8.
43. Palma-Guerrero J, Torriani SFF, Zala M, Carter D, Courbot M, Rudd JJ és mások. A Zymoseptoria tritici törzsek összehasonlító transzkriptomikai analízise összetett életmódbeli átmeneteket és a transzkripciós profilok intraspecifikus variabilitását mutatja. Mol. Plant Pathol. 2016;17. https://doi.org/10.1111/mpp.12333.
44. Kellner R, Bhattacharyya A, Poppe S, Hsu TY, Brem RB, Stukenbrock EH. A Zymoseptoria tritici búzapatogén expressziós profilja a transzkripció genomiális mintázatait és a gazdaspecifikus szabályozó programokat tárja fel. Genome Biol Evol. 2014;6. https://doi.org/10.1093/gbe/evu101.
45. Steinhauer D, Salat M, Frey R, Mosbach A, Luksch T, Balmer D és mások. A szukcinát-dehidrogenáz C alegység nélkülözhetetlen paralógja állandó rezisztenciát közvetít az SDHI gombaölő szerek egy alosztályával szemben a Zymoseptoria triticiben. PLoS Pathog. 2019;15. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1007780.
46. Marshall R, Kombrink A, Motteram J, Loza-Reyes E, Lucas J, Hammond Kosack KE és társai. A Mycosphaerella graminicola gombából származó két növényben expresszált LysM efector homológ elemzése új funkcionális tulajdonságokat és a búza virulenciájához való eltérő hozzájárulást tár fel. Plant Physiol. 2011;156. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
47. Lee WS, Rudd JJ, Hammond-Kosack KE, Kanyuka K. Mycosphaerella graminicola list efector-mediált lopakodó patogenezis felforgatja a felismerést mind a cerk1, mind a cebip homológokon keresztül búzában. Mol Plant-Microbe Interact. 2014;27. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
48. Tian H, MacKenzie CI, Rodriguez-Moreno L, van den Berg GCM, Chen H, Rudd JJ és társai. A Zymoseptoria tritici három LysM efektora együttesen hatástalanítja a kitin által kiváltott növényi immunitást. Mol Plant Pathol. 2021;22. https://doi.org/10.1104/pp.111.176347.
49. Zhong Z, Marcel TC, Hartmann FE, Ma X, Plissonneau C, Zala M, et al. A Zymoseptoria tritici egy kis szekretált fehérje felelős az Stb6 rezisztencia gént hordozó búzafajták avirulenciájáért. Új Phytol. 2017;214. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
50. Kema GHJ, Mirzadi Gohari A, Aouini L, Gibriel HAY, Ware SB, Van Den Bosch F és mások. A stressz és a szexuális szaporodás befolyásolja az AvrStb6 hőpatogén effektor és a strobilurin rezisztencia dinamikáját. Nat Genet. 2018;50. https://doi.org/10.1111/nph.14434.
51. Saintenac C, Lee WS, Cambon F, Rudd JJ, King RC, Marande W és mások. A búzareceptor-kináz-szerű Stb6 fehérje szabályozza a génről génre rezisztenciát a Zymoseptoria tritici gombás patogénnel szemben. Nat Genet. 2018;50. https://doi.org/ 10.1038/s41588-018-0051-x.
52. Tan KC, Oliver RP, Solomon PS, Mofat CS. A fehérjeszerű nekrotróf effektorok a gomba virulenciájában. Funct Plant Biol. 2010;37. https://doi.org/10. 1071/FP10067.
53. Bouton C, King RC, Chen H, Azhakanandam K, Bieri S, Hammond-Kosack KE és társai. Foxtail mozaikvírus: vírusvektor a fehérje expressziójához gabonafélékben. Plant Physiol. 2018;177. https://doi.org/10.1104/pp.17.01679.
54. Motteram J, Küfner I, Deller S, Brunner F, Hammond-Kosack KE, Nürnberger T és társai. Az egyetlen NPP1 domént tartalmazó MgNLP molekuláris jellemzése és funkcionális analízise a gombás búzalevél-kórokozó mycosphaerella graminicola fajból. Mol Plant-Microbe Interact. 2009;22. https://doi.org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
55. Faris JD, Zhang Z, Lu H, Lu S, Reddy L, Cloutier S és mások. Egy egyedülálló búzabetegség-rezisztencia-szerű gén szabályozza az effektor által kiváltott érzékenységet a nekrotróf kórokozókkal szemben. Proc Natl Acad Sci US A. 2010;107. https://doi. org/10.1094/MPMI-22-7-0790.
56. Lu Y, Deng J, Rhodes JC, Lu H, Lu LJ. Lényeges gének előrejelzése az Aspergillus fumigatus potenciális gyógyszercélpontjainak azonosításához. Comput Biol Chem. 2014;50. https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem.2014.01.011.
57. Osmani AH, Oakley BR, Osmani SA. Esszenciális Aspergillus nidulans gének azonosítása és elemzése heterokaryon mentési technikával. Nat Protoc. 2006;1. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.406.
58. Hu W, Sillaots S, Lemieux S, Davison J, Kaufman S, Breton A et al. Lényeges génazonosítás és a gyógyszercél prioritása az Aspergillus fumigatusban. PLoS Pathog. 2007;3. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 0030024.
59. Habig M, Quade J, Stukenbrock EH. A továbbfejlesztett genetikai megközelítés feltárja a járulékos kromoszómák gazdaszervezet genotípus-függő jelentőségét a Zymoseptoria tritici gombás búzapatogénben. MBio. 2017;8. https://doi. org/10.1128/mBio.{6}}.
60. Fouché S, Badet T, Oggenfuss U, Plissonneau C, Francisco CS, Croll D. Stresszvezérelt transzponálható elemek de-repressziós dinamikája és virulencia evolúciója gombás kórokozóban. Mol Biol Evol. 2020;37. https://doi. org/10.1093/molbev/msz216.
61. Möller M, Habig M, Freitag M, Stukenbrock EH. Rendkívüli genom-instabilitás és széles körben elterjedt kromoszóma-átrendeződések a vegetatív növekedés során. Genetika. 2018;210. https://doi.org/10.1534/genetics.118.301050.
62. Bertazzoni S, Williams AH, Jones DA, Syme RA, Tan KC, Hane JK. Kiegészítők teszik a ruhát: kiegészítő kromoszómák és egyéb nélkülözhetetlen DNS-régiók a növénypatogén gombákban. Mol Plant-Microbe Interact. 2018;31. https://doi.org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
63. Krishnan P, Meile L, Plissonneau C, Ma X, Hartmann FE, Croll D és mások. A transzponálható eleminszerciók alakítják a génszabályozást és a melanintermelést a búza gombás kórokozójában. BMC Biol. 2018;16. https://doi. org/10.1094/mpmi-06-17-0135-f.
64. Sánchez-Vallet A, Tian H, Rodriguez-Moreno L, Valkenburg DJ, Saleem Batcha R, Wawra S és mások. A szekretált LysM efector védi a gomba hifákat a kitin-függő homodimer polimerizáció révén. PLoS Pathog. 2020;16. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008652.
65. Breen S, Williams SJ, Winterberg B, Kobe B, Solomon PS. A búza PR-1 fehérjéket a nekrotróf patogén effektor fehérjék célozzák. Plant J. 2016;88. https://doi.org/10.1111/tpj.13228.
66. Snelders NC, Petti GC, van den Berg GCM, Seidl MF, Thomma BPHJ. Egy ősi antimikrobiális fehérje, amelyet egy gombás növényi kórokozó társított a planta mycobiome manipulálására. Proc Natl Acad Sci US A. 2021;118. https://doi.org/10.1073/pnas.2110968118.
67. Snelders NC, Rovenich H, Petti GC, Rocafort M, van den Berg GCM, Vorholt JA és társai. Mikrobióma manipuláció talajban terjedő gombás növényi kórokozóval effektor fehérjék felhasználásával. Nat Plants. 2020. https://doi.org/10. 1038/s41477-020-00799-5.
68. Rocha RO, Wilson RA. A Magnaporthe oryzae nukleozid-difoszfát kináz szükséges a metabolikus homeosztázishoz és a redox által közvetített gazdaszervezet veleszületett immunitásának elnyomásához. Mol Microbiol. 2020;114. https://doi.org/ 10.1111/mmi.14580