A QPCR és az RNA-seq összehasonlítása feltárja a HLA expresszió számszerűsítésének kihívásait 1. rész

Absztrakt

A humán leukocita antigén (HLA) I. és II. osztályú lókuszai a veleszületett és szerzett immunitás alapvető elemei. Funkcióik közé tartozik az antigénprezentáció a T-sejteknek, ami celluláris és humorális immunválaszokhoz vezet, valamint az NK-sejtek modulálása. A betegség kimenetelére gyakorolt ​​kivételes hatásukat a genomszintű asszociációs vizsgálatok világossá tették. A peptidkötő barázdát kódoló exonok képezték a fő hangsúlyt a HLA betegségérzékenységre/patogenezisre gyakorolt ​​hatásának meghatározásában. A HLA expressziós szintjei azonban szerepet játszanak a betegség kimenetelében is, ami újabb dimenziót ad a HLA rendkívüli sokféleségéhez, amely befolyásolja az immunválaszok változékonyságát az egyének között.

Szoros kapcsolat van a leukocita antigének és az immunitás között. A leukocita antigén az emberi fehérvérsejtek felszínén lévő molekulára utal, amely képes azonosítani és megkülönböztetni a különböző sejttípusokat és kórokozókat. Az emberi immunrendszer fontos része és az immunválasz fontos szabályozója.

A leukocita antigének különbségei eltérő immunválaszokat és betegségekre való érzékenységet eredményezhetnek. Például bizonyos leukocita antigének autoimmun betegségekhez, fertőző betegségekhez és daganatokhoz kapcsolódnak. Egyes leukocita antigének expressziója összefügg az immunsejtek működésével és mennyiségével is.

Ezért az egyén leukocita felszínének molekuláris jellemzőinek megértése nagy jelentőséggel bír az egyén immunállapotának, valamint a betegség kockázatának és prognózisának megítélésében. Ugyanakkor elősegíti a személyre szabott kezelési és megelőző intézkedések megfogalmazását is. Ebből a szempontból javítanunk kell az immunitást. A Cistanche jelentős hatással van az immunitás javítására. A Cistanche gazdag különféle antioxidáns anyagokban, például C-vitaminban és karotinoidokban. Ezek az összetevők megkötik a szabad gyököket, csökkentik az oxidatív stresszt és javítják az immunrendszer ellenálló képességét.

Click cistanche tubulosa kivonat por

A HLA expressziójának becsléséhez az immunogenetikai vizsgálatok hagyományosan kvantitatív PCR-re (qPCR) támaszkodnak. Az alternatív nagy áteresztőképességű technológiák, például az RNA-seq elfogadását technikai problémák hátráltatják a HLA gének extrém polimorfizmusa miatt. A közelmúltban azonban számos bioinformatikai módszert fejlesztettek ki a HLA expresszió pontos becslésére az RNS-seq adatokból. Ez izgalmas lehetőséget nyit a HLA-expresszió számszerűsítésére nagy adathalmazokban, de kérdéseket vet fel azzal kapcsolatban is, hogy az RNS-seq eredmények összehasonlíthatók-e a qPCR eredményeivel. Ebben a tanulmányban a HLA I. osztályú gének expressziós adatainak három osztályát elemezzük egy egyedek egyező csoportjára vonatkozóan: (a) RNS-seq, (b) qPCR és (c) sejtfelszíni HLA-C expresszió. Mérsékelt korrelációt figyeltünk meg a qPCR és az RNS-seq expressziós becslései között a HLA-A, -B és -C esetében ({{10}}.2 Kisebb vagy egyenlő, mint rho Kisebb vagy egyenlő, mint 0,53 ). Megbeszéljük azokat a technikai és biológiai tényezőket, amelyeket figyelembe kell venni a különböző molekuláris fenotípusok kvantifikációinak összehasonlításakor vagy különböző technikák alkalmazásakor.

Kulcsszavak

HLA · Expresszió · PCR · RNS-szekv.

Bevezetés

A génexpresszió olyan molekuláris fenotípust biztosít, amely a genetikai variáció és az összetett fenotípusok, például a betegség állapota között egy köztes helyen található. A génexpresszió genetikai alapjainak megértése stratégiai fontosságú lehet a genetikai variáció és a komplex fenotípusok közötti kapcsolatok megteremtésében (GTEx Consortium 2013; Lappalainen et al. 2013), beleértve az autoimmun és fertőző betegségekre való fogékonyságot. Bár a humán leukocita antigén (HLA) lókuszokban és általában a fő hisztokompatibilitási komplexum (MHC) régión belüli genetikai variáció tanulmányozását számos összetett betegség genetikai alapjainak boncolására használták (Trowsdale és Knight 2013; Dendrou et al. 2018), a molekuláris fenotípusok, különösen a génexpresszióval kapcsolatos fenotípusok felvétele viszonylag új keletű (Apps és mtsai 2015; Vince és mtsai 2016; Ramsuran és mtsai 2018; Johansson és mtsai 2022).

A 6p21 kromoszómán található humán MHC-régió nagy génsűrűséget mutat, egyedi kapcsolati egyensúlyhiány (LD) mintázattal és extrém polimorfizmussal (de Bakker et al. 2006; Radwan et al. 2020). Az MHC régió tartalmazza a HLA I. és II. osztályú lókuszokat, amelyek az immunválasz kiváltásában és modulálásában részt vevő molekulákat kódolnak. A HLA I. osztályú molekulákat a legtöbb sejtmaggal rendelkező sejt expresszálja, és általában intracelluláris peptideket mutatnak be a CD8 plusz T-sejteknek. Ezzel szemben a HLA II. osztályú molekulákat elsősorban professzionális antigénprezentáló sejtek expresszálják, és a CD4 plusz T-sejtek számára exogén antigéneket mutatnak be, amelyeket endocitózissal internalizáltak. Az I. osztályba tartozó molekulákat a természetes gyilkos (NK) sejtek receptorai, a gyilkossejtes immunglobulin-szerű receptorok (KIR-ek) is felismerik, amelyek mind az NK-sejtek képzését, mind aktiválását befolyásolják (Colonna és Samaridis 1995; Goodson-Gregg et al. 2020). A különböző HLA I. osztályú allotípusok és specifikus KIR-molekulák párosítása befolyásolja az NK-sejtek (és a CD8 plusz T-sejt egy részhalmazának) aktivitását, ami eltérő kockázatot eredményez a rák, a fertőző betegségek és az autoimmunitás tekintetében (áttekintve: Kulkarni et al. 2008).

A HLA-betegség asszociációit elsősorban az antigénprezentáció allél-specifikus különbségeinek tulajdonítják, a peptidkötő barázdában lévő kiterjedt polimorfizmusok miatt. A HLA expressziós szintjei azonban hozzájárulnak a HLA polimorfizmusok és a betegség kimenetelei között megfigyelt egyes összefüggésekhez. A HLA expressziós szintje az autoimmunitás és a rákkal és fertőzésekkel szembeni HLA által közvetített immunválasz erősségének fontos módosítója (René et al. 2016).

Számos példa van a HLA expressziós szintjei és a vírusfertőzés kimenetelének összefüggéseire. Jól dokumentált például, hogy a magasabb HLA-C expressziós szintek mind az mRNS-szinten, mind a sejtfelszíni fehérjeszinten a HIV-1 jobb kontrollálásával járnak együtt (Thomas et al. 2009; Kulkarni et al. munkatársai 2011; Apps és mtsai 2013; Parolini és mtsai 2018; Bachtel és mtsai 2018), míg az emelkedett HLA-A expresszió a HIV-kontroll károsodásához kapcsolódik (Ramsuran és mtsai. 2018). A SARS-CoV-2 fertőzés leszabályozza a HLA-C génexpressziót (Loi et al. 2022) és a HLA I. osztályú expressziót a sejtfelszínen (Zhang et al. 2021; Arshad et al. 2023), valamint a HLA osztályt II génexpresszió, beleértve a HLA-DPA1-et, -DPB1-et, -DRA-t és -DRB1-et (Wilk et al. 2020).

Ezenkívül összefüggés van a HLA-DPA1 (Ou et al. 2019) és a HLA-DPB1 (Thomas és mtsai. 2012; Ou és mtsai. 2021) expressziós szintjei között a HBV clearance-szel; HLA-DRA expresszió a denevér-influenza A vírusok fertőzésére való érzékenységgel humán sejtvonalakban (Karakus et al. 2019); és kiterjedt összefüggések a szabályozó variánsok és a HLA II. osztályú gének expressziós szintjei között, beleértve a HLA-DQA1, -DQB1, -DQB2, -DRB1 és -DRB5 géneket, a többszörösen elterjedt vírusok elleni antitestválaszsal (Kachuri et al. 2020).

A HLA lókuszok expressziós szintje szintén összefüggésbe hozható az autoimmunitással (lásd Johansson és mtsai, 2022). A sejtfelszíni HLA-C expressziós szinteket (Apps és mtsai 2013; Kulkarni és mtsai 2013), valamint a sejtfelszínen és a plazmában (da Costa Ferreira és mtsai, 2021) a HLA-G szinteket is összefüggésbe hozták. gyulladásos bélbetegség kockázatával. Fokozott HLA-B27 expressziót figyeltek meg a sejtfelszínen spondylitis ankylopoetica betegeknél (Cauli et al. 2002), csakúgy, mint a Graves-kórban szenvedő betegeknél az általános HLA I osztályú expressziót (Weider et al. 2021). A HLA II. osztályú expressziós szintje szintén befolyásolja az autoimmun állapotok kockázatát.

A HLA-DQA1 és -DRB1 gén expressziója, valamint a DQ és DR molekulák expressziója a sejtfelszínen fokozódik vitiligo betegek perifériás vér monocitáiban (Cavalli et al. 2016); a magasabb HLA-DQA1, -DQB1 és -DRB1 génexpresszióval, valamint a sejtfelszínen a DQ és DR expresszióval kapcsolatos szabályozó variánsok a szisztémás lupus erythematosus kockázatával járnak együtt (Raj et al. 2016); A HLA-DRB5 génexpresszió magasabb az intersticiális tüdőbetegségben szenvedő sclerodermás betegeknél (Odani és mtsai 2012); a specifikus HLA-DRB1 allélok erősen expresszálódnak rheumatoid arthritises betegekben (Houtman et al. 2021); és a DRB1*15:01 magasabb expressziója a sclerosis multiplex kockázatával jár (Alcina et al. 2012). Ezért az egyének közötti HLA-expresszió változásának és a HLA-expressziós szintet szabályozó mechanizmusoknak a megértése kulcsfontosságú lesz a betegségek fenotípusainak genetikai alapjainak feltárásához.

Hagyományosan a HLA expresszióját antitest-alapú technikákkal becsülték meg a sejtfelszíni expressziós szint meghatározására (Thomas és mtsai 2012; Apps és mtsai 2013), vagy kvantitatív PCR-rel (qPCR vagy RT-PCR) az mRNS transzkripciós szintjeit (Bettens et al. társai, 2014; Ramsuran et al., 2015, 2017). Kihívást jelent a vizsgálatok eredményeinek összehasonlítása, vagy akár különböző HLA-lókuszok összehasonlítása ugyanazon a vizsgálaton belül, mivel minden egyes elemzéshez és minden HLA-lókuszhoz különböző kísérleti eljárásokat alkalmaznak, ami eltérő amplifikációs hatékonyságot eredményezhet a qPCR-ben vagy antitest-affinitásokat az áramlási citometriában.

A nagy áteresztőképességű technológiák, mint például az RNA-seq, expressziós becsléseket biztosítanak a genomban lévő összes génre, beleértve a HLA-géneket is, így lehetővé teszik a HLA-expresszió értékelését az egész genomra kiterjedő kontextusban. Ezek a technológiák azonban számos kihívást jelentenek a HLA gének expressziós szintjének becslésére. Az RNS-seq vizsgálatokkal kapcsolatos, jól dokumentált torzításokon túlmenően (pl. kötegelt hatások, könyvtár-előkészítés, GC-tartalom ('t Hoen et al. 2013), a HLA-gének expressziós szintjének becslésének nehézsége abból fakad, hogy a mennyiségi meghatározás magában foglalja a rövid leolvasások egy referencia genomhoz való igazítását, amely nem adja meg a HLA alléldiverzitásának teljes reprezentációját.

Emiatt előfordulhat, hogy egyes leolvasások nem illeszkednek egymáshoz a referenciagenomot érintő nagyszámú különbség miatt (Brandt et al. 2015). Ezenkívül a HLA-gének egy géncsalád részét képezik, amely egymást követő duplikációk után alakult ki, és gyakran tartalmaznak olyan szegmenseket, amelyek nagyon hasonlóak a paralógok között, ami a gének közötti kereszt-illesztést és az expressziós szintek elfogult mennyiségi meghatározását eredményezi. Ezek a nehézségek motiválták olyan számítási folyamatok kifejlesztését (lásd Johansson és mtsai, 2022 áttekintést), amelyek az igazítási lépésben ismert HLA diverzitást magyaráznak, és kimutatták, hogy pontos expressziós szintet biztosítanak a HLA gének számára (Boegel és mtsai 2012; Lee et al. 2018; Aguiar és társai 2019; Gutierrez-Arcelus és munkatársai 2020; Darby és társai 2020).

Míg mind az RNS-seq, mind a qPCR megközelítés a HLA expresszióját a transzkriptumok számszerűsítésével becsüli meg, a módszerek különböző kísérleti és bioinformatikai feldolgozási eljárásokat foglalnak magukban. Tudomásunk szerint az RNS-seq eredményeinek kvantitatív összehasonlítását a qPCR-ből HLA génekre vonatkozóan nem végezték el. Ebben a tanulmányban különböző technikák és molekuláris fenotípusok összehasonlítására törekedtünk a HLA I. osztályú expresszió számszerűsítésére, szem előtt tartva, hogy egyetlen technika sem tekinthető aranystandardnak. Annak érdekében, hogy csökkentsük a technikai és biológiai eltérések hatását a különböző vizsgálatok összehasonlításában, RNS-seq vizsgálatot végeztünk egy 96 egyedből álló halmazon, amelyre vonatkozóan rendelkezésre álltak qPCR expressziós becslések (HLA-A, -B, -C esetén), ill. amelyek egy részében HLA-C antitest alapú sejtfelszíni expresszió is elérhető volt. Az RNS-szekvencia mennyiségi meghatározását HLA-ra szabott pipeline segítségével végeztük, amely lehetővé teszi a pontos expresszió becslést, minimalizálva az egyetlen referencia genomon alapuló standard megközelítések torzítását.

Anyagok és metódusok

Minták

Vérmintákat vettek a Frederick National Laboratory for Cancer Research (FNLCR) önkéntes donorprogramjában részt vevő 96 egészséges véradótól. Minden alanytól írásos beleegyezést kaptak, és a mintákat a National Cancer Institute IRB által jóváhagyott eljárásaival anonimizálták. Az RNS-t frissen izolált perifériás vér mononukleáris sejtekből (PBMC) extraháltuk az RNeasy Universal kit (Qiagen) segítségével. Az RNS-t RNS-mentes DNS-ázzal kezeltük a genomiális DNS eltávolítására. A PBMC-kből extrahált teljes RNS mennyiségét HT RNA Lab Chip (Caliper, Life Sciences) segítségével határoztuk meg. Minden olyan mintát, amely 8-nál nagyobb RNS-minőségi pontszámot mutatott, felhasználtuk a génexpressziós elemzésekhez.

HLA gépelés

A HLA alléleket Sanger szekvenálással határoztuk meg. Ezenkívül lefuttattuk a HLAper-eket (Aguiar et al. 2019) és a Kouramit (Lee és Kingsford 2018), hogy közvetlenül az RNAseq-ből következtessünk a HLA allélekre, és ellenőriztük, hogy megegyeznek-e a Sanger szekvenáláson alapuló hívásokkal. Ha figyelembe vesszük a HLApers és Kourami közötti következetes hívásokat, akkor a 288 összehasonlításból (3 lókusz × 96 egyén) mindössze 10 eltérést figyeltünk meg a Sanger-hívásokkal. Legtöbbjük (n=5) a Sanger-szekvenálás által meghatározotthoz nagyon közel álló allélre mutatott támogatást az RNS-seq-ből, ezért az RNS-seq-alapú hívások megtartása mellett döntöttünk. Három genotípus esetében megfigyeltünk homozigóta hívásokat az RNS-seq-ből, valószínűleg azért, mert az egyik allél nem expresszálódott, és megtartottuk a Sanger szekvenálásból származó hívásokat. Ez nem befolyásolja az expressziós becslést, mivel egyetlen leolvasás sem igazodik az RNS-seq-en keresztül nem észlelt allélhez. Az egyik genotípusnál jó támogatást tapasztaltunk a heterozigóta hívásra, míg a Sanger-szekvenálást homozigótának nevezték. Ebben az esetben megtartottuk az RNS-seq alapú hívást, mivel az jobban magyarázza a megfigyelt leolvasásokat. Az egyik allélhívásnál az RNA-seq alapú hívások hibáját vettük figyelembe az elégtelen olvasási lefedettség miatt.

Kvantitatív PCR (qPCR)

A HLA-A, -B és -C HLA mRNS transzkripciós szintjét qPCR-rel mértük egy olyan vizsgálatban, amely biztosítja a közös allélok elfogulatlan amplifikációját minden egyes lókuszban, miközben elkerüli az összes többi lókusz amplifikációját. Az alkalmazott primerek a következők voltak: HLA-A (F, GCTCCCACTCCATGAGGTAT; R, AGTCTG TGACTGGGCCTTCA); HLA-B (F, ACTGAGCTTGTG GAGACCAGA; R, GCAGCCCCTCATGCTGT); HLA-C (F, CTGGCCCTGACCGAGACCTG; R, CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). A reverz transzkripciót a High-Capacity RNS-cDNS kit (Applied Biosystems) segítségével végeztük. A HLA és a housekeeping gén 2 mikroglobulin (B2M) cDNS amplifikációját Power SYBR green master mix (Applied Biosystems) alkalmazásával ABI 7900HT gépen végeztük. A B2M primer szekvenciáit Kulkarni és munkatársai S4. táblázatában írják le. (2013). Az egyes HLA gének átlagos expressziós szintjét a B2M-re normalizáltuk, és a 2-∆∆Ct módszerrel számítottuk ki (ahol Ct a küszöbciklus).

A közönséges HLA allélek átlagos allél-specifikus expressziós szintjeit lineáris modellel becsülték meg Ramsuran és mtsai. (2015). Pontosabban, az expressziót az egyes egyedek által hordozott két allél lineáris függvényeként modelleztük, és kivontuk az egyes allélek hatását a génexpresszióra. Ezt a lépést R-ben hajtottuk végre (lásd a Kód elérhetősége szakaszt).

Felületi kifejezés

A HLA-C sejtfelszíni expressziót frissen izolált PBMC-kből származó CD3 plusz sejteken mértük áramlási citometriával a HLA-C-specifikus monoklonális DT9 antitest felhasználásával (Apps et al. 2013). A HLA-A analízishez az A*03-at és A*11-et hordozó egyének egy részében a sejteket 0554HA antitesttel festettük meg (One Lambda, Inc.).

RNS-szekv

RNS előkészítés

Az RNS-seq vizsgálatot -80 °C-on tárolt RNS-en végeztük. A teljes RNS mennyiségét a Qubit RNA HS Assay (Thermo Fisher) alkalmazásával határoztuk meg. Az RNS minőségét egy 2100 Bioanalyzer készülék és egy Agilent 6000 RNA Pico Kit (Agilent Technologies) segítségével értékeltük. Minden mintához 500 ng össz-RNS-t használtunk bemenetként a teljes transzkriptom rRNS-mentesített könyvtárak elkészítéséhez. Adapter-ligált könyvtárat készítettünk a KAPA HyperPrep Kit-tel (KAPA Biosystems, Wilmington, MA) Bioo Scientific NEXTfex™ DNS vonalkódos adapterekkel (BioScientifc, Austin, TX, USA) a KAPA által biztosított protokoll szerint.

rRNS-kiürítés RiboErase használatával

A riboszómális RNS-t úgy csökkentettük, hogy a teljes RNS-t rRNS-szekvenciákkal komplementer próbákkal inkubáltuk. A hibridizációt követően RNáz H-t használtunk az rRNS enzimatikus lebontására. A tisztítást és a DNáz-emésztést Kapa Pure Beads és DNáz segítségével végeztük a Kapa protokoll szerint.

Fragmentálás, cDNS-szintézis és könyvtárépítés

Az rRNS-szegény mintákat 85 fokon 4,5 percig fragmentáltuk magnézium jelenlétében, mielőtt az 1. és 2. szál szintézisét és A-farok reakcióit elvégeztük. A NEXTfex DNS vonalkódos adaptereket (1,5 uM) az A-farkú cDNS-hez ligáltuk, minden egyes mintához egyedi vonalkóddal. A termékeket Kapa Pure Beads-szel tisztítottuk, és 8 ciklusú Library amplifikációt végeztünk. Az amplifikációt követően egy végső könyvtártisztítást végeztünk, és a könyvtár mennyiségi meghatározását és a minőségellenőrzést Qubit DNA HS Assay (Thermo Fisher) és Agilent DNA HS kit segítségével értékeltük a 2100 Bioanalyzer készüléken.

Szekvenálás

Az eredményül kapott multiplexelt szekvenáló könyvtárakat klaszterképzésben használták Illumina cBOT-on (Illumina, San Diego, CA, USA), és a szekvenálást Illumina HiSeq 2500 segítségével végezték el, az Illumina által biztosított protokollokat követve a 2 × 126 bp-os páros végű szekvenáláshoz. Mindegyik transzkriptumot 40-50 millió leolvasás célmélységig szekvenálták.

RNS-seq 11 egyed friss mintáin

Az RNS szekvenálás előtt -80 fokon tárolt anyag minta degradációjának lehetőségének vizsgálatára, ami a qPCR becslésekkel való nézeteltérés lehetséges forrása, 11 donor vérét vettük át, és RNS-seq-et végeztünk az új mintákon. A kísérletet ugyanazzal a könyvtár-előkészítéssel és módszerrel végeztük, mint korábban, de Illumina NextSeq segítségével szekvenáltuk 2×150 pb leolvasással.

Az RNS-seq expressziójának mennyiségi meghatározása

Referencia átirat

A Salmon (Patro és mtsai, 2017) segítségével megbecsültük a Gencode v37 adatbázisban jegyzett összes transzkriptum expressziós szintjét. Az összes lehetőséget felhasználtuk a Salmon torzításkorrekciójához (GC torzítás, helyzeti torzítás és szekvencia-specifikus torzítás).

Személyre szabott

Ugyanaz, mint a "Ref-transzkriptom", de személyre szabott HLA-átiratokkal az egyes egyedek által hordozott HLA-A, -B és -C genotípusok szerint. A személyre szabást úgy hajtották végre, hogy a referenciagenom HLA alléljének szekvenciáját a genomhoz igazították, hogy megkapjuk a koordinátákat. Ezután a referenciagenomban jelenlévő allél és az összes többi allél több szekvenciájú összehangolásával (az IPD-IMGT/HLA 3.43-as kiadásból érhető el.0 (Robinson et al. 2020)) genomikusnak tulajdonítottunk. pozíciókat az összes HLA allélhez. Végül személyre szabott átiratot készítettünk a transzkriptum koordinátáira vonatkozó információk és a HLA allélszekvenciájának kombinációja alapján. Ezt az eljárást az R-ben (R Core Team 2020) hajtották végre a Biostrings csomag (Pagès et al. 2020) és a tidyverse meta csomag (Wickham et al. 2019) segítségével.

For more information:1950477648nn@gmail.com