Magzati és perinatális emberi magzatvíz őssejtekből származó szekréciós készítmények átfogó profilalkotása 1. rész

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Absztrakt:Korábban már beszámoltunk arról, hogy a rutin Ⅱ trimeszter prenatális diagnózisának (magzati hAFS) megmaradt mintáiból nyert c-KIT plusz htaman magzatvízből származó őssejtek regeneratív parakrin potenciállal rendelkeznek, amelyek elősegítik a túlélést, az antifibrotikus és proliferatív hatást. A III trimeszterben vett klinikai hulladékmintákból is izolálhatók a tervezett C-metszet (perinatális hAFS) során, így könnyebben elérhető alternatívát kínálva a magzati hAFS-hez képest. Mindazonáltal keveset tudunk a perinatális hAFS parakrin profiljáról. Itt részletesen leírjuk a hAFS teljes szekrécióját (azaz a kondicionált tápközegben, a hAFS-CM sejtek által felszabaduló oldható parakrin faktorok összességét) és az extracelluláris vezikulákat ( hAFS-EVs) belül, a Ⅱtrimester magzati versus III trimeszter perinatális sejtekből. A magzati és perinatális hAFS-t jellemeztük, és hipoxiás előkondicionálásnak vetették alá, hogy fokozzuk parakrin potenciáljukat. A hAFS-CM és a hAFS-EV készítmények fehérje- és kemokin/citokintartalmát elemeztük, az EV rakományt pedig RNS szekvenálással tovább vizsgáltuk. A magzati és perinatális hAFS fenotípusa, valamint a megfelelő szekretáló készítményei átfedték egymást; mégis, a magzati hAFS éretlen oxidatív foszforilációs aktivitást mutatott a perinatálishoz képest. Parakrin rakományuk profilozása bizonyos eltéréseket mutatott ki a terhességi stádium és a hipoxiás prekondicionálás szerint. Mindkét sejtforrás neurotróf, immunmoduláló, antifibrotikus és endoteliális stimuláló faktorokkal dúsított készítményeket biztosított, és az éretlen magzati hAFS-szekréciót kifejezettebb pro-vasculogenic, regenerative, pro-resolving és anti-aging profil határozta meg. A kisméretű RNS-profilozás mikroRNS-dúsulást mutatott mind a magzati, mind a perinatális hAFS-EV rakományban, referencia molekuláris aláírásként egy stabilan kifejeződő pro-rezolváló maggal. Itt megerősítjük, hogy a hAFS a regeneratív parakrin faktorok vonzó forrása; a magzati vagy perinatális hAFS-szekréciós készítmény kiválasztását a jövőbeli parakrin terápiához az adott klinikai forgatókönyv figyelembevételével kell értékelni.

Kulcsszavak:magzatvíz; őssejtek; parakrin hatások; extracelluláris vezikulák; sejtkondicionált táptalaj; kemokin; citokinek; proteomika; RNS szekvenálás; mikroRNS

További információért kattintson ide

1. Bemutatkozás

A regeneratív gyógyászat a közelmúltban olyan feltörekvő területként fejlődött ki, amely számos stratégia segítségével biztosítja a sérült szövetek funkcionális helyreállítását. Ahogy a szövetsebészeti megközelítések az elmúlt években jelentősen fejlődtek, az őssejt-parakrin hatások vizsgálata ezzel párhuzamosan egyre intenzívebbé vált. A transzplantált őssejtek terápiás potenciálját széles körben kimutatták, hogy leginkább a szekretált oldható faktoraik közvetítik, amelyek pro-regeneratív mikrokörnyezetet tudnak kialakítani a gazdaszövetben, miközben beindítják a funkcionális helyreállítás endogén mechanizmusait [1,2]. Ezért az őssejt-szekréció a sejtből felszabaduló parakrin trofikus molekulák egészét, valamint a membránhoz kötött extracelluláris vezikulákat egyre gyakrabban javasolták innovatív terápiás gyógyszerként számos független, kardiovaszkuláris, neurológiai és/vagy gyulladásos preklinikai vizsgálatban. betegség. Ennek megfelelően az őssejtek biológiai gyárakként képzelhetők el terápiás szekréciójuk kiaknázására azáltal, hogy felhasználásra kész és készen kapható regeneratív kezeléseket kínálnak. Egy ilyen sejtalapú, mégis sejtmentes stratégia alkalmazásával a kanonikus sejtterápiával kapcsolatos számos korlátozó szempont leküzdhető, ugyanakkor jótékony hatások is biztosítottak.mi az a cistancheEbből a szempontból a mesenchymalis stromasejteket (MSC) széles körben tesztelték feltételezett sejtjelöltként? Valójában az MSC-t és az ős-/progenitor sejteket különböző előkondicionálási stratégiákkal alakították ki és/vagy stimulálták, hogy fokozzák regenerációs képességüket és szekréciós potenciáljukat [3,4], kifejezetten érdeklődve a szekretált extracelluláris vezikulák (EV) biológiai relevanciája iránt.

Az EV-k nanoméretű részecskék, amelyeket lipid kettős réteg határol, és minden sejttípus aktívan szekretál. Az elektromos járművek között nagyon kicsi (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); az intercelluláris jelátvitel kritikus biológiai szállítóiként működnek azáltal, hogy molekuláris rakományukat egy szülői sejtből a válaszadó/célpontba szállítják [5,6]. Tekintettel arra, hogy sajátos parakrin potenciáljuk jótékony hatások kifejtésében összemérhető a származási sejtjeikkel, az őssejt EV-k vonzó terápiás lehetőségekként jelentek meg olyan betegségek preklinikai modelljeiben, mint az ischaemia, gyulladás vagy sérülés, amint azt részletesen áttekinti [{{3 }}]. Translációs szempontból a sejtmodulációs potenciálon felül az izolálás megvalósíthatósága és a fokozott önmegújulás kulcsfontosságú szempontjai a terápiás EV-k és az oldható faktorok ideális forrásának. Ebben a forgatókönyvben a magzati és perinatális MSC érdekes lehetőséget kínálhat proliferációs potenciáljuk és fejlődésileg éretlen profiljuk, az embrionális és a felnőtt szomatikus progenitorok közötti köztes jellemzőkkel [10,11]. A magzati MSC izolálható a terhesség alatt az embrion kívüli mellékletekből a prenatális szűrés során visszamaradt mintaként (azaz chorionbolyhok [12-14] és magzatvíz [15,16]), vagy születéskor perinatális progenitorként, klinikai hulladékanyagból (azaz magzatvíz és méhlepény membránokból [17-21], köldökzsinór-komponensekből [22-24] és magzatvízből [25,26]).

A Cistanche öregedésgátló hatású

Nevezetesen, a humán magzatvíz őssejteket (hAFS) a regeneratív gyógyászat ígéretes terápiás stratégiájaként emelték ki. és kimutatták, hogy nagymértékben multipotensek in vitro és in vivo [16, 27, 28], hozzájárulnak az in utero transzplantációt követő vérképzőszervi leszármazáshoz [29], és beépülnek a sérült szervekbe, miközben immunmoduláló hatást fejtenek ki [26, 30] és aktiválják endogén reparatív válaszok, amint azt a [31] átfogóan leírja. Csapatunk és mások is bebizonyították, hogy a hAFS bioaktív trofikus molekulákkal nagymértékben dúsított szekréciót bocsát ki, amely képes megcélozni a különböző reparatív mechanizmusokat. A hAFS parakrin faktorokról beszámoltak arról, hogy túlélést elősegítő ingereket biztosítanak a gyulladás csillapításával [32], szívvédelmet biztosítanak az elhúzódó ischaemia [33.34] és kardiotoxicitás ellen [35], és serkentik a lokális angiogenezist a kardiomiocita sejtciklus újrabelépésével [32]. 34,36]. Mivel ezeknek a hatásoknak a többségéről kimutatták, hogy a hAFS-EV önmagában történő beadásával ismétlődik, a független tanulmányok a regeneratív profiljuk különböző kóros hátterűek, köztük váz- és szívizomsérülések, vesebetegségek, osteoarthritis, oszteoporózis, nekrotizáló enterocolitis és neurodegeneratív hatások vizsgálatára összpontosítottak. modellek [34,37-44].

Bár a bizonyítékok alátámaszthatják a hAFS-EV-k klinikai transzformációját a jövőbeli parakrin terápia számára, fontos figyelembe venni, hogy a legtöbb ilyen tanulmány elsősorban a magzati hAFS modulációs potenciálját vizsgálta, amelyet a Ⅱ trimeszter prenatális szűrése során kaptak. a perinatális megfelelője (azaz a III. trimeszter c-metszeteiből) még nem került részletes feltárásra. A harmadik trimeszterben a perinatális hAFS sajátos immunszabályozási tulajdonságokat mutatott az én és a II trimeszterhez képest [26], miközben fenntartja a releváns endoteliális regenerációs potenciált [25].mennyi cistanche-t kell venniMegjegyzendő, hogy a magzati hAFS heterogén morfológiájáról szóló közelmúltbeli jelentés[45] új betekintést nyújtott a törzsükbe és a génexpressziós profiljukba.bioflavonoidokEz teljesen új megvilágításba helyezte a hAFS különböző sejtfrakcióinak regenerációs értékét[46]. Ezért a hAFS különböző alpopulációinak átfogó jellemzése egyre nagyobb figyelmet vonz. Korábban már beszámoltunk arról, hogy a 24 órás hipoxiás és szérummentes stimuláció hatékony stratégia a Ⅱ trimeszter magzati hAFS parakrin potenciáljának növelésére [34, 35, 37]. Mivel keveset tudunk a III trimeszter hAFS szekréciójának összetételéről, itt bemutatjuk a Ⅱ versus Ⅲ trimeszter hAFS-ek és szekréciós frakcióik (beleértve a hat-EV-ket) átfogó összehasonlítását, hogy megvizsgáljuk a terhességi stádium és a hipoxiás sejt hatását. sejt- és szekréciós jellemzők előkondicionálása.

2. Eredmények

2.1. A perinatális hAFS szoros fenotípusos egyezést mutat a magzattal

A magzati Il trimeszterben és a perinatalis III trimeszterben vett magzatvíz minták között nem volt statisztikailag szignifikáns különbség a donor életkorában. A magzati c-KIT* hAFS (f-hAFS II trimeszter magzatvíz mintáiból) és perinatalis c-KIT* hAFS (p-hAFS a III trimeszter magzatvíz klinikai hulladékából) hasonló tulajdonságokat igazolt fibroblasztszerű és ovális kerek morfológiával (ábra). 1A) és a mezenchimális stroma fenotípus (az adatokat nem mutatjuk be), amint azt korábban közöltük [16, 25]. Az 5. passzázsig in vitro tenyésztett f-hAFS és p-hAFS egyaránt elhanyagolható mértékű öregedést mutatott az öregedéssel összefüggő - -galaktozidáz (SA- -Gal) aktiváció miatt a sejtek körülbelül 4 százalékában (1B. ábra). . Mind az f-hAFS, mind a p-hAFS magas szintű koexpressziót mutatott a CD107a és CD146 mezenchimális markerekben, amelyekről a közelmúltban jelentették, hogy egy erősen szekréciós fenotípust határoznak meg[47]. A CD107at CD146* sejtek képviselték az f-hAFS populáció többségét (körülbelül 64 százalék,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

1. ábra. A magzati és a perinatális fenotípusos értékelés. (A) A magzati hAFS (f-hAFS, bal oldali panel) és a perinatális hAFS (p-hAFS, jobb panel) reprezentatív képei, standard körülmények között in vitro tenyésztve; léptéksáv: 200 um. (B) Az öregedő marker béta-galaktozidáz (SA- -Gal, kék színben) elemzése citokémiai festéssel f-hAFS-en és p-hAFS-en 5 tenyésztés után; a reprezentatív képek a bal oldali panelen jelennek meg, méretarány: 200 um. A -Gal-pozitív sejtek/mező megfelelő százalékos arányát a jobb oldali grafikon mutatja (f-hAFS: 4,12±0,58 százalék és p-hAFS: 3,88±2,10 százalék ;p=0,1424,n{ {24}} kísérletek).(C) A CD146 és CD107a mezenchimális markereket expresszáló hAFS immunfenotípusa. Az f-hAFS és p-hAFS (bal oldali panel) reprezentatív áramlási citometriai diagramjai és a megfelelő értékek kettős pozitív CD107a plusz CD146 plusz sejtekre vonatkoznak; CD107a plusz CD146* f-hAFS: 63,68±5,82 százalék,*p=0,016 a fennmaradó f-hAFS-hez képest 36,32±5,82 százalék (egyéb); CD107at CD146 plusz p-hAFS: 52,07±6,76 százalék, a maradék 47,07±6,76 százalék 93±56,76 százalék p-hAFS (egyéb); CD107a plusz CD146 plusz f-hAFS vs. CD107a plusz CD146 plusz p-hAFS p=0.2403,n=4 kísérletek. Egyéb: a maradék CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS és CD107at CD146-hAFS teljes mennyisége. Az összes értéket független kísérletek átlaga ± félértékeként fejeztük ki. SA- -Gal: Senescence-Associated- -galaktozidáz.

2.2. A magzati hAFS eltérő anyagcserét mutat, mint a perinatális hAFS

Annak értékelésére, hogy a terhességi szakasz befolyásolhatja-e a mitokondriális metabolizmust, az f-hAFS-t és a p-hAFS-t standard in vitro tenyésztési körülmények között elemeztük biokémiai elemzésekkel. Az aerob anyagcsere értékelése azt mutatta, hogy az oxigénfogyasztási ráta (OCR) és az ATP szintézis alacsonyabb volt f-hAFS-ben a p-hAFS-hez képest, mindkettő piruváttal és maláttal stimulálva (P/M;***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3. A hipoxiás előkondicionálás nem befolyásolja a magzati és perinatális életképességet, és fenntartja szekréciós tevékenységüket

A hAFS-szekréciós készítmények meghatározásához a sejteket szérummentes körülmények között tenyésztjük, hogy elkerüljük az FBS-ből származó szennyeződést. Korábban kimutattuk, hogy a 24 órás szérummentes (SF) és 1 százalékos oxigénhiányos tenyésztési körülmények nem változtatták meg szignifikánsan a Ⅱtrimester magzati hAFS (f-hope) életképességét, ugyanakkor támogatták a regeneratív parakrin faktorok felszabadulását sejtkondicionált tápközegükben. (hAFS-CM) és extracelluláris vezikulákban (hAFS. EVs) [34,35,37,49]. Itt a p-hAFS szekréciós frakciók első profilozása mellett értékeltük, hogy a p-ek hasonló viselkedést mutattak-e ugyanazon előkondicionálási rendszer mellett, kontrollként a normoxikus tenyésztési feltételt használva. Az f-hAFS és a p-hAFS életképességét 24 óra elteltével a következő körülmények között elemeztük: normoxikus (20 százalék O2) állapot teljes kontroll (Ctrl) táptalajban (Ctrlf-hAFSnormo és Ctrl p-hAFSnormo), normox állapot SF tápközegben (SF f-hAFSnormo és SF p-hAFSnormo), hipoxiás (1 százalék O2) állapot teljes kontrolltápközegben (Ctrlf-hipo és Ctrl p-hAFSnypo) és hipoxiás állapot SF tápközegben (SF f-hipo és SF p - hipohipo van, 3A ábra). Megerősítettük, hogy az f-életképesség nem változott Ctrl és SF körülmények között és hipoxiás stimuláció alatt is, az összes sejt több mint 80 százaléka (majdnem 88 százaléka) nem változott. A korai és késői apoptotikus sejtek kb. 13-18 százalék SF körülmények között, statisztikailag szignifikáns relevancia nélkül. Hasonlóképpen, a perinatális életképesség 80-92 százalék tartományba esett, és a korai és késői apoptotikus sejtek akár 18 százalékot is képviseltek SF körülmények között. A p-hAFS csak a kombinált hipoxiás és SF körülmények között volt csekély mértékben befolyásolva; valóban, míg az előkondicionálás nem befolyásolta a sejtek túlélését, amikor a p-hAFS-t komplett tápközegben tenyésztették, a megfelelő SF-állapot kb. 4-fold (* p<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

2. ábra A magzati- és perinatális HAFS metabolikus jellemzése. (A) Oxigénfogyasztási arány (OCR), ATP-szintézis F1-F.ATP-szintázon keresztül, és P/O-arány f-have-ben és-have-ban piruvát plusz malát (P/M) vagy szukcinát jelenlétében (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche AusztráliaAz OCR és az ATP szintézis gátlásának százalékos arányának összehasonlítása f- és hAFS-ben a fent jelzett inhibitorok miatt az alsó B panelen található. Az OCR kísérletekhez: hAFS plus Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Ezután a fehérjedúsítás alapján értékeltük az f-hAFS-ből nyert szekréciós frakciók hozamát a p-hAFS-hez képest. A teljesnek van szekretoma, mivel a sejt által kiválasztott parakrin faktorok összességét itt a hAFS-CM képviseli. Az f-hAFS-CM és a p-hAFS-CM fehérjekoncentrációja az SF tápközegben hipoxiás sejt-előkondicionálást követően a kontroll normoxiás állapothoz képest, mint kiindulási érték (nevezetesen, f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo és p -hAFS-CMHypo,) BCA-teszttel értékeltük ki, és 10§ sejtenként mértük.cisztanchA kapott eredmények azt sugallják, hogy az f-has-CM és a p-hAFS-CM azonos pozitív tendenciát mutatott a fehérjedúsulásban hipoxiás priming után (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 fokos sejtek; p-hAFS-CMNypo∶182,30±29,71 ug/10 fokos sejtek) normoxikus megfelelőikkel szemben (f-hAFS-CMnormo: 105,50±19,89 ug/10 fokos sejtek; p- hAFS-CMhypoi 91,12±24,39 ug/10 fokos sejt) Hasonlóképpen, a hAFS-EV-ek felszíni fehérjekoncentrációját mértük f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo és p-hAFS-EVShypo-ban. Az EV-k hasonló hozamot mutattak, ha f-hAFS-ből vagy p-hAFS-ből nyerték. Ami a hAFS-CM készítményeket illeti, az f-hAFS-EV és p-hAFS fehérjetartalmának növekedése pozitív tendenciát mutat. megfelelő normoxikus állapot (f-hAFS-EVSHypo∶2,03±0,67 ug/10 fokos sejtek és p-hAFS-EVSHypo∶1,85±0,47 ug/10 fokos sejtek; f-e-EVsnormo∶1,28±0,36 ug/10 fokos sejtek -hAFS-EVsnormo∶1,19±0,31 ug/10 fokos cellák, 3C. ábra).

2.4. Magzati és perinatális hAFS kibocsátású elektromos járművek analóg morfológiával és méreteloszlással

A transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM) morfológiai analízis megnövelte az f-hAFS és a p-hAFS magas EV-szekréciós elterjedését (4. ábra). Tovább vizsgáltuk az f-hAFS-EV-k és p-hAFS-EV-k méretét és területét (4B. ábra) hipoxiás előkondicionálást követően a normoxiás kiindulási értékkel összehasonlítva. A magzati és perinatális EV-k heterogén méretűek, a 40-250 nm tartományban, így mind az exoszómákat/kis EV-ket, mind a mikrovezikulákat/leváló hólyagokat tartalmazzák. Az EV/mező átlagos mérete a különböző csoportokban összehasonlítható volt, a magzati hAFS-EV-k mértéke 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo: 97,10±10,10 nm) és perinatálisan mért 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo: 94,60±19,53 nm; p-hAFS-EVShypo: 76,43±4.{37}} nm, ábra 4B, bal oldali panel). Ami a hozamot illeti, a hipoxia alatt stimulált hAFS pozitív tendenciát mutatott a kisméretű EV-k mennyiségének növekedésében, bár ez a növekedés statisztikailag nem volt szignifikáns. Az f-hAFS-EVStypo 40-70 nm-t mért, ami majdnem kétszerese a normoxikus megfelelőjükhöz képest. A 40-70 nm, 70-100 nm és 100-130 nm értékű perinatális-has-EVSHypo majdnem háromszorosa volt a normoxikus tenyészetben kapott értéknek (4B. ábra).

A nanorészecskék nyomkövetési analízise (NTA) megnövekedett részecskeszámot mutatott mind az f-hAFS-EV, mind a p-hAFS-EV preparátumokban, és megerősítette az EV-k növekedését a hipoxiás mintákban, amint azt a korábbi elemzések is megfigyelték (f-hAFS- EVsnormo: 182±0.10'részecskék/10 fokos sejt; f-have-EVshypo: 3,30±0,22×10 fokos részecskék/10 fokos sejt ;p-hAFS-EVsnormo:2,43±0,80×10 fokos részecskék/10 fokos sejtek;p-hAFS-EVshypo:3,05±0,62×10 fokos részecskék/10 fokos sejtek, 4C. ábra).

4. ábra Magzati- és perinatális has-EV-k morfológiai jellemzése. (A) Az f-hAFS és p-hAFS transzmissziós elektronmikroszkópiájának (TEM) reprezentatív képei (bal felső és alsó panel, fekete nyilakkal, amelyek intracitoplazmatikus multi-vezikuláris testeket jeleznek kis EV-kkel/exoszómákkal), és f-ről -hAFS-EV-k és p-hAFS-EV-k (jobb felső és alsó panel), amelyek szérummentes körülmények között és normoxikus versus hipoxiás előkondicionálás mellett szabadulnak fel (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; és f-hAFS-EVshypo), skálasávok: 200 nm. (B) Bal oldali panel: a hAFS-EV-k méreteloszlásának TEM elemzése; jobb oldali panel: az f-hAFS-EV-ek és p-hAFS-EV-ek számának mezőméretenkénti eloszlását vettük figyelembe 40 nm-től 250 nm-ig; az értékeket n=3 független kísérlet átlag±szemében fejezzük ki. (C) Nanorészecske-követő elemzés a hAFS méretéhez és eloszlásához. Bal oldali panel: a grafikus kimenet reprezentatív képe; jobb oldali panel: a hAFS-EVs koncentrációja 10 fokos részecskék per 10 fokos szekretáló sejtekben mérve; nm: nanométer; ml: milliliter.

2.5. A magzati és a perinatális hAFS proteomikus jellemzése kiemeli a szekretáris összetételükben mutatkozó különbségeket a terhességi kor és a hipoxiás előkondicionálás szerint

Mind az f-hAFS, mind a p-hAFS szekréciós készítmények proteomikai jellemzését shotgun címkementes platform segítségével végeztük, a nano folyadékkromatográfia és a nagyfelbontású tömegspektrometria (nLC-HRMS) összekapcsolása alapján. Negyvennyolc proteomikus profilt kaptunk a hipoxiás sejt-előkondicionáláson átesett f-hAFS-ből és p-hAFS-ből származó hAFS-CM és have-EV-k három biológiai replikációjának duplikált analízisével, összehasonlítva a normoxikus állapottal, mint kontrollal. Összesen 4179 különböző fehérjecsoportot azonosítottak legalább egy egyedi peptiddel, 2 és 3900 kDa közötti molekulatömeggel és 3,6 és 13 közötti izoelektromos pontokkal. A hAFS-EV-kben magasabb átlagos fehérjeexpressziót figyeltek meg a hAFS-CM-hez képest. . Az összes kapott fehérjelistát az azonosított fehérjék alapján állítottuk össze. Minden kísérleti körülményhez egyedi listát hoztak létre, amely normalizálta és átlagolta[50] a fehérjékhez rendelt peptidspektrum egyezési értékeket (PSM), amelyek az egyesekhez rendelt tömegspektrumok számát, és közvetetten a mintákban való bőségüket reprezentálják. A hAFS-CM és have-EV készítményekben azonosított fehérjék teljes listáját az S1 táblázat tartalmazza.

A lineáris diszkriminancia analízis (LDA[51]) alkalmazása ezen a törzslistán lehetővé tette statisztikailag szignifikáns fehérjék extrakcióját (Fratio nagyobb vagy egyenlő 4,5 és** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 a hAFS-CM és a have-EV készítményekben külön-külön kell figyelembe venni. Míg a fehérjék körülbelül 69,5 százaléka, illetve 69,9 százaléka oszlott meg a hAFS-EV-k és a hAFS-CM körülmények között, a fennmaradó tartalom eltérő arányban jelent meg kizárólagosnak, 3,7-13,4 százalék között a készítmények között.

A proteomikai változások kvantitatív vizsgálatához címkementes differenciálanalízist végeztünk a házilag készített MAProMa szoftverrel, két algoritmus, a DAve (Differential Average) és a DCI (Differential Confidence Index) alkalmazásával, amelyek a differenciális kifejezés arányát és megbízhatóságát reprezentálják. rendre) minden egyes fehérje PSM-jén a két összehasonlított kifejezés között. Szigorú szűrők használata DAve-hez és DCI-hez az azonosítás megbízhatóságának maximalizálása és az 1,5-szörösnél nagyobb eltérésű fehérjék figyelembevétele, az f-hAFS-CM és a p-hAFS-CM, valamint az f-hAFS-EV-ek páronkénti összehasonlítása A p-hAFS-EV-ket a sejt terhességi szakaszának megfelelően készítettük. Összesen 58 és 109 fehérjét találtunk eltérően expresszálva a fenti has-CM és have-EV kompartmentekben (S1B, C ábra a kiválasztott részletekért és S2-S3 táblázatok kiterjesztett formában). Ezek közül 30 fehérje fokozta az f-hAFS-CM-et, 28 pedig a p-hAFS-CM-et (S1B ábra); hasonlóképpen 44 különböző fehérje fokozta az f-have-EV-k szabályozását, és 65-öt a p-hAFS-EV-ekben (S1C ábra). Nevezetesen, azokat a fehérjéket, amelyek az f-have-ban felfelé szabályozták, a p-has-ban leszabályozottnak kell tekinteni, és fordítva.

értékeket jelentenek; lásd az S2 táblázatot a közölt fehérjék teljes listájához és részletes paramétereiért. (C) A magzati hAFS-CM-ben (bal oldali panel) és a perinatális have-CM-ben (jobb panel) legalább 2-es gyakorisággal azonosított fehérjék biológiai folyamatok dúsítási analízise a sejt hipoxiás előkondicionálása szerint. A FunRich eszköz alapján a génontológiai kifejezések oszlopdiagramokban jelennek meg, amelyek az egyes kategóriákban feldúsult gének százalékos arányát jelzik (rózsaszín oszlopok a-have-CMnormo, lila sávok f-hAFS-CMhypor világoskék sávok p-hAFS-CMnormo esetén, és kék golyók a p-hAFS-CMhypo esetében).vegyél cistanche-tCsak a Bonferroni gén-ontológiai kifejezései *p-vel javítva<0.05 are="">

Ez a cikk az Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms