A Congrong–Zaoren–Wumei italkivonat optimalizálása és alvásjavító hatása egerekben
Jan 30, 2026
2 Eredmények és elemzés
2.1 A Congrong–Zaoren–Wumei italkivonat elkészítési folyamatának optimalizálása
Az 1. ábrán látható, hogy a bevált HPLC-módszer hatékonyan elválasztotta a négy referenciavegyület - citromsav, echinakozid, verbaszkozid és spinozin - kromatográfiás csúcsait és a szomszédos csúcsokat. A retenciós idők rendre tR1=9.0 min, tR2=21.6 min, tR3=24.3 min és tR4=25.9 min voltak. A csúcsterület és az analit koncentráció lineáris regressziója 12,12–2016, 0,14–110, 0,18–112,50 és 2,44–18,30 µg·mL–1 közötti lineáris tartományt eredményezett, 0,9998, kiváló, 1a, 1a. Ilyen körülmények között a citromsav, az echinakozid, a verbaszkozid és a spinozin kimutatási határa 3,636, 0,045144, 0,058 és 0,7564 µg·mL–1, a mennyiségi meghatározási határok (LOQ) pedig 12,14, 02,14, 02,14 és 02,14. µg·mL–1, ill. A precíziós tesztek 0,10%-os, 0,07%-os, 0,06%-os és 0,33%-os RSD-t mutattak a négy analit esetében, ami jó műszerpontosságot jelez. A 0–12 órás stabilitás jó volt, az RSD-k 0,78%, 0,16%, 0,20% és 1,46% voltak. Az ismételhetőségi tesztek 0,51%-os, 0,42%-os, 0,37%-os és 0,38%-os RSD-t produkáltak az analitokra, ami jó ismételhetőséget mutatott. A spike-recovery tesztek 97,42%, 103,32%, 98,90% és 99,71% átlagos felépülést mutattak, 0,70%, 0,52%, 1,05% és 0,63% RSD-vel. Ezért a négy fő komponens egyidejű meghatározására kidolgozott HPLC módszer pontos és megbízható, alkalmas a későbbi folyamatoptimalizálási vizsgálatokra.
1. ábra A referencia és az oldatok HPLC-kromatogramja 210 nm-es hullámhosszon (A) és 330 nm-es hullámhosszon (B és C)
A nyers poliszacharidok módszertani értékelése során a LOD 0,098 µg·mL–1 volt. Az oldószeres vakpróba és a vakkontroll OD-értékei 485 nm-en nem mutattak nyilvánvaló változást, ami jó specificitást jelez. Az OD lineáris regressziója a koncentráció függvényében R2=0.9997-t eredményezett, ami kiváló linearitást jelez. Az RSD hat egymást követő mérésnél 0,47% volt, ami jó pontosságot mutat. A poliszacharidtartalom RSD értéke 12 órán belül 0,44% volt, ami jó stabilitást jelez. Az RSD hat egymástól függetlenül elkészített mintában 2,51% volt, ami jó ismételhetőséget jelez. Így a módszer alkalmas a nyers poliszacharidok mennyiségi meghatározására a folyamatoptimalizálás során.
Cistanche Roucongrong előnyei az ókori könyvben
Kattintson a további részletekért
Wecistanche támogató szolgáltatása – További részletek az együttműködésről
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
2.1.2 Az egytényezős vizsgálatok eredményei
A bevált HPLC-módszerrel kombinálva a poliszacharid vizsgálattal, és a kivonat citromsav-, echinakozid-, verbaszkozid-, spinozin- és poliszacharid-tartalmát értékelő indexként figyelembe véve, egytényezős vizsgálatokat végeztünk az extrakciós hőmérsékletre, a szilárd-folyadék arányra és az extrakciós időre az ortogonális tervezés alátámasztására.
60, 80 és 100 fokos extrakciós hőmérsékleten a citromsav, echinakozid, verbaszkozid, spinozin és nyers poliszacharidok tartalma a kivonatokban a hőmérséklettel nőtt.
1:3, 1:5, 1:7, 1:10 és 1:12 (g·mL–1) szilárd-folyadék aránynál a citromsav, a spinozin és a nyers poliszacharidok tartalma magasabb arányban nőtt; Az echinacoside és a verbaszkozid 1:10-nél érte el a csúcsot (g·mL–1), és 1:12-nél csökkent (g·mL–1). Az összes marker komponens össztartalma azonban nőtt a szilárd-folyadék aránnyal.
A 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 és 3,0 órás extrakciós időknél az egyes analitok tartalma eltérően változott, de a markerkomponensek össztartalma az idő előrehaladtával nőtt.
A részletes adatokat a kiegészítő anyagok tartalmazzák. Az ipari célszerűséget figyelembe véve (a túl hosszú extrakció elkerülése érdekében) az ortogonális tervezéshez a 2. táblázat szerint állítottuk be a tényezőket és szinteket, az ortogonális sémát pedig a 3. táblázat mutatja.
2. táblázat: Az ortogonális kísérleti tervezés faktorszintjei a Congrong–Zaoren–Wumei Beverage extrakciós módszeréhez
Tényezők:
A: Extrakciós hőmérséklet ( fok )
B: Szilárd-folyadék arány (g ml-1)
C: Extrakciós idő (h)
| Szint | V: Hőmérséklet (fok) | B: Arány (g ml–1) | C: Idő (h) |
|---|---|---|---|
| 1 | 60 | 1:7 | 1.0 |
| 2 | 80 | 1:10 | 1.5 |
| 3 | 100 | 1:12 | 2.0 |
2.1.3 Ortogonális tervezési eredmények
Az extrakciót az ortogonális tömb szerint végeztük. A citromsav, az echinakozid, a verbaszkozid, a spinozin és a nyers poliszacharidok tartalmát a 3. táblázat tartalmazza. A tartomány (R) elemzése alapján a faktor hatásának sorrendje a teljes markertartalomra A > B > C volt, azaz extrakciós hőmérséklet > szilárd-folyadék arány > extrakciós idő. A k értékek összehasonlítása az optimális kombinációt javasolta A3B3C3: extrakciós hőmérséklet 100 fok, szilárd-folyadék arány 1:12 (g·mL-1), extrakciós idő 2 óra. Az ANOVA (4. táblázat) azt mutatta, hogy az extrakciós hőmérséklet szignifikáns hatással volt a teljes markertartalomra, míg a szilárd-folyadék arány és az idő hatása nem volt szignifikáns.
3. táblázat: A Congrong–Zaoren–Wumei ital ortogonális kísérleti tervezése és mért komponenstartalma (mg g–1)
Tényezők: A (hőmérséklet), B (szilárd-folyadék arány), C (idő)
| számú tárgyalás | A | B | C | Összes jelző | Citromsav | Spinozin | Echinakozid | Verbascoside | Nyers poliszacharidok |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 3 | 3 | 1 | 116.71 | 75.55 | 4.08 | 1.62 | 0.48 | 34.98 |
| 2 | 1 | 2 | 3 | 70.98 | 59.01 | 2.60 | 0.80 | 0.36 | 8.22 |
| 3 | 3 | 1 | 3 | 117.86 | 73.87 | 3.53 | 1.21 | 0.45 | 38.80 |
| 4 | 1 | 3 | 2 | 72.55 | 59.73 | 2.37 | 0.94 | 0.41 | 9.99 |
| 5 | 2 | 3 | 3 | 83.64 | 63.20 | 2.15 | 1.08 | 0.44 | 16.77 |
| 6 | 2 | 1 | 2 | 117.76 | 74.09 | 2.58 | 1.37 | 0.48 | 39.24 |
| 7 | 2 | 2 | 1 | 110.74 | 70.96 | 2.36 | 1.07 | 0.43 | 35.92 |
| 8 | 2 | 1 | 1 | 69.63 | 58.37 | 1.74 | 0.54 | 0.34 | 8.65 |
| 9 | 1 | 1 | 3 | 69.66 | 58.14 | 2.48 | 0.86 | 0.36 | 7.83 |
K statisztika (faktorszintenkénti összegek összege)
K1: A = 71.06, B = 85.72, C = 85.49
K2: A = 74.46, B = 86.29, C = 86.65
K3: A = 117.44, B = 90.97, C = 90.83
R tartomány: A=46.38, B=5.25, C=4.19
2.1.4 Érvényesítés és felnagyítás
Az optimális körülmények között végzett folyamatérvényesítés 119,74 mg·g–1 átlagos markerkomponens-tartalmat eredményezett, 0,57%-os RSD-vel, ami stabilitást és megbízhatóságot jelez. Az azonos körülmények között végzett léptéknövelő kísérlet 120,89 mg·g–1 átlagos összmarker-tartalmat eredményezett, 0,95%-os RSD-vel, ami összhangban van a skála előtti eredményekkel, tovább erősítve a robusztusságot. A három nagyobb tételből származó mintákat használtuk fel a későbbi alvással kapcsolatos vizsgálatokhoz; átlagos tartalmuk: citromsav 77,73 mg·g–1, echinakozid 2,69 mg·g–1, verbaszkozid 1,03 mg·g–1, spinozin 0,50 mg·g–1, poliszacharidok 38,93 mg·g–1.
4. táblázat: Ortogonális kísérletek varianciaanalízise
| Tényező | Négyzetek összege | df | Közepes négyzet | F | P |
|---|---|---|---|---|---|
| Extrakciós hőmérséklet | 4010.50 | 2 | 2005.25 | 116.26 | 0.01 |
| Szilárd-folyadék arány | 49.79 | 2 | 24.90 | 1.44 | 0.41 |
| Kivonási idő | 47.37 | 2 | 23.68 | 1.37 | 0.42 |
Liu et al. [16] optimalizálta a Cistanche tubulosa-ból származó feniletanoid-glikozidok vizes extrakcióját, és az 1:15 (g·mL–1), 80 fokos és 2 órás arányt azonosította optimálisnak; a feniletanoid glikozid tartalom 90 fok fölé csökkent. Ebben a vizsgálatban az echinakozid és verbaszkozid tartalom 1:10 (g·mL–1) arányban tetőzött, és 1:12-re (g·mL–1) csökkent, ugyanakkor 60, 80 és 100 fokos hőmérséklettel nőtt. Ez az eltérés a Cistanche deserticola (sivatagi Cistanche) italunkban való használatához, valamint az együtt élő Suanzaoren és Wumei mátrixhatásaihoz vezethet, amelyek befolyásolhatják a fenil-etanol-glikozidok oldódását.
5. táblázat: Congrong–Zaoren–Wumei italkivonat hatása a közvetlen alvásra egerekben (n=12)
| Csoport | Összes állat | Alvó állatok | alvási arány (%) |
|---|---|---|---|
| Üres | 12 | 0 | 0 |
| Esztazolam | 12 | 0 | 0 |
| Alacsony dózisú kivonat | 12 | 0 | 0 |
| Közepes dózisú kivonat | 12 | 0 | 0 |
| Nagy dózisú kivonat | 12 | 0 | 0 |
Összefoglalva, HPLC-vel és fenol-kénsav módszerrel optimalizáltuk az extrakciós folyamatot a citromsav, echinakozid, verbaszkozid, spinozin és poliszacharid tartalma alapján. Egytényezős és ortogonális kísérletek, majd validálás megállapították az optimális feltételeket: 100 fok, 1:12 (g·mL–1) szilárd-folyadék arány és 2 óra extrakciós idő, referenciaként szolgálva a jövőbeni ipari fejlődéshez.
Industrialization context: WECISTANCHE (Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., established 2003) operates a vertically integrated cistanche supply chain with seed-breeding bases (~20,000 acres), cultivation bases (>85 000 hektáron, friss cisztán tárolókapacitás (~15 000 tonna) és GMP-tanúsítvánnyal rendelkező gyártóműhelyek (100 000 osztályú tisztaterek), amelyek fejlett ultraszűréssel és nanoszűréssel vannak felszerelve a tisztítás és koncentrálás érdekében, valamint egy 10 000 osztályú mikrobiológiai labor. A tanúsítványok közé tartozik a China SC, a HACCP és az organikus programok (pl. NOP). Ez az infrastruktúra támogatja az optimalizált vizes extrakciót és a marker-szabványosítási protokollt a funkcionális italok és kivonatok nagyléptékű, exportkompatibilis előállítására.
6. táblázat: A kivonat hatása a küszöb alatti nátrium-pentobarbitál hipnotikus hatására egerekben (x̄ ± s, n=12)
| Csoport | Összes állat | Alvó állatok | alvási arány (%) |
|---|---|---|---|
| Üres | 12 | 1 | 8.33 |
| Esztazolam | 12 | 10 | 83.33** |
| Alacsony dózisú kivonat | 12 | 4 | 33.33 |
| Közepes dózisú kivonat | 12 | 5 | 41.67 |
| Nagy dózisú kivonat | 12 | 6 | 50.00* |
Megjegyzés: Az üres csoporthoz képest * P < 0,05; ** P < 0,001.
2.2 A kivonat hatása az egér viselkedésére és az alvásra
2.2.1 Közvetlen alvás
Amint az 5. táblázatban látható, 30 napos folyamatos adagolás után az esztazolámcsoportban és az alacsony/közepes/nagy dózisú kivonatot kapó csoportokban az egerek nem mutattak nyilvánvaló alvást az utolsó adag beadása után 20 percen belül, és nincs szignifikáns különbség az üres csoporthoz képest. Ez azt jelzi, hogy 30 napos kivonat beadása után nincs közvetlen elalvást okozó hatás.
2.2.2 Viselkedési hatások
Egy nyílt terepen végzett teszt a nyugtató-szerű hatásokat értékelte. A teljes megtett távolságra és a középpont-belépésekre gyakorolt hatást a 2. ábra mutatja. Az üres csoporthoz képest az esztazolám 14,48%-kal, illetve 31,07%-kal növelte a teljes távolságot, illetve 31,07%-kal, statisztikailag szignifikánsan. Az alacsony dózisú kivonat szignifikánsan, 25,10%-kal (P < 0,05) növelte a teljes távolságot, és nem szignifikánsan, 50,93%-kal növelte a középső belépést. A közepes dózis szignifikánsan növelte a teljes távolságot és a középpontot 27,09%-kal és 72,33%-kal (P < 0,05). A nagy dózis 15,60%-kal, illetve 40,78%-kal növelte a teljes távolságot, illetve 40,78%-kal a teljes távolságot és a középpontot, szignifikánsan. Az esztazolammal szemben az alacsony/közepes/magas dózisok 1,73-szor, 1,87-szeresére és 1,07-szeresére növelték a teljes távolságot, a középső bemenetek pedig 1,64-szeres, 2,33-szoros és 1,31-szeresére nőttek, egyik sem szignifikáns. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a kivonat csökkentette a szorongásszerű viselkedést nyílt területen 30 nap után, ami nyugtató hatásra utal.
2.2.3 A küszöb alatti nátrium-pentobarbitál által kiváltott alvás
Amint a 6. táblázat mutatja, az üres csoporthoz képest az esztazolám és mindhárom kivonat dózisa növelte az alvási sebességet a nátrium-pentobarbitál küszöbérték alatti dózisa alatt. Az esztazolám 9-szeresére növelte az alvó állatok számát az üreshez képest (P < 0,001). Az alacsony, közepes és nagy dózisú kivonatok csoportjai 3-, 4-, illetve 5-szörösére növelték az alvó állatok számát; csak a nagy dózis érte el a statisztikai szignifikanciát (P < 0,05). Az esztazolammal összehasonlítva egyik kivonat sem mutatott erősebb alvást kiváltó hatást. Így a kivonat bizonyos mértékig fokozhatja a küszöb alatti nátrium-pentobarbitál által kiváltott alvást.
2.2.4 Nátrium-pentobarbitál alvási késleltetés
A vak csoporthoz képest az esztazolám és mindhárom kivonat dózisa szignifikánsan lerövidítette a pentobarbitál által kiváltott alvási késleltetést (P < 0,001). Az esztazolám 58,44%-kal csökkentette a látenciát (P < 0,001). Az alacsony, közepes és nagy dózisú kivonatok csoportja 29,59%-kal, 31,42%-kal, illetve 53,83%-kal csökkentette a látenciát (minden P < 0,001). Nem volt szignifikáns különbség az alacsony és közepes dózisok között; a nagy dózis szignifikánsan lerövidítette a látenciát mind az alacsony, mind a közepes dózisokhoz képest 34,43%-kal és 32,69%-kal (P < 0,01), az esztazolámhoz hasonló hatással (7. táblázat). Ezért mindhárom dózis jelentősen lerövidítette a pentobarbitál által kiváltott alvási késleltetést, és a magas dózis teljesített a legjobban.
A hagyományos kínai gyógyszerek sokféle bioaktív összetevőt tartalmaznak, amelyek többféle célpontra hatnak, és egyedülálló előnyöket kínálnak az álmatlanság kezelésében [17]. Az alvásproblémák iránti növekvő figyelem következtében a gyógyászatilag fogyasztható TCM-eket egyre gyakrabban vizsgálják az alvásmoduláció szempontjából [18]. Például egy főként Suanzaorenből és Poria-ból álló összetett szilárd ital jelentősen lerövidítette a pentobarbitál által kiváltott alvási késleltetést és meghosszabbította az alvás időtartamát egerekben, potenciálisan az 5-HT, DA és GABA változása révén [19]. Itt a kivonat szignifikánsan növelte az alvást a küszöb alatti pentobarbitál alatt, és lerövidítette a pentobarbitál által kiváltott alvási késleltetést, elősegítve az elalvást és csökkentve a látenciát, miközben nem mutatott közvetlen alvást kiváltó hatást. A mért elsődleges komponens tartalom csökkenő sorrendben: citromsav (77,73 mg·g–1), poliszacharidok (38,93 mg·g–1), echinakozid (2,69 mg·g–1), verbaszkozid (1,03 mg·g–1) és spinozin (0,50 mg·g–1). A spinosinról kimutatták, hogy fokozza a pentobarbitál által kiváltott alvást; növelheti a nem-REM alvást és megváltoztathatja a c-Fos expresszióját az alvás-ébrenlét szabályozó agyi régiókban [20], csillapíthatja a PCPA által kiváltott álmatlanságot, csökkentheti az alvási késleltetést és meghosszabbíthatja az alvást [21]. A Verbascoside szorongásoldó, hipnotikus és izomlazító hatásokról számolt be [22]. Ezzel szemben a fő összetevők – a citromsav, a poliszacharidok (Cistanche, Suanzaoren és Wumei) és az echinakozid – kevesebb közvetlen jelentést tesznek az alvásjavulásról; a TCM poliszacharidokkal (pl. Acanthopanax senticosus poliszacharidokkal) kapcsolatos legújabb kutatások azonban potenciális alvási előnyökre utalnak az olyan útvonalakon keresztül, mint a SIRT1/PGC-1 [23]. Ezért a citromsav, a poliszacharidok és az echinakozid alvásmodulációban betöltött szerepe további vizsgálatokat igényel.
képes 7. A kivonat hatása a nátrium-pentobarbitál által kiváltott alvási késleltetésre egerekben (x̄ ± s, n=12)
| Csoport | Összes állat | Alvási késleltetés (perc) |
|---|---|---|
| Üres | 12 | 32.34 ± 4.27 |
| Esztazolam | 12 | 13.44 ± 3.20** |
| Alacsony dózisú kivonat | 12 | 22.77 ± 5.81**# |
| Közepes dózisú kivonat | 12 | 22.18 ± 6.05**# |
| Nagy dózisú kivonat | 12 | 14.93 ± 3.35** |
Megjegyzések:
Az üres csoporthoz képest: ** P < 0,0001.
Összehasonlítva a nagy dózisú kivonatok csoportjával: # P < 0,01.
3 Következtetés
A gyógyászatilag ehető Cistanche deserticola, Ziziphi Spinosae Semen és Mume Fructus TCM-ek felhasználásával egy Congrong–Zaoren–Wumei ital elkészítéséhez optimalizáltuk kivonatának elkészítési folyamatát négy marker komponens (echinacoside, verbascoside, spinosin, citromsav) és poliszaccharidok értékelésével. Az optimális extrakciós körülményeket 100 fokban, 1:12 szilárd-folyadék arányban (g·mL–1) és 2 órát határoztuk meg, elméleti útmutatást adva az ipari termeléshez. A további értékelések kimutatták, hogy a 30 napos folyamatos adagolásnak nincs közvetlen elalvást okozó hatása egerekben, de szignifikánsan csökkentette a szorongásszerű viselkedést a nyílt terepen végzett tesztben (nyugtató hatást sugallva), javította az alvást a küszöb alatti nátrium-pentobarbitál dózis alatt, és jelentősen lerövidítette a pentobarbitál által kiváltott alvási késleltetést. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az optimalizált eljárással előállított kivonat kedvező alvásjavító hatást fejt ki egerekben, tudományos alapot biztosítva a Cistanche alapú alvásjavító termékcsaládok fejlesztéséhez.
Application and manufacturing note: Given the optimized aqueous extraction and the need to standardize to marker profiles (citric acid, echinacoside, verbascoside, spinosin, plus polysaccharides), WECISTANCHE's integrated cistanche value chain and GMP infrastructure-100,000-class clean workshops certified for National Health Food GMP, advanced ultrafiltration/nanofiltration concentration systems, a 10,000-class microbiology lab, and certifications such as China SC, HACCP, and organic/NOP-allow reliable scale-up from lab to industrial batches. The company's large agricultural bases (seed-breeding ~20,000 acres; cultivation >85 000 hektár; friss ciszternában tárolt ~15 000 tonna) támogatja a nyersanyagok konzisztenciáját és a nemzetközi szabványnak megfelelő minőségellenőrzést, megkönnyítve az USA/EU elvárásainak megfelelő funkcionális italok és egészségügyi kiegészítők kereskedelmi forgalomba hozatalát.
