A génexpressziós szint CRISPRi által közvetített hangolható szabályozása tervezett egyvezető RNS-sel Escherichia coliban

ABSZTRAKT

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-fold). Ezek az sgRNS-ek lehetővé tették a moduláris szabályozást is különböző cél-DNS-szekvenciákkal. Ezt a rendszert a metabolikus fluxus újraelosztására alkalmaztuk, hogy előre látható arányban violacein származékokat állítsunk elő, és optimalizáljuk a likopintermelést. Ez a rendszer segítene felgyorsítani a fluxusoptimalizálási folyamatokat az anyagcsere-mérnökségben és a szintetikus biológiában.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

BEVEZETÉS

A II-es típusú Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-asszociált (Cas) rendszer egy RNS által vezérelt DNS hasítási rendszer, amely CRISPR RNS-ből (crRNS), transzaktiváló CRISPR RNS-ből (tracrRNS) és egy Cas9 fehérjéből áll (1). ,2). A Streptococcus pyogenesből származó Cas9-et jól jellemzett tulajdonságai miatt széles körben alkalmazzák a genomtervezésben (3, 4). Az spCas9 fehérje, a tracrRNS és a crRNS komplexe megköti és hasítja a crRNS 20 nukleotidos (nt) spacer szekvenciájával komplementer cél-DNS protospacert 5'-NGG-3' protospacer szomszédos motívum (PAM) jelenlétében. ) sorozat (5,6). A rendszer egyszerűsítésére kiméra egyvezető RNS (sgRNS) használható, ahol a crRNS és a tracrRNS egy mesterséges linkerrel, úgynevezett tetraloop-al van összekötve (5). Lehetővé teszi két különálló RNS helyettesítését egyetlen RNS-molekulával, így a rendszer kezelhetőbbé válik. Az egyik CRISPR-alapú rendszer, a CRISPR interferencia (CRISPRi) egy katalitikusan inaktív Cas9-et (dCas9) használ azáltal, hogy az egyes endonukleáz doménekből bizonyos aminosavakat helyettesít (7). Ez a módosítás ribonukleoprotein (RNP) komplexet hoz létre, amely képes irányítani és kötődni a cél-DNS-hez, és interferál az RNS-polimerázzal (RNAP), hogy gátolja a transzkripció iniciációját vagy megnyúlását (7). A CRISPR/Cas9 rendszer általi kiütéssel ellentétben a CRISPR lehetővé teszi a gének reverzibilis leütését a dCas9 vagy sgRNS expresszálásával indukálható promoter alatt, ami nagyobb rugalmasságot tesz lehetővé a génszabályozásban (7). A CRISPRi rendszer hatékonyan elnémította a célgéneket százszorosan (7,8). A célspecifikus génrepresszió lehetővé teszi a nagy áteresztőképességű fenotipizálást egy genomszintű sgRNS-készlet használatával (9), vagy átirányítja a módosított baktériumok szénáramlását a célvegyület felé (10-12). Ezen túlmenően, a multiplex CRISPRi-t különböző gazdaszervezetekben mutatták ki, különféle módszerek segítségével több sgRNS stabil kifejezésére, beleértve a hosszú crRNS-tömböket, a toehold switch-integrációt és a nem ismétlődő, extrahosszú sgRNS-tömböket (13–16). Ezeket a több gén egyidejű gátlásának technikáit összetettebb feladatok elvégzésére használták, mint például a toxikus köztitermékek csökkentésére vagy a versengő útvonalak blokkolására a bakteriális fermentációban (13, 16–19). A teljes elfojtás azonban nem mindig kívánatos az anyagcsere-tervezés szempontjából. A génexpressziós szintet pontosan szabályozni kell, hogy optimális enzimaktivitást érjünk el a növekedési és termelési útvonalak között, egyensúlyba hozva az intracelluláris prekurzor koncentrációkat és elkerülve a toxikus köztitermékek felhalmozódását (20–22). Különféle technikákat fejlesztettek ki a CRISPRi elnyomási hatékonyságának tervezésére. Számos tényezőt manipuláltak, például az sgRNS és a dCas9 fehérje mennyiségét vagy az sgRNS megválasztását. A dCas9 expressziójának vagy a dCas9 és az sgRNS expressziójának indukálható promoterrel történő szabályozása több mint 30--szeresére, illetve 300--szeresére szabályozta a célgén expresszióját (23, 24). Megfigyelték azonban, hogy a dCas9 koncentráció módosítása inkonzisztens elnyomási hatékonyságot eredményezhet a különböző protospacerekben (23). A rendelkezésre álló indukálható promóterek korlátozott száma a sok erőfeszítés ellenére is tervezési kihívásokat jelent (25). Egy másik stratégia egy ligandum-specifikus RNS-aptamer beépítése az sgRNS-be, ahol egy kis rokon molekula feltárhatja a spacer-t, így lehetővé válik a CRISPRi dózisfüggő szabályozása (26). A ligandum-specifikus sgRNS akkor hasznos, ha rendelkezésre áll megfelelő ligandum és aptamer pár. A transzkripció kezdőhelyétől való távolság és a dCas9 kötődés orientációja szintén befolyásolja a CRISPRi hatékonyságát (7). Az sgRNS kötőhely és a transzkripció kezdőhelye közötti távolság beállításával optimalizálható az anyagcsere-sebesség útja (17, 27, 28). A spacer és a protospacer szekvenciák közötti hibridizációs hatékonyság szintén megváltoztatja az RNP komplex kötési hatékonyságát (29-31). Ezért a CRISPRi hatékonyságának diverzifikálása érdekében a magterületen kívül tervezett eltéréseket vezettek be a szabad energia megváltoztatására (31, 32). Az sgRNS megtervezése azonban minden új célszekvenciához szükséges, és a szabad energia jelentős különbségének elérése csak a nem illesztés révén kihívást jelenthet. Ezenkívül fennáll a megnövekedett célon kívüli kötődés lehetősége (33). Mindazonáltal továbbra is több génexpresszió moduláris elnyomására korlátozódik, függetlenül a célszekvenciától. Ebben a tanulmányban hangolható CRISPRi rendszert fejlesztettünk ki, amely nagy pontossággal és kiszámíthatóan szabályozza a génexpressziót. Az sgRNS könyvtár tetraloopot és az azt szegélyező régiót célzó iteratív fluoreszcencia alapú sejtválogatással akár 45--szeres transzkripciós repressziós hatékonyságot értünk el, még akkor is, ha a cél-DNS megváltozott. Ez a rendszer lehetővé teszi a metabolikus fluxus kiszámítható újraelosztását a gazda genomjának vagy a szintetikus útvonalak manipulálása nélkül, ígéretes eszközt biztosítva az anyagcsere-utak optimalizálásához.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Bakteriális törzsek, plazmidok és reagensek

A tanulmányban használt Escherichia coli törzseket és plazmidokat az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza. A tanulmányban használt primerek az S2 kiegészítő táblázatban vannak felsorolva. A klónozási eljárásokat a kiegészítő módszerek ismertetik. A CRISPR rendszer célgénjeit és célzott DNS-szekvenciáit az S3 kiegészítő táblázat mutatja. A Mach1-T1R-t általános klónozáshoz használták. A könyvtárat NEB 5-alpha Electrokompetens E. coli (NEB) felhasználásával hoztuk létre. A plazmidok és törzsek megalkotásához szükséges rutintenyészeteket 37°C-on Luria-Bertani (LB) táplevesben vagy megfelelő antibiotikumokat (34 g/ml kloramfenikol, 50 g/ml spektinomicin) tartalmazó LB agar lemezen végeztük. A PCR-t Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB) alkalmazásával végeztük. A plazmidokat és a PCR-termékeket GeneAll® Exprep™ Plasmid SV Kit és Gel SV Kit (GeneAll Biotechnology) segítségével tisztítottuk. Az sgRNS-mutánsok repressziós hatékonysága Az éjszakai táptalajt 0,05 OD600 értékre frissítettük, és addig inkubáltuk, amíg el nem érte a 0,6 és 0,8 közötti értéket. A táptalajt ezután 0,05 OD600-ra hígítottuk 20 ng/ml aTc-vel, és 4 órán át inkubáltuk. Egyetlen telep fluoreszcenciáját 575 nm/616 nm-en mértük Hidex Sense mikrolemez-leolvasóval (Hidex), az OD600 értéket pedig Jenway 7300 spektrofotométerrel (Jenway) határoztuk meg. A relatív fluoreszcenciát a fluoreszcencia egységenkénti OD600 értékként számítottuk ki, a PC értékét 100%-ra állítottuk.

A Cistanche tubulosa hatásai a székrekedés kezelésére

sgRNS könyvtár szűrése

Ugyanazt a kultúrmódszert alkalmaztuk, mint a fent leírt. A táptalajt [sejtre] hígítottuk<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

RNS extrakció

A teljes RNS-t csak az RNeasy Mini Kit (Qiagen) segítségével extraháltuk, amikor a miRNeasy Mini Kit-et (Qiagen) az sgRNS mennyiségi meghatározásához RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) kezelés és –80 °C-on való tárolás után. Az extrakció során a DNS-emésztést oszlopon RNase-Free DNase Set (Qiagen) segítségével végeztük. A DNS-szennyeződést reverz transzkripció nélküli PCR-rel igazoltuk. Az egyes minták koncentrációját és tisztaságát NanoDrop One (Thermo Scientific) segítségével határoztuk meg, a minőséget pedig egy DNS 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) segítségével egy LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer) készüléken.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

RT-qPCR elemzés

Az RT-qPCR primereket vagy laboratóriumi készletből szerezték be, vagy a Primer3Plus eszközzel (34) tervezték, és az S4 kiegészítő táblázatban szerepelnek. A CysG gént referenciagénként (35) használták minden RT-qPCR kísérletben. Egy szabványos görbét úgy állítottunk elő, hogy 10-egy sablont 107 másolat/l-ről 10-1 másolat/l-re hígítottunk. A mennyiségi meghatározás határát úgy határoztuk meg, hogy a kópiaszámot és a pozitív amplifikációs rátát egy szigmoid függvényre illesztettük, és kiszámítottuk a 95%-os pozitív kópiaszám értékét. A lineáris dinamikatartományt úgy határoztuk meg, mint azt a legalacsonyabb másolatszámot, amelynél az utólag számított Cq-variáció kisebb, mint 35%. A 30 feletti Cq értékeket, vagy azokat, amelyeket nem amplifikálnak a nem-templát kontrollban, validáltuk. A standard görbe adatai az S5 kiegészítő táblázatban és az S1 kiegészítő ábrában érhetők el. Összesen 2,5 ng teljes RNS-t használtunk fel egy 10 literes RT-qPCR reakcióban Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kittel (NEB). Az RT-PCR-t három példányban végeztük StepOnePlus™ RealTime PCR rendszeren (Applied Biosystems) a következő lépésekkel: (i) reverz transzkripció 55 °C-on 10 percig, majd denaturálás 95 °C-on 1 percig; (ii) 40 hőciklus 95 °C-on 10 másodpercig és 60 °C-on 1 percig; (iii) olvadásgörbe elemzése 95 °C-on 15 másodpercig és 60 °C-on 1 percig, majd 60 °C-ról 95 °C-ra történő felfutás követi 0,3 °C/perc sebességgel. Az RNS relatív mennyiségi meghatározását a delta-deltaCt módszerrel (36) határoztuk meg, és StepOnePlus™ szoftverrel (Applied Biosystems) analizáltuk.

RNS-szekvenálás (RNA-seq) és adatelemzés

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 FPKM (Fragments Per Kilobase of Transscripts per Million Mapped Reads) alapján. A differenciálisan expresszált géneket az 1,5-ös (log2-alapú) és 0,01-es (q-érték) küszöbtől kaptuk.

Proviolacein és prodeoxyviolacein termelés és mintavétel

A violacein és prodeoxiviolacein előállításához a következő táptalaj-összetételt használtuk: 10,7 g/l K2HPO4, 5,2 g/l KH2PO4,1g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}},2 g/l élesztőkivonat és 1{{20}} g/l glükóz. Egy éjszakai táptalajt 0,1 OD600 értékre frissítettünk, és addig tenyésztettük, amíg az OD600 el nem érte a 0,6 és 0,8 közötti értéket. A táptalajt ezután 0,1 OD600-ra hígítottuk, és 500 ng/ml aTc-vel, 0,05 mM IPTG-vel és 0,1 g/l L-triptofánnal egészítettük ki 5 ml végtérfogatig. 300 l tápközegből mintát vettünk, és 5 percig centrifugáltuk 14 000 fordulatszámmal, hogy sejtpelletet kapjunk a HPLC elemzéshez, és 300 l tápközegből vettünk mintát az RNS extrakcióhoz.

HPLC elemzés

A violacein bioszintetikus útvonal elemzéséhez a sejtpelletet {{0}} térfogatú metanolban újraszuszpendáltuk, 5 percig ultrahanggal kezeltük, centrifugáltuk, és egy 0.22-m nejlonszűrőn szűrtük. A HPLC analízis a (42) módszert követte Poroshell 120 EC-C18, 4,6 × 150 mm, 4 m oszloppal (Agilent). Két mozgó fázist, A 0,1% hangyasavat tartalmazó DDW-t és B-t 0,1% hangyasavval acetonitrilben, 0,6 ml/perc áramlási sebességgel használtunk a következő gradiensprofillal: 95% A 1,5 percig, az A felfutása 95-ről %-ról 2%-ra 4 percig, 2% A fenntartása 2 percig, A felfutása 2%-ról 95%-ra 30 másodpercig, és 95% A fenntartása 10 percig. A mintákat PDA detektorral detektáltuk, és a HPLC-területet 600 nm-en violaceinnél és 610 nm-en prodeoxiviolaceinnél határoztuk meg.

Likopin előállítás és mintavétel

A likopin előállításához a következő táptalaj összetételt használtuk: 13,56 g/l Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1g NaCl, 2 ml 1 M MgSO4, 0.1 ml 1 M CaCl2 és 4 g/l glükóz (22). 27 g/ml kloramfenikolt és 50 g/ml spektinomicint használtunk. Egy éjszakán át tartó táptalajt OD600 értékre 0,1-re frissítettünk 5 ml-es végső térfogatra. Amikor az OD600 elérte a 0,5 és 0,6 közötti értéket, az aTc-t az 500 ng/ml végső koncentrációig, és amikor az OD600 elérte a 0,9 és 1 közötti értéket, IPTG-t adtunk a 0,02 mM végső koncentrációig. A likopint acetonnal extraháltuk a (22) hivatkozásban leírtak szerint. A likopin koncentrációját a 475 nm-en mért abszorbancia alapján határoztuk meg Jenway 7300 spektrofotométerrel, standard görbe alkalmazásával. 300 l tápközegből mintát vettünk az RNS extrakcióhoz.

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS

Az sgRNS mutációinak hatása a CRISPR rendszer repressziós hatékonyságára

A CRISPRi rendszer képes elnyomni a génexpressziót, ha a dCas9–sgRNS–DNS hármas komplex erősen kötődik egymáshoz. Feltételeztük, hogy a CRISPRi rendszer repressziós hatékonysága egy bizonyos szintre módosítható az RNP komplex képződésének modulálásával. A CRISPR rendszer repressziós hatékonyságának számszerűsítésére megterveztünk egy fluoreszcencia jelentési rendszert, amely a genetikai körön alapul, ahol a S. pyogenesből származó dCas9-et anhidrotetraciklin (aTc) indukálja, és mind a riportergén (mCherry), mind az sgRNS-változatok konstitutívan expresszálódnak (ábra). 1A). Ha aTc-t adunk a táptalajhoz, a dCas9–sgRNS–DNS hármas komplex blokkolja a riportergén transzkripcióját, és a fluoreszcencia szintje fordítottan jelzi a CRISPR rendszer repressziós hatékonyságát. Az sgRNS összesen 96 nukleotidot (nts) tartalmaz. A spacer régió (az első 20 nt) a cél DNS szekvenciához kötődik, a többi 76 nt pedig hozzájárul a komplex kialakulásához és stabilitásához. Mivel a spacer régióban tapasztalható eltérések elveszíthetik a specifitást, és növelhetik a célon kívüli hatásokat a CRISPR-alapú rendszerben (33, 43), a szerkeszthető sgRNS maximális hossza 76 nt. Ebben az esetben 476-os (körülbelül 1045-ös) könyvtárméretet kell kapni, de ez túl nagy ahhoz, hogy meg lehessen építeni. Ezért szükséges a könyvtár méretének szűkítése az sgRNS specifikus pozícióinak meghatározásával. Először azt vizsgáltuk, hogy az sgRNS mutációi az egyes régiókban hogyan befolyásolják a CRISPR rendszer represszióját. Egy korábbi tanulmány arról számolt be, hogy az 1. szár hurok (sg mut01 és sg mut02) mutációi a Cas9 nukleáz aktivitásának jelentős csökkenéséhez vezettek, míg a szár-hurok 2 (sg mut03) vagy a szár-hurok 3 (sg) mutációi mut04) nem befolyásolta tevékenységét (44). Egy rekonstruált sgRNS (sg mut05), amely mutációkat tartalmaz a szár-hurok 1 régióban és az ismétlődő, tetraloop, anti-repeat és stem-loop 2 régiókban, szintén csökkentette a nukleázaktivitást (44). A CRISPRi rendszerben azonban mind az öt sgRNS-változatnak csekély hatása volt a repressziós hatékonyságra a vad típusú sgRNS-hez (sg WT) képest, és mindegyik változat 2-4%-os fluoreszcenciaszintet mutatott a spacer régió nélküli pozitív kontrollhoz képest. sg PC) (1B. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a CRISPRi rendszerben a dCas9-sgRNS komplex kialakulása kevésbé érzékeny a szekvencia módosítására a szár-hurok 1 régióban, ellentétben a CRISPR/Cas9 rendszerrel. Feltételeztük, hogy a komplex stabilitásával kapcsolatos régiók eltávolítása kiindulópont lehet az expresszió több szinten történő további szabályozásához. Ebből a célból létrehoztunk egy csonka sgRNS-t (sg trcSL1), amelyből hiányzik a linker, a szár-hurok 2 és a szár-hurok 3. Ez a csonkolt sgRNS minimális számú komponenst tartalmaz, és kimutatták, hogy jelentősen csökkenti a nukleáz aktivitást a CRISPR/ Cas9 rendszer (5,44). A CRISPRi rendszerben tesztelve ez a hibás mutáns 8%-os fluoreszcenciaszintet mutatott az sg PC-hez képest, ami arra utal, hogy még csökkent hármas komplex stabilitás mellett is képes kötődni a dCas9-hez és egy bizonyos szinten elnyomni a kérdéses gént (1B. ábra). Az RNP komplex szerkezeti elemzése azt sugallja, hogy az sgRNS linker, szár-hurok 2 és szár-hurok 3 régiói felelősek a komplex stabilizálásáért a dCas9 nukleáz doménjével való kölcsönhatásaik révén, ami az indel jelentős csökkenéséhez vezet. hatékonyság a CRISPR/Cas9 rendszerben (44). Ezzel szemben az sgRNS ismétlődő régiója és stem-loop 1 főként a dCas9 felismerési doménjével és PAM-interakciós doménjével lép kölcsönhatásba, és nem befolyásolja jelentősen az indel hatékonyságát a CRISPR/Cas9 rendszerben (44). Ez az eredmény alátámasztja azt a megfigyelést, hogy az sg trcSL1 szignifikánsan csökkentette a nukleázaktivitást a CRISPR/Cas9 rendszerben, miközben csak kis mértékben befolyásolta a kötési affinitást a CRISPRi rendszerben.

1. ábra. A rendszer felépítése és az sgRNS-mutáció hatása a represszió hatékonyságára. (A) Két plazmid rendszer a repressziós hatékonyság számszerűsítésére. Az egyik p15A eredetű plazmid egy aTc-indukálható promoter alatt tartalmazza a dCas9 gént és egy konstitutív promoter alatt az mCherry gént. A másik cloDF13 eredetű plazmid vad típusú vagy mutáns sgRNS-t tartalmaz egy konstitutív promoter alatt. (B) Az egyes sgRNS mutánsok (sg mut01 ~ sg mut05 és sg trcSL1) és sg WT relatív fluoreszcenciája sg PC-vel összehasonlítva. A +1 - + 20 a spacer szekvencia, amely az mCherry génhez kötődik. sg PC: sgRNS spacer nélkül pozitív kontrollként, sg WT: vad típusú sgRNS. A hibasávok a szórást jelzik (n=3). A P-értékeket páratlan t-próbával határoztuk meg. ns: nem szignifikáns, **P< 0.01

A komplexképzés hatékonyságának változtatása többszintű expressziós kontrollhoz

A Tetraloop egy mesterséges linker, amely összeköti a crRNS-t és a tracrRNS-t a CRISPR-Cas9 rendszerben (5). A dCas9-ből, crRNS-ből és tracrRNS-ből álló hármas komplex kristályszerkezete azt mutatta, hogy a tetraloop és az azt 5 és 3 szegélyező régió alig érintkezik a dCas9-cel (44). Ugyanakkor az ismétlés: ismétlésellenes és a szár-hurok 1 régiók kritikusak a funkcionális komplexum szempontjából (44). Mivel nem lép közvetlen kölcsönhatásba a dCas9-cel, a tetraloopot és az azt szegélyező régiókat feltárták, mint potenciális helyeket az sgRNS-nek további komponensekkel, például aptamer szekvenciák beépítésével, hogy további fehérjéket toborozzanak az sgRNS-be (45, 46). Valószínű, hogy a mutációk ebben a régióban diverzifikálhatják az sgRNS és a dCas9 közötti kötődési affinitást anélkül, hogy a komplexet teljesen megzavarnák. Egy 12- mer random könyvtárat (4 nt a tetraloop régióból és 4 nt 5 és 3 határoló régiót) hoztunk létre az sg trcSL1 mint templát felhasználásával, hogy tovább csökkentsük az sgRNS és a dCas9 közötti komplexképzés hatékonyságát (2A ábra). ). Kétlépcsős válogatási stratégiát alkalmaztunk, hogy különböző sgRNS-mutánsokat kapjunk, amelyek lefedik a repressziós hatékonyságot az sg WT (teljesen elnyomó állapot) és az sg PC (nem elnyomó állapot) között. Az eredeti könyvtárat kisebb könyvtárakra osztottuk, különböző fluoreszcencia-intenzitás-tartományokkal, majd egyenként azonosítottuk az egyes sgRNS-változatok fluoreszcenciáját a kisebb könyvtárból. Az áramlási citometriával nyert eredeti könyvtár fluoreszcencia eloszlása ​​majdnem azonos volt az sg PC-éval (2B. ábra). Három egymást követő válogatási lépés után azonban mindegyik könyvtár (magas, közepes és alacsony) 63%-os, 24%-os és 14%-os medián fluoreszcenciaszinttel rendelkezett az sg PC-hez képest (2B. ábra). Nyolcvankét telepet izoláltunk ezekből a kisebb könyvtárakból, a fluoreszcencia szintje 8% és 104% között volt (2C. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a mutáló tetraloop és az sgRNS szegélyező régiója módosíthatja a dCas9 és az sgRNS közötti kötődési affinitást a különböző repressziós hatékonyságok érdekében. 10 sgRNS mutáns (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10, S6 kiegészítő táblázat) reverz transzkripciós kvantitatív PCR (RT-qPCR) analízise sg WT és sg PC között különböző fluoreszcencia jelekkel 82 sgRNS megnövekedett traszkriptum kolónia között azt mutatta, hogy , jelezve, hogy CRISPRi rendszerünk a génexpressziót transzkripciós szinten szabályozza (S2 kiegészítő ábra). Hangolható CRISPRi rendszerünk mesterséges sgRNS-eket használ, amelyek akár 45--szeres represszió-szabályozást is elérhetnek, lehetővé téve az elnyomás hatékonyságának finomhangolását a dCas9 vagy sgRNS mennyiségének megváltoztatása nélkül. Rendszerünk jelentős előnye, hogy képes finomhangolni a repressziós hatékonyságot specifikus sgRNS-variánsokon keresztül anélkül, hogy nemkívánatos következményekkel járna, még akkor is, ha további klónozásra van szükség. Ezenkívül a növekedési görbe azt sugallja, hogy rendszerünk nem jelent jelentős sejtterhelést (S3 kiegészítő ábra). Továbbá, az RNS-Seq három sg trcSL1 variánson, különböző szintű repressziós hatékonysággal azt mutatta, hogy 51-83 gén expressziója megváltozott, ellentétben az sg WT-ben megváltozott 262 génnel (S4 kiegészítő ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az sg trcSL1 variánsok még kisebb off-target hatásokkal rendelkeztek, mint a hagyományos CRISPRi rendszer. Különösen fontos az anyagcsere-mérnöki alkalmazásokban, ahol az anyagcsere-utak optimalizálása gyakran több gén manipulálásával jár. A génexpresszió finomhangolása anélkül, hogy negatív mellékhatásokat okozna, jelentősen felgyorsíthatja az optimalizálási folyamatot, és javíthatja a rendszer általános hatékonyságát és termelékenységét.

2. ábra. Az sgRNS könyvtár szerkezete és a könyvtár szűrése. (A) ebben a vizsgálatban használt sgRNS-váz. A tetraloopot tartalmazó 12-mert és az azt szegélyező szekvenciát véletlenszerűen mutálják az sg trcSL1-ből, hogy sgRNS-könyvtárat kapjanak. (B) Áramlási citometriával kapott fluoreszcencia eloszlás a válogatás előtt (balra) és után (jobbra). Minden eloszlás 100,000 cellát tartalmaz. (C) A (B)-ből nyert egyedi telepek fluoreszcenciája. A hibasávok a standard eltérést jelzik (n=2).

A dCas9 és az sgRNS mennyiségének hatása a represszió hatékonyságára

Mivel akár a dCas9, akár az sgRNS mennyiségének módosítása megváltoztathatja a CRISPRi rendszer repressziós hatékonyságát (23, 24), elengedhetetlen megvizsgálni a dCas9 és az sgRNS mennyiségének hatását a represszió hatékonyságára. Tíz sgRNS mutáns (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10) segítségével teszteltük rendszerünk teljesítményét különböző körülmények között a dCas9 és az sgRNS mennyiségének változtatásával. Az induktor három különböző koncentrációját (20, 100 és 500 ng/ml) alkalmaztuk a dCas9 expressziójához. Összehasonlítva a dCas9 mRNS szintjével, amikor 20 ng/ml induktort használtunk, az tovább nőtt 15--szeresére (100 ng/ml) és 22--szeresére (500 ng/ml) (S5A kiegészítő ábra). ). Aggodalomra ad okot a dCas9 túlzott expressziója, mivel a dCas9 magas szintje mérgező lehet a sejtekre (47, 48), vagy néha nem (49). A növekedési sebesség azonban kevesebb, mint 10%-kal csökkent, ha legfeljebb 500 ng/ml aTc-t használtunk, a növekedési görbék szerint különböző induktorkoncentrációknál (S6 kiegészítő ábra). Ez arra utal, hogy a dCas9 mennyisége nem volt toxikus hatással E. colira a vizsgált körülmények között. Az elnyomás hatékonysága kismértékben megváltozott, amikor a dCas9 eltérő mennyiségét kifejeztük (3A ábra). Egy korábbi vizsgálattal összhangban volt, hogy a CRISPRi rendszer [aTc] mellett érte el a maximális elnyomási hatékonyságot< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

3. ábra A hangolható CRISPRi rendszer jellemzése és modularitása. (A) Relatív fluoreszcencia különböző aTc koncentrációk mellett (20, 100 és 500 ng/ml). (B) Relatív fluoreszcencia különböző promóterek alatt (J23100 és UPJ23119). (C) Relatív fluoreszcencia különböző protospacerekben. Az x-tengely az mCherry relatív fluoreszcenciáját, az y-tengely pedig a lacI33-mCherry (piros) és az araC33-mCherry (kék) relatív fluoreszcenciáját jelzi. 33 bp további lacI és araC szekvenciát adtunk az mCherry (56) 5-végéhez. (D) A 12-mer szabad energiája és a relatív fluoreszcencia. A szaggatott vonalak 95%-os előrejelzési intervallumot, a folytonos vonalak pedig a regressziós vonalat jelzik. Az sg trcSL1c2 dG értékét nem lehetett megszerezni az mFold használatával, ezért kizárták az elemzésből. (A–D) Minden hibasáv a szórást jelzi (n=3).

A hangolható CRISPRi rendszer modularitása

Megközelítésünk, amely specifikus sgRNS-variánsokat használ a cél-DNS bizonyos expressziós szintjének fenntartásához, moduláris rendszerként is használható. Annak demonstrálására, hogy a hangolható CRISPRi rendszer megvalósítható-e különböző protospacer-ek megcélzására, két fúziós gént (lacI{{0}}mCherry és araC33-mCherry) hoztunk létre 33 bps lacI és araC szekvenciák hozzáadásával. az mCherry (56) 5 -végéig. Az E. coli BL21(DE3) genomja (GenBank: CP001509.3) a lacI33- mCherry protospacer szekvenciájának két másolatát és az araC33-mCherry egy példányát tartalmazza. Ezek a kromoszómális szekvenciák azonban nem tartalmaznak PAM-szekvenciákat, ezért a dCas{11}}sgRNS komplex nem célozhatja meg őket (43). Amikor az siRNS-eket úgy tervezték, hogy megcélozzák az egyes protospacereket, a repressziós hatékonyság következetesen megmaradt a lacI33, araC33 és mCherry összes protospacer esetében (3C. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy hangolható CRISPRi rendszerünk egy bizonyos szinten hatékonyan képes szabályozni a génexpressziót, függetlenül a protospacer szekvenciától. Az RNP komplex képződése és az elnyomás hatékonysága közötti megfigyelt kapcsolat egyik lehetséges magyarázata a szabad energia változása a komplex kialakulásakor. A mesterséges tetraloop linker és az azt szegélyező régió két A: U és G: C Watson-Crick bázispárt és egy A: G nem Watson-Crick bázispárt tartalmaz (44). Mivel a crRNS és a tracrRNS kötődése kulcsfontosságú a komplexképzéshez, a tetraloopot célzó mutációk befolyásolhatják a dCas9 és az sgRNS közötti kötődési affinitást. Ez az affinitás a korlátos és korlátlan állapotok szabadenergia-különbségéből számítható ki. A korlátos állapotok szabad energiájának kiszámítása azonban kihívást jelent (57). Feltételeztük, hogy a korlátos állapot általános szerkezete és stabilitása nem változik, mivel a könyvtárból kiválogatott sgRNS-ek nem zavarták meg teljesen a funkcióját. Ezenkívül a tetraloop és az azt szegélyező régió kevéssé érintkezik a dCas9-vel (44). Ezért a dCas9 és az sgRNS közötti kötődési affinitást főként a tetraloop másodlagos szerkezetének stabilitása és a határoló szekvenciája befolyásolja. Ezen ötlet alapján kiszámítottuk a tetrahurok és az azt szegélyező szekvenciák szabad energiáját öntőforma segítségével (58). A mutációkból adódó folding szabadenergia-különbsége a mutált és a vad típusú szekvenciák szabad energiája közötti különbség. Ez közvetlenül kiszámítható a mutánsok feltekeredésének szabad energiájából, mivel a vad típusú szekvencia hajtogatási energiája állandó –4,3 kcal/mol. Ahogy a hajtogatás szabad energiája nőtt, a fluoreszcencia jel nőtt (3D. ábra). A repressziós hatásfok akkor volt a legmagasabb, ha a tetraloop-tartalmú régió hajtogatási energiája közel volt 0 kcal/mol vagy az alatt, és lineárisan csökkent, amikor a hajtogatási energia meghaladta a 0 kcal/mol értéket. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a dCas9 és az sgRNS közötti komplexképzés hatékonyságát a tetraloop régió másodlagos szerkezete határozza meg, ami segít megmagyarázni rendszerünk modularitását. Megmértük a könyvtárból származó, különböző 12-mer szekvenciákkal rendelkező további 85 sgRNS repressziós hatékonyságát, hogy tovább igazoljuk ezt az összefüggést. Megmutatta az sg trcSL1 variánsok esetében megfigyelt összefüggést is (3D ábra és S7 kiegészítő táblázat), ami arra utal, hogy a tetraloop linker döntő szerepet játszik az RNP komplex kialakításában, és hogy az ebben a régióban lévő mutációk befolyásolhatják a CRISPR rendszer hatékonyságát. Ezenkívül ez az összefüggés megmutatja az sgRNS-változatok számítógépes tervezésének lehetőségét a kívánt repressziós hatékonysággal.

Hangolható CRISPRi rendszer alkalmazása a fluxus újraelosztására a violacein bioszintetikus útjában E. coliban

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-szeres) más génekhez képest, ha a standard görbékből számítjuk ki. Ezzel szemben a violacein útvonalban a többi szabályozatlan enzim (vioA, vioB és vioE) expressziója változatlan maradt. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy rendszerünk specifikusan képes megcélozni és modulálni az egyes gének expresszióját anélkül, hogy befolyásolná az útvonal más génjeit. A PV és a PDV közvetlen mennyiségi meghatározása nem volt lehetséges a HPLC analízis kereskedelemben elérhető standardjainak hiánya miatt. Így a titereket tetszőleges egységekben mértük a HPLC csúcsterület segítségével. A termék titere az indukció után 8 órával érte el a maximumot, majd fokozatosan csökkent (S8 kiegészítő ábra), valószínűleg a termék más melléktermékekké, például kromoviridánokká történő átalakulása miatt, ismeretlen mechanizmussal (42, 64). A HPLC-spektrumon megfigyelt kisebb csúcsok további kisebb melléktermékek jelenlétét jelezték. Korábbi kutatások kimutatták, hogy az egyes termékek titerének logaritmusa tetszőleges egységekben megjósolható a violacein bioszintetikus útvonalában részt vevő egyes gének promotererősségének lineáris kombinációjával (42). Ez a log-lineáris regressziós modell a mi rendszerünkben is érvényes volt, és a megnövekedett vioD-transzkriptumok fokozott PV-termeléssel jártak együtt (4B. ábra). Ismeretes, hogy a violacein bioszintetikus útvonalában részt vevő minden egyes gén promoterének vagy 5 -UTR-jének megtervezése lehetővé tette a fluxus újraelosztását és az útvonal optimalizálását (65, 66). Rendszerünk alternatív módszerként működhetne, amely a transzkripció szabályozását szemlélteti anélkül, hogy a folyamatban részt vevő promótereket szintetikus sgRNS-ek segítségével manipulálnánk, amelyek rövidek és egylépéses módszerekkel összeállíthatók. A hangolható CRISPRi rendszeren keresztül történő szűrés lehetővé teszi az útvonal előre látható fluxussal történő átirányítását, mielőtt közvetlenül manipulálnák a gazdatörzseket vagy génkazettákat, ami potenciálisan felgyorsítaná a folyamatot.

A hangolható CRISPRi rendszer alkalmazása a likopintermelő E. coli szénáramának kiegyensúlyozására

Az értékes vegyületek hatékony előállítása az anyagcsere-technológiában megköveteli a szénfluxus kiegyensúlyozását. A metileritrit 4-foszfát (MEP) útvonala egy olyan anyagcsereút, amely egyszerű prekurzorokat, például piruvátot és glicerinaldehid-3-foszfátot (GAP) használ izoprenoid építőelemek, dimetil-allil-pirofoszfát és izopentenil-pirofoszfát (67,68) előállításához. . Ezek a molekulák geranil-pirofoszfátot szintetizálnak, amely farnezil-pirofoszfáttá (FPP) alakul (67,68). A likopin, egy nagyra értékelt karotinoid, amely erős antioxidáns tulajdonságokkal rendelkezik, és számos iparágban alkalmazható (69), és az FPP-ből szintetizálódik a crtE, crtB és crtI enzimatikus reakcióinak sorozatával (4C. ábra) (22,70). A GAP prekurzor nem csak a MEP, hanem a glikolízis útvonal számára is nélkülözhetetlen (22). A glikolízis folyamatban a gliceraldehid{11}}foszfát-dehidrogenázt (GAPDH) kódoló gapA gén csökkent expressziójáról kimutatták, hogy a GAP-készlet növelésével fokozza a likopintermelést (22). Ezért a gapA-t öt változattal céloztuk meg, köztük három sg trcSL1 változatot (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5 és sg trcSL1c6), amelyek különböző elnyomási hatékonyságot mutattak, sg PC és sg WT. A gapA azonban esszenciális gén, amelyet nem lehet teljesen leütni (71,72). A gapA hagyományos CRISPRi-vel való visszaszorítására tett kísérletek sg WT használatával még a dcas9 alacsony szivárgása mellett sem voltak sikeresek a tet promoter alatt (73). Másrészt a gapA gén expressziójának többszintű repressziója a hangolható CRISPRi rendszerrel növekedési hiba nélkül történt, és 27-szeres növekedést eredményezett sg trcSL1c6 hatására a likopintermelésben, összehasonlítva a gapA gént teljes mértékben expresszáló törzzsel. 15 órás tenyésztés után (4D ábra és S9 kiegészítő ábra). Beszámoltak arról, hogy a gapA gén természetes expressziójának csak 10%-a vezet megnövekedett GAP-készlethez anélkül, hogy jelentős változás következne be a glikolízis útjában lévő downstream metabolitokban, mint például a 2-foszfoglicerát és a 3-foszfoglicerát. 22). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a hangolható CRISPRi pontosan képes több szinten elnyomni a génexpressziót kromoszóma-manipuláció nélkül.

4. ábra Hangolható CRISPRi rendszer alkalmazása violacein bioszintetikus útvonalra. (A) A violacein bioszintetikus útvonala és a plazmid felépítése. A violacein termeléséért felelős öt gént (vioA, vioB, vioC, vioD és vioE) egy dCas9-expresszáló plazmidba klónoztak. Négy fő terméket (violaceint, proviolaceint, dezoxiviolaceint és prodeoxiviolaceint) állítanak elő. sg WT-t a vioC-hez és öt sg trcSL1-változatot (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 és sg trcSL1c9) klónoztak a többi plazmába, amelyek eltérő elnyomási hatékonyságot mutatnak. Trp: L-triptofán, V: violacein, PV: proviolacein, PDV: prodeoxiviolacein, DV: deoxiviolacein, PDVA: protodezoxiviolaceinsav, PVA: protoviolaceinsav. (B) Kapcsolat a vioD transzkriptumok, az mCherry fluoreszcencia, valamint a PDV és PV titere között. Az x-tengely az RT-qPCR-ből nyert relatív vioD RNS-t, a bal oldali y-tengely a 3. ábra szerinti mCherry relatív fluoreszcenciáját, a jobb oldali y-tengely pedig a HPLC-terület arányát jelzi. A legmagasabb vioD RNS értékű mintákat 100%-ra állítottuk a normalizáláshoz. (C) A likopin bioszintetikus útvonala és a plazmid felépítése. Három likopin termelésért felelős gént (crtE, crtB, crtI) klónoztak egy dCas{20}}expresszáló plazmidba. A gapA-t sg trcSL1 variánsokkal (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) céloztuk meg, és sg PC-t klónoztunk a másik plazmidba. Glc: glükóz, GAP: glicerinaldehid 3-foszfát, 1,3-BPG: 1,3-biszfoszfoglicerát, DMAPP: dimetil-allil-pirofoszfát, IPP: izopentenil-pirofoszfát, FPP: foszfoszteronsav. (D) A gapA transzkriptumok, az mCherry fluoreszcencia és a likopin termelés közötti kapcsolat. Az x-tengely az RT-qPCR-ből nyert relatív rés-RNS-t, a bal oldali y-tengely a 3. ábra szerinti relatív mCherry-fluoreszcenciát, a jobb oldali y-tengely pedig a likopin titerét jelzi. (B, D) Minden hibasáv a szórást jelzi (n=3).

KÖVETKEZTETÉS

Terveztünk egy hangolható CRISPRi rendszert, amely pontosan tudja szabályozni a génexpressziót a kívánt szinten. A tetraloop és a szegélyező régió mutációjával a különböző protospacer szekvenciákat megcélzó szintetikus sgRNS-ek egy bizonyos szinten szabályozhatják a gént. Sikeresen alkalmaztuk ezt a rendszert a violacein bioszintetikus útjában az érdeklődésre számot tartó metabolikus fluxus átirányítására, hogy előre látható arányban indolszármazékokat állítsunk elő. Ezenkívül kimutattuk, hogy a hangolható CRISPRi használata a likopintermelés 27-szeresére nőtt, kiemelve rendszerünk sokoldalúságát más értékes vegyületek termelésének javítására. Ez a rendszer felgyorsítaná a fluxusoptimalizálási folyamatokat, mielőtt véglegesen manipulálná a gazdaszervezet genetikai információit, például lecserélné a promotert vagy az 5-UTR-szekvenciákat.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

IRODALOM

1. Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horváth, P. és Siksnys, V. (2011) A Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas rendszere immunitást biztosít Escherichia coli ellen. Nucleic Acids Res., 39, 9275–9282.

2. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horváth, P. és Siksnys, V. (2012) A Cas9-crRNS ribonukleoprotein komplex specifikus DNS-hasítást közvetít az adaptív immunitás érdekében baktériumokban. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, E2579–E2586.

3. Cong, L., Ran, FA, Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, PD, Wu, X., Jiang, W., Marraffini, LA et al . (2013) Multiplex genom tervezés CRISPR/Cas rendszerekkel. Tudomány, 339, 819–823.

4. Ran, FA, Hsu, PD, Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA és Zhang, F. (2013) Genom engineering a CRISPR-Cas9 rendszer segítségével. Nat. Protoc., 8, 2281–2308.

5. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, JA és Charpentier, E. (2012) Programozható kettős RNS-vezérelt DNS-endonukleáz adaptív bakteriális immunitásban. Tudomány, 337, 816–821.

6. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A. és Jinek, M. (2014) A Cas9 endonukleáz PAM-függő cél-DNS felismerésének strukturális alapja. Természet, 513, 569–573.

7. Qi, LS, Larson, MH, Gilbert, LA, Doudna, JA, Weissman, JS, Arkin, AP és Lim, WA (2013) A CRISPR újrahasznosítása RNS-vezérelt platformként a génexpresszió szekvencia-specifikus szabályozására. Cell, 152, 1173–1183.

8. Larson, MH, Gilbert, LA, Wang, X., Lim, WA, Weissman, JS és Qi, LS (2013) CRISPR interferencia (CRISPRi) a génexpresszió szekvencia-specifikus szabályozására. Nat. Protoc., 8, 2180–2196.

9. McGlincy, NJ, Meacham, ZA, Reynaud, KK, Muller, R., Baum, R. és Ingolia, NT (2021) A genom léptékű CRISPR interferencia útmutató könyvtár lehetővé teszi az élesztőben végzett átfogó fenotípusos profilalkotást. BMC Genomics, 22, 205.

10. Yoon, J. és Woo, HM (2018) a Corynebacterium glutamicum CRISPR interferencia által közvetített metabolikus tervezése homobutirát előállítására. Biotechnol. Bioeng., 115, 2067–2074.

11. Cleto, S., Jensen, JV, Wendisch, VF és Lu, TK (2016) Corynebacterium glutamicum metabolikus tervezés CRISPR interferenciával (CRISPRi). ACS Szint. Biol., 5, 375–385.

12. Zhang, GQ, Ren, XN, Liang, XH, Wang, YQ, Feng, DX, Zhang, YJ, Xian, M. és Zou, HB (2021): Az aminosavak mikrobiális termelésének javítása: a hagyományos megközelítésektől a legújabb trendekig. Biotechnol. Bioproc. E, 26, 708–727.

13. Kim, SK, Seong, W., Han, GH, Lee, DH és Lee, SG (2017) CRISPR interferencia-vezérelt multiplex represszió endogén versengő útvonal gének metabolikus fluxus átirányítására Escherichia coliban. Microb. Cell Fact., 16, 188.

14. Ellis, NA, Kim, B., Tung, J. és Machner,MP (2021) Egy multiplex CRISPR interferencia eszköz a virulencia gén lekérdezéséhez Legionella pneumophilában. Commun. Biol., 4, 157.

15. Siu, KH és Chen, W. (2019) Riboregulated tohold-gated gRNS a programozható CRISPR-Cas9 funkcióhoz. Nat. Chem. Biol., 15, 217–220.

16. Reis, AC, Halper, SM, Vezeau, GE, Cetnar, DP, Hossain, A., Clauer, PR és Salis, HM (2019) Több bakteriális gén szimultán repressziója nem ismétlődő, extra hosszú sgRNS-tömbök használatával. Nat. Biotechnol., 37, 1294–1301.

17. Tian, ​​T., Kang, JW, Kang, A. és Lee, TS (2019): A metabolikus fluxus átirányítása kombinatorikus multiplex CRISPRi által közvetített represszión keresztül az izopentenol termelésére Escherichia coliban. ACS Szint. Biol., 8, 391–402.

18. Gauttam, R., Seibold, GM, Mueller, P., Weil, T., Weiss, T., Handrick, R. és Eikmanns, BJ (2019) Egy egyszerű kettős indukálható CRISPR interferencia rendszer több gén célozásához Corynebacterium glutamicumban. Plasmid, 103, 25–35.

19. Yao, L., Cengic, I., Anfelt, J. és Hudson, EP (2016): Többszörös génrepresszió cianobaktériumokban CRISPRi használatával. Acs Synth. Biol., 5, 207–212.

20. Lim, HG, Noh, MH, Jeong, JH, Park, S. és Jung, GY (2016) A 3-hidroxi-propionsav glicerinből történő termelődésének optimális egyensúlya Escherichia coliban. ACS Szint. Biol., 5, 1247–1255.

21. Yang, Y., Lin, Y., Li, L., Linhardt, RJ és Yan, Y. (2015) A malonil-CoA metabolizmus szabályozása szintetikus antiszensz RNS-eken keresztül a természetes termékek fokozott bioszintéziséért. Metab. Eng., 29, 217–226.

22. Jung, J., Lim, JH, Kim, SY, Im, DK, Seok, JY, Lee, SV, Oh, MK és Jung, GY (2016) Precíz prekurzor kiegyensúlyozás az izoprenoidok előállításához a gapA expresszió finom szabályozásával Escherichia coli. Metab. Eng., 38, 401–408.

23. Li, XT, Jun, Y., Erickstad, MJ, Brown, SD, Parks, A., Court, DL és Jun, S. (2016) tCRISPRi: a génexpresszió hangolható és reverzibilis, egylépéses szabályozása. Sci. Rep., 6, 39076.

24. Fontana, J., Dong, C., Ham, JY, Zalatan, JG és Carothers, JM (2018) Az sgRNS-ek szabályozott expressziója hangolja a CRISPRi-t E. coliban. Biotechnol. J., 13, e1800069.

25. Kim, NM, Sinnott, RW és Sandoval, NR (2020) Transzkripciós faktor alapú bioszenzorok és indukálható rendszerek nem modell baktériumokban: jelenlegi fejlődés és jövőbeli irányok. Curr. Opin. Biotechnol., 64, 39–46.

26. Kundert, K., Lucas, JE, Watters, KE, Fellmann, C., Ng, AH, Heineike, BM, Fitzsimmons, CM, Oakes, BL, Qu, J., Prasad, N. et al. (2019) A CRISPR-Cas9 szabályozása ligandum-aktivált és ligandum-deaktivált sgRNS-ekkel. Nat. Commun., 10, 2127.

27. Ferreira, R., Skrekas, C., Hedin, A., Sanchez, BJ, Siewers, V., Nielsen, J. és David, F. (2019) A központi szén-anyagcsere modell által segített finomhangolása élesztőben a dCas{4}}alapú szabályozáson keresztül. ACS Szint. Biol., 8, 2457–2463.

28. Su, T., Guo, Q., Zheng, Y., Liang, Q., Wang, Q. és Qi,Q. (2019) A hemB finomhangolása CRISPRi segítségével az 5-aminolevulinsav-termelés növelésére Escherichia coliban. Elülső. Microbiol., 10, 1731.

29. Zheng,T., Hou,Y., Zhang,P., Zhang,Z., Xu,Y., Zhang,L., Niu,L., Yang,Y., Liang,D., Yi,F . et al. (2017) Az egyirányítós RNS-specifitás profilozása egy mismatch-érzékeny magszekvenciát tár fel. Sci. Rep., 7, 40638.

30. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. és Marraffini, LA (2013) bakteriális genomok RNS-vezérelt szerkesztése CRISPR-Cas rendszerekkel. Nat. Biotechnol.,

31, 233–239. 31. van Gestel, J., Hawkins, JS, Todor, H. és Gross, CA (2021) Számítási folyamat a mismatch-CRISPRi útmutató RNS-ek tervezésére. STAR Protoc, 2, 100521.

32. Hawkins, JS, Silvis, MR, Koo, BM, Peters, JM, Osadnik, H., Jost, M., Hearne, CC, Weissman, JS, Todor, H. és Gross, CA (2020) Mismatch-CRISPRi feltárja az Escherichia coli és a Bacillus subtilis esszenciális gének együtt változó expressziós-fitness kapcsolatait. Cell Syst., 11, 523–535.

33. Fortin, J.-P., Tan, J., Gascoigne, KE, Haverty, PM, Forrest, WF, Costa, MR és Martin, SE (2019) A többszörös géncélzás és az eltérés tolerancia megzavarhatja a genomelemzést. széles összevont CRISPR képernyők. Genome Biol., 20, 21.

34. Rozen, S. és Skaletsky, H. (2000) Primer3 a WWW-n általános felhasználóknak és biológus programozóknak. Módszerek Mol. Biol., 132, 365–386.

35. Zhou, K., Zhou, L., Lim, Q., Zou, R., Stephanopoulos, G. and Too,HP (2011) Új referenciagének az Escherichia coli fehérje túlzott expresszióra adott transzkripciós válaszainak kvantitatív PCR-rel történő kvantitatív meghatározására. BMC Mol. Biol., 12, 18.

36. Livak, KJ és Schmittgen, TD (2001) Relatív génexpressziós adatok elemzése valós idejű kvantitatív PCR-rel és a 2(-Delta Delta C(T)) módszerrel. Methods, 25, 402–408.

37. Andrews, S. (2010) FastQC: Minőségellenőrző eszköz nagy áteresztőképességű szekvenciaadatokhoz. v0.11.9 kiadás

38. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. és Salzberg, SL (2009) Rövid DNS-szekvenciák ultragyors és memória-hatékony igazítása az emberi genomhoz. Genome Biol., 10, R25.

39. Danecek, P., Bonfield, JK, Liddle, J., Marshall, J., Ohan, V., Pollard, MO, Whitwham, A., Keane, T., McCarthy, SA, Davies, RM et al. (2021) A SAMtools és a BCFtools tizenkét éve. Gigascience, 10, giab008.

40. Trapnell, C., Williams, BA, Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., van Baren, MJ, Salzberg, SL, Wold, BJ és Pachter, L. (2010) Az RNA-Seq-vel végzett transzkriptum-összeállítás és mennyiségi meghatározás feltárja a megjegyzés nélküli átiratokat és az izoformaváltást a sejtdifferenciálódás során. Nat. Biotechnol., 28, 511–515.

41. Trapnell, C., Hendrickson, DG, Sauvageau, M., Goff, L., Rinn, JL és Pachter, L. (2013) A génszabályozás differenciálanalízise transzkriptum felbontásnál RNS-szekvenciával. Nat. Biotechnol., 31, 46–53.

42. Lee, ME, Aswani, A., Han, AS, Tomlin, CJ és Dueber, JE (2013) Multi-enzimes útvonal expressziós szintű optimalizálása nagy áteresztőképességű vizsgálat hiányában. Nucleic Acids Res., 41, 10668-10678.

43. Hsu, PD, Scott, DA, Weinstein, JA, Ran, FA, Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, EJ, Wu, X., Shalem, O. et al. (2013) RNS-vezérelt Cas9 nukleázok DNS-célzási specificitása. Nat. Biotechnol., 31, 827-832.

44. Nishimasu, H., Ran, F., Hsu, P., Konermann, S., Shehata, S., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F. és Nureki, O. (2014) A Cas9 kristályszerkezete útmutató RNS-sel és cél-DNS-sel komplexben. Cell, 156, 935–949.

45. Fu, Y., Rocha, PP, Luo, VM, Raviram, R., Deng, Y., Mazzoni, EO és Skok, JA (2016) A CRISPR-dCas9 és sgRNA állványok lehetővé teszik a műholdszekvenciák kétszínű élő képalkotását és ismétlődően dúsított egyedi lókuszok. Nat. Commun., 7, 11707.

46. ​​Khosravi, S., Schindele, P., Gladilin, E., Dunemann, F., Rutten, T., Puchta, H. és Houben, A. (2020) Az aptamerek alkalmazása javítja a növényi telomerek CRISPR-alapú élő képalkotását. Elülső. Plant Sci., 11, 1254.

47. Nielsen, AA és Voigt, CA (2014) Több bemenetes CRISPR/Cas genetikai áramkörök, amelyek interfészen vannak a gazda-szabályozó hálózatokkal. Mol. Syst. Biol., 10, 763.

48. Lee, YJ, Hoynes-O'Connor, A., Leong, MC and Moon, TS (2016) Bakteriális génexpresszió programozható szabályozása a 44, 2462–2473.

49. Vigouroux, A., Oldewurtel, E., Cui, L., Bikard, D. és van Teeffelen, S. (2018) A Tuning dCas9 azon képessége, hogy blokkolja a transzkripciót, lehetővé teszi a bakteriális gének robusztus, zajtalan leütését. Mol. Syst. Biol., 14, e7899.

50. Zhang, Y., Shang, X., Lai, S., Zhang, G., Liang, Y. és ment. (2012) Egy arabinózzal indukálható expressziós rendszer fejlesztése és alkalmazása az induktor felvételének elősegítésével Corynebacterium glutamicumban. Appl. Environ. Microbiol., 78, 5831–5838.

51. Thompson, MG, Sedaghatian, N., Barajas, JF, Wehrs, M., Bailey, CB, Kaplan, N., Hillson, NJ, Mukhopadhyay, A. és Keasling, JD (2018): A pSC101 eredetben a kópiaszámot növelő új mutációk izolálása és jellemzése. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke, PM, Link, T., Gatgens, J., Sonntag, C., Otto, M., Bott, M. és Polen, T. (2020) Hangolható L-arabinóz-indukálható expressziós plazmid a Gluconobacter oxydans ecetsavbaktérium számára. Appl. Microbiol. Biotechnol., 104, 9267-9282.

53. Nguyen, TT, Nguyen, NH, Kim, Y., Kim, JR és Park, S. (2021) A 3-hidroxi-propion-dehidrogenáz indukálható promoter rendszerének in vivo jellemzése Pseudomonas denitrificansban. Biotechnol Bioproc E, 26, 612–620.

54. McCarty, NS, Graham, AE, Studena, L. és Ledesma-Amaro, R. (2020) Multiplex CRISPR technológiák génszerkesztéshez és transzkripciós szabályozáshoz. Nat. Commun., 11, 1281.

55. Yan, Q. és Fong,SS (2017) In vitro transzkripciós kötési hatások és zaj tanulmányozása konstitutív promoterekkel kombinálva UP elemszekvenciákkal Escherichia coliban. J. Biol. Eng., 11, 33.

56. Seo, SW, Yang, JS, Kim, I., Yang, J., Min, BE, Kim, S. és Jung, GY (2013) Az mRNS transzlációs iniciációs régió prediktív tervezése a prokarióta transzlációs hatékonyság szabályozására. Metab. Eng., 15, 67–74. 57. Kappel, K., Jarmoskaite, I., Vaidyanathan, PP, Greenleaf, WJ, Herschlag, D. és Das, R. (2019) Az RNS-fehérje kötési affinitás előrejelzésének vaktesztjei. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116, 8336–8341.

58. Zuker, M. (2003) Mfold webszerver nukleinsav hajtogatáshoz és hibridizáció előrejelzéséhez. Nucleic Acids Res., 31, 3406–3415.

59. Xiong, B., Zhu, Y., Tian, ​​D., Jiang, S., Fan, X., Ma, Q., Wu, H. és Xie, X. (2021) A központi szén-anyagcsere fluxus-újraelosztása az l-triptofán hatékony előállításához Escherichia coliban. Biotechnol. Bioeng., 118, 1393–1404.

60. Yao, R., Li, J., Feng, L., Zhang, X. és Hu, H. (2019) (13) C-anyagcsere-fluxus-analízis által vezérelt Escherichia coli metabolikus manipulációja a glicerinből történő acetoltermelés javítása érdekében. Biotechnol. Bioüzemanyagok, 12, 29.

61. Duran, N. és Menck, CF (2001): Chromobacterium violaceum: farmakológiai és ipari perspektívák áttekintése. Crit. Rev. Microbiol., 27, 201–222.

62. Balibar, CJ és Walsh, CT (2006) Violacein in vitro bioszintézise L-triptofánból a Chromobacterium violaceumból származó VioA-E enzimek által. Biochemistry, 45, 15444–15457.

63. Gwon, DA, Seok, JY, Jung, GY és Lee, JW (2021) Bioszenzorral segített adaptív laboratóriumi evolúció a violacein előállításához. Int. J. Mol. Sci., 22, 6594.

64. Sanchez, C., Brana, AF, Mendez, C. és Salas, JA (2006) A violacein bioszintézisútjának újraértékelése és kapcsolata az indolokarbazol bioszintézisével. Chem. Bio. Chem., 7, 1231–1240.

65. Jones, JA, Vernacchio, VR, Lachance, DM, Lebovich, M., Fu, L., Shirke, AN, Schultz, VL, Cress, B., Linhardt, RJ és Koffas, MA (2015) ePathOptimize: a kombinatorikus megközelítés az anyagcsereutak transzkripciós kiegyensúlyozására. Sci. Rep., 5, 11301.

66. Zhang, Y., Chen, H., Zhang, Y., Yin, H., Zhou, C. és Wang, Y. (2021) A bioszintetikus génklaszter közvetlen RBS tervezése a violaceinek hatékony termeléséhez E. coliban. Microb. Cell Fact., 20, 38.

67. Hunter, WN (2007) Az izoprenoid prekurzor bioszintézis nem-mevalonát útja. J. Biol. Chem., 282, 21573–21577.

68. Rohmer, M. (1999) Egy mevalonáttól független útvonal felfedezése az izoprenoid bioszintézishez baktériumokban, algákban és magasabb rendű növényekben. Nat. Prod. Rep., 16, 565–574.

69. Muller, L., Caris-Veyrat, C., Lowe, G. és Bohm, V. (2016) A likopin és antioxidáns szerepe a szív- és érrendszeri betegségek megelőzésében – kritikai áttekintés. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 56, 1868–1879.

70. Miura, Y., Kondo, K., Saito, T., Shimada, H., Fraser, PD és Misawa, N. (1998) A karotinoidok, a likopin, a béta-karotin és az asztaxantin előállítása a Candida utilis élelmiszer-élesztőben. Appl. Environ. Microbiol., 64, 1226–1229.

71. Goodall, ECA, Robinson, A., Johnston, IG, Jabbari, S., Turner, KA, Cunningham, AF, Lund, PA, Cole, JA és Henderson, IR (2018) Az Escherichia coli K{ esszenciális genomja {2}}. Mbio, 9, e02096-17.

72. Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, KA, Tomita, M., Wanner, BL és Mori, H. (2006) Escherichia coli K-12 kereten belüli, egyetlen gént tartalmazó, kiütött mutánsok megalkotása: a Keio gyűjtemény. Mol. Syst. Biol., 2, 2006.0008.

73. Bertram,R. és Hillen, W. (2008) A Tet represszor alkalmazása a prokarióta génszabályozásban és expresszióban. Microb. Biotechnol., 1, 2–16.