A dendrimer-tesaglitazar konjugátum a mikroglia fenotípus-eltolódását idézi elő, és fokozza az amiloid fagocitózist† 3. rész

A D-Tesa növelte a patogén fehérjék eltávolításáért felelős enzimek expresszióját

Az inzulinbontó enzim (Ide) és a mátrix metalloproteáz 9 (MMP9) olyan mikroglia által szekretált enzimek, amelyek lebontják az extracelluláris -amiloidot és -synukleint.71,72 A D-Tesa kezelés jelentősen megnövelte az Ide 3 expresszióját.1-szeresére (p <) 0,001) növekvő MMP9-expresszióval (1.8-szeres növekedés, p=0.057) a csak LPS-sel kezelt kontrollokhoz képest (6A és B ábra).

Az utóbbi években egyre több tanulmány bizonyítja, hogy szoros kapcsolat van az inzulinbontó enzimek és a memória között. Ez a felfedezés értékes támpontokat ad számunkra az emlékezet kialakulásának és fenntartásának mechanizmusának további feltárásához.

Az inzulinbontó enzim fontos enzim, melynek fő funkciója az inzulin lebontása a vércukor egyensúly fenntartása érdekében. A közelmúltban végzett vizsgálatok azonban kimutatták, hogy az inzulinbontó enzim nem csak metabolikus szerepet játszik, hanem közvetlenül befolyásolja az agy neuronjainak növekedését és helyreállítását, valamint fontos szerepet játszik a memória fenntartásában.

Számos tanulmány kimutatta, hogy minél magasabb az inzulinbontó enzim szintje, annál jobb a memória. Az inzulinbontó enzimek ugyanis elősegíthetik a neuronok növekedését és helyreállítását, ezáltal javítva az agy tanulási és memóriaképességét. Emellett az inzulinbontó enzimek elősegíthetik a neuronok közötti kapcsolatot is, ezáltal fokozva az asszociációt és a memória megtartását.

Az inzulinbontó enzimek memóriában betöltött fontos szerepét széles körben alkalmazzák a klinikai orvoslás területén. A kutatók azt találták, hogy az inzulinbontó enzimek belélegzésével nem csak a memória, hanem a kognitív képességek és a depressziós tünetek is javulhatnak.

Röviden, az inzulinbontó enzimek és a memória kapcsolata egy nagyon fontos terület, amely értékes támpontokat ad számunkra a memória biológiai mechanizmusának tanulmányozásához. A jövőbeli kutatások tovább kutatják az inzulinbontó enzimek funkcióját és szerepét, segítenek jobban megérteni a memória kialakulásának és tárolásának mechanizmusát, és jobb alapot biztosítanak az emberi agy tanulási és memóriaképességének javításához. Látható, hogy javítanunk kell a memórián, a Cistanche pedig jelentősen javíthatja a memóriát, mert a Cistanche szabályozhatja a neurotranszmitterek egyensúlyát is, például növelheti az acetilkolin és a növekedési faktorok szintjét, amelyek nagyon fontosak a memória és a tanulás szempontjából. Ezen túlmenően, a Cistanche javíthatja a véráramlást és elősegítheti az oxigénszállítást, ami biztosítja, hogy az agy elegendő tápanyaghoz és energiához jusson, ezáltal javítva az agy vitalitását és állóképességét.

Kattintson az Ismerje meg a memória javításának módjait

A Free Tesa szignifikánsan növelte azIde kifejeződését 2-szeresére (p=0,011), és nem szignifikánsan növelte az MMP92--szorosát (p=0,35) (6A ábra) és B). Az M2 mikroglia neurodegeneratív betegségekben enzimatikus lebontással vagy fagocitózissal képes eltávolítani az -amiloidot, a szinukleint és más patogén fehérjéket, a D-Tesa pedig fokozza az ezekben a folyamatokban részt vevő fehérjéket (azaz Ide és MMP9).71–73

Az ideexpressziót csökkentik az AD és PD patológiában, és ismert, hogy a PPAR agonisták felfelé szabályozzák, ami összhangban van eredményeinkkel.

71,72 Funkcionálisan csak az Ide szintjének 2-szeres növekedése csökkenti az -amiloid felhalmozódást és az idegsejtek elhalását in vivo.74,75 Ezért a D-Tesa által megfigyelt 3-szeres Ide-növekedés, és Az Ide 2-szeresére növelése a freeTesa által in vivo terápiásán hatékony lehet.

A D-Tesa fokozza az -amiloid fagocitózisát

A CD36 egy mikroglia scavenger receptor, amely elősegíti a fagocitózist és az -amiloid lebomlását.73 Alulszabályozása az AD-ban csökkenti az -amiloid eltávolítását, de a PPAR aktiválása felfelé szabályozza.

Mind a D-Tesa, mind a szabad Tesa szignifikánsan növelte a CD36 expressziós szintjét a csak LPS-nek kitett sejtekhez képest (p < 0.0001 vs. p < 0,005 a D-Tesa és a szabad Tesa esetében ), de a D-Tesa sokkal hatékonyabb volt, mint a szabad Tesa (6-szeres növekedés a 2.{11}}szeres növekedéshez képest a D-Tesa és a szabad Tesa esetében, p < 0,0005) (6C. ábra) ).

Eredményeink összhangban vannak a pioglitazonnal (egy másik PPAR agonista) végzett korábbi vizsgálatokkal, amelyek azt mutatták, hogy az -amiloid fokozott mikrogliális fagocitózisa PPAR- és CD{1}}függő mechanizmuson keresztül következik be.73

Annak vizsgálatára, hogy a CD36 D-Tesat-kezelésből származó felszabályozása összefüggésben áll-e ezen sejtek megnövekedett fagocitáló képességével, funkcionális fagocitózis vizsgálatot végeztünk -amiloiddal. 73

Röviden, miután a sejteket a korábbi in vitro vizsgálatokhoz hasonlóan kezeltük, két órán át fluoreszcensen jelölt -amiloid1-42-t vittünk a sejtekre, mostuk a sejteket, majd áramlási citometriát végeztünk, hogy megvizsgáljuk az -amiloid sejtfelvétel mértékét. A D-Tesa növelte mind az -amiloidot fagocitáló sejtek százalékos arányát, mind a sejtenként internalizált -amiloid átlagos mennyiségét (7A és B ábra).

Ezzel ellentétben a szabad Tesa nem javított az -amiloid fagocitózisában. A D-Tesa jobb hatásai a Tesához képest valószínűleg a dendrimer konjugáció által lehetővé tett jobb sejt internalizációnak tulajdoníthatók.

Ez összhangban van azokkal a korábbi munkákkal, amelyek azt mutatták, hogy a fluoreszcensen jelölt G4-PAMAM-OH-val kezelt BV2-sejtek több mint 95%-a harminc percen belül internalizálta a dendrimert, és legalább 24 órán keresztül folytatta a dendrimer internalizálását.76

Hasonlóképpen, a kis molekulájú minociklin konjugálása fluoreszcensen jelölt G4-PAMAM-OH-hoz azt mutatta, hogy a BV2-sejtek 99%-a 3 órán belül internalizálta a fluoreszcensen jelölt dendrimer-gyógyszer konjugátumot.26 Azt is kimutatták, hogy a konjugátum magasabb szintje csökkentette a nitrogén-oxidot. a szabad gyógyszerhez, miután a BV2 sejteket LPS-sel kezeltük, eredményeinknek megfelelően.

A D-Tesaphagocytázással kezelt sejtek 1.9-szer több -amiloidot termeltek, mint az LPS-sel kezelt kontrollsejtek (p < 0,001), ami összemérhető a 2.5-szeres növekedéssel A pioglitazonnal kezelt patkányok primer mikrogliasejtek által okozott -amiloid fagocitózisáról számoltak be Yamanaka és munkatársai.73 Az -amiloid fagocitózis valamivel magasabb mértéke az előző tanulmány szerint vagy azért lehet, mert nem kezelték együtt sejteiket LPS-sel, mint mi, vagy azért, mert az elsődleges mikroglia PPAR-t expresszál magasabb szint, mint az ebben a vizsgálatban használt BV2-sejtek.77

Mint ilyen, a vizsgálatunkban szereplő in vitro kísérletekből becsültnél alacsonyabb D-Tesa dózis valószínűleg hatékony lehet az in vivo vizsgálatokban és az emberekben, mivel a BV2-sejtekről ismert, hogy alacsonyabb szinten expresszálják a PPAR-t, mint az elsődleges mikroglia.77

A mikrogliák számos neurodegeneratív betegségben szerepet játszanak, és a BBB megakadályozta, hogy sok olyan gyógyszer elérje a terápiás szintet az agyban, amely a mikroglia fenotípusát gyulladáskeltő, neurotoxikus M1 fenotípusból gyulladásgátló, neuroprotektív M2 fenotípussá változtatja.5,6, 14,15

Például két PPAR-agonistát, a pioglitazont és a roziglitazont III. fázisú klinikai vizsgálatokban vizsgálták az Alzheimer-kórra vonatkozóan, mivel képesek voltak megváltoztatni a mikroglia fenotípusát, de valószínűleg a BBB-n keresztüli rossz transzport miatt kudarcot vallottak. a mikroglia fenotípusa neurodegeneratív betegségekben.

Egy ilyen megközelítés megköveteli, hogy a gyógyszert a mikrogliákba kellő mennyiségben kell juttatni ahhoz, hogy válaszreakciót váltsanak ki. Ennek érdekében a G4-OH-PAMAM dendrimerekről kimutatták, hogy szisztémás injekció után számos állatmodellben gyógyszert juttatnak a mikrogliákba, és ennek eredményeként jelenleg klinikai vizsgálatokban értékelik őket a ccTLD (NCT03500627) és a súlyos COVID kezelésére. -19 társuló gyulladás (NCT04458298).18–28

Annak érdekében, hogy a mikroglia fenotípus megváltoztatásának jótékony hatásait kombináljuk azzal a képességgel, hogy gyógyszereket juttatunk a mikrogliákba, a tezaglitazárt (egy PPAR/kettős agonista) egy G4-OH-PAMAMdendrimerhez konjugáltuk (1–3. ábra). Kimutattuk, hogy a D-Tesa képes az M1 mikroglia fenotípusát M2 fenotípussá változtatni (4. és 5. ábra), ami a káros reaktív oxigénfajták szekréciójának csökkenését eredményezi.

Továbbá kimutattuk, hogy a D-Tesával kezelt mikrogliák fokozzák a kóros fehérjéket, például a -synukleint és az -amiloidot lebontó enzimek expresszióját, valamint az -amiloid fagocitózisát egy funkcionális vizsgálatban (6. és 7. ábra).

Bár nem mutatunk be olyan adatokat, amelyek bizonyítják a D-Tesa azon képességét, hogy megkerülje a BBB-t és felhalmozódjon a mikrogliákban, korábban kimutattuk, hogy a hasonló gyógyszerterhelésű, méretű és zéta potenciállal rendelkező G4-OH-PAMAM gyógyszerkonjugátumok képesek áthaladni csökkent BBB és felhalmozódó inmicroglia intravénás beadás után.26,36,52

Ezek az eredmények alátámasztják a D-Tesa továbbfejlesztését többféle neurológiai betegség kezelésére. Míg ebben a cikkben az Alzheimer- és a Parkinson-kórra összpontosítunk, a D-Tesa számos neurológiai rendellenesség klinikai transzlációjára is képes. A mikroglia hasonló szerepe miatt a neurodegeneratív betegségek többszörös patológiájában a PPAR agonistát, a pioglitazont is vizsgálták, illetve jelenleg is vizsgálják a Parkinson-kór,78 ALS,79 adrenomieloneuropathia (NCT03864523), sclerosis multiplex (NCT) és hematoma multiplex (NCT) II. fázisú klinikai vizsgálataiban. feloldódás intracerebrális vérzésben (NCT00827892).

Ha ezek a klinikai vizsgálatok is kudarcot vallanak a pioglitazon BBB-n keresztül történő gyenge szállítása miatt, a D-Tesa leküzdheti ezt a szállítási akadályt, és kezelheti az ilyen betegségekben szenvedő betegeket.

Más csoportok nanorészecskéket használtak a PPAR agonisták makrofágokhoz való eljuttatásának javítására, de nem kísérelték meg ezeket az agonisták mikrogliákba juttatását. Osinski és munkatársai kimutatták, hogy a Tesával töltött liposzómákat többnyire a zsigeri fehér zsírban lévő makrofágok vették fel egy férfi leptinhiányos elhízás modellben.80

Ezenkívül kimutatták, hogy a Tesával töltött liposzómák nem változtatták meg az M1 marker Mcp-1 expresszióját, de növelték az Arg1 M2 marker expresszióját, míg a szabad Tesa-val végzett kezelés csökkentette az M1 makrofágok teljes számát és az Mcp{{6 expresszióját. }}, és nem növelte az Arg1 kifejezést.

Nakashiro et al. poli(tej-ko-glikolsav) (PLGA) nanorészecskéket használt a pioglitazon (egy PPAR-agonista) makrofágokhoz való eljuttatására ateroszklerózissal összefüggésben.81

In vivo kimutatták, hogy a PLGA-pioglitazon csökkentette az immunsejtek szintjét a vérben. LPS-sel és interferonnal kezelt elsődleges csontvelő-eredetű makrofágok azt találták, hogy a PLGA-pioglitazon növeli az IL-4 és IL-10 (M2 markerek) szintjét, és nem csökkenti az IL-6 vagy TNF szintet.

Megállapításaik hasonlóak a miénkhez; Az M2 markerek a nanorészecske-PPAR agonista kezelés hatására növekedtek, míg az IL-6 és a TNF-szintek nem csökkentek. Di Mascolo et al. PLGA-polivinil-alkohol nanorészecskéket használtak a roziglitazon (egy másik PPAR agonista) szállítására.82

In vitro kimutatták, hogy a nanorészecske-gyógyszer komplexek csökkentik az iNOS, TNF- és IL-1 expresszióját csontvelő-eredetű makrofágokban. Sejtjeiket nanorészecskés gyógyszerrel előkezelték az LPS-sel történő stimulálás előtt, míg mi a sejteket LPS-sel a D-Tesa-kezelés előtt, ami lehet az oka annak, hogy nem tapasztaltunk TNF- és IL-1 csökkenést, bár azt is megfigyeltük. az iNOS expressziójának csökkenése.

Következtetés

Számos neurodegeneratív betegségre jelenleg nincs patológiát megváltoztató terápia, és ahogy a népesség folyamatosan növekszik, ezeknek a betegségeknek a prevalenciája és kezelésének költsége tovább fog emelkedni, ami rávilágít arra, hogy sürgősen megoldást kell találni. A közelmúltban a pro-inflammatorikus M1 mikroglia kritikus fontosságú több neurodegeneratív betegség patológiájában.

Ezt követően a vér-agy gáton átjutott gyógyszer, amely „M1-M2” fenotípus-eltolódást indukálhat a mikrogliákban, terápiás potenciállal rendelkezik, különféle betegségekre, különösen az Alzheimer-kórra és a Parkinson-kórra.

A D-Tesa-t úgy tervezték, hogy szisztémás beadás után egy „M1-től M2-ig” indukáló gyógyszert juttatjon a mikrogliákba, hogy csökkentse a neurotoxikus anyagok mikrogliális szekrécióját, ugyanakkor gyulladásgátló állapotot váltson ki, amely fokozza a patogén fehérjék lebomlását és fagocitózisát az agyban. Sikeresen szintetizáltuk a D-Tesa-t egy rendkívül hatékony kattintás-kémiai módszerrel.

A gyógyszer egy észterkötésen keresztül kapcsolódik a dendrimerhez, amely intracellulárisan hasítható lizoszómális körülmények között, és a Tesa körülbelül 60%-a szabadul fel az első 48 órában lizoszómális körülmények között.

Kimutatták, hogy a D-Tesa felülmúlja a Tesát in vitro az M1-M2a/M2b/M2c fenotípus eltolódás indukálásában, ami csökkent nitrogén-oxid-szekréciót, a -synuclein és -amiloidbontó enzimek fokozott expresszióját, valamint az -amiloid fagocitózisának növekedését eredményezte.

Így a D-Tesa egyesíti a dendrimer előnyös szállítási tulajdonságait a Tesa M1-M2 kapcsolási tulajdonságaival. A mikroglia közös szerepe és az M1-M2 fenotípus-eltolódás indukálásának közös terápiás előnye miatt a D-Tesa számos neurológiai rendellenesség kezelésére alkalmas, ha a betegség progressziójának megfelelő szakaszában alkalmazzák.

Szerzői hozzájárulások

LD, AS, KL, RS, SK és RMK konceptualizálta a kísérleteket. Az LD, AS és RS elvégezték a dendrimer-drog konjugátum szintézisét és jellemzését. LD, KL és JJ végezte a sejtkísérleteket. LD és K. L. végezte a statisztikát. Az LD és az AS írta a kéziratot, és minden szerző szerkesztette a kéziratot.

Érdekellentétek

Az RMK és az SK társfeltalálók a hidroxil-végződésű dendrimer alkalmazásában a mikroglia célzott bejuttatására neurológiai betegségekben, valamint az ebben a cikkben ismertetett dendrimer technológiához kapcsolódó szabadalmak.

Társalapítói az Ashvattha Therapeuticsnak, az Orpheris Inc.-nek és a RiniSight Inc.-nek, amelyek a platform klinikai fejlesztésében vezető vállalatok. SK és RMK az AshvatthaTherapeutics Inc. igazgatósági tagjai. RS jelenleg az AshvatthaTherapeutics alkalmazásában áll, és részesedéssel rendelkezik a társaságban; a munkaR. S. ennek a lapnak adott elő, mielőtt csatlakozott volna Ashvatthához. Az összeférhetetlenséget a JohnsHopkins Egyetem kezeli.

Köszönetnyilvánítás

Szeretnénk köszönetet mondani Elizabeth Smith Khourynak az in vitro kísérletekkel kapcsolatos hasznos megbeszélésekért. Ezt a projektet a JohnsHopkins és a NICHD Patz Distinguished Professorship Alapítvány finanszírozta (HD076901 támogatási szám) (RMK). Köszönjük a Wilmer Core Grant for Vision Research, Microscope és Core Module (adományszám EY001865) számára a Sony áramlási citométerhez való hozzáférést.

Köszönjük a Servier Medical Artsnak, hogy felhasználta képgyűjteményét (http://smart.servier.com/), amely a Creative Common Attribution 3.0 GenericLicense licenccel rendelkezik, amelyet úgy módosítottak, hogy a grafikus absztrakt legyen.

Hivatkozások

1 CL Gooch, E. Pracht és AR Borenstein, The burden of neurological disease in the United States: A summary report and call to action, Ann. Neurol., 2017, 81, 479–484.

2 JL Cummings, T. Morstorf és K. Zhong, Alzheimer-kór gyógyszerfejlesztési csővezetéke: kevés jelölt, gyakori kudarcok, Alzheimer's Res. Ther., 2014, 6, 37.

3 P.-P. Liu, Y. Xie, X.-Y. Meng és J.-S. Kang, Az Alzheimer-kór hipotéziseinek és klinikai vizsgálatainak története és fejlődése, Signal Transduction Targeted Ther., 2019, 4, 1–22.

4 C. Soto és S. Pritzkow, Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative betegségek, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332–1340.

5 VH Perry és C. Holmes, Microglial priming in neurodegenerative disease, Nat. Rev. Neurol., 2014, 10, 217–224.

6 Y. Tang és W. Le, Differential Roles of M1 and M2Microglia in Neurodegenerative Diseases, Mol. Neurobiol., 2016, 53, 1181–1194.

7 MW Salter és B. Stevens, Microglia az agybetegségek központi szereplőjeként jelenik meg, Nat. Med., 2017, 23, 1018–1027.

8 S. Krasemann et al., The TREM2-APOE Pathway Drives the Transscriptional Phenotype of Dysfunctional Microglia in Neurodegenerative Diseases, Immunity, 2017, 47, 566–581.e9.

9 Q. Zhao és munkatársai, A pioglitazon antidepresszáns-szerű hatásai krónikus enyhe stresszes egérmodellben a mikroglia aktivációs fenotípusok PPAR által közvetített megváltozásával társulnak, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.

10 L. Wen et al., Polarization of Microglia to the M2Phenotype in a Peroxisome Proliferator-Activated ReceptorGamma-Dependent Manner Attenuates Axonal Induced by Traumatic Brain Injury in Mice, J. Neurotrauma, 2018, 35–2340.

11 W. Cai és munkatársai, Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR): A központi idegrendszeri sérülések és javítások mestere, Prog. Neurobiol., 2018, 163–164, 27–58.12 B. Brakedal és mtsai., Glitazone use asssociated with red riskof Parkinson-kór, Mov. Disord., 2017, 32, 1594–1599.

For more information:1950477648nn@gmail.com