ABSZTRAKT

A melanin az emberi bőr fő pigmentje, amely elsődleges szerepet játszik az ultraibolya sugárzás elleni védelemben. A melanintermelés megváltozása hiperpigmentációs betegségekhez vezethet, mind esztétikai, mind egészségügyi következményekkel. Így a melanogenezis szuppresszorait az orvosi és kozmetikai kezelések hasznos eszközeinek tekintik. Nagy érdeklődés irányul a természetes források iránt, amelyek célja a biztonságos és mennyiségileg elérhető depigmentáló anyagok megtalálása. Úgy gondolják, hogy a zuzmók az ilyen típusú vegyületek lehetséges forrásai, mivel számos fenolmolekula előfordulása arra utal, hogy a melaninszintézisben részt vevő fenoláz enzimekre, például a tirozinázra hatással lehet. Ebben a munkában négy zuzmófajt, a Cetraria islandica Ach.-t, a Flavoparmelia caperata Hale-t és a Letharia vulpina (L.) Hue-t, valamint a Parmotrema perlatum-ot (Hudson) M. Choisy-t használtuk, hogy növekvő polaritású oldószerekben, ti. kloroform, kloroform-metanol, metanol és víz. A sejtmentes, tirozináz gátlási kísérletek a L. vulpina metanolos kivonatnál mutatták a legnagyobb gátlást, ezt követte a C. islandica kloroform-metanol. A depigmentációs aktivitások összehasonlítható eredményeit in vitro és in vivo rendszerekkel, például MeWo melanomasejtekkel és zebradán lárvákkal figyelték meg. Tanulmányunk első bizonyítéka a zuzmókivonatok depigmentáló hatásának, a tirozináz gátlástól a sejt- és in vivo modellekig, ami azt sugallja, hogy a L. vulpina és a C. islandica kivonatok további vizsgálatokat érdemelnek bőrfehérítő termékek fejlesztése érdekében.

A vonatkozó tanulmányok szerintcistancheegy közönséges gyógynövény, amelyet "az életet meghosszabbító csodanövényként" ismernek. Fő összetevője azcisztanozid, melynek különféle hatásai vannak, mint plantioxidáns, gyulladáscsökkentő, és az immunrendszer működésének elősegítése. A mechanizmus a cistanche ésbőrfehérítésa cistanche antioxidáns hatásában rejlikglikozidok. Az emberi bőrben a melanint a tirozin oxidációja katalizáljatirozináz, az oxidációs reakcióhoz pedig oxigén részvétele szükséges, így a szervezetben lévő oxigénmentes gyökök a melanintermelést befolyásoló fontos tényezővé válnak. A Cistanche cisztanozidot tartalmaz, amely antioxidáns, és csökkentheti a szabad gyökök képződését a szervezetben, ígygátolja a melanin termelését.

Kattintson a Cistanche Tubulosa kiegészítőre a fehérítéshez

További információért:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

TantárgyakNövénytudomány, Bőrgyógyászat

KulcsszavakTirozináz, zuzmó másodlagos metabolitjai, zebrahal, melanogenezis, Letharia vulpina, Cetraria islandica

BEVEZETÉS

Gerincesekben a melaninszintézist speciális sejtek, az úgynevezett melanociták valósítják meg, a lizoszómaszerű organellákban, a melanoszómákban. A melanizációt különböző folyamatok szabályozzák, beleértve a környezeti (pl. UV sugárzás) és az endogén (pl. -MSH) faktorokat, a melanocortin-1 receptor (MC1R) stimulálását, a cAMP és MAPK útvonalak általi jelátvitelt, a mikroftalmia aktiválódását. kapcsolódó transzkripciós faktor (MITF), valamint a melanoszóma előtti fehérje (Pmel), a tirozináz (TYR) és a tirozinázzal rokon fehérjék (TYRP1) expressziója (D'Mello et al., 2016; Cheli és mtsai, 2010).

A tirozináz (EC1.14.18.1) a melaninszintézis kulcsenzime, és széles körben vizsgálták a melanizációt moduláló ágensek célpontjaként. A természetben széles körben elterjedt, többfunkciós réztartalmú enzim, amely állatokban a melanizációért, növényekben és mikroorganizmusokban pedig barnulásért felelős (Kondo & Hearing, 2011). Az enzim a melanin képződésének két különböző reakcióját katalizálja: a tirozin hidroxilezését mikofenolát aktivitással és a 3,4-dihidroxifenilalanin (L-DOPA) o-dopakinonná történő oxidációját difenolok hatására. Ezek a reaktív o-kinonok nem enzimatikus polimerizáción mennek keresztül, melanint képezve.

Bár az emberi bőr melanin nélkülözhetetlen pigment az UV-sugárzás okozta károsodások elleni védelemben, a túlzott melanintermelés hiperpigmentációs rendellenességeket, például melazmát, ephelideket és lentigineket okoz (Mukherjee et al., 2018). Ezek az állapotok sok ember számára problémát jelentenek, és ennek következtében a depigmentáló szerek keresése nagy érdeklődést váltott ki az orvosi és gyógyszerészeti területeken (Solano, 2014). Ezért jelentős kutatási erőfeszítések irányultak olyan új természetes hatóanyagok felfedezésére, amelyek gazdagok biztonságos és mennyiségileg elérhető pigmentációgátlókban (Li et al., 2013; Lo et al., 2013; Wang és mtsai, 2011). A fő stratégia a tirozináz megcélzása, egyre nagyobb az érdeklődés a tirozináz inhibitorként használható természetes termékek iránt (Leyden et al., 2011). Az irodalomban nagyszámú, természetes forrásból származó tirozináz-inhibitorról számoltak be a pigmentfoltos bőrbetegségek kezelésében való lehetséges alkalmazásukról (Mukherjee et al., 2018; Parvez és mtsai, 2007). Sok ilyen vegyület esetében a gátló hatás a fenolos szerkezetükhöz kapcsolódik, amely magas antioxidáns hatást biztosít. Különböző bizonyítékok arra utalnak, hogy a zuzmókat érdemes megvizsgálni, mint az ilyen típusú vegyületek lehetséges forrásait (Brandão et al., 2017; Higuchi és mtsai, 1993; Honda et al., 2016; Lopes, Coelho és Honda, 2018).

A zuzmók szimbiotikus társulások egy heterotróf gomba (a mikobiont) és egy vagy több fotoszintetikus partner (a fotobionták) között (Nash III, 2006). A szimbiózis eredményeként a mikobiont több másodlagos metabolitot (úgynevezett zuzmóanyagot) termel, amelyek többsége ezekre a szervezetekre jellemző (Ranković & Kosanić, 2015). Ezek a metabolitok segíthetnek megvédeni a biotikus és abiotikus tényezőket, például a növényevőket vagy az UV-sugárzást (Phinney, Solhaug és Gauslaa, 2018). Legtöbbjük fenolos vegyület, amely főleg az acetát-polimalonát útvonalból származik, és várhatóan számos biológiai aktivitást biztosít. Ennek megfelelően a zuzmókat a hagyományos orvoslásban világszerte különböző célokra használják (Crawford, 2015; Devkota és mtsai, 2017), míg különböző zuzmóanyagokat használnak fel gyógynövény- és gyógyszerészeti alkalmazásokhoz (Einarsdóttir et al., 2010; Gül¸). cin et al., 2002; Ranković és Kosanić, 2015). Különböző tulajdonságok közül ezeknek a vegyületeknek a fenolos természete a fenoláz enzimek, például a tirozináz aktivitására gyakorolt ​​hatásra utal (Honda et al., 2016). A zuzmók jó forrásai a természetes antioxidánsoknak, amelyek közül néhányat tirozináz inhibitorként ismernek el (Behera, Adawadkar és Makhija, 2004). Egyes szabadalmak a zuzmókivonatokhoz vagy zuzmóvegyületekhez kapcsolódó tirozinázzal szembeni tevékenységet is igényelnek (Takayama et al., 2010), de ezeket régóta figyelmen kívül hagyták, főként azért, mert nehézségekbe ütközik olyan mennyiségű és tisztaságú zuzmóanyag beszerzése, amely elegendő a szerkezeti felvilágosításhoz és a zuzmóvegyületekhez. farmakológiai tesztelés (Boustie, Tomasi és Grube, 2011; Muggia, Schmitt és Grube, 2009).

A tanulmány célja a zuzmóanyagok biológiai hatásainak feltárása volt különböző – sejtmentes és sejtes – pigmentációs modelleken, beleértve az in vivo Zebrafish kísérleteket is. Ezen túlmenően tippeket adtunk a zuzmók depigmentáló vegyületek kinyerésére, valamint gyógyszerészeti és kozmetikai depigmentáló termékek előállítására való hasznosításának lehetőségére. A zuzmók melanizációra gyakorolt ​​hatásának korlátozott ismeretei miatt először szűrést végeztünk a széles elterjedésükről és abundanciájukról ismert különböző fajokon, pl. Cetraria islandica Ach., Flavoparmelia caperata Hale, Letharia vulpina (L.) Hue és Parmotrema perlatum (Hudson) M. Choisy. Mindegyik fajból négy kivonatot kaptunk növekvő polaritású oldószerek felhasználásával, a tiszta kloroformtól a vízig. Első felmérésként minden kivonatot sejtmentes, tirozináz gátlási kísérletekben teszteltünk. A kifejezett dózisfüggő gátló hatást mutató kivonatokat in vitro és in vivo melanizációs modelleken alkalmaztuk, melanintermelő melanomasejtek (MeWo), illetve fejlődő zebradánembriók tenyészetével. A zebrahalat azért alkalmaztuk, mert a közelmúltban in vivo modellként hozták létre a melanogén szabályozó vegyületek fenotípus-alapú szűrésére (Lin et al., 2011). A zebradán különösen fontos gerinces modell a kábítószer-hatások felmérésében, mivel egyedülálló tulajdonságokkal rendelkezik, beleértve a könnyű karbantartást és gyógyszeradagolást, rövid szaporodási ciklust, külső megtermékenyítést és fejlődést, lehetővé téve a fejlődési környezet manipulálását és az optikai méréseket az átlátszón keresztül. test fala.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Vegyszerek

Minden reagenst a Sigma-Aldrich-től (Milánó, Olaszország) vásároltunk, hacsak másként nem jelezzük.

A zuzmófajták és a kivonat elkészítése

A F. caperata és a P. perlatum Thalli-ját Liguria keleti részén (ÉNy-Olaszország) egy erdős területen gyűjtötték, a L. vulpinát Valtournenche erdőterületén (É. Valle d'Aosta, Olaszország), a C. islandicát pedig Kubjától vásárolták. Ürditalu (Tallinn, Észtország). Az olasz jogszabályok szerint a zuzmógyűjtéshez nincs szükség engedélyre. A zuzmóanyagokat egyikünk (PG) azonosította mikroszkópos elemzéssel, azonosító kulcsok és helyszíni tesztek segítségével. Ezt követően a zuzmóanyagot megtisztítottuk a törmeléktől, egy éjszakán át szobahőmérsékleten száradni hagytuk, és felhasználásig papírzacskóban tároltuk szobahőmérsékleten.

A szárított zuzmótallit szobahőmérsékleten (körülbelül 23 °C-on) extraháltuk négy oldószerpolaritással kloroformról vízre: kloroform, kloroform–metanol (9:1), metanol és víz (14,4 g F. caperata 70 ml-ben). oldószer, 10,4 g P. perlatum 60 ml-ben, 13,3 g L. vulpina 75 ml-ben és 100,6 g C. islandica 500 ml-ben). Az extrakciókat 5 napon keresztül végeztük, és mindegyik oldószer esetében háromszor, gyakori keverés mellett. A felülúszó folyadékot ezután szűrtük, és csökkentett nyomáson rotációs rendszerben (Rotavapor Heidolph, Schwabach, Németország) szárazra pároltuk, így szárított kivonatokat kaptunk (Souza et al., 2016). A zuzmókivonat hozamát az 1. táblázat tartalmazza.

Tirozináz gátlási vizsgálat

A hagyományos TLC kromatográfiás profilt 20 × 20 cm-es lemezeken (Merck szilikagél 60 F254) végeztük az irodalmi protokollok szerint (Culberson és Kristinsson, 1970; White és James, 1985). Röviden, a L. vulpina metanolos kivonat és a C. islandica kloroform-metanol kivonat mintáit extrakciós oldószereikben oldottuk fel, majd kapilláriscső segítségével TLC lemezre foltoztuk. A vékonyréteg-kromatográfiás profilt mozgófázisként toluol:ecetsav (200:30 ml) alkalmazásával végeztük (C oldószer). Az oldószerfront elérése után a lemezt szobahőmérsékleten száradni hagytuk. A megszáradt lemezeket először látható fényben (nappali fényben) vizsgáltuk és fényképeztük a pigmentek mint színes foltok kimutatására, majd fluoreszcens fényben, 254 és 350 nm-es gerjesztéssel.

A tirozináz gátlási aktivitás minden foltban való megjelenítésére a TLC lemezeket L-tirozin oldattal (körülbelül 2,5 × 10-5 mmol/cm2), majd tirozináz oldattal (körülbelül 3,6 U/cm2) permeteztük. A tirozináz-gátló aktivitású foltok sötét háttéren fehéren jelentek meg (Wangthong et al., 2007).

Sejtkultúra, sejtéletképesség és melanin vizsgálatok

A MeWo humán melanoma sejtvonalat (kat. HTB-65, ATCC, Manassas, VA, USA) használtuk a sejtek életképességi vizsgálatához, amint azt Pastorino és munkatársai (2017) számolták be, valamint a melanin vizsgálathoz, amint azt leírták: Cornara és munkatársai (2018).

Zebrafifish depigmentációs vizsgálat

A kifejlett zebrahalat (Danio rerio) egy kereskedelmi kereskedőtől szerezték be, és 500-530 /cm vízvezető képességű keringető rendszerben tartották 27 ◦C-on, pH 7,0-7,5, állandó 14/10 fény mellett. sötét fotoperiódus. Az állatok állatorvosi ellátása az olasz törvény (D.to L.Vo 26/2014) szerint történt, a kísérleteket az Institutional Ethics Review Body (Genoai Egyetem) és az Olasz Egészségügyi Minisztérium (720/ engedély) hagyta jóvá. 2015-PR). A kifejlett zebrahal ívását standard módszerek szerint végeztük. A szinkronizált embriókat különösen a lámpa bekapcsolásával kiváltott reggeli természetes ívásból nyerték. Az embriókat 6-üreges lemezekre rendeztük, amelyek 2 ml embrió táptalajt és 15 embriót tartalmaztak üregenként. Az extraktum törzsoldatokat közvetlenül felhasználás előtt hígítottuk a kívánt koncentrációra embrióközeggel (L. vulpina metanolos kivonat: 6-45 µg/ml; C. islandica kloroform-metanol kivonat: 5-65 µg/ml). Minden egyes lyukba hígított kivonatokat adtunk, és 8-56 lóerővel (a megtermékenyítés után órával) inkubáltuk, ami 48 órás expozíciót eredményezett. Pozitív kontrollként 10 mM arbutint használtunk. A tápközeget 24 óránként cseréltük, hogy biztosítsuk a tesztvegyületek egyenletes eloszlását. Az 56 lóerős embriókat csipesszel dechorionáltuk, trikain-metánszulfonát oldatban (Sigma Aldrich) elaltattuk, majd sztereomikroszkóp alatt (Leica M205C) fényképeztük. A pigmentációra gyakorolt ​​hatásokat az ImageJ szoftver 1.74-es verziójával értékelték ki. A pixel mérés elemző funkciót használtuk a zebradán pigmentáció területének értékelésére.

Statisztikai analízis

A tirozináz gátlás, az MTT és a zebradán pigmentáció adatai alapján kapott dózis-válasz görbéket logisztikus regressziós modellel elemeztük, így az IC50 és az IC05 értékeket medián, illetve küszöbértékként feltételezték. A statisztikai összehasonlítások az R 3.0.1 (R Core Team, 2013) környezettel történtek, ANOVA teszt, t Student Bonferroni korrekcióval és Dunnett tesztjei többszörös összehasonlításhoz.

EREDMÉNYEK

A tirozináz aktivitásra gyakorolt ​​hatás

A zuzmókivonatok a gomba tirozináz aktivitását moduláló hatások komplexét mutatták, in vitro sejtmentes vizsgálatban értékelve. Egyes kivonatok tirozináz aktivációt indukáltak, különösen a F. caperata metanolos, kloroformos és L. vulpina vizes kivonatai, mások kétfázisú viselkedést mutattak, míg néhány gátló hatást mutatott (1. ábra és 2. táblázat). Különösen a kloroform-metanol (1B. ábra) és a metanolos kivonatok (1C. ábra) mutattak összességében erősebb tirozinázgátlást, dózisfüggő hatásokkal. A legerősebb gátlási aktivitást a L. vulpina metanolos kivonata (1C. ábra), majd a C. islandica kloroform-metanolos kivonata követte (1B. ábra). Ezeknek a kivonatoknak a gátló hatása volt az egyetlen, amely lehetővé tette az IC50 értékek becslését 95 százalékos CI-vel (2. táblázat). Pozitív kontrollként ezekben a kísérletekben a kojinsav által kiváltott tirozináz gátlás 13,9 µg/ml IC50 értékkel (95 százalékos konfidencia intervallum: 12,4–15,7).

További információ: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501