Szerves ásványi nanorészecskék kimutatása és jellemzése az emberi vesékben
Feb 22, 2022
Tsui-Yin Wong1,2,*, Cheng-Yeu Wu1,2,3,* et al
Az ektópiás meszesedés számos emberi betegséggel jár, beleértve az érelmeszesedést, a rákot,krónikusvesebetegség, éscukorbetegségmellitusz. Bár ásványi nanorészecskéket kimutattak a meszesedett erekben, ezeknek a részecskéknek a természete és szerepe az emberi szervezetben továbbra sem világos. Itt mutatjuk meg először azt az embertvesevégstádiumból nyert szövetekkrónikusvesebetegségvagy veserákos betegek kerek, többrétegű, 50-1500 nm-es ásványi részecskéket tartalmaznak, míg az egészséges kontrollokban nem figyeltek meg részecskéket. Az ásványi részecskék elsősorban a Henle csavarodó tubulusait, gyűjtőcsatornáit és hurkjait körülvevő extracelluláris mátrixban, valamint a tubulusokat kijelölő sejtek citoplazmájában találhatók meg, és polikristályos kalcium-foszfátból állnak, hasonlóan a csontokban és a méhen kívüli meszesedésekben található ásványhoz. AzveseAz ásványi nanorészecskék számos olyan szérumfehérjét tartalmaznak, amelyek gátolják az ektopiás meszesedést a testfolyadékokban, beleértve az albumint, a fetuin-A-t és az apolipoprotein A1-et. Mivel az ásványi-szerves nanorészecskék nemcsak meszesedő lerakódásokban, hanem mikroszkopikus meszesedésektől mentes területeken is megtalálhatók, megfigyeléseink azt mutatják, hogy a nanorészecskék a meszesedés és a vesekövek előfutárai lehetnek az emberben.
Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Az ektópiás meszesedés érelmeszesedéssel, rákkal,krónikusvesebetegségés diabetes mellitus1-3. A legújabb vizsgálatok azt mutatják, hogy az érelmeszesedés éskrónikusvesebetegségA vaszkuláris meszesedés jeleit mutató betegek fokozott morbiditási és mortalitási kockázatot mutatnak, ami arra utal, hogy az ektópiás meszesedés káros az emberi egészségre1,3. A nem kívánt meszesedést idősödő egyéneknél is megfigyelték, és a legtöbb 60 év feletti embernél az érrendszeri meszesedés jelei mutatkoznak4. Ezen okok miatt az ektópiás meszesedést kiváltó tényezők megfejtése és a hatékony kezelés kidolgozása fontos célt jelent.
Az ektópiás meszesedés a szervezetben a meszesedést gátlók és indukálók közötti egyensúlyhiányként definiálható. A meszesedésgátlók közé tartoznak a szérumfehérjék, például az albumin, a fetuin-A, az oszteopontin és a mátrix GLA fehérje, valamint a kisméretű vegyületek, mint a pirofoszfát, míg a hiperfoszfatémia és a gyulladás a meszesedés fő indukálói5–7. A legújabb tanulmányok azt mutatják, hogy a meszesedést kiváltó szerek a vaszkuláris meszesedés során a csontképződéshez hasonló sejtfolyamatot aktiválnak7,8. A fejlődő csontokban mineralizációt indukálókhoz hasonló mátrix hólyagokat a meszesedett lágyszövetekben is kimutattak7–9. Ezeket a mátrix hólyagokat valószínűleg az érrendszeri simaizomsejtek bocsátják ki, amelyek oszteoblaszt-szerű sejtekké differenciálódnak, amelyek meszesedést indukálnak7.
Az ektopiás meszesedés jeleit mutató lágy szövetekben ásványi nanorészecskéket (NP-ket) mutattak ki. Price et al. azt találta, hogy a biszfoszfonát etidronáttal vagy D-vitaminnal kezelt patkányok széruma ásványi anyag-fehérje komplexeket tartalmaz, amelyek fetuin-A-t és mátrix GLA fehérjét tartalmaznak10,11. Hasonlóképpen Jahnen-Dechent et al. megfigyelték, hogy meszesedő hashártyagyulladásban szenvedő betegek asciticus folyadékában fetuin-A-tartalmú ásványi komplexek, amelyeket calciprotein particle-nek (CPP-nek) neveztek, kimutathatók12. Bertazzo et al. kimutatták az ásványi NP-k jelenlétét az aortabillentyűkben és a koszorúerekben mind ateroszklerotikus, mind reumás lázas betegeknél13. Míg az ásványi részecskék képződésével kapcsolatos tanulmányok általában az emberi szív- és érrendszerre összpontosítottak, továbbra sem világos, hogy a részecskék megtalálhatók-e más szövetekben, és hogy ezek az entitások szerepet játszanak-e az egészségben vagy a betegségekben.
Korábban megfigyeltük, hogy az ásványi-szerves NPS-ek spontán módon képződnek emberi és állati testfolyadékokban14–28. Ezeket az ásványi NP-ket eredetileg nanobaktériumként (NB) írták le, és úgy vélték, hogy nemcsak a legkisebb sejtek a Földön29, hanem számos betegség, köztük az Alzheimer-kór, az érelmeszesedés, a rák, lehetséges átvihető okozói is.vesekőképződés, policisztásvesebetegségés prosztatagyulladás30-32. Eredményeink azonban azt mutatták, hogy az NB valójában nem élő ásványi NP-k, amelyek morfológiájuk, növekedésük, szaporodásuk és szubkultúrájuk tekintetében a közönséges baktériumokat utánozzák15,18,22. Megvizsgálásra vár, hogy az úgynevezett NB-hez hasonló ásványi részecskék megtalálhatók-e az emberi szövetekben, és hogy ezek a részecskék szerepet játszanak-e a betegségekben.
Jelen tanulmányban nanoanyag-megközelítést dolgoztunk ki az ásványi-szerves NP-k kimutatására és elemzésére beteg emberben.veseszövetek. Kimutattuk, hogy a végstádiumú krónikus vesebetegségben és veserákos betegek veseszövetei a testnedvekben in vitro spontán kicsapódó biomimetikus ásványi részecskékre hasonló multilamelláris ásványi NP-ket tartalmaznak. Eredményeink kritikus meglátásokat tárnak fel ezen ásványi anyagok-szerves részecskék biokémiai összetételével, képződési mechanizmusával és biológiai funkciójával kapcsolatban, valamint rávilágítanak az ektopiás meszesedés és a betegségek kiindulási mechanizmusaira az emberi szervezetben.
Eredmények
Végstádiumú krónikus vesebetegségben (n=2) vagy veserákkal (n=18) szenvedő humán betegek veseszöveteit sebészi úton eltávolítottuk; lásd az 1. táblázatot; a veserák mintáinál a nem -a szövet rákos része). Egészséges kontrollként olyan betegek vesebiopsziáit tanulmányoztuk, akik trauma vagy hematóma volt, de korábban nem volt kóros vesefunkció (n=2; 1. táblázat).
Az egészséges egyének veseszövetei normális szövettani jellemzőket mutattak, és nem figyeltek meg méhen kívüli meszesedést a von Kossa-festést követően (1A, B ábra). Másrészt a beteg egyénektől nyert, hematoxilinnel és eozinnal (H&E) megfestett veseszövetek szövetkárosodást mutattak (2A–C. ábra, nyilakkal jelölve), és a vizsgált beteg szövetek 80 százaléka mineralizált lerakódásokat mutatott, amint kiderült. von Kossa festéssel (1C–T. ábra, 2E,F ábra, a meszesedés fekete nyilakkal jelölt fekete anyagként látható; lásd még az 1. táblázatot). Elmeszesedett lerakódásokat észleltek a kéregben és a velőben, beleértve a distalis tekercses tubulusokat körülvevő extracelluláris teret, a proximális csavart tubulusokat, a Henle gyűjtőcsatornáit és hurkjait, valamint a tubulusokat és csatornákat körülvevő sejtek citoplazmáját (1C–T és 1. ábra). 2E, F). Nem észleltünk meszesedést a vesetestben (2D. ábra).
Az ásványi csapadék természetének vizsgálatára ultravékony vesemetszeteket készítettünk transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM) megfigyelésre. A mikroszkopikus ásványi lerakódásokat tartalmazó mintákban ásványi részecskéket vagy granulátumokat mutattak ki a vesehámsejtek citoplazmájában, az alapmembrán alatti extracelluláris mátrixban, valamint a proximális és disztális, csavarodott tubulusok lumenében (3A, B ábra, a részecskék megnagyobbodtak). az A1–A4 és a B1–B4 paneleken). Ásványi NP-ket is megfigyeltek a Henle hurkjait és a gyűjtőcsatornákat bélelő sejtekben (3C, D ábra, kinagyítva a C1, C2 és D1 paneleken). Néhány részecskét találtunk a vesesejtek intracelluláris vezikuláiban (3A. ábra, A1 és A2 panelek). Az itt alkalmazott elektronmikroszkópos megközelítés lehetővé tette az ásványi részecskék belsejének vizualizálását is; egyes részecskék elektronsűrű gyűrűket tartalmaztak, amelyek világos, elektronlucens rétegekkel váltakoztak (3A. ábra, A3 és A4 panelek, 3C. ábra, C1 panel). Számos véredény, például a vasa recta rens (a vese egyenes artériái), nagyszámú ásványi NP-vel veszünk körül (3D. ábra, D1 panel). Így az összes emberi veseszövet különböző helyein ásványi NP-ket találtak, amelyek méhen kívüli meszesedés jeleit mutatták, míg a vizsgált egészséges kontrollokban nem találtak részecskéket.
A veseszövetekben található ásványi részecskék nagyon hasonlónak tűnnek azokhoz az ásványi-szerves NP-ekhez, amelyeket korábbi tanulmányainkban15,17 leírtunk, spontán képződnek a testnedvekben (és amelyeket bionoknak24 neveztünk). Ennek a lehetőségnek az igazolására ásványi szerves NP-ket (vagy bioonokat) állítottunk elő kicsapási módszerrel, amint azt korábban leírtuk15. Ez a módszer abból áll, hogy kicsapó ionokat, például kalciumot és foszfátot adnak a sejttenyésztő táptalajhoz (Dulbecco módosított Eagle táptalaj vagy DMEM), amely emberi szérumhoz (HS) hasonló testfolyadékot tartalmaz, majd sejttenyésztési körülmények között inkubálják (lásd Módszerek). Az így előállított részecskék (HS-NPS) gömb alakúak vagy ellipszoidok voltak, és sima vagy kristályos ásványi felületet mutattak (4A–E. ábra), hasonlóan a testnedvekben22,23, valamint az emberi ascitesben12 és a korábban leírt részecskékre. elmeszesedett artériák13. Az ásványi részecskék nagyon hasonlítottak a veseszövetekben megfigyelt ásványi NP-ekhez vagy granulátumokhoz általános morfológiájuk, többrétegű szerkezetük és felületi jellemzőik tekintetében (4F-J ábra). A HS-eredetű részecskék és a veseszemcsék mérete is összehasonlítható volt, átmérőjük 50 és 1500 nm között változott (4A-E, F-J ábra). Amint fentebb megjegyeztük, néhány vesegranulátumot lipidmembrán vett körül, amely valószínűleg intracelluláris rakományhólyagokat vagy extracelluláris membránvezikulumokat jelent (4H, I. ábra, a membránokat nyilakkal jelöljük); ilyen membrános szerkezetek hiányoztak az in vitro előállított HS-NP mintákból (4A–E. ábra). Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a vesegranulátumok hasonlóak a szérumban összeállított ásványi-szerves NP-ekhez.
Kiválasztott területi elektrondiffrakciós analízissel megfigyeltük, hogy az in vitro előállított HS-NP-k ásványi fázisa polikristályos nanoanyagból állt (4E. ábra, betét; figyelje meg a halvány koncentrikus gyűrűket). Hasonló eredményeket kaptunk a veseszemcsék esetében (4J. ábra, betét), valamint a csontok és a méhen kívüli meszesedések esetében, a korábbi vizsgálatokban leírtak szerint33,35.
Energiadiszperzív röntgenspektroszkópiával (EDX) vizsgáltuk a HS-NP-k és a vesegranulátumok kémiai összetételét. A HS-NP-k a szén (C), a kalcium (Ca), az oxigén (O) és a foszfor (P) főbb csúcsait mutatták (4K. ábra), ami összhangban van egy kalcium-foszfát ásványi anyag jelenlétével. A szilícium (Si) alacsony csúcsát a HS-NP-kben is megfigyelték (4K. ábra), amely valószínűleg egy kisebb részecske-összetevőt jelent. A veseszemcsék szén-, kalcium-, oxigén- és foszfor-csúcsokat is mutattak, ami kalcium-foszfát ásványi anyagra utal, valamint további szilícium- és vascsúcsokat (Fe) (4L. ábra). Az uráncsúcsokat (U) a minta-előkészítés során kontrasztreagensként használt uranil-acetátnak tulajdonították (az urán jelenléte egyes ásványi részecskék mintáiban, például vesegranulátumokban, illetve hiánya a kontrollszövetben a 4M. ábrán a magas koncentrációnak tulajdonítható az urán affinitása a foszfáthoz, amint azt korábban közöltük35). A részecskéket körülvevő veseszövet kontroll EDX spektruma szén- és oxigéncsúcsokat mutatott (4M. ábra), ami arra utal, hogy kalcium és foszfor főleg az ásványi részecskékben található.
A HS-NP-k és a vesegranulátumok kalcium:foszfor (Ca:P) aránya 0,65 és 1,18 között változott. Ezek az arányok eltérnek a sztöchiometrikus hidroxiapatitnál megfigyelt 1,67-es elméleti értéktől, de még mindig a korábban a kalcium-foszfát és apatit kristályok esetében megfigyelt tartományon belül vannak a különböző kristályosodási fokoknál15. Ezek az eredmények együttesen megerősítik, hogy a veseszemcsék kalcium-foszfát NP-kből állnak.
Különféle fehérjékről azt találták, hogy szisztémás módon gátolják a méhen kívüli meszesedést a szervezetben36,37. Ezen túlmenően, a szintetikus NP-k felületén található fehérje korona a feltehetően meghatározza a részecskék biológiai eloszlását és a sejtekre gyakorolt hatását in vivo38,39. Másrészt az emberi veseszövetekben található ásványi-szerves NP-k fehérje összetétele továbbra sem teljesen ismert. Korábban azt találtuk, hogy az albumin, a fetuin-A és az apolipoprotein-A1 (apo-A1) jelentik a fő fehérjéket, amelyek kölcsönhatásba lépnek a testnedvekben képződő ásványi-szerves NP-kkel17,20. Itt immunarany jelölést alkalmaztunk ezen fehérjék jelenlétének és ultrastrukturális elhelyezkedésének vizsgálatára a vesegranulátumokon belül.
Humán szérumalbumin (HSA), humán szérum fetuin-A (HSF), humán apo-1A és teljes HS elleni poliklonális antitesteket használtunk a szérumfehérjék jelenlétének vizsgálatára a HS-NP-kben és a vesegranulátumokban. A poliklonális antitestek (a korábban leírtak szerint előállított25) specifitását Western blottal igazoltuk (5. ábra). A poliklonális antitestek mindegyike pozitívan reagált az in vitro előállított HS-NP-kkel, valamint az emberi veseszövetekben található ásványi granulátumokkal (6A, B ábra, A1–A3 és B1–B3 panelek; fekete pontok). Az antitestek főleg a HS-NP-k és vesegranulátumok elektronsűrű rétegeivel vagy sötét magjával reagáltak (6A, B ábra), ami azt jelzi, hogy ezek a sötét területek magasabb fehérjeszintet tartalmazhatnak, mint az elektron-lucens területek. Az elsődleges antitest nélkül végzett negatív kontrollok nem produkáltak reakciót (6A., B. ábra, A4 és B4 panel, kontroll). Megállapítottuk, hogy a vesegranulátumok a HS-NP-ekhez hasonló ásványi-szerves NP-ket képviselnek, nemcsak morfológiájuk és ásványi összetételük alapján, hanem a szérumban jelenlévő fő meszesedésgátlókhoz való kötődésük alapján is.
Ezt követően immunfluoreszcens mikroszkópos vizsgálatot alkalmaztunk a HSA-t és HSF-et tartalmazó ásványi granulátumok jelenlétének igazolására beteg emberi vesékben. Ezzel a technikával az emberi veseszövetek kimutatták
pozitív festődés a két fehérjére különböző területeken, beleértve a vesetubulusokat körülvevő interstitiumot, valamint a tubulusokat körülhatároló sejtek citoplazmáját (7A. ábra, A1 és A2 panelek). Ezeken a területeken albumint és fetuin-A-t egyaránt tartalmazó fehérje-aggregátumokat is észleltek, bár kisebb mennyiségben, mint az egyes fehérjék festődése (7A ábra és A3 panel, egyesített festés sárga színnel). Nevezetesen észrevettük, hogy az immunfluoreszcenciával kimutatott fehérjefestődés szorosan átfedésben van a von Kossa festéssel megfigyelt méhen kívüli meszesedés mintájával (7A, B ábra, a meszesedés fekete anyagként látható, amelyet a B-ben nyilakkal jeleztünk). Ezek az eredmények további alátámasztást nyújtanak az ásványi-szerves részecskék jelenlétének a vizsgált emberi veseszövetekben.
Vita
Noha előrelépés történt a szintetikus NP-k és az emberi sejtek közötti kölcsönhatások megértésében, jóval kevesebbet tudunk a testnedvekben spontán képződő ásványi-szerves NP-k hatásairól. Korábbi vizsgálataink kimutatták, hogy ezek a részecskék biológiai folyadékokban képződnek, amikor a kalcium és a foszfát koncentrációja meghaladja a telítettséget15,16. Azt is megfigyeltük, hogy ezeket a részecskéket az immunsejtek internalizálják, de csak a nagy részecskék indukálnak gyulladást elősegítő immunreakciókat23. Azonban ezeknek a részecskéknek az emberi szövetekben való eloszlását és azt, hogy a szervezetben fiziológiai vagy kóros szerepet játszanak-e, eddig nem vizsgálták.
Jelen tanulmányunkban először mutattunk ki ásványi-organikus NP-ket végstádiumú vesebetegségben vagy veserákban szenvedő humán betegek veséjében. A kimutatott ásványi-szerves NP-k a csontásványhoz hasonló gyengén kristályosodott kalcium-foszfátot, valamint albumint, fetuin-A-t és apo-A1-et tartalmaznak, amelyek szisztémás meszesedés-gátlóként hatnak a testnedvekben. Eredményeink megegyeznek azokkal a korábbi jelentésekkel, amelyek ásványi-fehérje komplexek jelenlétét írták le az érszövetekben és testnedvekben12, 13, 34, 40. Mivel az általunk megfigyelt részecskéket olyan területeken találtuk meg, ahol nem találhatók mikroszkopikus meszesedések, megfigyeléseink arra utalnak, hogy a részecskék az ektopiás meszesedés prekurzorai lehetnek az emberi szövetekben. Tekintettel arra a lehetőségre, hogy az ásványi-szerves NP-k fokozatosan megnövekedhetnek a méretükben, és részecskékké alakulhatnak át kedvező körülmények között, amint azt korábbi tanulmányainkban leírtuk15,18, az itt bemutatott megfigyelések arra utalnak, hogy az ásványi prekurzorok nagyobb méretűek kialakulásához vezethetnek. ásványi lerakódások in vivo, például Randall plakk és vesekő.
Megfigyeléseink, miszerint ásványi méhen kívüli meszesedések és ásványi-szerves NP-k találhatók a vesék különböző anatómiai struktúráiban, összhangban vannak az e szerv méhen kívüli meszesedésére vonatkozó korábbi megállapításokkal41. Evan és munkatársai megfigyelései azt mutatták, hogy a nephrolithiasisban szenvedő betegek veséjében a mineralizáció megindulhat és elsősorban a Henle-hurok intersticiális szövetében fordulhat elő40,42. A szerzők megfigyelték, hogy az ezen a területen képződő ásványi lerakódások kinyúlhatnak az urothelium bazális oldalából, és vesekövek kialakulásához vezethetnek. Megfigyeléseink azt sugallják, hogy a Henle-hurkok mellett más veseterületek is tartalmazhatnak ásványi NP-ket, amelyek végül nagy ásványi lerakódásokat képezhetnek az emberi vesékben. Azt is vizsgáljuk, hogy a vérkeringésben képződő ásványi NP-k a veseszövetekbe transzlokálódhatnak, és méhen kívüli meszesedést és kőképződést idézhetnek elő a vesékben.
A jelen vizsgálatban kimutatott több vesegranulátum intracelluláris vagy extracelluláris hólyagokban található (4H, I. ábra), és ezek hasonlóak azokhoz a mátrix vezikulákhoz, amelyekről kimutatták, hogy meszesedést okoznak a csontokban és a fogakban7,8. Nemrég megfigyeltük, hogy az emberi és állati szérumból izolált vezikulák ásványi NP-k és mikroszkopikus csapadékok képződését indukálják in vitro25. Schlieper és munkatársai34 azt is megfigyelték, hogy az artériákban található ásványi részecskék membránstruktúrákhoz kapcsolódnak, és azt javasolták, hogy ezekben a szövetekben a mátrix vezikulák vagy apoptotikus testek az ásványi részecskék nukleátorai lehetnek. Hasonlóképpen, Khan és mtsai. beszámoltak arról, hogy az idiopátiás vesekőben szenvedő betegek veséjében talált kalcium-foszfát-lerakódások kollagénrostokhoz és mátrix-vezikulákhoz kapcsolódnak9. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a veseszövetekben kimutatott ásványi-szerves NP-k a membrán hólyagokat magában foglaló mechanizmuson keresztül képződhetnek, ami hasonló az atheroscleroticus artériákban tapasztalthoz7,8. Másrészt egy közelmúltbeli tanulmány kimutatta, hogy a nők emlőartériáiban észlelt ektópiás meszesedés nem járt osteogén vagy apoptotikus sejtmarkerekkel43, ami arra utal, hogy a meszesedés mechanizmusa az érintett szervre vagy biológiai összefüggésre specifikus lehet. Ezen túlmenően a humán veseszövetekben ásványi-szerves NP-k, például az itt leírtak, az ionok (pl. kalcium és foszfát) és a meszesedésgátlók (pl. albumin, fetuin-A és apo) fiziológiás koncentrációjának fenntartása miatt is kialakulhatnak. -A1) az emberi testnedvekben.
Eredményeink azt sugallják, hogy az ásványi-szerves NP-k elektronsűrű rétege és magja nagyobb mennyiségű fehérjét és szerves molekulát tartalmazhat, mint a részecskék elektron-lucens területei (6A, B ábra). Ezek az elektronsűrű rétegek mineralizáltnak tűnnek, amint az az anyag kristályos természetéből látható TEM alatt (lásd a 4A-J ábrát). Más szerzők, köztük Ryall41 és Evan et al.44, azt javasolták, hogy az elektron-lucens réteg ásványokat, míg az elektronsűrű rétegek szerves molekulákat jelenthetnek. Ezek az értelmezések legalább részben a minták feldolgozási és vizsgálati módjának, valamint a felhasznált kiindulási szövetek természetének köszönhetők.
Amellett, hogy szerepet játszanak a méhen kívüli meszesedésben, az ásványi anyagok-szerves részecskék gyulladást válthatnak ki a veseszövetekben. Nemrég kimutattuk, hogy míg az ásványi-szerves NP-k nem indukálják a gyulladást elősegítő interleukin-1 kiválasztását az emberi makrofágok által, az 1 μm-nél nagyobb ásványi aggregátumok képesek erre23. Kimutatták, hogy az interleukin-1 kristályos anyagok hatására felszabaduló felszabadulása az intracelluláris molekuláris komplexek, az úgynevezett inflammaszómák aktiválásán múlik45–47. Ezenkívül az ásványi részecskéket kimutatták a daganatos vesékben, és a rák és a gyulladás közötti összefüggés mára jól felismerhető48. Még vizsgálni kell annak lehetőségét, hogy az aggregált ásványi részecskék aktiválhatnak egy gyulladást, és hozzájárulhatnak a gyulladás és a rák kialakulásához a vesékben vagy más szövetekben.
Az itt leírt ásványi granulátumok az ektopiás meszesedés mellett más betegségi folyamatokban is részt vehetnek. Korábban például azt javasoltuk, hogy az ásványi NP-k a testnedvekben lévő különféle fehérjékhez kötődjenek, és kimerítsék ezeket a szerves molekulákat a testfolyadékokból20, 26. Másrészt az emberi szervezet normál körülmények között megakadályozhatja az ásványi NP-k képződését és felhalmozódását a meszesedést gátló szerek és a retikuloendoteliális rendszer (azaz makrofágok) jelenlétére támaszkodva. Az ásványi NP-k így csak akkor halmozódhatnak fel, ha a szisztémás vagy helyi kalcium-homeosztázis megzavarodik, és ha a védőmechanizmusok meghibásodnak az emberi szervezetben.
Javasoljuk, hogy az itt kidolgozott nanoanyag-megközelítés felhasználható ásványi-szerves NP-k képződésének vizsgálatára állati és emberi szövetekben. Például a meszesedést gátló fehérjék, például az albumin, a fetuin-A és az apo-A1 ellen termelt antitestek ásványi analízissel kombinálva használhatók ásványi-szerves NP-k képződésének kimutatására és jellemzésére állatmodellek szöveteiben. Az ezzel a megközelítéssel kapott eredményeket az emberi testnedveken végzett klinikai mérésekre lehet alkalmazni, hogy azonosítani lehessen azokat a biológiai paramétereket, amelyek tükrözik az ásványi részecskék képződésének és a szervezet méhen kívüli meszesedésének állapotát. Arra számítunk, hogy ez a tudás új terápiás stratégiák kidolgozásához vezethet a méhen kívüli meszesedéssel összefüggő emberi betegségek és állapotok megelőzésére és kezelésére.
Mód
Veseszövetek.Az emberi szövetek felhasználását és az ebben a tanulmányban végzett kísérleteket a Chang Gung Memorial Hospital Institutional Review Board jóváhagyta; a módszereket és a kísérleteket a jóváhagyott irányelveknek megfelelően végezték. A betegek írásos beleegyezését kapták. A kontroll egészséges veseszöveteket olyan traumás és haematomás betegek biopsziájából nyertük, akiknek a kórtörténetében nem szerepelt vesebetegség (n=2); veseszöveteket veserákos betegektől (n=20) és végstádiumú vesebetegektől (n=2) is nyertünk, akiknek veséjét eltávolították vagy biopsziát vettek át a transzplantációs műtét során (1. táblázat). A veserák szövetei esetében a szövet nem rákos részét boncoltuk ki és elemeztük a jelen vizsgálatban.
Szövettani elemzés.A veseszöveteket paraffin blokkokra helyeztük. A blokkokat felvágtuk, és a szövetszeleteket főzőlapon 70 fokon 30 percig melegítettük a paraffin eltávolítása céljából. A metszeteket háromszor 15 percre friss xilololdatba merítettük, hogy teljesen eltávolítsuk a maradék paraffint. A metszeteket 95 százalékos, 80 százalékos és 70 százalékos etanollal rehidratáltuk 5 percig minden alkalommal. A rehidratált mintákat kétszer desztillált vízzel (ddH2O) mostuk 5 percig. A sejtmagokat hematoxilinnal festettük 8 percig. A festéket 10 percig meleg vízzel távolítottuk el a mintákról. A vesemintákat ddH2O-ban öblítették, és 10-szer 95 százalékos etanolba mártották. Az etanollal kezelt mintákat eozin Y-vel ellenfestettük 1 percig. A mintákat 95 százalékos és 100 százalékos etanollal dehidratáltuk minden alkalommal 10 percig, majd 10 percig xilolban dehidratáltuk. A végső dehidratált vesemintákat 50 százalékos glicerint tartalmazó tárgylemezekre helyeztük, és digitális kamerával felszerelt fénymikroszkóp alatt megfigyeltük.
A paraffinmentesített és rehidratált mintákat a H&E festésnél leírtak szerint készítettük el. A rehidratált metszeteket ezüst-nitráttal (5%) megfestettük, majd 20 percig UV-fénynek tesszük ki. Az oldatot ddH2O-val mostuk 15 percig. A metszeteket nátrium-tioszulfáttal (5%) festettük 5 percig, majd 15 percig ddH2O-val mostuk. A metszeteket nukleáris gyorsvörös színnel festettük (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) 5 percig. A megfestett mintákat egymás után 95 százalékos és 100 százalékos etanollal 10 percig dehidratáltuk, majd xilolban 10 percig dehidratáltuk. A vesemintákat üveglemezekre helyeztük, és a fent leírtak szerint megvizsgáltuk.
Elektronmikroszkópia és EDX analízis.A vesemintákat LGPS disszekciós mikroszkóp (Olympus, Tokió, Japán) segítségével 1 mm-nél kisebb vastagságú darabokra vágtuk. A szöveteket 2,5% glutáraldehiddel és 1% paraformaldehiddel rögzítettük 0,1 M kakodilát pufferben 4 fokon egy éjszakán át. A rögzített mintákat háromszor mostuk 0,1 M kakodilát pufferrel 8 százalékos szacharózban (pH 7,2) jégen 10 percig. A mosott szöveteket foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) inkubáltuk, amely 1% ozmium-tetroxidot és 1,5% kálium-ferrocianidot tartalmazott, 2 órán át jégen. A szöveteket háromszor ddH2O-val mostuk jégen 10 percig. A mosott szöveteket jégen festettük 1%-os uranil-acetát ddH2O-ban 1 órán át, majd háromszor ddH2O-val jégen mostuk. A veseszöveteket 30, 50, 70, 80 és 90 százalékos etanollal dehidratáltuk minden alkalommal 10 percig, kivéve, ha az etanol elérte a 70 százalékot, ebben az esetben a mintákat 4 fokon egy éjszakán át tároltuk. A szöveteket 1%-os foszfovolfrámsavval 95%-os etanolban festettük 15 percig, majd 95%-os etanollal 5 percig dehidratáltuk. A mintákat 40, 57, 67 és 100 százalékos propilén-oxidba merítettük minden alkalommal 10 percre, majd újabb 5 percre 100 százalékos propilén-oxidba merítettük. A veseszöveteket 50, 70 és 100 százalékos Eponate 812-vel (Ted Pella, Redding, CA) minden alkalommal 1 órán át infiltráltuk. Az Eponate 812-beágyazott vesemintákat úgy állítottuk elő, hogy kétszer 100 százalékos Eponate-ban inkubáltuk. A beágyazott mintákat kemencében 60 fokon egy éjszakán át inkubáltuk, hogy lehetővé tegyük a gyanta polimerizációját.
A fent leírt módon kapott mosott HS-NP pelleteket glutáraldehiddel (2,5%) és paraformaldehiddel (1%) fixáltuk ddH2O-ban 4 órán át 4 fokon. A rögzített pelleteket ddH2O-val mostuk háromszor 10 percig. A pelleteket egymást követő inkubálással 30, 50, 70, 80, 90, 95 és 100 százalékos etanolban dehidratáltuk, minden alkalommal 10 percig, kivéve, ha az etanol elérte a 70 százalékot, amelyben a pelleteket 4 fokon egy éjszakán át tároltuk. Más etanolos oldatok csak 10 percig érintkeztek a pelletekkel. A dehidratált pelleteket LR fehér beágyazó közeggel (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) infiltráltuk, különböző arányú etanol és LR tápközeg (3:1, 1:1 és 1:3) alkalmazásával 30 percig. A pelleteket friss LR tápközeggel (100%) infiltráltuk egy éjszakán át a polimerizáció előtt. Az LR tápközeggel átitatott pelleteket kemencében 60 fokon 2 napig inkubáltuk, hogy lehetővé tegyük a gyanta polimerizációját. A vese- és HS-NP-k blokkjait metszettek, hogy 70–100 nm vastagságú szeleteket kapjanak Reichert Ultracut S mikrotom segítségével (Leica, Wetzlar, Németország). A szövetmetszeteket 4 százalékos uranil-acetáttal festettük meg, mielőtt egy JEM 1230 transzmissziós elektronmikroszkóppal (JEOL, Tokió, Japán) 100 kV-on működött volna. Az elektrondiffrakciós mintákat ugyanezzel a rendszerrel kaptuk. Nikkelrácsokat használtak alátámasztásul.
Az EDX analízishez a veseszövetek vékony metszeteit uranil-acetáttal megfestettük, és a fentiek szerint ddH2O-val mostuk, majd elektronikus exszikkátorszekrényben szárítottuk. A mintákat 120 kV-on működő, nagy felbontású JEM 2100 transzmissziós elektronmikroszkóp (JEOL) segítségével figyeltük meg. Az EDX spektrumokat három párhuzamosban vettük INCA Energy EDS rendszerrel (Oxford Instruments, Abingdon, Egyesült Királyság). A HS-NP-k vékony metszeteit festés nélkül figyeltük meg.
Ásványi-szerves NP-k előállítása.Az összes kiindulási oldat pH-ját 7,4-re állítottuk be, és felhasználás előtt 0,2 μm-es membránon szűréssel sterilizáltuk. A HS-t egészséges emberi önkéntesektől kaptuk hagyományos vénapunkciós technikával. Az emberi biológiai folyadékok felhasználását ebben a vizsgálatban a Linko Chang Gung Memorial Hospital Intézményi Felülvizsgáló Testülete hagyta jóvá, és az önkéntesek írásos beleegyezését kapták. A HS-NP-ket úgy állítottuk elő, hogy egyenként 3 mM CaCl2-t és Na2HPO4-et adtunk 10% HS-t tartalmazó DMEM-hez (Gibco, Carlsbad, CA), majd egy hétig inkubáltuk sejttenyésztési körülmények között (37 fok, 5 százalék CO2, párásított levegő). A részecskéket centrifugálással 16, 000 × g-vel 15 percig 4 fokon pelletizáltuk, és kétszer mostuk HEPES pufferrel (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) ugyanezzel a centrifugálási eljárással.
SDS-PAGE és Western-blot.Az SDS-PAGE és Western blot analízist lényegében a korábbiak szerint végeztük15. Röviden: 0,2 ug (5A, D ábra) vagy 1,2 ug (5B, C ábra) HS fehérjék, 47 ug (5A, B, D ábra) vagy 590 ug HS-NP fehérjék (5C. ábra), 0,1 ug HSA (5A–D. ábra) és 0,6 ug (5A, C, D ábra) vagy {{23} },15 ug HSF-et (5B. ábra) oldottunk fel 5×-es "töltőpufferben" (0,313 M Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 0,05% brómfenolkék, 50% glicerin, 12,5% - merkapto-etanol) 1x végső koncentrációig, 5 percig 95 °C-on történő melegítés és denaturáló és redukáló körülmények között végzett elválasztás előtt 10%-os SDS-PAGE-val, mini-gél rendszerrel (Hoefer, Holliston, MA). Az NP-kontroll (az 5A–D. ábra 1. sávjában használt) ásványi NP-kből állt, amelyeket úgy készítettek, hogy egyenként 3 mM CaCl2-t és Na2HPO4-et adtunk a DMEM-hez (végső térfogat 1 ml), majd egy napig inkubáltuk sejttenyésztési körülmények között; a részecskéket centrifugálással 16,000 × g-vel 15 percig ülepítettük, kétszer mostuk HEPES pufferrel, és 50 ul HEPES pufferben újraszuszpendáltuk. Az újraszuszpendált részecskék 20 ul-es aliquot részét SDS-PAGE-hoz dolgoztuk fel a fentiek szerint. A PVDF membránokat 1 órán keresztül blokkoltuk 5% (w/v) zsírtalanított tejben szobahőmérsékleten. A korábban leírtak szerint házon belül előállított elsődleges antitesteket25 1:1,000 (-apo-A1 és -HS-NP), 1:3,000 (-HSF) hígításban használták. , vagy 1:6,000 ( -HSA). A kecske anti-nyúl torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitestet a gyártó (Millipore, Billerica, MA) utasításai alapján alkalmaztuk. A blotokat fokozott kemilumineszcenciával (Amersham Biosciences, Amersham, Egyesült Királyság) és autoradiográfiás filmekkel mutattuk ki.
Immunarany jelölés.A mintákat TEM megfigyelésre készítettük elő. A HS-NP blokkokat 70 nm-nél kisebb vastagságú szeletekre vágtuk. A rácsokon lévő mintametszeteket 1% halzselatinnal (Sigma) blokkoltuk 0,1 M HEPES pufferben (pH 8,0) 25 percig. A rácsokat a következő primer antitestekkel inkubáltuk: -HSA, 1:30; -HSF, 1:50; -apo-A1, 1:30; -HS-NP, 1:60. A negatív kontroll nem tartalmazott elsődleges antitestet (1% halzselatint HEPES pufferben). Az inkubált metszeteket HEPES pufferrel öblítettük 15 percig. Az öblített metszeteket 1 százalékos halzselatinnal blokkoltuk HEPES pufferben 20 percig. A mintákat másodlagos 5-nm-arany-konjugált kecske anti-nyúl IgG-vel kezeltük 1 órán át. A mintákat 10 percig HEPES pufferrel mostuk, majd 10 percig ddH2O-val mostuk. A TEM megfigyeléseket a fentiek szerint végeztük.
Fluoreszcens mikroszkóp.A fentiek szerint elkészített szövettani veseszövet lemezeket 1%-os szarvasmarha-szérumalbuminnal blokkoltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. A lemezeket primer poliklonális antitestekkel inkubáltuk 1:4 hígításban, 000. A mosási lépések után a mintákat a kecske anti-nyúl-FITC (492/520 nm) és a kecske anti-nyúl-TRITC (550/570 nm) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) másodlagos antitestekkel inkubáltuk 1:100 arányban. 1 óra. A komplexeket PBST-vel mostuk 15 percig. A fluoreszcens festést 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) használtuk 10 ug/ml mennyiségben 15 percig. A DAPI-festett mintákat 95 és 100 százalékos etanollal 10 percig dehidratáltuk, majd további 10 percig xilolban dehidratáltuk. A dehidratált vesemintákat Vectashield fluorescence H-1000 rögzítőközeggel (Vector Laboratories, Burlingame, CA) rögzítettük, és Spot Flex kamerával felszerelt konfokális mikroszkóp alatt (LSM510 Meta; Zeiss, Oberkochen, Németország) figyeltük meg.
A Cistanche tubulosa megelőzi a vesebetegséget, kattintson ide a mintaért
Hivatkozások
1. Giachelli, CM Ectopiás meszesedés: kemény tények gyűjtése a lágyrészek mineralizációjáról. Am J. Pathol 154, 671-675 (1999).
2. Abedin, M., Tintut, Y. & Demer, LL Vaszkuláris meszesedés: mechanizmusok és klinikai következmények. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 1161-1170 (2004).
3. Alexopoulos, N. & Raggi, P. Meszesedés atherosclerosisban. Nat Rev Cardiol 6, 681–688 (2009).
4. Allison, MA, Criqui, MH & Wright, CM A szisztémás meszesedő atherosclerosis mintázatai és kockázati tényezői. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 331-336 (2004).
5. Ketteler, M. et al. A kalcium-szabályozó fehérjék hiányosságai dializált betegekben: a kardiovaszkuláris meszesedés új koncepciója az urémiában. Kidney Int Suppl 84, S84–87 (2003).
6. Kapustin, A. & Shanahan, CM Vaszkuláris meszesedés célzása: kemény célpont felpuhítása. Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009).
7. Kapustin, AN és Shanahan, CM Vaszkuláris simaizomsejtekből származó mátrix-vezikulák kalciumszabályozása. Trends Cardiovasc Med 22, 133–137 (2012).
8. Doherty, TM et al. Meszesedés érelmeszesedésben: csontbiológia és krónikus gyulladás az artériás kereszteződésben. Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201-11206 (2003).
9. Khan, SR, Rodriguez, DE, Gower, LB & Monga, M. Randall plakkok asszociációja kollagénrostokkal és membrán hólyagokkal. J Urol 187, 1094–1100 (2012).
10. Price, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK A szérum fetuin-ásványi komplex biokémiai jellemzése. J Biol. Chem. 278, 22153-22160 (2003).
11. Price, PA, Williamson, MK, Nguyen, TM & Than, TN A fetuin-ásványi komplex szérumszintjei korrelálnak az artériák meszesedésével patkányban. J Biol. Chem. 279, 1594-1600 (2004).
12. Heiss, A. et al. A fetuin-A és a savas szérumfehérjék hierarchikus szerepe a kalcium-foszfát részecskék képződésében és stabilizálásában. J Biol. Chem. 283, 14815-14825 (2008).
13. Bertazzo, S. et al. A nanoanalitikai elektronmikroszkópia alapvető betekintést tár fel az emberi szív- és érrendszeri szövetek meszesedésére. Nat Mater 12, 576–583 (2013).
14. Martel, J. & Young, JD Feltételezett nanobaktériumok emberi vérben kalcium-karbonát nanorészecskékként. Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549-5554 (2008).
15. Young, JD et al. A feltételezett nanobaktériumok a normál kalcium-homeosztázis fiziológiai maradványait és tenyésztési melléktermékeit képviselik. Plos One 4, e4417 (2009).
16. Young, JD et al. A szérumban található kalcium és apatit granulátumok jellemzése, mint pleomorf mineralo-protein komplexek és feltételezett nanobaktériumok prekurzorai. Plos One 4, e5421 (2009).
17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD. Fetuin-A/albumin-ásványi komplexek, amelyek hasonlítanak a szérumkalcium granulátumokra és feltételezett nanobaktériumokra: a kettős gátlás-oltás koncepció bemutatása. Plos One 4, e8058 (2009).
18. Young, JD & Martel, J. The rise and fall of nanobacteria. Sci Am 302, 52–59 (2010).
19. Martel, J., Wu, CY & Young, JD. A feltételezett nanobaktériumok és meszesedő nanorészecskék tenyésztésében táplálékként használt gamma-besugárzott szérum kritikus értékelése és demonstrációja. Plos One 5, e10343 (2010).
20. Martel, J. et al. Emberi testnedvekből származó ásványi nanorészecskék átfogó proteomikai analízise folyadékkromatográfiás-tandem tömegspektrometriával. Anal Biochem. 418, 111-125 (2011).
