A Cistanche Tubulosa kivonatok hatása a hímek szaporodási funkciójára sztreptozotocin–nikotinamid-indukált cukorbeteg patkányok esetében –Ⅱ

3.2. In vivo elemzés

3.2.1. A CTE hatása a testsúlyra és a kalóriabevitelre

6 hetes kísérletezés után a cukorbeteg csoport (HFD-DM) nagyobb testtömeget mutatott, mint a kontrollcsoport. A HFD-DME4 csoport alacsonyabb testtömeget mutatott, mint a HFD-DM és HFD-DMER csoport (7a. ábra). A kontrollcsoport kalóriabevitele szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a többi csoporté. A másik öt csoport kalóriabevitele között nem volt szignifikáns különbség (7b. ábra).

3.2.2. Orális glükóz tolerancia teszt (OGTT) a cukorbetegség sikeres kiváltásának meghatározására

Az orális glükóz tolerancia tesztet (OGTT) ígéretes eszközként használják a diabetes mellitus kimutatására. A megnövekedett glükózszint a vérben cukorbetegségre utal. Amint a 8a. ábra mutatja, a plazma glükóz szintje alacsonyabb volt a CTE csoportokban, mint a DM csoportban 0, 30, 90 és 120 perccel. Továbbá a plazma glükózkoncentráció görbe alatti területe (AUC) azt mutatta, hogy a CTE és RSG csoportokban a vércukorfelvételi sebesség megnövekedett (8b. ábra).

3.2.3. A plazma teljes glükóz-, koleszterin- és trigliceridtartalma

A plazma éhgyomri vércukorszint magasabb volt a DM csoportban és alacsonyabb a DME2 csoportban (kivéve a kontrollt), mint másokban. Nem volt szignifikáns különbség az összkoleszterinben a csoportok között, kivéve a DME4 csoportot. A DME4 csoportban a koleszterinszint alacsonyabb volt, mint a többieknél. A trigliceridek szintje magasabb volt a DM csoportban és alacsonyabb a DME4 csoportban, és a triglicerid tartalom csökkent a CTE koncentrációjának növekedésével (2. táblázat). Az eredmények azt mutatják, hogy a plazma glükóz, koleszterin és triglicerid szintje magasabb volt a DM csoportban, és a szint szignifikánsan csökkent a CTE kezelés során.

3.2.4. A plazma inzulinszintje, a plazma leptinszintje és a homeosztázis modell értékelése – inzulinrezisztencia (HOMA-IR) értékei

A plazma inzulin, leptin és HOMA-IR értékeket a 3. táblázat tartalmazza. A DM csoport magasabb plazma inzulin és plazma leptin szinteket mutatott, mint a kontrollcsoport. A HOMA-IR index is szignifikánsan magasabb volt a DM csoportban. A plazma inzulin, leptin és HOMA-IR értékek csökkentek a CTE koncentrációjának növekedésével. A plazma leptin szignifikánsan csökkent a CTE csoportokban, de az RSG gyógyszercsoport (DMR) nem mutatott szignifikáns különbséget a DM csoporthoz képest.

3.2.5. A CTE hatása a plazma LH- és tesztoszteronszintjére cukorbeteg patkányokban

Amint a 4. táblázat mutatja, a tesztoszteron koncentrációja diabéteszes patkányokban (DM) jelentősen csökkent, míga tesztoszteron koncentrációja jelentősen megnőtta CTE különböző dózisaiban. Továbbá az eredmények enyhe csökkenést mutattak az LH szintjében a DM csoportban a DMR, DME1, DME2 és DME4 csoporthoz képest. Az LH termelés magasabb volt a DME4 csoportban.

3.2.6. A CTE hatása a cukorbeteg patkányok spermaparamétereire

A kísérleti eredmények azt mutatták, hogy a DM csoportban szignifikánsan csökkent a spermiumok száma és motilitása, mint a kontrollcsoportban, míg a spermiumok abnormalitási aránya szignifikánsan megnőtt a DM csoportban. Érdekes módon a DMR csoportban javult a spermiumok száma, motilitása és a spermiumok abnormalitási aránya, de a spermiumok motilitása nem ér el szignifikáns szintet a DME4-hez képest. A DME2 mindegyikénél jobb spermiumszámot mutatott, és a DME4 csoportban szignifikánsan megnövekedett a motilitási ráta. Nem volt szignifikáns különbség a kóros spermiumok száma között az RSG-vel és CTE-vel kezelt csoportok között (5. táblázat).

3.2.7. A CTE hatása a cukorbeteg patkányok ondótubulusainak morfológiájára

A 9. ábra a here metszet H&E festését mutatja. A fekete nyíl a Leydig sejtet, a fehér nyíl pedig a Sertoli sejtet jelöli. Mind a Leydig-sejt, mind a Sertoli-sejt a DM csoportban szignifikáns atrófiát mutatott, és egy üreg volt látható a lumenben. A Leydig-sejtek és a Sertoli-sejtek szerkezete helyreállt a CTE-vel és RSG-vel kezelt csoportokban. A ondótubulus vastagsága nagyobb volt a CTE és RSG csoportban, mint a DM csoportban.

3.2.8. A CTE hatása a KiSS1, GPR54, SOCS-3 és SIRT1 MRNS-ekre diabéteszes patkányok hipotalamuszában

A KiSS1 (10a. ábra), a GPR54 (10b. ábra), a SOCS-3 (10d. ábra) és a SIRT1 (10c. ábra) expresszióját a 10. ábra mutatja be. A KiSS1 és a GPR54 receptor mRNS expresszióját cukorbeteg patkányokban szignifikánsan alacsonyabb, mint a kontrollcsoportban. A KiSS1 és GPR 54 mRNS expressziós szintje a DMR-ben, DME1-ben, DME2-ben és DME4-ben szignifikánsan megemelkedett. Különösen a GPR54 mRNS expressziója szignifikánsan megnövekedett DME4-ben, és majdnem hasonló volt a kontrollcsoporthoz.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A TESTOSTERON TERMELÉSÉNEK VÉDELMÉRE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ez a kísérlet tovább vizsgálta a SOCS-3 és SIRT1 mRNS-ek mennyiségét patkányok hipotalamuszában. A SOCS-3 mRNS expressziója cukorbeteg patkányokban szignifikánsan megemelkedett, ami azt jelzi, hogy a leptin impedancia súlyosabb volt. A DMR, DME1, DME2 és DME4 csoportok szignifikáns javulást mutattak a cukorbeteg csoporthoz képest. A SIRT1 mRNS expressziója a DM csoportban szignifikánsan csökkent, és szignifikánsan nőtt a DME1 és DME4 csoportokban.

3.2.9. A CTE hatása a cukorbeteg patkányok plazmájában és herében lévő antioxidáns enzimekre

A 6. táblázat azt mutatja, hogy a diabéteszes patkányok plazma SOD-aktivitása, GPx-aktivitása és kataláz-aktivitása szignifikánsan csökkent, és az aktivitások növekedtek a CTE-vel és RSG-vel kezelt csoportokban. Ezen túlmenően a DME4 jelentős javulást mutatott a GPx aktivitásában, mint mások. Az eredmények azt mutatták, hogy a SOD és a kataláz aktivitása diabéteszes patkányokban hat hét után szignifikánsan csökkent. A DMR csoport SOD és kataláz aktivitása nem éri el a szignifikáns szintet. A CTE-vel kezelt csoportok jelentős javulást mutattak az SOD és a kataláz aktivitásban. A kataláz és SOD fokozott aktivitása a CTE-csoportokban a herében is megfigyelhető volt (7. táblázat). A SOD és a kataláz legmagasabb aktivitását a DME1 csoportban, illetve a DME2 csoportban figyelték meg.

3.2.10. A CTE hatása a cukorbeteg patkányok oxidatív stresszére és gyulladására a plazmában és a herében

A nitrogén-monoxid (NO) termelődését a plazmában (11a. ábra) és a herében (11b. ábra) a 11. ábra mutatja. A DM csoport NO termelése szignifikánsan megnövekedett mind a herében, mind a plazmában a kontrollcsoporthoz képest. A NO-termelés fokozatos csökkenését figyelték meg a DME1, DME2 és DME4 csoportokban (plazmában). A DMR-csoport az NO-termelésben is jelentős csökkenést mutatott. A here esetében enyhe NO termelés csökkenés volt megfigyelhető a CTE csoportokban, míg a DMR csoport nem csökkentette szignifikánsan az NO termelést.

Ahogy a 12. és 13. ábrán látható, a TNF- és IL-6 szintje szignifikánsan megemelkedett diabéteszes patkányokban (mind a plazmában, mind a herében), ami azt jelzi, hogy a gyulladás súlyosabb. A plazmában a TNF-szint hasonló a CTE-vel és RSG-vel kezelt csoportokban (12a. ábra). A CTE csoportok szignifikánsan (különösen a DME2) csökkentették a TNF-szintet a herében (12b. ábra). Az IL-6 szintje szignifikánsan csökkent a CTE és RSG csoportok plazmájában (13a. ábra). A herében az IL-6 szintjének csökkenésére irányult, de ez nem ért el szignifikáns szintet (13b. ábra).

3.2.1.1. A CTE hatása a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott oxidatív stresszre és gyulladásra cukorbeteg patkányok spermiumában

A 14. ábra a patkánysperma szuperoxid-aniontartalmát mutatja. Az eredmények azt mutatták, hogy a cukorbeteg patkányok spermájában a szuperoxid-anion termelés szignifikánsan megnőtt, és a DMR-csoportban nem volt szignifikáns javulás. A DME1 és DME4 csoportok szignifikánsan csökkent szuperoxid anion termelést mutattak.

3.2.12. A CTE hatása a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott lipid-peroxidációra cukorbeteg patkányok spermiumában

Tanulmányok kimutatták, hogy a lipid-peroxidáció megnövekedett mind az 1-es, mind a 2-es típusú cukorbetegeknél [19]. A malondialdehid (MDA) szintje a plazmában, a spermában és a herében a 8. táblázatban látható. A DM csoportban az MDA szint a plazmában, a herében és a spermában szignifikánsan magasabb volt, és a CTE és RSG kezelés csökkentette az MDA termelődését. Szignifikáns csökkenést figyeltek meg a DME4 és DMEI csoportokban a plazmában. Ez a tanulmány megállapította, hogy a cukorbeteg patkányok nemcsak a plazmában növelték a lipidperoxidáció mértékét, hanem a herében és a spermiumban is. A CTE különböző dózisainál jelentős javulás volt megfigyelhető.

4. Megbeszélés

A cukorbetegség krónikus betegség, amely a vér magas cukorszintjével jár. Az antioxidáns és a ROS szint közötti egyensúlyhiány oxidatív stressznek nevezett állapothoz vezet. A szuperoxid, a hidroxilgyök, a hidrogén-peroxid, a nitrogén-oxid és a szingulett oxigén néhány példa a ROS-ra, amely az oxidatív stresszen keresztül hozzájárul a cukorbetegség kialakulásához [20].Cistanche tubulosaegy sivatagi növény, amely olyan aktív komponenseket tartalmaz, mint plpoliszacharidok, oligoszacharidok, fenil-etanol-glikozidok (echinacoside, verbascoside), palmitinsav, linolsav, iridoidok, alditolok és lignánok. Ez a növény gyulladáscsökkentő, neuroprotektív, antibakteriális, vírusellenes, antioxidáns, daganatellenes és immunmoduláló hatást képes kifejteni [21]. Irodalmi tanulmányok azt mutatják, hogy a Cistanche tubulosa fenil-etanol-glikozidjai az antioxidáns aktivitás fő okai [22]. Az in vitro és in vivo vizsgálatokban a rezveratrolt (RES) és a roziglitazont (RSG) vettük pozitív kontrollnak. Az RSG egy erős inzulinérzékenyítő, és affinitást mutat a peroxiszóma proliferátor által aktivált receptor (PPARc) izoformájához. Szabályozza a hiperglikémiát cukorbetegeknél [23]. A RES természetes antioxidáns hatással rendelkezik, értágítóként működik, szabályozza a lipoprotein-anyagcserét, gátolja a vérlemezke-aggregációt és megelőzi a rákot [24,25]. Vizsgálataink azt mutatták, hogy az ECH jobb gyökfogó aktivitást mutat, mint a CTE és a RES (1. ábra). Az is nyilvánvaló, hogy az ECH nem okoz jelentős toxicitást az LC-540 és a TM3 Leydig-sejtekre (2. ábra).

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA FÉRFI SZEXUÁLIS FUNKCIÓHOZ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

AGE-ket használtak stressz körülmények indukálására Leydig sejtekben. Az AGE-k termelése, a gyulladás, az oxidatív stressz és a cukorbetegség összefüggenek. A cukorbetegség hiperglikémiás állapota elősegíti a sejtkárosodást az AGE-k termelése és az oxidatív stressz révén. Az AGE-k sejttoxicitást indukálnak, ami tovább segíti az immunsejtek toborzását és a sejthalált. Az AGE-k emelkedett szintje elősegíti a RAGE és az AGER1 kétféle receptor expresszióját [26]. Az oxidatív stressz során a mitokondriális légzési láncból egy elektronnak a molekuláris oxigénbe történő csepegtetése és ezt követő átvitele szuperoxid-anion képződését eredményezi. Eredményeink azt mutatják, hogy az AGE-k által kiváltott szuperoxid anion termelése megnövekedett a kontrollcsoportban, és további javulást tapasztaltunk mind az ECH, mind a RES kezelések során. Vizsgálatunk szerint kiderült, hogy az AGE-k által kiváltott szuperoxid (3. ábra) és H2O2 (4. ábra) termelés csökkent ECH és RES jelenlétében.

Az NF-κB a cukorbetegséggel összefüggő gyulladás fontos közvetítőjeként ismert [27]. Az NF-κB expressziója sejtműködési zavarokhoz és sejthalálhoz vezet. Az NF-κB oxidatív stressz általi aktiválása serkenti a pro-inflammatorikus választ, az endotelin felszabályozását és az apoptózist [28]. A RAGE és NF-κB expressziója megnövekedett az AGE-stimulált csoportokban, és az ezt követő csökkenés az ECH-val és RES-kezelt sejtekben volt megfigyelhető (5. ábra).

Tesztoszteronegy anabolikus szteroid és elsődlegesférfi nemi hormonkoleszterinből szintetizálják. A folyamat a koleszterin oldalláncának oxidatív hasításával kezdődik a koleszterin oldallánc hasító gén (CYP11A) által. Ez a gén a mitokondriális membránban lokalizálódik, és a koleszterint pregnenolonná alakítja. Ezután a CYP17A1 gén az endoplazmatikus retikulumból eltávolít két extra szénatomot, és több C19 szteroidot termel. Ezenkívül a pregnenolont a hidroxiszteroid-dehidrogenáz (3- -HSD) androszténdion/progeszteronná oxidálja. Végül, a tesztoszteron az androszténdion 17. szénatomjának ketocsoportjának 17-béta-hidroxiszteroid-dehidrogenáz (17- -HSD) általi redukálásával keletkezik. A Leydig-sejtek részt vesznek a tesztoszteron fő termelésében. A koleszterinnek a belső mitokondriális membránba történő átviteléhez a szteroidogenikus akut szabályozó fehérje (StAR) működése szükséges. A jelenlegi tanulmányok azt mutatják, hogy a StAR, CYP11A1, CYP17A1 és HSD17 3 expressziója csökkent az AGE-vel kezelt sejtekben (kontroll), és óriási növekedést mutattak ki az ECH-val és RES-kezelt sejtekben (6. ábra). . Így az eredmények azt mutatják, hogy a termelés aA tesztoszteron emelkedett az ECH- és RES-kezelt csoportokban. 

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA a szexuális erő javításáért PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cukorbetegség esetén a glükóz szervekbe történő szállítása korlátozott, és ennek eredményeként a glükózszint megemelkedik [29]. Ezért a hiperglikémiás állapot a cukorbetegség kimutatásának egyik fontos markere. Vizsgálataink azt mutatják, hogy a plazma glükóz szintje emelkedett a cukorbeteg csoportokban, és a DM csoport AUC értéke szignifikánsan magasabb volt, mint a többi csoporté (8. ábra). A plazma glükóz mellett az összkoleszterin és triglicerid tartalom is szignifikánsan emelkedett a DM csoportban (2. táblázat). Az érelmeszesedést elősegíti a megnövekedett koleszterin- és trigliceridszint [30]. A koleszterin- és trigliceridszint azonban csökkent a CTE-vel és RSG-vel kezelt csoportokban. A DME4 csoport triglicerid tartalma közel hasonló értéket ért el, mint a kontrollcsoporté.

Az inzulin a hasnyálmirigy sejtjei által termelt és a szervezet vércukorszintjének szabályozására funkcionális hormon, míg a leptin a zsírsejtek által termelt hormon, amely képes szabályozni a táplálékfelvételt és az energiafelhasználást. A vizsgálatok kimutatták, hogy a leptin részt vesz az elhízás patofiziológiájában, és pozitív kölcsönhatás van a leptin és az inzulin között [31]. Vizsgálataink azt mutatják, hogy a plazma inulin és leptin szintje magasabb volt a DM csoportban, és az inzulinszint csökkent a CTE koncentrációjának növekedésével. Az RSG csoport nem mutat szignifikáns különbséget a DM csoporthoz képest. Az inzulinrezisztenciát és a sejtfunkciót HOMA-IR módszerrel értékeltük. A HOMA-IR érték nőtt a DM csoportban, és szignifikánsan különbözött a többi csoporttól (3. táblázat).

A DM a HPG tengely hormonális váltakozásán keresztül befolyásolja a reproduktív funkciót, és a vizsgálatok kimutatták, hogy a herében az inzulin expresszióját a cukorbetegség is befolyásolja. Sertoli-sejtek vakuolizációja, fokozott DNS-fragmentáció, károsodott spermatogenezis és fokozott csírasejt-fogyás jellemzi. Az oxidatív stressz szintén hozzájárul a reproduktív funkció rendellenességeihez [32]. A hím reproduktív szervben (herékben) a spermiumok képződésének folyamatát spermatogenezisnek nevezik. A here szorosan felcsavarodott tubulusokból áll, amelyeket szemiferous tubulusoknak neveznek. A Sertoli-sejtek a szemiferus tubulus falában láthatók, és táplálják az éretlen spermiumokat. A spermiumparaméterek vizsgálata azt mutatta, hogy a DM csoportban a spermiumok száma és motilitása csökkent, az eltérések pedig növekedtek (5. táblázat). Ellentétes hatást figyeltek meg a CTE-vel és RSG-vel kezelt csoportokban. A DM csoportban mind a Leydig-sejtek, mind a Sertoli-sejtek szignifikáns sorvadást mutattak, és az üreg látható volt a lumenben. A DM csoportban a magtubulus vastagsága is csökkent. A CTE-vel és RSG-vel kezelt csoportokban javult az eredmény (9. ábra). Emellett a DM csoportban csökkent az LH és a tesztoszteron szintje, a CTE-vel kezelt csoportokban pedig emelkedett (4. táblázat). Férfiaknál az alacsony szérum tesztoszteronszint és az alacsonyabb LH pulzusfrekvencia gyakran társult az elhízáshoz és a 2-es típusú diabetes mellitushoz [33].

A KiSS1 gén által kódolt kisspeptinek a HPG tengely erős stimulátoraiként ismertek, és a kisspeptin gén bármely mutációja a nemi szteroidok és a gonadotropin alacsony szintjéhez vezet. A vizsgálatok azt mutatják, hogy STZ-indukált cukorbeteg patkányokban a Kiss1 mRNS szintje csökkent [33]. Az emlősök meddőségének kiváltása és fenntartása a G-protein-kapcsolt receptor 54-hez (GPR54) kapcsolódik. A GPR 54 mutációját a szexuális érés hiánya és a gonadotrop hormonok (LH és FSH) alacsony szintje jellemzi. A gyulladást elősegítő citokinek, mint például az IL-6 és a TNF-felerősítik a citokin jelátviteli 3 (SOCS3) szuppresszorának expresszióját, amely szerepet játszik a gyulladás által közvetített inzulinrezisztenciában a májban és az adipocitákban [34]. A SIRT 1 egy gén, amely számos öregedési betegség szabályozásához kapcsolódik. Ez a gén kiemelkedően expresszálódik a hasnyálmirigy sejtjeiben, szabályozza az inzulinszekréciót és megakadályozza az apoptózist. A jelenlegi tanulmányok azt mutatták, hogy a KiSS1, GPR54 és SIRT1 expressziója csökkent a DM csoportban, de az expresszió nőtt a CTE-vel kezelt csoportokban (10. ábra). A SOCS-3 kifejezések növekedése a DM csoportban a gyulladásos állapotot jelzi. Az elhízás és a gyulladás között azonosított első molekuláris kapcsolat a TNF- volt. Ezért a megnövekedett TNF-szint a gyulladás jelzője. A pro-inflammatorikus citokinek, például a TNF- és az IL-6 csökkent szintje volt megfigyelhető a CTE-vel kezelt csoportokban (12. és 13. ábra).

A ROS és az antioxidánsok közötti egyensúlyhiány cukorbetegséghez vezet. A szuperoxid-diszmutáz (SOD), a kataláz (CAT) és a glutation-peroxidáz (GPX) az elsődleges antioxidánsok, amelyek felelősek az optimális ROS-szint fenntartásáért [35]. Az eredményekből kiderült, hogy az antioxidánsok aktivitása szignifikánsan alacsonyabb volt a DM csoportban. A CT-vel kezelt csoportok javulást mutattak az antioxidánsok termelésében. Az RSG-vel kezelt csoport nem mutatott jelentős javulást az antioxidáns aktivitásban (6. és 7. táblázat).

A nitrogén-monoxid (NO) fontos ROS-ként ismert, amely hozzájárul a gyulladáshoz. Vizsgálataink rámutatnak, hogy a NO szintje csökkent a CTE-vel kezelt csoportokban (11. ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a cukorbeteg patkányok spermájának szuperoxid-anion tartalma szignifikánsan megemelkedett, és az RSG beadása után nem volt szignifikáns javulás. CTE csoportokban csökkent a szuperoxid termelés.

Az MDA meghatározása nagyon hasznos a lipidperoxidáció értékelésére. A lipidperoxidáció a lipidek oxidációjának folyamata, amely végül sejtkárosodást eredményez. Az MDA a többszörösen telítetlen zsírsavak lipid-peroxidációjának eredményeként keletkezik. A tanulmányok azt mutatják, hogy az MDA-szint korrelál az életkorral és az éhgyomri vércukorszinttel [36]. A jelenlegi tanulmány azt mutatta, hogy a CTE javítja a lipidperoxidációt a plazmában, a herében és a spermában (8. táblázat).

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SZEXUÁLIS FUNKCIÓ JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Következtetések

A diabéteszes állapotok során fellépő oxidatív stressz megzavarja a férfiak reproduktív rendszerét a spermiumok károsodása és az ivarmirigy-működési zavarok miatt. A Cistanche tubulosa farmakológiai hatásai miatt a kínai orvoslásban széles körben elfogadott sivatagi növény.Echinakozid (ECH)a CTE fő összetevője, amely antioxidáns és gyulladáscsökkentő hatásáért felelős. In vitro eredményeink azt mutatták, hogy az ECH helyreállította a tesztoszteron szintézis útvonalat és csökkentette az NF-κB és a RAGE fehérje expresszió szintjét. Az ECH hatékonyan gátolta a szuperoxid anion és a H2O2 termelődését Leydig sejtekben. Az in vivo vizsgálatok kimutatták, hogy az ECH csökkentette a koleszterin, a trigliceridek, a TNF- és az IL-6 szintjét. Emellett a cukorbeteg patkányok hipotalamuszában az mRNS expressziója szignifikánsan javult. Azt is meg kell jegyezni, hogy az ECH csökkentette a lipidperoxidációt és javította az inzulinrezisztenciát diabéteszes hím patkányokban. Az antioxidáns aktivitás mind a plazmában, mind a herében nőtt. Ezért vizsgálataink azt sugallták, hogy az ECH hatékony védelmet nyújtott a reproduktív diszfunkció ellen STZ-indukált cukorbeteg hím patkányokban.