Absztrakt

Célkitűzés: Egy Cistanche tartalmú formula (amely helyettesíti az eredeti vértápláló és vese tonizáló gyógynövényeket) hatásának vizsgálata a növekedési faktor- 2 (TGF- 2) transzformáló expressziójára, a sclera-remodellingre és a vízszállításra forma-deprivációs myopia (FDM) patkányokban a caMCAVvein1/1/caCaporin1/1 (quaaporin1/1) szabályozásával. (AQP1) útvonalon.

Módszerek: Negyven SPF-minőségű hím SD patkányt választottunk ki, amelyek közül 30-at használtunk fel az FDM modell létrehozására. A sikeres modellezés után a patkányokat FDM csoportra, pirenzepin (PIR) csoportra és Cistanche formula csoportra osztották, mindegyik csoportban 10 patkány volt. A fennmaradó 10 nem modellezett patkány szolgált normál csoportként. A normál csoport és az FDM csoport nem kapott beavatkozást. A PIR csoportot naponta kétszer (reggel és este) PIR szemcseppel kezelték, míg a Cistanche tápszeres csoportot gyomorba adták a Cistanche tartalmú tápszert. A patkányok fénytörési hibáját és axiális hosszát retinoszkóppal és diagnosztikai műszerrel detektáltuk. A scleralis szövet morfológiai változásainak megfigyelésére HE festést alkalmaztunk. Immunhisztokémiai festést alkalmaztak a TGF- 2 expressziójának kimutatására a scleralis szövetben. Western blot módszerrel határoztuk meg az AQP1 és CAV1 fehérjék relatív expressziós szintjét a scleralis szövetben. RT-PCR-t végeztünk a glutamát-aszpartát transzporter (GLAST) és a glutamát transzporter 1 (GLT-1) mRNS relatív expressziós szintjének mérésére a scleralis szövetben. Eredmények: A normál csoporthoz képest az AQP1 és CAV1 fehérjék refrakciós hibája, TGF- 2 expressziós szintje és relatív expressziós szintje az FDM csoportban, a Cistanche formula csoportban és a PIR csoportban szignifikánsan csökkent, míg a GLAST mRNS és GLT-1 mRNS axiális hossza és relatív expressziós szintje szignifikánsan nőtt (mind.05). Az FDM csoporthoz képest az AQP1 és CAV1 fehérjék töréshiba, TGF- 2 expressziós szintje és relatív expressziós szintje a Cistanche formula csoportban és a PIR csoportban szignifikánsan megnőtt, míg a GLAST mRNS és GLT-1 mRNS axiális hossza és relatív expressziós szintje szignifikánsan csökkent (mind P < 0,05). A Cistanche képletcsoporthoz képest a PIR csoportban az AQP1 és CAV1 fehérjék töréshibája, TGF- 2 expressziós szintje és relatív expressziós szintje szignifikánsan csökkent, míg a GLAST mRNS és GLT-1 mRNS axiális hossza és relatív expressziós szintje szignifikánsan megnőtt (mind P < 0,05). A HE festési eredmények azt mutatták, hogy a normál csoportban nem volt kóros változás az egyes retinarétegek szerkezetében; az FDM csoport retinája elvékonyodott, és súlyos vakuoláris elváltozások jelentek meg a ganglion sejtrétegben; a Cistanche képletcsoport és a PIR csoport retinavastagsága megnőtt, a sejtelrendeződés alapvetően szabályos volt, a ganglionsejtek száma nőtt, és az egyes rétegekben a sejtek sűrűn helyezkedtek el, a legjelentősebb teljesítmény a Cistanche formula csoportban volt. Következtetés: A Cistanche tartalmú formula bizonyos pozitív hatást fejt ki az FDM kezelésében, és mechanizmusa a CAV1, AQP1 és TGF- 2 expressziójának szabályozásával, valamint a scleralis remodelling és a vízszállítási funkciók kiegyensúlyozásával és javításával hozható összefüggésbe.

 

 

CISTANCHE GYÓGYNÖVÉNY-KIEGÉSZÍTŐ A VESEMŰKÖDÉS JAVÍTÁSÁRA

 

 

Kulcsszavak

Forma-deprivációs rövidlátás; Cistanche tartalmú formula; Átalakító növekedési faktor- 2; Aquaporin 1; Caveolin-1; Scleralis átalakítás; Vízi közlekedés

 

Az elmúlt években az emberek életmódjának változásaival és az elektronikai eszközök folyamatos fejlődésével a myopia előfordulása egyre növekszik. Gyakori betegségként globális egészségügyi problémává vált. Form-deprivation myopia (FDM) a myopia egy speciális típusa, amelyet általában a szem vizuális stimulációjának megvonása vagy csökkentése okoz. Az FDM nemcsak a scleralis remodelling folyamatát zavarja meg, hanem a szemgolyó alakjának rendellenes megváltozásához és a vízszállítási funkció zavaraihoz is vezet, ami tovább súlyosbíthatja a scleralis szövetkárosodást és deformációt. Az Aquaporin 1 (AQP1) egy széles körben létező fehérje, amelynek fő funkciója a vízmolekulák sejtmembránokon keresztüli gyors szállításának elősegítése. A szemben az AQP1 eloszlása ​​és működése az intraokuláris folyadék dinamikus egyensúlyával függ össze. A Caveolin-1 (CAV1) egy fehérje, amely részt vesz a sejtmembrán mikrostruktúrák kialakításában és a jelátvitelben. A szemben a CAV1 főként a retina pigment epiteliális sejtjeiben és fotoreceptor sejtjeiben van jelen, és a vizuális jelek átviteléhez és az intraokuláris környezet stabilitásához kapcsolódik. A transzformáló növekedési faktor- 2 (TGF- 2) egy pleiotróp citokin, amelynek számos biológiai hatása van, például elősegíti a sejtproliferációt, a differenciálódást és a migrációt. Az intraokuláris környezetben a TGF- 2 fontos szerepet játszik a szaruhártya és a sclera fejlődésében és fenntartásában. Jelenleg az FDM fő kezelése a gyógyszeres terápia.

A hagyományos kínai orvoslásban (TCM) a myopia kialakulása olyan tényezőkkel van összefüggésben, mint az elégtelen qi és a vér, valamint a vese-esszencia hiánya. A vesét "veleszületett alapnak" tekintik, és szorosan kapcsolódik a szem működéséhez. A TCM szerint "a vese szabályozza az esszenciát, és az esszencia táplálja a szemet; a máj kinyílik a szemekbe, és elegendő májvér biztosítja a tiszta látást". Ezért a vese tonizálása és a vér táplálása mindig is fontos terápiás alapelv volt a TCM-ben előforduló hiányszindrómák által okozott szembetegségeknél.

A "sivatagi ginzeng" néven ismert Cistanche, a TCM "kilenc halhatatlan gyógyszere" egyike, több mint 2000 éves múltra tekint vissza, mint gyógyászati ​​összetevő. Az ősi TCM klasszikusok csúcsminőségű tápláló gyógyászati ​​anyagaként jegyzett Cistanche nagyra értékelik a vesét tonizáló, az esszenciát pótló, a vért tápláló és a szárazságot hidratáló hatásait. Sok más TCM gyógynövénytől eltérően a Cistanche kizárólag sivatagokban nő, főleg a Tamarix ramosissima gyökerein élősködik olyan régiókban, mint Xinjiang, Belső-Mongólia és Gansu Kínában. Az egyedülálló sivatagi környezet gazdag hatóanyagokkal ruházza fel, köztük echinacoside, verbascoside és flavonoidok, amelyek tudományosan bizonyítottan erős antioxidáns tulajdonságokkal rendelkeznek, csökkentik a sejt apoptózist és elősegítik a sejtburjánzást.

A modern kutatások kimutatták, hogy a Cistanche jelentős vesetápláló hatással bír. Csökkentheti a vesesejtek apoptózisát, elősegítheti a vesesejtek szaporodását, helyreállíthatja a sérült vesesejteket, kitágíthatja a vese ereit, ezáltal javítva a veseműködést. Ezenkívül a Cistanche fokozhatja az immunitást a limfociták proliferációjának elősegítésével, ellenáll a fáradtságnak a máj glikogéntermelésének növelésével, és öregedésgátló hatást fejt ki a szabad gyökök megkötésén keresztül. Ezek a biológiai aktivitások nagymértékben összhangban állnak a TCM „a vese tonizálása és tápláló esszencia” elméletével, és tudományos alapot adnak a szembetegségek kezelésében való alkalmazásához. A vese tonizáló és tápláló vér TCM terápiás elve alapján, valamint a Cistanche modern farmakológiai tulajdonságait ötvözve, ez a tanulmány az eredeti vértápláló és vese tonizáló gyógynövényeket Cistanche-ra cserélte, így egy új Cistanche tartalmú formulát alkotott, és feltárta annak hatékonyságát és mechanizmusát az FDM kezelésében, egy új ötlet kidolgozását célozva. rövidlátás.

1 Anyagok és módszerek

1.1 Kísérleti állatok

Negyven SPF-minőségű, 180-200 g tömegű, 6-8 hetes hím SD patkányt a Beijing Keyu Animal Breeding Center-től vásároltak [engedélyszám: SCXK (Jing) 2022-0004], és rutinszerűen az Eye Medical Sciences Academy of China Academy of China Medical Laboratory-ban nevelték őket. Ez a kísérlet megfelelt a „Kísérleti állatok kezeléséről szóló szabályzat” vonatkozó rendelkezéseinek, és jóváhagyta a Kínai Kínai Orvostudományi Akadémia Szemkórházának Orvosetikai Bizottsága (Tételszám: YKEC-KT-2024-017-P001).

1.2 Főbb reagensek és műszerek

Gyógyászati ​​anyagként a Cistanche tubulosa-t (a Chengdu WeCistanche Bio-Tech. Co., Ltd.-től vásárolták, hatóanyagként legalább 30,0% echinakozidot, legfeljebb 12,0% verbakozidot és legalább 75,0% fenetil-alkohol-glikozidot használtak). pirenzepin (PIR, Suzhou Hongsen Pharmaceutical Co., Ltd.); Compound Tropicamide szemcseppek (Hebei Jinyao Yongguang Pharmaceutical Co., Ltd., specifikáció 5 ml); 4 g·L⁻¹ oxibuprokain-hidroklorid szemcsepp (Shandong Bausch & Lomb Freda Pharmaceutical Co., Ltd.); AQP1 antitest (Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.); CAV1 antitest (Wuhan Botu Biotechnology Co., Ltd.); -aktin antitest (Shanghai Jingke Chemical Technology Co., Ltd.); Kecske anti-nyúl IgG (Wenzhou Kemiao Biotechnology Co., Ltd.); HE festőkészlet (Shanghai Zeye Biotechnology Co., Ltd.).

1.3 Modellezési módszer és csoportosítás

Harminc patkányt használtunk az FDM modell létrehozásához. A patkányokat pentobarbitál-nátrium (30 mg·kg-1) intraperitoneális injekciójával érzéstelenítettük. A jobb szem povidon-jóddal történő tisztítása és fertőtlenítése után átlátszatlan szemmaszkot ragasztottunk a jobb szemre. A szemmaszkot naponta ellenőrizték, hogy nincs-e leválás vagy enyhe szivárgás, és ha meglazult, újra ragasztották. A bal szemet kezeletlenül hagyták. 4 hét monokuláris formamegvonás után binokuláris retinoszkópiát és axiális hosszmérést végeztünk a patkányokon. A modellezés sikerkritériumai: cikloplégia után retinoszkóppal vagy automata refraktométerrel mértük a refrakciós hibát, és a deprivált szemnél szignifikáns rövidlátási eltolódás mutatkozott a refrakciós státuszban [azaz a binokuláris refrakciós hiba 2 D-nél nagyobb vagy egyenlő különbsége sikeres modellezésnek minősült, a deprivált szem átlagos rövidlátási eltolódása pedig körülbelül D±5 volt a kontrollhoz képest.]-4. Mind a 30 patkányt sikeresen modelleztük, és FDM-csoportra, PIR-csoportra és Cistanche-csoportra osztották, mindegyik csoportban 10 patkányt. A fennmaradó 10 nem modellezett patkány szolgált normál csoportként.

1.4 Beavatkozási módszerek

A normál csoport és az FDM csoport nem kapott beavatkozást. A PIR csoport 5 csepp PIR szemcseppet kapott a jobb szembe naponta kétszer (reggel és este), 2 perces időközönként 15 napon keresztül. A Cistanche képletcsoportot a Cistanche tartalmú formulával avatkozott be. A Cistanche tubulosa-t (50 g, a magösszetevő) vízzel kifőzzük, és 1000 g·L-1 koncentrációjú gyógyászati ​​oldattá koncentráljuk. A patkányoknak intragasztrikus adagolást adtunk 12,70 g·kg-1 dózisban naponta egyszer 15 napon keresztül. A Cistanche adagolását klinikai alkalmazási tapasztalatai és modern farmakológiai kutatásai alapján határozták meg, biztosítva az olyan hatóanyagok hatékony koncentrációját, mint az echinacoside és a verbaszkozid.

1.5 Észlelési módszerek

1.5.1 A törési hiba és az axiális hosszváltozások értékelése

Morfológiai és fénytörési hiba kimutatása: Huszonnégy órával a formamegvonás befejezése után minden csoportból véletlenszerűen kiválasztottunk 3 patkányt kimutatásra. A kísérlet előtt a patkányokat sötéthez alkalmazkodó környezetbe helyezték 30 percre, majd izoflurán belégzéssel elaltatták és speciális állattartóra rögzítették. A szemgolyó panorámás szkenneléséhez nagy felbontású OCT képalkotó rendszert használtak. A szkennelés során a szondát úgy állítottuk be, hogy merőleges legyen a szaruhártyára, hogy tiszta keresztmetszeti képeket kapjunk a retináról és a lencséről. Mindegyik szemet háromszor egymás után pásztázták, és a szaruhártya elülső felületétől a retina pigment epitélium rétegéig terjedő tengelyirányú távolságot (azaz axiális hosszt) a rendszer beépített szoftvere automatikusan megmérte a szférikus ekvivalens törési hiba kiszámításához. Az adatok pontosságának biztosítása érdekében két szakmailag képzett kutató egymástól függetlenül, vakon elemezte a képeket. Ha a két mérési eredmény közötti különbség nagyobb volt, mint 0,50 D, az adatokat eldobtuk és újra megmértük. Axiális hossz megerősítő kimutatása: Az OCT mérési eredmények ellenőrzésére A-scan ultrahang diagnosztikai műszert is alkalmaztunk. Először oxibuprokain-hidroklorid szemcseppet csepegtettünk a patkányok mindkét szemébe helyi érzéstelenítés céljából, majd az A-scan szondát óvatosan érintkezésbe hoztuk a szaruhártyával. A műszert kézi üzemmódra állítottuk, és a pontos ultrahang terjedési sebességet az intraokuláris közegnek megfelelően állítottuk be: 1540 m·s⁻¹ az elülső kamrára és az üvegtestre. Működés közben az egyes interfészeket manuális jelöléssel lokalizáltuk, és mindegyik szemet háromszor ismételten megmértük az átlagérték megállapításához. Ezt a kísérletet vakon hajtották végre, és minden operátor egységes képzésben részesült a következetes mérési technikák biztosítása érdekében. A műszert a mérés előtt kalibrálták, és néhány mintát véletlenszerűen választottak ki ismételhetőségi vizsgálatra, hogy értékeljék az osztályon belüli és az osztályok közötti korrelációs együtthatókat (ICC). A kísérlet során szigorú szabványosított működési eljárásokat követtek az adatok tudományosságának és megbízhatóságának biztosítása érdekében.

1.5.2 HE-festés

A fénytörési hiba és az axiális hossz kimutatása után a patkányokat túlzott érzéstelenítéssel leöltük. Mindkét szem szemhéját és környező szöveteit fertőtlenítettük, és a szaruhártya felezőpontjára merőleges orr- és temporális limbust jelöltük ki. A kötőhártyát a jeleknek megfelelően bemetszették, és a szemgolyót enukleáltuk. A végtagot bemetszették, hogy eltávolítsák az elülső szegmens szövetét és az üvegtestet, és a scleralis szövetet megtartottuk. A scleralis szövetet 40 g·L⁻¹ paraformaldehiddel fixáltuk 24 órán át, gradiens etanollal dehidratáltuk, rutinszerűen paraffinba ágyaztuk, xilollal tisztítottuk, semleges balzsammal rögzítettük, 5 μm-es metszeteket vágtunk, HE-vel megfestettük, és megfigyeltük a szövetek morfológiai morfológiai változásait.

1.5.3 Immunhisztokémiai festés a TGF- 2 expressziójához scleralis szövetben

Minden csoportból két-két patkányt választottunk ki. A scleralis szövetmetszeteket antigén visszanyerésének és blokkolásának vetettük alá, egér anti-TGF- 2-vel (1:3000) 24 órán keresztül inkubáltuk, mostuk, másodlagos antitesttel (1:2000) 1 órán át inkubáltuk, rutinszerűen előhívtuk és ellenfestettük, semleges balzsammal rögzítettük, és 2-3 mikroszkóp alatt a szövetváltozásokat optikai felvételeken vettük. A pozitív rész szürke értékét képelemző rendszerrel detektáltuk.

1.5.4 Az AQP1 és CAV1 fehérje expressziós szintjének Western blot kimutatása a scleralis szövetben

Minden csoportból két-két patkányt választottunk ki. A scleralis szövetet kivágtuk, homogenizáltuk, és a teljes fehérjét RIPA lízispuffer hozzáadásával extraháltuk. Fehérjedenaturálást, mennyiségi meghatározást, elektroforézist, membrántranszfert és blokkolást végeztünk. Az AQP1 (1:1000), CAV-1 (1:3000) és -aktin antitesteket (1:2000) elsődleges antitesteket adtunk hozzá, és egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk. Másodlagos antitestet (1:2000) adtunk hozzá, és szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk. ECL reagenst adtunk hozzá, és a fehérje szürke értéket Image Lab szoftverrel elemeztük. A célsáv szürkeértékének aránya az -aktinhoz viszonyítva a relatív expressziós szint volt.

1.5.5 A GLAST és az GLT-1 mRNS expressziójának RT-PCR kimutatása scleralis szövetben

A patkányok megmaradt scleralis szövetét vettük, és a teljes RNS-t Trizol módszerrel extraháltuk. A teljes RNS-t spektrofotométerrel mértük, és a cDNS-t reverz transzkripcióval végeztük a kit utasításai szerint. Az RT-PCR reakciórendszert a következő reakciókörülmények között állítottuk elő: 75 fok 30 másodpercig, 85 fok 60 másodpercig, 80 fok 30 másodpercig történő lágyítás, 65 fok 30 másodpercig tartó meghosszabbítás, összesen 40 ciklus. A -aktint belső referenciaként használva a glutamát-aszpartát transzporter (GLAST) és a glutamát transzporter 1 (GLT-1) relatív expressziós szintjét a 2⁻ΔΔCt módszerrel számítottuk ki. A primer szekvenciákat az 1. táblázat mutatja be. A csoportok közötti összehasonlításhoz egyutas varianciaanalízist, a csoportok közötti páronkénti összehasonlításhoz LSD-t tesztet használtunk. A teszt szintje:=0.05.