Az ELOVL2 elősegíti a rák progresszióját azáltal, hogy gátolja a sejtapoptózist vesesejtes karcinómában

edmund.chen@wecistanche.com

Absztrakt. VeseA sejtkarcinóma (RCC) egy agresszív húgyúti rosszindulatú daganat, amely rossz prognózissal jár, különösen metasztázisos betegeknél, fő altípusai a tiszta sejtes RCC (ccRCC), a papilláris PCC (pRCC) és a kromofób RCC (chRCC). Az intracelluláris lipidcseppek (LD-k) jelenlétét a ccRCC fémjelének tekintik. A megváltozott lipidmetabolizmus jelentőségét a ccRCC-ben széles körben felismerték. A nagyon hosszú láncú zsírsavak (ELOVL) megnyúlása katalizálja a zsírsavak (FA) megnyúlását, módosítja a lipidösszetételt, és szükséges a normál testi funkciókhoz. Az elongázok RCC-ben való részvétele azonban továbbra sem világos. Jelen tanulmányban az ELOVL2 expresszióját vizsgáltuk ccRCC-ben; különösen hét ELOVL-izozim magas szintjét figyelték meg primer tumorokban. Megjegyzendő, hogy emelkedett ELOVL2 expressziós szintet figyeltek meg a ccRCC-ben, valamint a pRCC-ben és a chRCC-ben. Ezen túlmenően, az ELOVL2 magasabb szintje szignifikánsan összefügg a ccRCC-ben és pRCC-ben szenvedő betegek rossz prognózisának megnövekedett előfordulásával. Az ELOVL2 CRISPR/Cas{5}}közvetített leütése a hosszú láncú többszörösen telítetlen FA-k megnyúlásának visszaszorítását és az LD termelés növekedését eredményeztevese-rákos sejtek. Ezenkívül az ELOVL2 abláció a sejtproliferáció elnyomását eredményezte az apoptózis in vitro indukciója és a tumornövekedés in vivo gyengülése révén. Összességében a jelen tanulmány új betekintést nyújt a lipidmetabolizmust magában foglaló tumorproliferációs mechanizmusokba, és azt sugallja, hogy az ELOVL2 vonzó új célpont lehet az RCC-terápia számára.

Kulcsszavak:vesesejtes karcinóma, lipidcsepp, sejtburjánzás, vese, vese

Bevezetés

A vesesejtes karcinóma (RCC) egy gyakran előforduló és halálos rosszindulatú daganat, amely a rákos esetek és a kapcsolódó halálozások körülbelül 2 százalékáért felelős világszerte (1), fő altípusai a tiszta sejtes RCC (ccRCC), a papilláris PCC (pRCC) és a kromofób. RCC (RCC). Az összes RCC altípus közül a ccRCC a leggyakoribb szövettani megnyilvánulás, és patogenezisét a hypoxia-indukálható faktorok (HIF) konstitutív aktiválása jellemzi a von Hippel-Lindau (VHL) tumorszuppresszor gén funkcióvesztése miatt. (1). Különféle célzott terápiákat fejlesztettek ki a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) vagy a rapamicin (mTOR) jelátvitel emlős célpontja és az áttétes betegségek immunkontroll-gátlói ellen. A betegség progressziója azonban a betegek többségénél elkerülhetetlen (1,2).

A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE/VESEDIALÍZIS

A ccRCC jellemzője az intracelluláris lipidcseppek (LD-k) bősége, amelyek triglicerideket (TG-ket) és koleszterin-észtereket (CE-ket) tartalmazó semleges lipidmagból állnak, amelyet egy foszfolipid egyrétegű réteg (3) vesz körül. Az LD-k a lipidfelvételért felelős dinamikus organellumok. és tárolásra, valamint a homeosztázis fenntartására, az energiatermelés elősegítésére és a különböző típusú stresszekkel szembeni védelemre vagy a membrán biogenezis fenntartására használják a daganatos sejtek gyors növekedése során számos ráktípus esetén (4). Valójában korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az LD-k hozzájárulnak a ccRCC-hez. progresszió (5,6).

A lipidek fő összetevőjét alkotó zsírsavak (FA-k) szubsztrátként szolgálnak az energiatároláshoz, a membránszintézishez és a jelátviteli molekulák előállításához. A megnyúlás és a deszaturáció a hosszú láncú FA-k (LC-FA) de Novo szintézisének központi lépései, a telítetlenség hossza és mértéke az FA funkciójának és metabolikus sorsának meghatározója (7). A sztearoil-CoA-deszaturáz 1-et (SCD1), amely a zsíracil-deszaturáz család tagja, alaposan tanulmányozták ccRCC-ben (6.8.9). Bebizonyosodott, hogy a fokozott SCD1 expresszió támogatja az életképességet, míg egy SCD1 kis molekula inhibitor (A939572) kimutatták, hogy elnyomja a sejtproliferációt ccRCC-ben(8.9). Ráadásul. Yang és munkatársai (10) kimutatták, hogy a szterin szabályozó elemkötő fehérje 1 (SREBP1) elősegítette a lipid deszaturációt az FA-sav-deszaturáz 1-en (FADSI) keresztül, mielőtt az NF-xB jelátvitelt aktiválták a ccRCC-ben a sejtproliferáció elősegítése érdekében. Az elongázok esetleges szerepe az RCC-ben azonban továbbra sem világos.

Beszámoltak arról, hogy emlősökben a kezdeti és sebességszabályozó FA-kondenzációs reakciókat az elongáz enzimek családja katalizálja, amelyeket a nagyon hosszú láncú FA-k (ELOVL) elongációjának neveznek. A mai napig hét ELOVL-tagot azonosítottak, amelyek általában a telített és egyszeresen telítetlen FA-kra (ELOVL1, ELOVL3, ELOVL6 és ELOVL7) vagy a többszörösen telítetlen FA-kra (PUFA-k; ELOVL2, ELOVL4 és ELOVL5) specifikusakra oszthatók. Lucarelli és munkatársai (9) feltárták a PUFA-k jelentős felhalmozódását és az ELOVL2 és ELOVL5 fokozott expresszióját a ccRCC-ben. Megjegyzendő, hogy kimutatták, hogy a szisztémás dokozahexaénsav (DHA) endogén módon termelődik, és szabályozza a de novo lipogenezist, miközben szabályozza a lipidraktározást szterin szabályozó elemkötő 1-es transzkripciós faktor (SREBPF1) független módon, az ELOVL2 ablációja következtében. egerek (11). Ezenkívül kimutatták, hogy az ELOVL2 túlzott expressziója elősegíti az LD felhalmozódását, fokozott FA-felvétellel mind a 3T3-LI preadipocita sejtvonalban, mind az F442A sejtekben (12). Korábbi in vitro vizsgálatok DHA-val, külsőleg beadva a rákos sejtekhez. kimutatták, hogy a DHA daganatellenes, gyulladásgátló és pro-apoptotikus hatást fejt ki a rákos sejteken (13-15). Azonban az ELOVL2 bármilyen lehetséges szerepe a ccRCC progressziójában a lipidmetabolizmus modulációján keresztül nagyrészt feltáratlan.

Jelen tanulmányban az ELOVL2 inccRCCprogresszióban betöltött szerepét az elsődleges ccRCC és a normál ccRCC transzkripciós profilozásával tártuk fel.veseminták, ami azt mutatja, hogy az ELOVL2 túlzottan expresszálódik a ccRCC-ben, és felülreprezentált az ELOVL izoenzimek között. Megjegyzendő, hogy az ELOVL2 túlzottan expresszálódott ccRCC-ben, valamint pRCC-ben és RCC-ben is, ami szignifikánsan összefügg a CCR CCR pRCC-ben szenvedő betegek rossz prognózisával. Ezenkívül kimutatták, hogy az ELOVL2 gátlása befolyásolja a lipid anyagcserét és elnyomja a sejtproliferációt az apoptózis elősegítése révén, legalábbis részben az endoplazmatikus retikulum (ER) homeosztázis megzavarása révén.veseráksejteket. A jelen tanulmány eredményei arra utalnak, hogy az ELOVL2 potenciális új terápiás célpont lehet az RCC kezelésében.

A CISTANCHE JAVÍTJA A vese-/veseelégtelenséget

Anyagok és metódusok

Sejtvonalak és tenyészetek. A 293T (RCB2202) és OS-RC-2 (RCB0735) sejtvonalakat a RIKEN BioResource Centertől, míg a 786-O és ACHN sejtvonalakat az ATCC-től vásárolták; Az SK-RC-52 sejteket DrJ.G.Old (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) ajándékozta meg. RPTEC sejtvonal, amely az emberi hámsejtekből származikvese-proximális tubulus, a Lonza Group, Ltd.-től vásárolták (CC-2553). Az ACHN, 786-O, SK-RC-52 és OS-RC-2 sejteket RPMI-1640 tápközegben tenyésztettük, amelyet 10% magzati borjúszérummal (FBS) egészítettek ki, 37 °C-on, 5% párásított CO2-atmoszférában. A 293T sejteket Dulbecco módosított Eagle tápközegében tenyésztettük, amelyet 10 százalék borjúmagzati szérummal (FBS) egészítettünk ki, 37 °C-on, 5 százalékos párásított CO2 atmoszférában. Az RPTEC sejteket ben tenyésztjükvese-epithelialis növesztő táptalaj (REGM™) Bulletkit™ (CC-3190; Lonza Bioscience) 37 ˚C-on 5%-os párásított CO2 atmoszférában.

Betegek és ccRCC minták. RCC szövetek és a szomszédos normálisvese46 radikális vagy részleges nefrektómián átesett beteg szöveteit a Tsukuba Egyetemi Kórháztól szerezték be 2006 és 2015 között a Tsukubai Egyetem Etikai Bizottsága által jóváhagyott protokollok szerint (H28-104 jóváhagyás). Minden beteg írásos beleegyezését adta a műtét előtt. A tumorstádiumokat a Nemzetközi Rákellenőrzési Szövetség TNM-stádiumának megfelelően jelöltük ki (16). A kóros fokozatokat a négyszintű Fuhrman osztályozási rendszer szerint osztályozták (17). A betegek összes jellemzőjét az SI táblázat foglalja össze: RNS extrakció és cDNS szintézis. A fagyasztott szövetekből a teljes RNS-t kivontuk ésvese-rákos sejteket TRIzol® Reagent (Thermo Fisher Scientific, Inc.) alkalmazásával. Az RNS-tisztítást követően az RNS-t reverz transzkripcióval cDNS-vé írtuk át nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlettel (kat. szám: 4368814; Thermo Fisher Scientific, Inc.), a gyártó utasításai szerint.

Reverz transzkripciós-kvantitatív polimeráz láncreakció (RT-qPCR). A génexpressziós szinteket egy 7500 Fast Real-Time PCR gép segítségével határoztuk meg Fast SYBR-Green Master Mix-szel (Thermo Fisher Scientific, Inc.). A ciklus körülményei a következők voltak: kezdeti tartás 95 °C-on 20 másodpercig, 40 ciklus 95 °C-on 3 másodpercig és 60 °C-on 30 másodpercig, majd egy olvadási görbe 95 °C-tól 15 másodpercig és 60 °C-ig terjed. C-on 1 percig. Belső kontrollként hipoxantin-foszforiboziltranszferáz 1-et (HPRT1) használtunk. Az összes primer szekvenciát a SII. táblázat tartalmazza. Az apoptózissal kapcsolatos gének értékelése érdekében a proapoptotikus gének, a Bcl-2-asszociált X-fehérje (BAX), a Bcl-2 homológ antagonista/gyilkos (BAK), a forbol-12-mirisztát-13- relatív expressziós szintje acetáttal indukált protein 1-et (PMAIP1/NOXA) és p53-mal szabályozott apoptózis modulátort (BBC3/PUMA), valamint a BCL2 anti-apoptotikus gént és az indukált mieloid leukémia sejtdifferenciációs fehérje gént (MCL1) elemezték. A relatív génexpressziós szinteket a 2-ΔΔCq módszerrel határoztuk meg (18).

Western blot analízis. A Western-blot analízist a korábban leírtak szerint végeztük (19). A sejteket lízispufferben lizáltuk (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% SDS és proteáz inhibitor), és jégen ultrahanggal kezeltük. A lizátumokat 1,000 xg-vel centrifugáltuk 20 percig 4 °C-on, és a felülúszókat mintaként gyűjtöttük. A minták fehérje mennyiségi meghatározását Quick Start Bradford Protein assay (kat. sz. 5000202JA; Bio-Rad Laboratories, Inc.) segítségével végeztük. A mintákat 10 százalékos SDS-PAGE-nak vetettük alá, és az elválasztott termékeket ezt követően PVDF membránokra vittük át.

A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE/VESE FERTŐZÉSÉT

A membránokat ECL Prime blokkoló szerrel (kat. sz. RPN418V; Cytiva) blokkoltuk 60 percig szobahőmérsékleten. A membránokat ezután egy éjszakán át 4 °C-on a következő antitestekkel inkubáltuk: Anti-szerin/treonin-protein kináz/endoribonukleáz inozit igénylő 1. enzim (anti-IRE1 ; 1:200; #3294, Cell Signaling Technology, Inc.), anti-foszforilált IRE1 (anti-p-IRE1 ; 1:200; NB100-2323, Novus Biologicals, LCC), anti-C/EBP homológ fehérje (anti-CHOP; 1:200; MA1-250, Thermo Fisher Scientific, Inc. .). Anti-nyúl vagy anti-egér immunglobulin G HRP-kapcsolt, egész szamár Ab-ot (kat. sz. NA934V, NA931VS; GE Healthcare; Cytiva) 1:10,000 arányban használták másodlagos antitestként. A Western-blotokat ImmunoStar® Zeta (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) segítségével tettük láthatóvá Fujifilm LAS-4000 képalkotó és LAS400IR (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) segítségével. -aktint használtunk belső kontrollként (1:10 000, katalógusszám: A5316; Sigma-Aldrich).

A génexpresszió bioinformatikai elemzése. Az elsődleges daganatok klinikai és RNS-szekvenálási (RNA-seq) adatait, amelyeket RCC-ben szenvedő betegektől gyűjtöttek a The Cancer Genome Atlas (TCGA) adatbázisban, a Genomic Data Commons (GDC) adatportáljáról töltötték le (20). Összesen 1005 (880 beteg és 125 kontroll) mintát vizsgáltak meg, ebből 530 beteg és 71 kontrollmintát.vese vesetiszta sejtes karcinóma kohorsz (KIRC; ccRCC), 286 beteg és 31 egészséges méhnyakmintavese vesepapilláris sejtes karcinóma kohorsz (KIRP; pRCC), valamint 64 beteg és 23 egészséges minta a vese kromofób kohorszhoz (KICH; chRCC). Az ELOVL2 génexpressziót a húgyúti rákmintákban a Normal and Tumor szövetek Gene Expression adatbázisa (GENT2) segítségével elemeztük. A génexpressziós adatokat az U133 Plus 2 (GPL570) platform génexpressziós omnibus (GEO) nyilvános adattárából töltöttük le (http://gent2.appex.kr/gent2/) (21).

Plazmidok és lentivírus transzdukció. A korábbi vizsgálatokban (22, 23) jellemzett ELOVL2 kis hajtű-RNS-eit (shRNS-eket) a pLKO.1 lentivírus vektorba (8453. plazmid; Addgene, Inc.) szubklónoztuk. Az shRNS-vektor megalkotásához használt oligonukleotid-szekvenciákat a SIII. táblázat tartalmazza. A lentivírusokat 293T sejtekben hozták létre négy plazmid transzfektálásával, köztük a lentivírus vektor (pLKO-shControl vagy pLKO-shELOVL2), pMDLg/pRRE (plazmid #12251; Addgene, Inc.), pRSV-Rev (plazmid #12253). Addgene, Inc.) és pMD2.G (plazmid #12259; Addgene, Inc.) Lipofectamine 2000® transzfekciós reagens (Thermo Fisher Scientific, Inc.) alkalmazásával. A transzfekció után 48 órával a vírustartalmú felülúszókat összegyűjtöttük, és egy 0,45 µm-es szűrőn szűrtük át fertőzés céljából. Vírustranszdukcióhoz a pLKO-shControl vagy a pLKO-shELOVL2 lentivírusokat a 786-O, ACHN és SK-RC-52 sejtekkel inkubáltuk egy éjszakán át 37 °C-on, párásított sejttenyésztő inkubátorban. A sejteket puromicin jelenlétében szelektáltuk 24 órával a fertőzés után. A szubklónok stabilizálása érdekében a sejteket puromicint tartalmazó tápközegben 1 hónapig tenyésztettük 37 °C-on, párásított sejttenyészet inkubátorban, és túlélő poolokat használtunk az expressziós és proliferációs elemzésekhez.

A túlzott expressziós kísérletekhez az OSRC-2 sejteket pCMV6 üres vektorral (PS100001 plazmid; Origene Technologies, Inc.) vagy pCMV6-ELOVL2-vel (RC209232 plazmid; Origene Technologies, Inc.) transzfektáltuk 37 ˚C-on, párásított sejttenyészetben. inkubátorban, Lipofectamine 3000® transzfekciós reagenssel (Thermo Fisher Scientific, Inc.), a gyártó utasításai szerint. A sejteket a transzfekció után 48 órával használtuk a jelzett vizsgálatokhoz. CRISPR/Cas9 tervezés és klónozás. A pX330-U6-kiméra_BB-CBh-hSpCas9 (pX330) plazmidot Feng Zhang (Addgene, Inc.; plazmid #42230) ajándékozta (24). Az ELOVL2 CRISPR egyvezetős (sg) szekvenciáit kifejezetten az ELOVL2 2. exonjára (sgELOVL2 #1) és 3. exonjára (sgELOVL2 #2 és #3) célozták meg a CRISPR Design Tool (GE Healthcare Dharmacon, Inc.) segítségével;‑Discovery.com/gene-editing/crispr-cas9/crispr-design-tool/), mielőtt a pX330-ba klónozná. Az egyvezetős vezérléshez (sgControl) szolgáló CRISPR vezetőszekvenciát korábban megtervezték (25). Az egyvezető RNS-ek (sgRNS-ek) oligonukleotid szekvenciáit a SIII.

Az ACHN sejteket ezután 6 lyukú lemezekre oltottuk (1,4x1{7}}5 sejt/lyuk), és 2 órával később kotranszfektáltuk 2 µg pX330-expresszált sgRNS-sel és 0,2 µg pCI-neo vektorral (Promega Corporation; kat. sz. E1841) 37 ˚C-on párásított sejttenyésztő inkubátorban FuGENE HD (Promega Corporation; katalógusszám E2312) alkalmazásával. A transzfekció után 24 órával 400 µg/ml G418-at alkalmaztunk 7-10 napig, és a sejteket 2 vagy 3 napig hagytuk helyreállni. Amikor a sejtek az összefolyáshoz közeledtek, 10 cm-es edényekbe ritkábban ültettük be őket. 2 vagy 3 hét elteltével klónozó korongok (MilliporeSigma; katalógusszám: Z374431-100EA) segítségével megkülönböztethető telepeket izoláltunk. Az egyes klónokat kiterjesztettük, és a célterületen Sanger-szekvenálással értékeltük kiütési állapotukat.

A CISTANCHE JAVÍTJA A VESE-/VESEFÁJDALÁST

Sejtburjánzási vizsgálatok. A sejtszaporodást MTT-teszttel értékelték Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc.) segítségével a gyártó utasításai szerint. Röviden, a sejteket 96 lyukú lemezekre oltottuk, és 72 óra elteltével 10 µl WST-8-at adtunk hozzá. Az OD460 értéket 1 órás, 37 °C-on végzett inkubációt követően mértük. Szubkután xenografálás. A BALB/c meztelen (nu/nu) nőstény egereket (n=12; 6-8 hetes) a Charles River Laboratories, Inc.-től vásároltuk. Az egereket specifikus patogénmentes körülmények között, 12-12 éves korig tartottuk. h világos/sötét ciklus, ad libitum hozzáféréssel élelmiszerhez és vízhez. A szubkután xenograft vizsgálatokhoz 1x107 sejtet 100 µl PBS-ben szuszpendálva injektáltunk szubkután a jobb oldalba 24G tűvel, és hetente egyszer mértük a tumor térfogatát. A tumor térfogatát a következő képlettel számítottuk ki: mm{17}} hosszúság x szélesség x magasság x 0,52 (26). 90 nap elteltével az összes állatot leöltük, és a xenograft tumorokat kivágtuk. Az állatokat 2 százalékos izofluránnal érzéstelenítettük, mielőtt nyaki diszlokációval elaltatták volna őket

A xenograft tumorok formalin-fixált és paraffinba ágyazott (FFPE) mintáit 4 µm vastag metszetekre vágtuk a paraffinmentesítés és rehidratálás előtt. Az antigén kinyeréséhez a metszeteket mikrohullámú sütőben 21 percig citromsav pufferben előkezeltük. Az antigénvisszanyerési eljárás után az endogén peroxidáz aktivitást 3 százalékos H2O2-vel blokkoltuk 25 percig, és a lemezeket Ki-67 antitesttel (1:200; Dako; Agilent Technologies, Inc.; M7240) inkubáltuk 4 °C-on egy éjszakán át. Az immunhisztokémiai reakciót a Histofine Simple Stain MAX PO® (Nichirei Biosciences, Inc.; katalógusszám: 424151) másodlagos antitesttel tettük láthatóvá, kromogénként diaminobenzidint használva. Valamennyi állatkísérletet jóváhagyott a Tsukuba Egyetem Állatkísérleti Bizottsága, és minden kísérletet a Tsukuba Egyetem Állatkísérletek Szabályzata (20-370. számú jóváhagyás) irányelvei szerint végeztek. Apoptózis vizsgálatok. Az apoptózist a Caspase-Glo® 3/7 Assay System (Promega Corporation; katalógusszám: G8090), az Annexin-V-FLUOS festőkészlet (Roche Diagnostics; katalógusszám: 11858777001) és a JC-1 mitokondriális membránpotenciál segítségével értékelték ki. Assay kit (Cayman Chemical Company; katalógusszám: 10009172), a gyártó utasításai szerint.

Az LD-k festése. A sejteket üveg fedőlemezekre oltottuk 60 mm-es edényekbe, és olajsavat (200 µM) tartalmazó tápközeggel tenyésztettük 37 ˚C-on egy éjszakán át 5 százalékos CO 2 -tartalmú inkubátorban. A táptalajt ezután leszívtuk, és a sejteket kétszer mostuk PBS-sel, majd 4%-os formaldehiddel (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) 5 percig szobahőmérsékleten fixáltuk. Ezután a sejteket kétszer mostuk PBS-sel, és inkubáltuk 0,5 µM Lipi-Greennel (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) 30 percig sötétben, 37 °C-on. Ezt követően a sejteket kétszer mostuk PBS-sel, és a fedőlemezeket üveglemezekre rögzítettük VECTASHIELD® Antifade Mounting Medium DAPI-val (Vector Laboratories, Inc.; katalógusszám: H-1200). A megfestett sejtek képeit BZ-X710 fluoreszcens mikroszkóppal (Keyence Corporation) készítettük. Az élő sejteket 0,5 µM Lipi-Greennel inkubáltuk Hanks kiegyensúlyozott sóoldatában (HBSS) 30 percig, majd kétszer HBSS-ben mostuk, 0,5 százalékos BSA-t tartalmazó 1 mM EDTA/PBS-ben (pH 8,0) újraszuszpendáltuk, és sejtszűrőn engedtük át. . A sejteket Gallios áramlási citométeren (Beckman-Coulter, Inc.), és az adatokat FlowJo v10 szoftverrel (FlowJo LLC) elemeztük.

ER nyomkövető festés. Az ACHN sejteket (ACHN/sgControl, ACHN/sgELOVL2-1 és ACHN/sgELOVL2-2) üveg fedőlemezekre oltottuk 6{{20}}-mm-es edényekben, és 37 ˚C-on tenyésztettük 48 órán át 5 százalékos CO 2 inkubátor. A táptalajt ezután leszívtuk, és a sejteket kétszer mostuk HBSS-sel, majd 4 százalékos formaldehiddel (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) 5 percig szobahőmérsékleten fixáltuk. A sejteket ezután kétszer mostuk HBSS-sel, és 500 nM ER Tracker Red-el (Thermo Fisher Scientific, Inc.; katalógusszám: E34250) 2 órán át sötétben, 37 °C-on inkubáltuk. Ezt követően a sejteket kétszer mostuk PBS-sel, és a fedőlemezeket tárgylemezekre helyeztük. A megfestett sejtek képeit BZ-X710 fluoreszcens mikroszkóppal (Keyence Corporation) készítettük. Az élő sejteket 500 nM ER Tracker-rel inkubáltuk HBSS-ben 30 percig, majd kétszer HBSS-ben mostuk, 0,5% BSA-t tartalmazó 1 mM EDTA/PBS-ben (pH 8,0) reszuszpendáltuk, és sejtszűrőn engedtük át. A sejteket Gallios áramlási citométeren elemeztük, és az adatokat FlowJo v10 szoftverrel elemeztük.

Gázkromatográfiás tömegspektrometria (GC-MS). A sejtpelletekből az összes lipid extrakcióját a korábban leírtak szerint végeztük (27). Az extraktumok hidrolízisét és derivatizálását FA-metil-észterekké (FAME-k) végeztük. A konjugált FA-k belső standardjaihoz C20:4 (ω-6), C20:5 (ω-3), C22:5 (ω-6), C22:5 (ω-3) és C22 :6 (ω‑3) A FAME-ket a MilliporeSigma vagy a Cayman Chemical Company cégtől vásárolták. A GC-MS analízist GCMS-TQ8040 (Shimadzu Corporation) segítségével, Omegawax® kapilláris GC oszloppal (MilliporeSigma; katalógusszám: 24136) végeztük. A hőmérsékleti gradienst kezdetben 70 °C-ról 150 °C-ra emelték 20 °C/perc sebességgel, és 150-ről 280 °C-ra 8 °C/perc sebességgel, majd 280-ról 200 °C-ra csökkentették 15-ös sebességgel. ˚C percenként. A mintainjektálást splitless módban hajtottuk végre, 1,0 µl mintával. Az MS analízishez az ionforrást és az interfész hőmérsékletét 200 °C-ra, illetve 270 °C-ra állítottuk be. Az adatokat teljes letapogatási módban (30-600 m/z) gyűjtöttük 70 eV ionizációs feszültség mellett. A FAME-k azonosítása a retenciós idő és az elektronionizációs-MS (EI-MS) spektrum és a referencia FAME-szabványok alapján történt. A FAME-k relatív mennyiségét a mintatömegenkénti átlagos csúcsterület összehasonlításával számítottuk ki. Mindegyik mintát egymástól függetlenül háromszor mértük meg.

Statisztikai analízis. Az adatokat átlag ± SD-ben fejezzük ki. Minden statisztikai elemzést a JMP 10 szoftver (SAS Institute, Inc.), a GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.) vagy az R csomag (4.0.2-es verzió; RStudio, Inc.) segítségével végeztünk. A két csoport közötti különbségek jelentőségét a párosítatlan Student-féle t-teszt vagy Mann-Whitney teszt segítségével értékeltük. A három vagy több csoport közötti különbségek jelentőségét egyirányú ANOVA-val értékelték, utólagos összehasonlítással, Dunnett-teszt vagy Kruskal-Wallis teszt alkalmazásával, majd Dunn-féle post hoc teszttel Bonferroni-korrekcióval. A túlélési görbéket a Kaplan-Meier-módszerrel szerkesztettük, és a görbék közötti különbséget a log-rank teszttel értékeltük. A betegeket két csoportra osztották, egy alacsony expressziós vagy magas expressziós csoportra, a medián expressziós értékek határértékét alkalmazva. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Eredmények

Az ELOVL2 erősen túlzottan expresszálódik az RCC-ben. A jelen kohorszban először hét ELOVL izoenzim mennyiségét vizsgáltuk a megfelelő normál és tumorszövetekben, és kiderült, hogy az ELOVL1, ELOVL2, ELOVL5 és ELOVL7 expressziós szintje megemelkedett a ccRCC szövetekben (1A. ábra). Ezen eredmények validálására az ELOVL izoenzim gén expresszióját a megfelelő normál és tumorszövetekben TCGA adatbázis (KIRC kohorsz) segítségével vizsgáltuk. Megerősítették, hogy az ELOVL2 mRNS expressziója a legnagyobb mértékben és szignifikánsan emelkedett a ccRCC szövetekben (1B. ábra; P.<0.0001). subsequently,="" elovl2="" mrna="" expression="" was="" investigated="" further="" among="" three="" major="" histological="" subtypes="" of="" rcc="" using="" tcga="" database="" (kirc,="" kirp="" and="" kich="" cohorts).="" this="" revealed="" that="" elovl2="" was="" overexpressed="" in="" the="" prcc="" and="" chrcc="" tissues;="" however,="" its="" expression="" in="" ccrcc="" tissues="" was="" the="" highest="" among="" the="" histological="" subtypes="" (fig.="" 1c).="" moreover,="" the="" elovl2="">

Az expressziós szintek jelentősen megemelkedtek az ACHN, 786-O és SK-RC-52 sejtvonalakban, bár az OS-RC-2 sejtvonal mRNS expressziós szintje alacsonyabb volt, mint az RPTEC sejtvonalban (1D. ábra). . Ezt követően a GENT2 adatbázis segítségével vizsgálták az ELOVL2 génexpresszió rákkal összefüggő változását különböző ráktípusokban (1E. ábra). A normál szövetekkel összehasonlítva az ELOVL2 expresszióját szignifikánsan magasabbnak találtákvese, prosztata-, tüdő- és vastagbélrákban, míg az ELOVL2 expressziója hasonló volt a hólyag- vagy mellrákban. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az ELOVL izoenzimek szerepe ráktípusonként eltérő, és hogy az ELOVL2 túlzott expressziója összefüggésbe hozható az RCC, különösen a ccRCC karcinogenezisével vagy betegség progressziójával.

Az ELOVL2 túlzott expressziója összefügg az RCC progressziójával. Megvizsgálták az ELOVL2 génexpressziója és a tumor-csomópont-metasztázis (TNM) stádiumai közötti összefüggést a KIRC kohorszban, hogy tisztázzák az ELOVL2 klinikai jelentőségét a ccRCC-ben. Az ELOVL2 expressziója magasabb volt a lokálisan előrehaladott és metasztatikus betegségekben, bár expressziója nem volt összefüggésben a nyirokcsomó-metasztázis állapotával (2A-C. ábra). Az ELOVL2 expressziója együttesen a klinikai stádiumnak megfelelően növekedett (2D. ábra). Ezt követően az ELOVL2 expressziója és az RCC-ben szenvedő betegek prognózisa közötti összefüggést értékeltük, hogy tisztázzuk a ccRCC klinikai hatását. A Kaplan-Meier-analízis szerint kiderült, hogy az ELOVL2 magas expressziója szignifikánsan a rossz prognózishoz kapcsolódik a jelenlegi kohorszban (P=0.0015, 2E. ábra). Ezen eredmények validálására az ELOVL2 expressziója és a ccRCC-s betegek prognózisa közötti összefüggést tovább vizsgálták a KIRC kohorszban, és kimutatták, hogy ehhez hasonlóan az ELOVL2 magas expressziója szignifikánsan rossz prognózissal jár (P<0,01, fig.="" 2f).="" moreover,="" a="" high="" expression="" of="" elovl2="" was="" significantly="" associated="" with="" a="" poor="" prognosis="" of="" patients="" with="" prcc=""><0.0001, fig.="" 2g).="" however,="" this="" was="" not="" observed="" in="" patients="" with="" chrcc="" (fig.="" 2h).="" in="" total,="" the="" aforementioned="" results="" indicated="" that="" elovl2="" may="" mediate="" ccrcc="" and="" prcc="" disease="" progression,="" at="" least="">

Az ELOVL2 elősegíti a veseráksejtek proliferációját. Az ELOVL2 RCC-sejtek proliferációjában betöltött szerepének felmérésére az ELOVL2 shRNS-leütését végezték el 786-O, ACHN és SK-RC-52 sejtekben. Az egyes shRNS-ek hatását RT-qPCR segítségével értékeltük, és az ELOVL2 expressziójának jelentős csökkenését igazoltuk (3A. ábra). Ezután MTT vizsgálatokat végeztünk az ELOVL2 leütésének sejtproliferációra gyakorolt ​​​​hatásának vizsgálatára. Megfigyelték, hogy az ELOVL2 leütése gátolta az összes sejt proliferációját a kontroll shRNS-sel transzfektált sejtekhez képest (3B. ábra).

Ezzel szemben az ELOVL2 túlzott expressziója indukálódott az OS-RC-2 sejtekben, egy olyan sejtvonalban, amelynél alacsonyabb az ELOVL2 alapexpressziója. A transzfekció hatékonyságát RT-qPCR segítségével értékeltük, és az ELOVL2 szignifikánsan megnövekedett expresszióját igazoltuk (3C. ábra). Az MTT vizsgálatok kimutatták, hogy az ELOVL2-t túltermelő sejtek proliferációja szignifikánsan elősegítette a kontrollcsoporthoz képest (3D. ábra), ami azt jelzi, hogy az ELOVL2 a sejtek proliferációjának elősegítője lehet.vese-rákos sejtek.

Az ELOVL2 abláció gátolja a tumor növekedését in vivo, a PUFA-k szintézisét és az LD-k termelődésétvese-rákos sejtek. Az ELOVL2 RCC progresszióban betöltött szerepének további tisztázása érdekében egy ELOVL2-knockout ACHN sejtvonalat hoztak létre CRISPR/Cas9 rendszer (sgELOVL2-1 és sgELOVL2-2) segítségével (S1. ábra). In vitro a sejtproliferáció szignifikánsan csökkent az ELVOVL2 abláció következtében az ACHN sejtekben (S1. ábra). Ennél is fontosabb, hogy az ELOVL2 CRISPR/Cas9 által közvetített ablációja elnyomta a tumornövekedést, amikor a sejteket szubkután egerekbe ültettük be (4A. ábra). A szubkután xenograft tumorok maximális térfogata az ACHN/kontrollban és az ACHN/sgELOVL2-2-ben a leölés napján 241, illetve 109 mm3 volt. Megjegyzendő, hogy az ACHN/sgELOVL2-1 csoportban az összes xenograft tumor spontán visszafejlődött a transzplantációt követő 14. napon, és a kiirtás időpontjában nem észlelték. A Ki‑67 indexet a kontrollal vagy sgELOVL2-vel transzfektált xenograft tumorokban is megvizsgálták, és megfigyelték, hogy az ACHN/sgELOVL2‑2 sejtek szignifikánsan alacsonyabb Ki‑67 indexet mutattak, mint az ACHN/kontrollsejtek (4B és C ábra). . Ezek az eredmények tovább támasztották azt a lehetőséget, hogy az ELOVL2 fokozza a tumornövekedést in vivo. Mivel az ELOVL2 a 6p24.2 kromoszómán található, és egy endoplazmatikus retikulum transzmembrán fehérjét kódol, amely a C20–C24 PUFA-k megnyúlását szabályozza (7), a teljes FA-szintet az ACHN/sgControl és ACHN/sgELOVL2 sejtekben GC-MS analízis segítségével értékelték ki. (S2 ábra). Az LC-PUFA-szintek változását a 4D. ábra mutatja be. Az ELOVL2 esszenciális enzim a dokozahexaénsav (DHA, C22:6 n-3) endogén termelődésében (28,29), és amint az várható volt, a DHA szintje jelentősen csökkent az ELOVL2 ablációja következtébenvese-rákos sejtek. Sőt, a

más LC-PUFA-fajták, köztük az arachidonsav (AA, C20:4 n-6), az eikozapentaénsav (EPA) és a dokozapentaénsav (DPA) mennyisége is jelentősen csökkent. Másrészt a DPA termelése nem változott következetesen az ACHN/sgELOVL2 sejtekben. A DPA mennyisége az ACHN sejtekben nagyon alacsony volt, és több mintában nem volt kimutatható (S2 ábra). Mivel a korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy az ELOVL2 elősegíti az LD-k felhalmozódását a DHA termelésén keresztül (11, 12), az LD-k tárolását semleges lipidfestéssel tovább értékelték. Megjegyzendő, hogy az LD-k mennyisége az ACHN/sgELOVL2 sejtekben szignifikánsan csökkent az ACHN/sgControl sejtekhez képest (4E-4G ábra), ami arra utal, hogy a lipidmetabolizmusnak az ELOVL2 túlzott expressziója általi megváltozása befolyásolhatja az RCC-sejtek proliferációját.

Az ELOVL2 abláció az apoptózist indukáljavese-rákos sejtek. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az intracelluláris LD-k termelése elősegíti az apoptózist stresszes tumor mikrokörnyezetben (4). Ezért a jelen vizsgálatban az apoptózist ACHN/sgControl vagy ACHN/sgELOVL2 sejtekben értékelték, és a kaszpáz 3/7 szignifikánsan megnövekedett aktivitását mutatták ki az ACHN/sgELOVL2 sejtekben (5A. ábra). Hasonlóképpen, nagyobb számú apoptotikus ACHN/sgELOVL2 sejtet azonosítottak, mint az ACHN/sgControl sejteket, amint azt az Annexin V/PI festés bizonyítja (5B. ábra). A celluláris stressztől függően az intrinsic apoptózis (30) a mitokondriális membránpotenciál elvesztéséhez vezet; így a jelen tanulmány tovább mérte az ACHN/sgControl vagy ACHN/sgELOVL2 sejtek mitokondriális transzmembrán elektromos potenciálját fluoreszcens JC-1 segítségével. Az aggregátum/monomer arány szignifikánsan csökkent az ACHN/sgELOVL2 sejtekben (5C. ábra), jelezve a mitokondriális transzmembrán polarizáció elősegítését és az intrinsic apoptotikus útvonal ELOVL2 abláció általi aktiválását. Pontosabban, a pro-apoptotikus gén (BAX, BAK, PUMA és NOXA) expressziós szintje szignifikánsan megnőtt, míg az anti-apoptotikus gén (BCL2 és MCL1) expressziós szintje szignifikánsan csökkent az ELOVL2 abláció miatt (5D. ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az ELOVL2 hozzájárul a sejtek túléléséhez a veserák sejtek apoptózisának gátlásán keresztül

Az LD formában a lipidtároló kapacitás leépülése az ER homeosztázis összeomlásához vezethet, kiváltva az unfolded protein választ (UPR) és a celluláris apoptózist (4,5). Ezért az ELOVL2 expresszió ER homeosztázisban való részvételére vonatkozó hipotézis alátámasztására ER tracker festést végeztünk ACHN/sgControl vagy ACHN/sgELOVL2 sejtekben. Az ezt követő ER-képalkotás (5E. ábra) és az áramlási citometriával végzett mennyiségi meghatározás (5F. és G. ábra) az ER-stressz miatti ER-tágulást jelezte az ACHN/sgELOVL2 sejtekben. Ezenkívül az ELOVL2 abláció elősegítette az IRE1 foszforilációját, amely az UPR érzékelők aktivátora (5H. ábra), míg aAz ER stressz által kiváltott apoptózisban főszerepet játszó CHOP-t az ELOVL2 ablációja szabályozta (5H. ábra). Ezek az eredmények együttesen azt mutatták, hogy az ELOVL2 által közvetített lipidmetabolizmus elnyomja a sejt apoptózisátvese-rákos sejteket, és azt javasolta, hogy az ER homeosztázis megzavarása az indukció lehetséges mechanizmusa lehet.

Vita

A jelen tanulmány kimutatta, hogy az ELVOL2 megváltoztathatja a lipid anyagcserét és elősegítheti a tumor növekedését a veseráksejtek apoptózisának gátlásán keresztül. Ezenkívül megfigyelték, hogy az ELOVL2 expressziója az RCC szövetekben megemelkedett, és ez

az ELOVL2 magasabb expressziója szignifikánsan összefüggött az RCC-ben szenvedő betegek rossz prognózisával. Korlátozott számú tanulmány áll rendelkezésre az ELOVL2 szerepéről a rák progressziójában (22, 31, 32), és eredményeik ellentmondásosak. Simple és munkatársai (22) kimutatták, hogy az ELOVL2 elősegítette az LC-PUFA szintézist, támogatva a hatékony EGFR jelátvitelt és a glioblasztóma őssejtek proliferációját. Ezzel szemben Kang és munkatársai (31) arról számoltak be, hogy az ELOVL2 abláció elősegítheti a sejtmigrációt és az emlőráksejtek kolóniaképződését, és feltárta, hogy a csökkent ELOVL2 expresszió az emlőrákos betegek rosszabb prognózisával járt együtt. Továbbá Ding és munkatársai (32) arról számoltak be, hogy az ELOVL2 elnyomja a neuroblasztóma sejtek proliferációját, és kedvező túlélési arányokkal jár. A korábbi vizsgálatokban közölt ellentmondó eredmények szerint az ELOVL2 többszerepű funkcióját igazolták a rák progressziójában, amely egyértelműen ráktípusonként változik.

A megváltozott lipidmetabolizmus nagymértékben befolyásolja a rák progresszióját, ez a hatás a jelen tanulmány eredményeiben is megfigyelhető, összhangban az ELOVL2 szerepét az LC-PUFA-k nyúlási folyamatának elsődleges szabályozójaként és a DHA bioszintézisében kritikus enzimként leíró kutatással. 7). Jelen tanulmányban kimutatták, hogy az endogén LC-PUFA-k,

beleértve az AA-t és a DHA-t is, csökkentek az ELOVL2 ablációja miatt veserák sejtekben. Ezzel kapcsolatban korábban beszámoltak arról, hogy az AA útvonal lipoxigenáz (LOX) inhibitorok általi gátlása apoptózist indukál és csökkenti a sejtek életképességét.vese-rákos sejtek in vitro (33,34). Bár a jelen tanulmány ELOVL2 túlzott expressziós eredményei összhangban vannak ezekkel a mechanikai megállapításokkal, korábban azonban már beszámoltak arról, hogy a DHA beadása gátolja a veseráksejtek proliferációját és invázióját in vitro (35, 36). Az LC-PUFA-k azonban köztudottan eltérő és ellentétes hatást fejtenek ki a rák progressziójára. Ezért a különféle LC-PUFA-k kényes egyensúlyának az ELOVL2 gátlása miatti megváltozása összefüggésbe hozható a különböző ráktípusokban megfigyelt eltérő fenotípusokkal. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy egerekben az ELOVL2 endogén DHA-termelése következtében az LD-szintek megnövekednek (11,12). Hasonlóképpen kiderült, hogy az ELOVL2 abláció elnyomhatja a DHA és az LD termelést veserák sejtekben, ami arra utal, hogy az ELOVL2 túlzott expressziója elősegítheti az LD termelést az endogén DHA termelésen keresztül RCC-ben. A rákos sejtek gyakran zordabb környezeti (makro- és mikro) körülmények között is megtalálhatók, ideértve a hipoxiát és a tápanyaghiányt, de mégis gyorsan növekednek ilyen súlyos stresszhatások hatására. Kimutatták az LD-k funkcióit sejtstressz körülményei között, mint például az energia és a redox homeosztázis fenntartása, az autofágia szabályozása, az ER homeosztázis fenntartása és a lipotoxicitás elleni védelem (4).

Ackerman és munkatársai (6) feltárták, hogy az LD-k megakadályozzák a toxikus, telített lipidek felhalmozódását hipoxia során azáltal, hogy puffereli a sejt lipidtelítettségét a TG-rezidens telítetlen FA-k ccRCC-ben történő kicserélésével. A telített FA-k (SFA), köztük a palmitát (C16:0) miatti celluláris lipotoxicitás apoptózist okozhat, ami rákos sejthalálhoz vezethet (37,38). A közelmúltban az ELOVL2-t kritikus túlélést elősegítő enzimnek minősítették, amely segít a glükolipotoxicitás által kiváltott sejtapoptózis megelőzésében (39). Megjegyzendő, hogy az ELOVL2/DHA tengelyen módosított lipid-megosztás az SFA-palmitát nem mérgező hasznosítását eredményezi azáltal, hogy egy CPT1-függő mechanizmuson keresztül elősegíti a mitokondriumokba való transzportját a FA-oxidációhoz (FAO). Ezenkívül Balaban és munkatársai kimutatták, hogy a C4-2B prosztataráksejteket és az MCF-7 emlőráksejteket a mitokondriális FAO megvédi a palmitát által kiváltott apoptózistól (37, 38). A palmitát által kiváltott lipotoxicitás során az anti-apoptotikus fehérjék, köztük a BCL-2 vagy az MCL-1 sejtszintek csökkenéséről számoltak be (40, 41), míg a pro-apoptotikus fehérjék, köztük a PUMA vagy a NOXA szintjéről számoltak be. növelendő (42,43). Jelen tanulmányból kiderült, hogy az ELOVL2 abláció elősegíthetivese-rákos sejtek apoptózisát pro- és anti-apoptotikus gének hasonló módon történő megváltoztatásával. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az ELOVL2 megvédheti a sejteket a lipotoxicitás által vezérelt apoptózissal szemben, hogy elősegítse a tumor növekedését RCC-ben.

Ezenkívül kimutatták, hogy az ELOVL2 ablációja RCC-ben elősegítheti az ER-stressz és a CHOP-upregulációt, csökkentve a BCL-2-t és az MCL-1-et, míg a BAK-ot és a BAX-ot egy mitokondriumfüggő útvonalon keresztül (44). Valójában a jelen tanulmány eredményei azt mutatták, hogy az ELOVL2 ablációja hasonlóan megváltoztatta a pro- és anti-apoptotikus géneket. Qui és munkatársai (5) tanulmányának megállapításaival összhangban, akik arról számoltak be, hogy a HIF2 / PLIN2-függő LD-k elősegítik az ER-stressz elleni rezisztenciát és a sejtek túlélését ccRCC-ben, ezek az együttes eredmények alátámasztják az ER-stresszt, amely elősegíti az ELOVL2 által a sejtes apoptózist. abláció bevese-rákos sejteket, csökkenti az LD-t és eltávolítja a sejtpuffert a toxikus lipidekkel szemben.

Összefoglalva, a jelen tanulmány legjobb tudásunk szerint először bizonyította, hogy az ELOVL2 elősegíti a tumor növekedését azáltal, hogy gátolja az apoptózist a PUFA-k meghosszabbításán keresztül, legalábbis részben az ER homeosztázis fenntartásávalvese-rákos sejtek. Összességében azt sugallták, hogy az ELOVL2-indukálta LD-k hozzájárulhatnak a rák progressziójához az RCC-ben előforduló sejtstressz elleni többszörös védőhatás miatt. Ezenkívül azt javasolták, hogy az ELOVL2 vonzó potenciális terápiás célpont lehet az RCC-ben szenvedő betegek számára.