Az agyszövet felülről lefelé irányuló proteomikájának javítása a FAIMS segítségével 1. rész
Aug 27, 2024
Absztrakt
Az Alzheimer- és Parkinson-kór proteomikai vizsgálatai értékes betekintést nyújtottak a neurodegeneratív betegségekbe. Eddig ezek a vizsgálatok nagyrészt alulról felfelé irányuló megközelítésekre korlátozódtak, ami akadályozza a fehérje "ép" állapotának jellemzését.
Az Alzheimer-kór egy neurodegeneratív betegség, amely visszafordíthatatlan hatással van az egyén memóriájára és kognitív képességeire. Bár az emberek nem tudják teljesen kigyógyítani a betegséget, gondos kezeléssel és megelőzéssel a betegség progressziója a lehető legnagyobb mértékben lassítható, a beteg testi-lelki egészsége megőrizhető.
A memória az Alzheimer-kórban szenvedő betegek egyik legnyilvánvalóbb aspektusa. Gyakran elfelejtik a fontos információkat, például a nevüket, szeretteik nevét, fontos dátumokat stb. Ezen túlmenően néhány haladó, önállóan tanuló szókincs, például elvont fogalmak és szinonimák is feledésbe merülhet. Néhány kognitív képzéssel és kezeléssel azonban az Alzheimer-kóros betegek bizonyos szempontból továbbra is meg tudják őrizni memóriájukat.
Bár az Alzheimer-kór negatív következményekkel járhat, pozitívan kell tekintenünk rá. Először is, ha növeljük a betegség tudatosságát és megértését, jobban megelőzhetjük és kezelhetjük azt. Másodszor, az Alzheimer-kórban szenvedő betegek gondozói és családtagjai azt is megtanulhatják, hogyan kell hatékonyan kommunikálni és kommunikálni velük, hogy segítsenek a betegeknek megőrizni önméltóságukat és a lehető legtöbb boldogan élni.
Általánosságban elmondható, hogy bár az Alzheimer-kór visszafordíthatatlan hatással lehet a memóriára és a kognitív képességekre, meg kell őriznünk az optimista hozzáállást, és igyekeznünk kell lassítani a betegség progresszióját kezelésekkel és megelőző intézkedésekkel. Ugyanakkor több segítséget, támogatást kell nyújtanunk az Alzheimer-kóros betegeket ápolóknak, közösen melegebb, interaktívabb közösséget teremteni. Látható, hogy javítanunk kell a memórián. A Cistanche jelentősen javíthatja a memóriát, mert hagyományos kínai gyógyászati anyag, számos egyedi hatással, amelyek közül az egyik a memória javítása. A Cistanche hatása a benne található különféle hatóanyagokból adódik, beleértve a csersavat, poliszacharidokat, flavonoid glikozidokat stb. Ezek az összetevők számos módon elősegíthetik az agy egészségét.
Kattintson a Tudjon meg 10 módszerre a memória javítására
A felülről lefelé irányuló proteomika (TDP) felülmúlja ezt a korlátot; azonban jellemzően csak a legnagyobb mennyiségben előforduló, viszonylag kis méretű proteoformák megfigyelésére korlátozódik.
Ezért a frakcionálási technikákat általában a minták összetettségének csökkentésére használják. Itt vizsgáljuk a tegas fázis frakcionálását nagy térerejű aszimmetrikus hullámforma ionmobilitás spektrometriával (FAIMS) a TDP-n belül.
Az Alzheimer-kór (AD) agyszövetéből származó nagy komplexitású minta felhasználásával leírjuk, hogy a FAIMS hozzáadása a TDP-hez hogyan javíthatja erőteljesen a proteomlefedettség mélységét.
Például a FAIMS implementációja –50, –40 és –30 CV-ra léptető külső kompenzációs feszültséggel (CV) több mint kétszeresére növelheti a nem redundáns proteoformák, gének és proteomszekvencia-lefedettség átlagos számát a FAIMS nélküli megoldáshoz képest.
Azt is megállapítottuk, hogy a FAIMS befolyásolhatja a proteoformák transzmisszióját és azok töltési burokát méretük alapján. Fontos, hogy a FAIMS lehetővé tette az érintetlen amiloidbéta (A ) proteoformák azonosítását, beleértve az aggregációra hajlamos A 1–42 variánst, amely erősen kapcsolódik az AD-hez.
A nyers adatokat és a kapcsolódó fájlokat a PXD023607 adatkészlet-azonosítóval a MassIVE adattáron keresztül letétbe helyezték a ProteomeXchange Consortiumban.
BEVEZETÉS
Az elmúlt 2 évtizedben a neurodegeneratív betegségek előfordulása több mint kétszeresére nőtt világszerte, és az Alzheimer-kór (AD) a legelterjedtebb forma.1 Két fehérjefaj, az amiloid béta (A ) peptidek és a foszforilált mikrotubulusokhoz kapcsolódó tau(tau) fehérje. A 2–5. szoros összefüggésben áll az AD-vel.
Ezért az AD részletes proteomekarakterizálása különösen fontos volt.6,7 A tömegspektrometria központi szerepet játszott ezekben a vizsgálatokban,8 túlnyomórészt alulról építkező megközelítéssel.9-16
Az alulról felfelé irányuló elemzésekhez szükséges proteáz emésztés azonban gátolja a fehérje teljes állapotának rögzítését, amely genetikai allélek, alternatív splicing, proteolitikus feldolgozás és poszttranszlációs módosulások (a továbbiakban: „proteoformok”) miatt változhat.17– 20
Mivel a felülről lefelé irányuló proteomikai (TDP) megközelítések ép állapotban elemzik a fehérjéket, nagyobb a valószínűsége annak, hogy bizonyos patológiákkal kapcsolatos proteoformákat rögzítenek, és erősebb, közvetlenebb kapcsolatot tesz lehetővé a genotípus és a fenotípus között.20–22
Például a TDP különösen alkalmas az olyan fehérjékből, mint a tau, származó endogén proteolitikus fragmensek rögzítésére, amelyeket Alzheimer-kórhoz kapcsoltak.23–26 Számos korábbi TDP-alkalmazás ígéretesnek bizonyult a regionális agyproteómák heterogenitásának és a különböző ingerekre adott neuronális változásoknak a feltárásában. .27–30
Az összetett minták TDP-je azonban jellemzően offline frakcionálási technikákat igényel a minta összetettségének csökkentése érdekében, mivel az emberi proteom mérete és mennyisége több nagyságrendet is átölel, és a fehérjék általában nem jól felbonthatók fordított fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (LC).31
Ez az offline frakcionálás végrehajtható géllel eluált folyadékfrakció-befogó elektroforézissel, méretkizárásos kromatográfiával, ioncserélő kromatográfiával vagy affinitásos tisztítással, hogy csak néhányat említsünk.22,32-35
Sajnos az offline frakcionálás jellemzően csökkenti a hozamot és az áteresztőképességet azáltal, hogy meghosszabbított mintakezelést igényel.36 A gázfázisú ionmobilitási szétválasztás vonzó frakcionálási alternatíva, amely bevezethető az LC és az MSdimenziók között anélkül, hogy további mintakezelési lépésekre lenne szükség.
A nagy térerősségű aszimmetrikus hullámforma ionmobilitás-spektrometria (FAIMS) különösen alkalmas erre a feladatra, mivel a közelmúltban bemutatták a FAIMS Pro eszközt, amelynek moduláris felépítése lehetővé teszi az ionmobilitás egyszerű beépítését számos áramköri Orbitrap műszerbe.
A FAIMS, amelyet differenciális mobilitási spektrometriának is neveznek, a vivőgázban lévő ionokat olyan tényezők kombinációja alapján választja el, mint a méret, a töltés vagy az alak, egy aszimmetrikus hullámforma bevezetésével nagy és alacsony elektromos mezővel.38 Az ionok ütközésének megakadályozása érdekében Egyenáramú kompenzációs feszültség (CV)39 alkalmazása révén az ion útjában eltérés lép fel, amely lehetővé teszi az ion szelektív átvitelét.38
A FAIMS alkalmazása ép fehérjeanalízisre nagyrészt az egyes fehérjék konformereinek vagy a fehérjék kis kombinációinak elválasztására korlátozódott; 40–45
a FAIMS-t azonban a közelmúltban alkalmazták ép és natív proteinanalízisre folyadék extrakciós felületi analízissel.46–50 Itt a FAIMS-TDP analízist alkalmazzuk egy Alzheimer-kóros beteg mediális frontalcortexéből (MFC) származó teljes szövetmintára.
A –50 és –20 CV közötti CV-tartományon keresztül végzett pásztázás külső léptetéssel lehetővé tette számunkra, hogy meghatározzuk, hogy a FAIMS CV modulációja hogyan befolyásolja a hengeres FAIMS egységen keresztül továbbított ionok jellemzőit, és hogyan lehet ezt a kapcsolatot kihasználni a méret alapján megcélzott proteoformákra.
A FAIMS-TDP több mint kétszeresére növelte a proteoform azonosítást egyetlen CV-nél a FAIMS nélkülihez képest, és lehetővé tette a neurodegeneratív betegségek szempontjából releváns proteoformák mélyebb kikérdezését, beleértve a -, - és -synucleineket, a PARK7-et, a tau splice izoformákat és számos ép A proteoformát.
Összességében ez a munka leírja, hogyan érhető el reprodukálhatóan a proteoformák és a proteomlefedettség nagyobb azonosítása FAIMS-szel végzett gázfázisú frakcionálással TDP-ben.
MÓD
Minta előkészítés
Az MFC-minta a Rush Egyetem Alzheimer-kórközpontjától érkezett. A résztvevők klinikán dolgozó idősek voltak, akik 1992 és 2005 között memóriapanaszokkal és/vagy ordemenciával jelentkeztek.
A Rush Memory Clinic-en kiértékelték őket az esetleges demencia miatt, és beleegyeztek abba, hogy a Rush Alzheimer's Disease Core Center klinikai magja részeként agyadományozást végezzenek. A tanulmányt a Rush University Medical Center intézményi felülvizsgálati bizottsága hagyta jóvá.
A halált követően a hozzátartozók hozzájárultak a boncoláshoz. A beteg általános kognitív diagnosztikai kategóriája az Alzheimer-kóros demencia volt, a kognitív károsodás egyéb okai nélkül51, míg a post mortem intervallum 230 perc volt.
Minden mintakezelési lépést a BSL{{0}} óvintézkedések betartásával hajtottak végre. 33 mg -80 fokon tárolt MFC szövetet 1,5 ml-es LoBind Eppendorf csövekbe (Eppendorf, katalógusszám: 022431081) vittünk át 0,5 ml homogenizáló puffer hozzáadásával, amely 8 M karbamidot, 10 mM ammónium-hidrogén-karbonátot (ABC) és trisz(2-karboxi-etil)-foszfin (TCEP) 7,5 pH-n.
A homogenizálást fizikai megszakítással értük el kézi motorral hajtott pellet mozsártörővel 30 másodpercig (BioVortexer spirálostorral; Biospec 1083 és 1017), mielőtt 0,5 ml homogenizáló puffert adtunk hozzá szobahőmérsékleten.
A mintát ezután 37 °C-on 60 percig 1200 fordulat/perc sebességgel inkubáltuk ThermoMixer segítségével, hogy lehetővé tegyük a sejtfehérjék extrakcióját és denaturálását. A karbamidban oldhatatlan anyag pelletálását 18, 000g-vel, 20 percig 22 °C-on végzett centrifugálással végeztük, majd a kapott felülúszót 3 ml mosópufferhez (WB; 8 M karbamid, 10 mM ABC, pH 7) adtuk. .5) egy 4 ml-es 100 kDa molekulatömegű határérték (MWCO) szűrőn belül a nagy molekulatömegű fajok eltávolítására.
1 órás 22 fokos és 5000 g-s centrifugálás után a visszatartott anyag térfogata 200 µl, a szűrlet térfogata pedig 3,8 ml volt. A szűrletből 3,8 ml-t átvittünk egy 3 kDa MWCO-szűrőbe, hogy eltávolítsuk a kis molekulájú szennyeződéseket és az alacsony molekulatömegű peptideket.
A 3 kDa-os MWCOfiltert 22 fokon és 7300 g-vel centrifugáltuk 1 órán át, így a visszatartott térfogat 200 μL volt. A 100 kDa-os MWCO szűrőből származó 200 μl retentátot még egyszer mostuk úgy, hogy 4 ml-re hígítottuk WB-vel, majd újra átszűrtük ugyanazon a szűrőn.
Ezt az átfolyást ugyanahhoz a 3 kDa-os MWCO-szűrőhöz adtuk, mint fentebb említettük, és még egyszer betöményítettük.
A 3 kDa MWCO szűrőmosásból származó végső 200 μl retentátot egy 1,5 ml-es LoBindEppendorf csőbe vittük át. A minta savanyításához 10 μl 10%-os hangyasavat (FA) adtunk hozzá, ami 0,5%-os FA-koncentrációt eredményezett a végső mintában.
A mintát 18, 000g-vel centrifugáltuk 15 percig, hogy eltávolítsuk a kicsapódott anyagot, mielőtt megmérnénk a fehérjekoncentrációt a bicinkoninsav (BCA) vizsgálattal.
A szarvasmarha szérumalbumin standardokat 8 M karbamidban, 10 mM ABC-ben és 0,5% FA-ban készítettük el, hogy figyelembe vegyük a BCA vizsgálathoz való esetleges puffer-hozzájárulást. A fehérjekoncentrációt a BCA vizsgálattal 1,1 mg/ml-nek határoztuk meg, ami megfelel 0,22 mg teljes kinyert fehérje végső hozamának a ~200 μl-es mintában. 0,5 mg/ml-re hígítottuk 0,5% FA-t tartalmazó WB-vel, és -80 °C-on tároltuk az LC-MS analízisig.
Meg kell jegyeznünk, hogy a kezdeti kísérletek (az adatok nem publikáltak) hagyományos proteáz/foszfatáz inhibitor koktéllal a homogenizációs pufferünkön belül félrevezető BCAassay és LC-MS eredményekhez vezettek, mivel a 3KMWCO szűrő számos koktélkomponenst visszatartott.
Ezen túlmenően, sok általánosan használt foszfatáz- és proteázinhibitor kémiailag inkompatibilis a redukálószerekkel, például a TCEP-pel. Figyelembe véve ezeket az inkompatibilitásokat, és azt, hogy a 8 M karbamid és 10 mM TCEP erősen denaturáló körülményei várhatóan inaktiválják a legtöbb proteázt, úgy gondoltuk, hogy a proteolitikus lebomlás ilyen körülmények között továbbra is minimálisra csökken.
LC-MS/MS elemzések és FAIMS beállítások
A mintákat Waters NanoACQUITY UPLC rendszerrel elemeztük, amelynek mozgófázisai {{0}},2% FA-t tartalmaztak H2O-ban (A mozgófázis) és 0,2% FA-t ACN-ben (B mobil fázis).
Mind a csapdázó előoszlop (100 μm id, 5 cm hosszúság), mind az analitikai oszlop (75 μm id, 50 cm hosszú) a C2 töltőanyaggal (5 és 3 μm a csapda/analitikai, 300 Å, elválasztási technológia) töltött iszap volt. . A mintákat egy 5 μLloop-ba töltöttük, ami a betöltött anyagmennyiség 2,5 ug-ának felel meg, és 5% b izokratikus áramlással, 3 μl/perc sebességgel 20 percen keresztül injektáltuk a csapóoszlopba.
Az elválasztást 5-50% b gradienssel végeztük 180 percen keresztül, 300 nl/perc sebességgel. A fehérjék MS/MS analíziséhez a NanoACQUITY rendszert a FAIMS Pro interfésszel felszerelt Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid tömegspektrométerhez kapcsolták.
A forrásparaméterek között szerepelt 2,2 kV elektrospray feszültség, 275 fokos transzfer kapilláris hőmérséklet és 60%-os iontölcsér rádiófrekvenciás amplitúdója. A FAIMS-t szabványos felbontásra állítottuk be kiegészítő, felhasználó által vezérelt vivőgáz-áramlás és –5 kV-os diszperziós feszültség nélkül (-33,3 kV/cm-es diszperziós mezőnek felel meg),50, míg a CV a kísérlettől függően változott (ezt "külső léptetésnek" nevezik ").
A Fusion Lumost "ép fehérje" alkalmazási módra állítottuk, amely 2 mTorr-ra csökkenti a magasabb energiájú C-csapda disszociációs (HCD) cellN2 nyomását, és az adatokat teljes profilként gyűjtöttük. Az MS1 és MS2 adatokat 120 000 és 60 000 felbontással, 3 és 2 mikroszkenneléseket végeztünk 500–2, 000 m/z és 400–2, 000 m/z tartományban, és AGC célok 5 × 106 és 5 × 105.
Az MS1-et és az MS2-t is 400 ms maximális befecskendezési idővel szereztük be. Az adatfüggő beállítások közé tartozott a 6 legintenzívebb ion kiválasztása, a töltési állapotnál alacsonyabb ionok kizárása5+, a meghatározatlan töltési állapotok felvétele, valamint a dinamikus kizárás egy 30 másodperces megfigyelés után.
Az MS2-hez kiválasztott ionokat ±1,5 m/z ablakon keresztül izoláltuk, és ütközés-indukált disszociáción (CID) keresztül fragmentáltuk 35%-os ütközési energiával. CID-t használtunk a HCD helyett, mivel a normalizált ütközési energia kisebb függősége miatt értelmezhető fehérje fragmentációs spektrumokat kaptunk, ezáltal előtérbe helyezve a proteoform megfigyeléseink szélességét a szekvencia lefedettségével szemben.
Az egyes FAIMS CV-ekhez tartozó adatkészleteket három példányban gyűjtöttük össze. Az összes nyers fájl a MassIVE adattárba került, és az MSV000086696 csatlakozáson keresztül vagy a ProteomeXchange PXD023607 kódjával érhető el.
For more information:1950477648nn@gmail.com
