Az epigallokatechin{0}}gallát elősegíti a sertés petesejtek in vitro érését és embriófejlődését a sertés petesejtek IVF-jét követően, 2. rész

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Eredmények

Az EGCG hatása a kumulusz expanziós indexére

Az érett petesejtek és az első poláris testextrudálással rendelkező oociták morfológiája az S1A és S1B kiegészítő ábrákon látható. Először is megvizsgáltuk a kumulusz expanziós indexet a petesejtekben, miután különböző koncentrációjú EGCG-vel kezeltük, és amint az 1. táblázatban látható, az EGCG 5 és 1{6}} uM mellett szignifikánsan növelte a kumulusz expanziós indexet a kontrollcsoporthoz képest. (5 uM csoport versus 0 uM csoport: 2,989 ±0.068 versus 2,438 ±0.081;10 μM csoport versus {{30}} uM csoport: 3,079±0,110 versus 2,438±0,081). A 20 uM-os EGCG azonban nem volt hatással a kumulusz expanziós indexére a kontrollcsoporthoz képest (20 uM csoport versus 0 μM csoport -2,879±0,076 versus 2,438±0,081).

További információért kattintson ide

Az EGCG hatása a petesejtek IVM-arányára

Az EGCG hatásait a petesejtek in vitro érési sebességére tovább vizsgáltuk. Amint a 2. táblázat mutatja, a petesejtek érési sebessége magasabb volt az 5 és 20 μM csoportban, mint a 0 μM EGCG kontrollcsoportban; míg a különbség statisztikailag nem volt szignifikáns (2. táblázat). Másrészt az 10 μM EGCG-kezelés szignifikánsan megnövelte a petesejtek érési sebességét a 0 μM EGCG kontrollcsoporthoz képest (10 μM csoport versus 0 μM csoport∶58,63±2,79% versus 46,27±3,25%);P<>

Az EGCG hatása a petesejtek oxidatív stresszére

Az EGCG-vel kezelt petesejtek ROS termelését a ROS termelési teszttel határoztuk meg. A különböző koncentrációjú EGCG-vel végzett kezelést követően petesejtekben a ROS fluoreszcens jelek reprezentatív képei az 1A. ábrán láthatók. Az immunfluoreszcens festés mennyiségi meghatározása azt mutatta, hogy az 5 μM-os EGCG nem befolyásolta a ROS termelést a petesejtekben, összehasonlítva a 0 μM kontrollcsoporttal (1B ábra). EGCG 10 és 20 μM mellett szignifikánsan csökkentette az oociták ROS-szintjét a 0 μM EGCG kontrollcsoporthoz képest (1B ábra).

A Cistanche javíthatja az immunitást

Mivel a 10 μM-os EGCG növelheti a kumulusz expanziós indexet és a petesejtek érési sebességét, valamint csökkentheti a petesejtek ROS szintjét, a további vizsgálatokhoz 10 μM EGCG-t választottunk. Amint az 1C. ábrán látható, az EGCG 10 uM-nál jelentősen megnövelte aantioxidánskapacitása apetesejtekösszehasonlítva a 0 uM kontrollcsoporttal (1C. ábra). Ezenkívül a glutation szintje emelkedett, míg az MDA szintje csökkent a 10 μM EGCG-vel kezelt petesejtekben (1D és E ábra). Továbbá qRT-PCR-t végeztünk a mRNS expressziós szintjének meghatározásáraoxidatívstresszhez kapcsolódó gének, beleértve a katalázt (CAT), a glutationtperoxidáz(GPx) és szuperoxid-diszmutáz (SOD). Az 10 μM-os EGCG szignifikánsan megnövelte a CAT, GPx és SOD mRNS expressziós szintjét a 0 uM-os kontrollcsoporthoz képest (2A-C. ábra).

Az EGCG hatásai az mRNS expressziós szintjeireApoptózis-Kapcsolódó gének a petesejtekben

A qRT-PCR-t az apoptózissal összefüggő gének mRNS expressziós szintjének meghatározására végeztük, beleértve

Bax, Bcl{{0}} és kaszpáz-3. A 10 uM-os EGCG szignifikánsan csökkentette a Bax és a kaszpáz-3 mRNS-expressziós szintjét, és növelte a Bcl-2 mRNS-expressziós szintjét a 0 µM-os kontrollcsoporthoz képest (3A-C. ábra).

Az IVM és IVF során használt EGCG hatása a petesejtek fejlődési potenciáljára

Az embriók és blasztociszták reprezentatív képei a SIC-S1E kiegészítő ábrán láthatók.

Az IVF során végzett kezelés szignifikánsan növelte a hasítási arányt és a blasztociszta arányát a kontrollcsoporthoz képest (3. táblázat). Az IVM során végzett EGCG-kezelés jelentősen növelte a blasztociszták arányát, de nem a hasítási arányt a kontrollcsoporthoz képest (3. táblázat). Ezenkívül az EGCG-kezelés mind az IVM, mind az IVC során szignifikánsan növelte a hasítási arányt és a blasztociszta arányát a másik három csoporthoz képest (3. táblázat). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az EGCG IVM és IVF során elősegítheti a petesejtek fejlődési potenciálját.

Az IVM és a VC során használt EGCG hatása a petesejtek fejlődési potenciáljára

Az IVC alatt végzett EGCG kezelés szignifikánsan csökkentette a petesejtek hasadási és blasztociszta arányát az EGCG kezelés nélküli csoporthoz képest (4. táblázat). Másrészt az IVM alatt végzett EGCG kezelés szignifikánsan növelte a petesejtek hasítási és blasztociszta arányát az EGCG kezelés nélküli csoporthoz képest (4. táblázat). Az IVM és IVC során végzett EGCG kezelés szignifikánsan csökkentette a petesejtek hasítási és blasztociszta arányát. összehasonlítva az EGCG-kezelés nélküli csoporttal és az IVM alatt EGCG-kezelést kapott csoporttal (4. táblázat). Összességében ezek az eredmények azt mutatták, hogy az IVM alatt végzett EGCG-kezelés növelte a petesejtek fejlődési potenciálját, míg az IVC alatti EGCG-kezelés gyengítette a petesejtek fejlődési potenciálját.

Vita

The IVM technique for the COC has been developed and applied to produce offspring in mammals including pigs, however, the rate of blastocytes formation following IVF is still low using IVM oocytes compared with that of in vivo-matured oocytes such as pigs. In pigs, the COCs are usually collected from medium size antral follicles(>3 mm átmérőjű), ahol a petesejtek képesek a petesejtek érését indukálni, míg a follikuláris szomatikus sejtek nem képesek reagálni az ovulációs ingerekre. Ezenkívül az in vitro környezet általában növeli a ROS sejttermelését, amely a sejtkárosodás fő oka.16 Ezért a tenyésztési körülmények optimalizálása az in vivo környezet utánzása érdekében elengedhetetlen az oociták normális növekedéséhez és éréséhez. Jelen tanulmányban különböző koncentrációjú EGCG-t adtak az IVM, IVF és IVC táptalajhoz, hogy megfigyeljék a petesejtek érési minőségét. A 10 uM koncentrációjú EGCG jelentősen javítja a sertés petesejtek IVM-ét. Ebben a vizsgálatban az EGCG kiegészítése IVF és IVC során két különböző hatást vált ki. 10 µM EGCG kiegészítése IVF alatt elősegítheti a petesejtek hasítási sebességét, ami összhangban volt Spinaci és munkatársai megállapításaival, amelyek azt mutatják, hogy az IVF során 10 µM EGCG kiegészítése jelentősen megnövelte a megtermékenyítési arányt.17 Az EGCG hozzáadásának hatása IVF során a spermiumra, nem pedig az OOcytára gyakorolt ​​hatásának köszönhető.

Az in vitro tenyésztés során a petesejtek és embriók elkerülhetetlenül fénynek és magasabb oxigénkoncentrációnak vannak kitéve, mint in vivo, ami a ROS (szuperoxid-anion, hidrogén-peroxid és nagyon reaktív hidroxil) fokozott termeléséhez vezethet. Számos tanulmány kimutatta, hogy az IVM tápközegben lévő antioxidánsok kiegészítése javíthatja az embrió fejlődési képességét. Az EGCG antioxidánsként működik, és kimutatták, hogy mérsékli az anyai hipertermia káros hatásait egerekben a tüszőbe zárt petesejtekre. Barberino és munkatársai kimutatták, hogy az EGCG gyengítette a preantrális tüszők apoptózisát a foszfatidil-inozitol -3-kináz/protein kináz B jelátviteli útvonalon keresztül juh petefészekszövet in vitro tenyésztése után." Huang és munkatársai azt javasolták, hogy 50 μM EGCG javíthatja a szarvasmarha petesejtek érését. és az EGCG protektív szerepe összefüggésbe hozható antioxidáns tulajdonságával mértéke Eredményeink korábbi vizsgálatokkal kombinálva arra utaltak, hogy az EGCG sertés petesejtek IVM-ére gyakorolt ​​hatása összefüggésbe hozható az antioxidáns és apoptózis elleni hatással, ami tovább jelen tanulmányban vizsgáljuk.

A ROS túlzott felhalmozódása oxidatív stresszhez vezethet, és eredményeink azt mutatták, hogy az EGCG növelheti a teljes antioxidáns kapacitást és csökkentheti a ROS és MDA szintjét a sertés petesejtekben. Ennek oka az lehet, hogy az EGCG közvetlenül képes eltávolítani a ROS-t és/vagy az EGCG szinergikusan hathat az antioxidáns rendszerrel. A nem enzimatikus rendszerek molekulákra támaszkodnak a ROS közvetlen kioltásához, míg az enzimatikus rendszerek specifikus enzimekből állnak, amelyek méregtelenítik a ROS-t. Ez utóbbiban az SOD család fontos szerepet játszik az oxidatív stressz szabályozásában. A SOD az egyetlen ismert enzim, amely közvetlenül megköti a szabad gyököket azáltal, hogy katalizálja a szuperoxid-anion hidrogén-peroxiddá való átalakulását. A SOD enzim szabályozza a sejtek által termelt szuperoxid és hidrogén-peroxid szintjét, majd szabályozza a sejtjelátvitelt." A kataláz fontos antioxidáns és a peroxiszómák marker enzime. Az összes peroxiszóma enzim 40 százalékát teszi ki. Antioxidáns oligomer - négy egyforma, tetraéderben elhelyezkedő alegységgel használható, és fontos enzim, amely megvédi a sejteket a ROS oxidatív károsodásától.2 A glutation egy glutaminsavból, ciszteinből és glicinből álló tripeptid, amely Y-amid kötéseket és szulfhidril-csoportokat tartalmaz. Képes fenntartani a normál immunrendszert funkciója és antioxidáns hatása van. A glutation-peroxidáz (GPX-ek) a GSH oxidációját H, O-val, méregtelenítéssel kombinálja.2"A vizsgálatok kimutatták, hogy a hőstressz oxidatív stresszt válthat ki a bubalin petesejtekben, ami kiváltja a ROS eliminációját az antioxidáns enzim védekező rendszere által. 2 Vizsgálataink következetesen azt mutatták, hogy az EGCG csökkentette a petesejtek ROS szintjét és MDA tartalmát, miközben növelte az intr acelluláris GSH tartalom és teljes antioxidáns kapacitás.

Az apoptózis folyamata befolyásolhatja a petesejtek minőségét és túlélési arányát, és ezáltal befolyásolhatja az embrionális fejlődést. A Bcl-2 család fehérjéi kulcsszerepet játszanak a sejthalál szabályozásában a pro-apoptotikus és anti-apoptotikus fehérjetagok közötti kiegyensúlyozott kölcsönhatáson keresztül. 24 A pro-apoptotikus Bax fehérje az emlős mitokondriális függő apoptózis magja. A kaszpáz-3 a sejt apoptózisában is pótolhatatlan szerepet játszik. A kaszpáz-3 a sejtapoptózis folyamatában a legfontosabb terminális splicing enzim, az aktivált kaszpáz-3 pedig a sejtapoptózis kulcsfontosságú végrehajtója. Eredményeink azt mutatják, hogy az EGCG növelte a Bcl{10}} mRNS expressziós szintjét, de csökkentette a Bax és a kaszpáz-3 mRNS expressziós szintjét. Ezek az eredmények együttesen azt sugallják, hogy az EGCG antioxidáns és anti-apoptotikus hatása sertés petesejtekben nagymértékben összefügg a SOD1, CAT és GPX, valamint az apoptózissal kapcsolatos gének szabályozásával.

Összefoglalva, eredményeink arra utalnak, hogy az EGCG elősegíti a sertés petesejtek in vitro érését és embriófejlődését IVF után. Az EGCG petesejtekre gyakorolt ​​védő hatása összefügghet antioxidáns és apoptózis-ellenes tulajdonságaival.

Finanszírozás

Ezt a tanulmányt a Guangdong tartomány Természettudományi Alapítványa (2020Al515010976), a Guangdong Pearl River Tehetségek Program Helyi Innovatív és Kutatócsoportok Projektje (2019BTO2N630), valamint a Guangdong tartomány Tudományos és Technológiai Innovációs Stratégiai Projektjei (2020203B0020203) támogatásai támogatták.

Ez a cikk a következő forrásból származik. A cikk a következő Dove Press folyóiratban jelent meg: Drug Design, Development, and Therapy