3. kísérlet A Cistanche Deserticola fenil-etanol-glikozid hatása patkány perimenopauzális modellre Ⅲ

3. kísérlet A Cistanche deserticola fenil-etanol-glikozid hatása patkány perimenopauzális modellre

1 Kísérleti anyagok

1.1 Kísérleti állatok

Wistar patkányok, SPF minőségű, nőstény, Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., patkány tanúsítvány száma ehhez a tételhez: 0017216; laboratóriumi bizonyítvány száma SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Kísérleti gyógyszerek

Cistanche deserticola feniletanol-glikozidaz 1. kísérlet módszere szerint állítottuk elő, és a tartalom elérte a 66,47%-ot. Gengnian'an kapszula, összetevők: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, bazsarózsa kéreg, Poria cocos, gyöngyház, curculigo, Schisandra chinensis, magnetit, Polygonum multifloratum, vineating, multifloraum . Funkciók és jelzések:Tápláld a jint és urald a jangot, enyhíti a bajokatés megnyugtatja az elmét. Menopauzális hőhullámok és izzadás, szédülés, fülzúgás, ingerlékenység és álmatlanság esetén alkalmazzák. Műszaki adatok: 0,3 g kapszulánként. Használata és adagolása: Szájon át, 3 kapszula, naponta 3 alkalommal. Gyártó: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Gyártási tételszám: 121104. Engedélyszám: Z14021848 nemzeti gyógyszerengedélyezési szám.

Szója izoflavonok és E-vitamin lágy kapszula, összetevők listája: szója izoflavon por, E-vitamin, napraforgóolaj, zselatin, glicerin, víz, tartrazin, titán-dioxid. Ikonikus összetevők és tartalom: 100 grammonként 55,2 mg szója-izoflavont (geniszteinnek számítva) és 608,5 mg E-vitamint tartalmaz. Egészségügyi funkciók: Csontsűrűség növelése. Használati utasítás és adagolás: Naponta kétszer 1 kapszulát vegyen be meleg vízzel. Leírás: 500mg×100 kapszula. Gyártó: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Gyártási tételszám: 13070302. Engedélyszám: National Food Health G20080032.

MENNYI IDEIG TELJES, HOGY MŰKÖDIK A CISTANCHE?

1.3 Kísérleti reagensek

Karboxi-metil-cellulóz-nátrium, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., tételszám: 20120418; penicillin-nátrium injekcióhoz, North China Pharmaceutical Co., Ltd., specifikáció: 4 millió egység, gyártási tételszám: c1206807;

Formaldehid oldat (analitikailag tiszta), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., gyártási tételszám: 20130902; 0,9%-os nátrium-klorid injekció, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; specifikáció: 250ml, gyártási tételszám: 13082405B;

Klór-hidrát, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, tételszám: 20120827; Patkány E2 ELISA detektáló készlet, R&D Company, tételszám: 20140101A; Patkány T ELISA detektáló készlet, R&D Company, tételszám: 20140101A; Patkány LH ELISA detektáló készlet, R&D Company, tételszám: 20140101A; Patkány FSH ELISA kimutatási készlet, R&D Company, tételszám: 20140101A;

2 Kísérleti módszerek

2.1 Modellezés és gyógyszeradminisztráció

Modellezési módszer: Vegyünk 1 00 nőstény, 210-230 g testtömegű patkányt, véletlenszerűen válasszunk ki 12 patkányt üres csoportba, és essünk át álműtéten, a maradék patkányokat pedig a menopauza létrehozására használjuk fel. modellek. Miután a patkányokat lemértük, a patkányokat 10%-os klorálhidrát (0,3 ml/100 g) intraperitoneális injekciójával elaltattuk, és a hasi helyzetet rögzítettük. Ezután a patkányokat levágtuk a hátukon az utolsó borda alól a hónalj középső vonalának metszéspontjában és körülbelül 2 cm-re a gerinc oldalsó oldalától, majd fertőtlenítettük. A bőr és a hátizmok kb 1cm bemetszettek, a bemetszés látómezőjében tejfehér fényes zsírtömeg látható, melybe beágyazódik a petefészek. Kis csipesszel finoman fogja meg a zsírtömeget, és húzza ki a bemetszésből, válassza szét a zsírtömeget, és egy vékony, szabálytalan, sárgásvörös petefészket fog látni. Vágáskor először vékony fonallal kössük le a petefészek alatti petevezetéket (zsírt is beleértve), a bal petefészket teljesen távolítsuk el, és távolítsuk el a jobb petefészek 80%-át. A műtét után a méhszarvokat visszahelyezték a hasüregbe, az izmokat és a bőrt összevarrták, és mindkét petefészket azonos módon eltávolították. A műtét után az állatokat gondosan felneveltük, és intramuszkulárisan 200,000 u/kg penicillint (egyenként 0,1 ml) injekcióztunk be a fertőzés megelőzése érdekében, naponta egyszer 3 egymást követő napon. A műtét után 5 nappal megkezdtük a patkányok hüvelykenetének vizsgálatát egyenként, naponta egyszer, 5 egymást követő napon. A kenetben ivarzási reakciókat mutató patkányokat eldobtuk. 72 teljesen kasztrált patkányt választottunk ki, és véletlenszerűen 6 csoportra osztották. Kísérleti célokra ezek a modellcsoport, a Gengnianan-csoport, a szójaizoflavon-csoport, valamint a nagy, közepes és kis dózisú Cistanche deserticola fenil-etanol-glikozid-csoport.

Elkészítés módja: Elkészítés módja: {{0}},5% CMC Elkészítési módszer: Mérjünk le 4 g karboximetil-cellulóz-nátriumot, és keverjük össze desztillált vízzel 800ml-re. A Cistanche deserticola fenil-etanol-glikozid csoport nagy, közepes és kis dózisai 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg és 33,33 mg/kg (beadási térfogat 1 ml/100 g) voltak. Elkészítési mód: Mérjünk be 1333,3 mg, 666,7 mg és 333,3 mg összes málna flavonoidot, oldjuk fel kis mennyiségű 0,5%-os CMC-vel, majd állítsuk be a térfogatot 100 ml-re, jól keverjük össze, és kész. Gengniangan kapszula (450 mg/kg, desztillált vízzel 45 mg/ml-re keverve, 1 ml/100 g, ami a klinikai adag 10-szeresének felel meg); Elkészítési mód: Vegyünk 15 Gengniangan kapszulát, először oldjuk fel kis mennyiségű 0,5%-os CMC-vel, majd állítsuk a térfogatot 100 ml-re és jól keverjük össze, ami a Gengnianan kapszulaszuszpenzió adagja (450 mg/kg). Szójabab izoflavon E-vitamin lágy kapszula (166,67 mg/kg, desztillált vízzel 16,67 mg/ml, 1 ml/100 g, ami a klinikai adag 10-szeresének felel meg); Elkészítési mód: Vegyünk 4 szójabab izoflavon E-vitamin lágy kapszulát, először oldjuk fel kis mennyiségű 0,5%-os CMC-vel, majd állítsuk a térfogatot 120 ml-re, és jól keverjük össze, hogy megkapjuk a szója izoflavon E-vitamin lágy kapszula szuszpenzióját (16,67 mg/kg). ).

Beadás módja: Minden csoportban az állatok a műtét utáni 1. napon kaptak megfelelő gyógyszert. A vakcsoportot és a modellcsoportot azonos térfogatú 0,5%-os CMC-oldattal (a szonda térfogata 1 ml/100 g), a Gengnianan csoportot pedig Gengnianan kapszulaszuszpenzióval (450 mg/kg, ami a klinikai dózis 10-szeresével egyenértékű) szondáztattuk. ). ), a szójabab izoflavon csoportja szójabab izoflavon E-vitamin lágy kapszula szuszpenziót kapott (166,67 mg/kg, ami a klinikai dózis 10-szeresének felel meg), valamint a nagy, közepes és kis dózist.Cistanche deserticola feniletanol-glikozidcsoportokat orálisan adták be a csoportnak megfelelően. Cistanche deserticola fenil-etanol-glikozid nagy, közepes és kis dózisai (a dózisok rendre 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg és 33,33 mg/kg, a mennyiség 1 ml/100 g), naponta egyszer, folyamatos intragasztrikus beadással . gyógyszert 30 napig.

2.2 Megfigyelési tételek és kimutatási módszerek

Az egyes csoportokban a patkányok vízszintes-függőleges mozgási pontszámait 29 nappal a beadás után mértük. 2 órával az utolsó gyomorba történő beadás után (15 órás koplalás) távolítsa el a szemgolyókat, hogy vért gyűjtsön, elkülönítse a szérumot ésvérplazmaés mérjük meg az E2, T, LH, FSH, GnRH és BGP tartalmát a szérumban, valamint -EP tartalmát a plazmában; a patkányokat feldarabolták. Távolítsa el a csecsemőmirigyet, a lépet, a méhet és a petefészekszövet fennmaradó 20%-át, mérje le nedves tömegüket, és számítsa ki a csecsemőmirigy, a lép és a méh szervi indexét (szerv index=szerv nedves tömeg mg/patkány tömeg g) , majd távolítsuk el az agyat A hipotalamusz és az agyalapi mirigy számára a hipotalamuszból, az agyalapi mirigyből és a méh 1/2 részéből szövethomogenizátumokat állítottunk elő, valamint a hipotalamuszban, az agyalapi mirigyben és a méhszövet homogenizátumában az ösztrogén receptorok tartalmát, valamint az androgént. meghatároztuk a hypothalamus szövet homogenizátumok receptor tartalmát. A csecsemőmirigyet, a lépet, a méhet és a petefészket 10%-os formaldehid oldatban fixáltuk, paraffinba ágyaztuk, metszeteket vágtunk és HE-vel megfestettük. Ahisztomorfológiai változásokminden csoportban fénymikroszkóp alatt figyelték meg.

2.2.1 Nyílt mező módszerrel végzett teszt

A kísérleti eszköz egy 40 cm magas, 80 cm hosszú és szélességű kocka alakú nyitott doboz. A környező falak és az alsó rész fekete. Az alja 25 egyenlő területű blokkból áll, amelyeket fehér vonalak osztanak el. A kísérlet során a patkányt a nyitott doboz közepén lévő négyzetbe helyeztük, és az alján 5 percen belül a patkány által keresztezett blokkok számának vízszintes aktivitási pontszáma (a négyzetek, amelyekben mind a négy mancs belépett, megszámolhatók), és hányszor álltak egyenesen a hátsó végtagok (két mellső mancs a levegőben volt). (vagy falba kapaszkodva) vertikális aktivitási pontszám. A székletet minden kísérlet után teljesen el kell távolítani, és a beadás után 2 órával minden patkányt egyszer meg kell mérni. Ezt a kísérletet egy csendes szobában végezték.

2.2.2 Kit meghatározási módszer

Szérumminták vétele: Használjon pirogén- és endotoxinoktól mentes kémcsöveket. A műtét során kerülje a sejtstimulációt. A vér összegyűjtése után centrifugálja 3000 ford./perc sebességgel 10 percig, hogy gyorsan és óvatosan elválassza a szérumot és a vörösvértesteket. Vegyünk plazmamintákat: heparin antikoaguláns csövekkel antikoagulált. Centrifugálja 3000 fordulat/perc sebességgel 30 percig, és vegye ki a felülúszót. Szövethomogenizált minták vétele: Adjon megfelelő mennyiségű fiziológiás sóoldatot a szövethez, és pépesítse. Centrifugálja 3000 fordulat/perc sebességgel 10 percig, és vegye ki a felülúszót.

A patkány (Rat) ösztradiol (E2) ELISA kit meghatározásának módszere megegyezik a 2. kísérletben leírtakkal. A standardok (S0-S5) koncentrációi: 0, 4, 8, 16, 32 és 64 pmol/l.

A Patkány (Rat) Tesztoszteron (T) ELISA Kit vizsgálati módszere megegyezik az Ösztradiol ELISA Kit vizsgálati módszerével. A standardok (S{{0}}S5) koncentrációi: {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 és 320 pg /mL. A patkány (Rat) luteinizáló hormon (LH) ELISA kimutatási készlet meghatározási módszere megegyezik az ösztradiol ELISA detektáló készlet meghatározási módszerével. A standardok (S0-S5) koncentrációi 0, 3, 6, 12, 24 és 48 ml/ml. A patkány (Rat) follikulus-stimuláló hormon (FSH) ELISA kit vizsgálati módszere megegyezik az ösztradiol ELISA kit vizsgálati módszerével. A standardok (S0-S5) koncentrációi 0, 0,75, 1,5, 3, 6 és 12 NE/L. A patkány (Rat) gonadotropin-releasing hormon (GnRH) ELISA kimutatási készlet meghatározási módszere megegyezik az ösztradiol ELISA detektáló készlet meghatározási módszerével. A standardok (S0-S5) koncentrációi 0, 5, 10, 20, 40 és 80 mlU/ml.

A patkány (Rat) osteocalcin (BGP/OCN) ELISA kimutatási készlet meghatározási módszere megegyezik az ösztradiol ELISA detektáló készlet meghatározási módszerével. A standardok (S{{0}}S5) koncentrációi: 0, 0,75, 1,5, 3, 6 és 12 ng/ml. A patkány (Rat) -endorfin (-EP) ELISA detektáló készlet meghatározási módszere megegyezik az ösztradiol ELISA detektáló készlet meghatározási módszerével. A standardok (S0-S5) koncentrációi: 0, 3, 6, 12, 24 és 48 pg/ml. A patkány (Rat) ösztrogénreceptor (ER) ELISA detektáló készlet meghatározási módszere megegyezik az ösztradiol ELISA detektáló készlet meghatározási módszerével. A standardok (S{{20}}S5) koncentrációi 0, 4, 8, 16, 32 és 64 pg/ml. A patkány (Rat) androgén receptor (AR) ELISA detektáló készlet meghatározási módszere megegyezik az ösztradiol ELISA detektáló készlet meghatározási módszerével. A standardok (S0-S5) koncentrációi 0, 25, 50, 100, 200 és 400 pg/ml.

2.3 Statisztikai feldolgozási módszerek

Az adatok elemzéséhez az SPSS17.{1}} egészségügyi statisztikai csomagot használtuk az adatok statisztikai feldolgozásához. A mérési adatokat átlag ± szórás (-x±s) formában fejeztük ki. A csoportok közötti összehasonlításhoz egyirányú varianciaanalízist alkalmaztunk. Az LSD módszert alkalmaztuk a variancia homogenitásának vizsgálatára. , a Games-Howell tesztet az egyenetlen szórásokhoz, a Ridit tesztet pedig az osztályzati adatokhoz.

A 11. táblázatból és a 14. ábrából látható, hogy a vak csoporthoz képest a modellcsoportban lévő patkányok csecsemőmirigy-indexe, lépindexe és méhindexe szignifikánsan csökkent (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Hatások a vér biokémiai indexszintjére perimenopausális modellpatkányokban

Az egyes csoportok patkányainak szérum E2, T, LH, FSH, GnRH és BGP tartalmát és plazma-EP tartalmát a 12-13. táblázatok és a 15-17. ábrák mutatják be.

A 12-13. táblázatokból és a 15-18. ábrákból látható, hogy a vak csoporthoz képest a modellcsoportban lévő patkányok szérum E2- és T-szintjei szignifikánsan csökkentek (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

14. táblázat A Cistanche deserticola fenil-etanol-glikozid hatása a szérum GnRH-ra és a plazma -EP-szintekre patkány perimenopauzális modellben (-x±s)

A 14. táblázatból és a 19-20 ábrákból látható, hogy a vak csoporthoz képest a modellcsoportban a patkányok szérum GnRH szintje szignifikánsan megemelkedett, a plazma -EP szintje pedig szignifikánsan csökkent (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Hatások az ER- és AR-tartalomra perimenopauzális modellpatkányok szöveteiben

Az egyes csoportok patkányainak releváns szöveteiben az ER és AR tartalma a 16-17. táblázatokban és a 22-23. ábrákon látható.

A 17. táblázatból és a 23. ábrából látható, hogy a vak csoporthoz képest a modellcsoport hipotalamuszában az AR szint szignifikánsan alacsonyabb volt (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Hatások a szervszövet morfológiájára perimenopausalis modellpatkányokban

Az egyes kísérleti csoportokban a patkányok méhének, csecsemőmirigyének és lépének kóros és szövettani megfigyelési eredményei a következők. A patológiás fényképeket az 1. függelékben mutatjuk be a perimenopauzás modellpatkányok patológiás fotóihoz.

5.1 A méhszövet morfológiájára gyakorolt ​​hatás perimenopauzás modellpatkányokban

A patkányok méhnyálkahártyájának, mirigyeinek és myometriumának különböző mértékű változásai szerint az egyes kísérleti csoportokban félkvantitatív standardokat használtunk a kóros szövetmorfológia négy szintre osztására, és az egyes kísérleti csoportokban a patkányok méhét. mért. A megfigyelési eredményeket a 18. táblázat tartalmazza.

"-" A méhnyálkahártya hámsejtek, mirigyek, myometrium és serosa mind normálisak; "+" az endometrium hámsejtjei és mirigyei sorvadtak, a myometrium és a serosa normális; "++" a méhnyálkahártya epitélium A sejtek és mirigyek részben sorvadtak, az izomréteg enyhén sorvadt, a serosa normális; A "+++" méhnyálkahártya hámsejtjei és mirigyei jelentősen sorvadtak, a serosa pedig normális.

A Ridit-teszt után a 18. táblázatból látható, hogy a vakcsoporttal összehasonlítva a modellcsoportban a patkányok méhében jelentős kóros szöveti elváltozások mutatkoztak (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 A petefészekszövet morfológiájára gyakorolt ​​hatás perimenopauzális modellpatkányokban

Az egyes kísérleti csoportokban a patkányok petefészkében a tüszők, sárgatest, granulosa sejtek és véredények különböző mértékű változásai alapján szemikvantitatív standardokat használtunk a kóros szövetmorfológia négy szintre osztására. Minden kísérleti csoportban megmértük és megfigyeltük a patkányok petefészkeit. Az eredményeket a 19. táblázat tartalmazza.

19. táblázat A Cistanche deserticola fenil-etanol-glikozid hatása a petefészek patológiás elváltozásaira perimenopauzás modellpatkányokban Egység: csak

A "-" minden szinten mutathat növekvő tüszőket, érett tüszőket és sárgatestet. A sárgatest jól fejlett, sok granulosa sejtréteggel, gazdag follikuláris folyadékkal és gazdag vérerekkel; A "+" jelzi a növekvő tüszőket, az érett tüszőket és a sárgatestet, de az érett tüszők és a sárgatestek száma kicsi. , a tüszők kisebbek, a granulosa sejtek kevésbé rétegzettek; A "++" érett tüszőket és a sárgatestet mutathat, több sárgatesttel, kevesebb granulosa sejttel és kevesebb vérerrel; A "+++"-nek nincsenek tüszői, több sárgatest, és a petefészek Atrófiás, érrendszeri.

A Ridit-teszt után a 19. táblázatból látható, hogy a vak csoporthoz képest a modellcsoport patkányainak petefészkei jelentős patológiás szöveti elváltozásokat mutattak (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 A csecsemőmirigyre és a lépszövet morfológiájára gyakorolt ​​hatások perimenopauzás modellpatkányokban

Mérje meg mikrométerrel a csecsemőmirigy-kéreg legvastagabb és legkeskenyebb részének vastagságát minden egyes kísérleti csoportban az egyes patkányok csecsemőmirigyének legkeskenyebb részének vastagságát, hogy megkapja az átlagot; Használja a mikrométer alapvonalát, hogy a lépcsomókra essen, mérje meg a lépcsomók vastagságát mindkét oldalon. a központi artériával a központtal, és számítsa ki az átlagot. A mért eredményeket a 20. táblázat és a 24. ábra mutatja.

A 20. táblázatból és a 24. ábrából látható, hogy a vak csoporthoz képest a thymus cortex vastagsága és a lépcsomók térfogata szignifikánsan csökkent a modellcsoportban (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).