Az immunglobulin G expressziója humán proximális tubuláris epiteliális sejtekben

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

ZHENLING DENG et al

Absztrakt. Proximáliscső alakúhámsejtek (PTEC-ek) veleszületett immunjellemzőkkel rendelkeznek, és proinflammatorikus faktorokat, kemokineket és komplementkomponenseket termelnek, amelyek elősegítik az epiteliális-mezenchimális átmenetet (EMT). Korábbi vizsgálataink azt mutatták, hogy a humán mesangiális sejtek és a podociták képesek voltak immunglobulin (Ig)A és IgG szintetizálására és szekretálására. Jelen tanulmány célja az Ig expressziójának értékelése volt a PTEC-ekben. Először az IgG-t a citoplazmában, a sejtmembránban és a lumenben mutatták kiPTEC-eka normál vesekéregben azáltalimmunhisztokémia. Másodszor, az Ig gén transzkripcióját és a V(D)J rekombinációt egyetlen PTEC-ben detektáltuk Nesd PCR és Sanger szekvenálás segítségével. Harmadszor, az Ig-t, Igκ-t és Igλ-t egyértelműen kimutatták egy immortalizált PTEC-vonalban (HK-2) immunfestéssel és Western-blot-vizsgálattal, amelyben RP215-öt (olyan antitest, amely túlnyomórészt nem B-sejt-eredetű IgG-hez kötődik) használtak. Ezenkívül az Ig, Igκ és Igλ géntranszkriptumok, a konzervatív V(D)J rekombináció az Ig variábilis régióban, a rekombinációt aktiváló gén 1/2 és az aktiváció által kiváltott citidin-deamináz egyaránt kimutatható volt a HK-2 sejtekben. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a PTEC-k a B-sejtekhez hasonló módon expresszálhatnak IgG-t. Ezenkívül az IgG expresszióját a TGF-1 szabályozta, és részt vehet az EMT-ben.

Kulcsszavak:proximáliscső alakúhámsejtek, egysejtű, HK-2, IgG, epiteliális-mezenchimális átmenet

A Cistanche tubulosa megelőzi a vesebetegséget, kattintson ide a mintaért

Bevezetés

Proximáliscső alakúhámsejtek (PTEC-ek) a legelterjedtebb sejttípus aveseés fontos szerepet játszanak a vese helyreállításában és/vagy a krónikus vesebetegségek progressziójában. A PTEC-ek immunológiai funkciókat fejtenek ki több Toll-szerű receptor (TLR), például TLR 1, 2, 3, 4 és 9 (1,2), valamint antigénprezentáló sejtfunkcióval kapcsolatos molekulák, köztük MHCII, CD74, CD80 expresszálásával. és CD86 (3). A PTEC-ek ezek a veleszületett immunjellemzők lehetővé teszik számukra, hogy immunválaszként működjenek az ingerek széles skálájára, és ennek következtében bioaktív mediátorok termelődjenek és felszabaduljanak, beleértve a proinflammatorikus citokineket, kemokineket és komplementkomponenseket, amelyek intersticiális gyulladást és fibrózist okoznak (4). A PTEC-ek újszülöttkori Fc-receptorokat is expresszálnak, és megőrzik az immunglobulin (Ig)G specifikus pH-függő kötődési és transzcitózisának képességét (5). Legjobb tudomásunk szerint azonban továbbra sem ismert, hogy a PTEC-ek expresszálnak-e Ig-t.

Korábban azt feltételezték, hogy az Ig-eket kizárólag érett B-sejtek és plazmasejtek termelik, és az Ig-ek antitestként működnek a különféle kórokozók felismerésére és semlegesítésére. Ezt az elméletet azonban megkérdőjelezték az elmúlt évtizedekben, mivel egyre több bizonyíték számolt be arról, hogy Ig-eket, köztük IgA-t, IgG-t és IgM-et nem B-sejtek, például humán hámráksejtek is képesek előállítani és kiválasztani (6,7) és normál nem B-sejtek (8, 9), valamint az immunrendszer által védett helyeken, mint például a szem (10), a központi idegsejtek (11, 12), a placenta (13), valamint a here és a mellékhere (14)

A B-sejt-eredetű Ig-ekhez (B-Ig-ekhez) hasonlóan a nem B-Ig-k is az Ig-gén transzkripciójának és átrendeződésének termékei, és klasszikus V(D)J-rekombinációs mintákat mutatnak be nukleotid-addíciókkal a csomópontokban és szomatikus hipermutációkkal (7, 11,14). A B-Ig-ekkel ellentétben a nem B-Ig-ek korlátozott V(D)J rekombinációs mintázatot és kisebb diverzitást mutatnak (7). Funkcionálisan a nem-B-Ig-ek nemcsak természetes antitestaktivitást fejtenek ki a bőrben és a nyálkahártyában (8), hanem növekedési faktorként is működhetnek a sejtproliferáció és adhézió elősegítése érdekében, valamint fokozhatják a rák kialakulását és metasztázisát az integrinekhez való kötődés révén (8). 15-17). Például az RP215 által felismert rákos IgG úgy hajtja végre onkogén funkcióját, hogy kölcsönhatásba lép az integrin 6 4 komplexszel, és aktiválja a FAK és Src útvonalakat (15).

Korábbi vizsgálatunk kimutatta, hogy a mezangiális sejtek (18) és a podociták (19) képesek IgA-t és IgG-t szintetizálni és kiválasztani, valamint részt vesznek a sejtnövekedésben és a sejtadhézióban in vitro. A jelen tanulmány célja az Ig-ek expressziós szintjének értékelése volt a PTEC-ben, és megvizsgálta az epiteliális-mezenchimális átmenetben (EMT) betöltött lehetséges szerepét.

A cisztanche hatásai: a vese előnyei

Anyagok és metódusok

Sejttenyésztés és kezelés.Az American Type Culture Collection-től vásároltunk egy megörökített PTEC-vonalat, a HK-2-t. A HK-2 sejteket DMEM/F12-ben tenyésztettük, kiegészítve 100 U/ml penicillinnel, 0,1 mg/ml sztreptomicinnel (valamennyi Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) és 10% magzati szarvasmarha-szérummal (FBS; Ausztrál eredetű; Biological Industries USA, Inc.) 37 °C-on, 95 százalék levegőt és 5 százalék CO2-t tartalmazó atmoszférában. Az Ig FBS-ben való interferenciájának elkerülése érdekében a tápközeget szérummentes táptalajra cserélték 24-48 órával a sejtgyűjtés előtt. A HK-2 sejteket különböző koncentrációjú (2, 5 és 10 ng/ml) TGF-1-gyel (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) kezelték.

Egyetlen PTEC izolálás és cDNS szintézis.Makroszkóposan normális kérgi szövetből humán vesemintát vettünk egy olyan betegtől (31 éves férfi), aki vesekarcinóma következtében nefrektómián esett át, nyilvánvaló veseműködési zavar nélkül. Egysejtes szuszpenziót készítettünk a vesekéreg 1 mg/ml kollagenáz I-gyel (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) történő emésztésével 37 °C-on 2 0 percig. A PTEC-eket fikoeritrin (PE) konjugált anti-CD10 (kat. szám 312203) és allophycocyanin (APC) konjugált anti-CD13 (kat. sz. 301705; mindkettő BioLegend, Inc.) segítségével fluoreszcenciával (aktivált sejtválogatással) válogattuk. BD FACSAria II Special Order System) a korábban leírtak szerint (20). A megfelelő izotípus kontroll antitesteket (kat. szám: 400111 és 400119; mindkettő BioLegend, Inc.) használtuk a nem specifikus festődés kizárására. A kettős pozitívan jelölt élő sejteket PTEC-ként izoláltuk. Egyetlen PTEC-t manuálisan választottunk ki fordított fénymikroszkóp alatt kapilláris pipettával, majd egy 0,2 ml-es vékonyfalú PCR-csőbe vittük át, amely lízispuffert tartalmazott (21). Az egyszeri PTEC RNS extrakciót és a cDNS szintézist a korábban leírt módszerek szerint végeztük (21). Összesen öt egyedi PTEC-t használtunk az Ig gén transzkripciójának és átrendeződésének kimutatására.

PCR amplifikáció.A teljes RNS-t HK-2 sejtekből, a perifériás vér mononukleáris sejtjéből vonták ki [PBMC-k, amelyeket egy 31 éves egészséges női donortól izoláltak Ficoll (kat. sz. 7111011; Dakewe Biotech., Ltd.) segítségével. ] és a vesekéreg (ugyanattól a betegtől származik, amelyet egyetlen PTEC-izolációban használtak) TRIzol® reagenssel (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), az RNS-koncentrációt pedig NanoDrop spektrofotométerrel (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc.) határoztuk meg. . Ezt követően 2 µg teljes RNS-t fordítottunk át cDNS-vé a RevertAid First Strand cDNS Synthesis kit (kat. sz. K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.) segítségével. A PCR-t az Ig, Igκ, Igλ és az aktiváció által kiváltott citidin-deamináz (AID) konstans régióit célzó primerekkel végeztük. A beágyazott PCR-t az Ig, az alacsony sűrűségű lipoprotein receptorhoz kapcsolódó protein 2 (LRP2), valamint a rekombinációt aktiváló gén (RAG)1 és RAG2 variábilis régiójának amplifikálására végezték. A PCR-termékeket elektroforézissel 1,0%-os agarózgélen választottuk el, és GelRed (kat. szám: 41003; Biotium, Inc.) alkalmazásával tettük láthatóvá. A vizsgálatban használt AID, RAG1/2 primerek és az Ig, Igκ, Igλ konstans régiói a Jing és munkatársai által használt primerekre vonatkoznak (19). Az Ig variábilis régió primerjei a van Dongen és munkatársai által használt primerekre vonatkoznak (22). A PCR-hez használt többi primert az SI táblázat tartalmazza. A termociklusos körülményeket a SII. táblázat tartalmazza.

Sanger szekvenálás és a szekvenálási adatok elemzése.Az egyedi PTEC-ekből, HK-2 sejtekből és PBMC-kből nyert Ig variábilis régió PCR-termékeit pGEM-T Easy Vector System I-be (kat. sz. A1360; Promega Corporation) klónozták, amelyet transzformáltak. TOP10 kompetens sejtekbe (CB104; Tiangen Biotech Co., Ltd.). Röviden, 5 µl ligációs terméket adtunk 30 µl TOP10 kompetens sejtekhez, 30 percig jégen inkubáltuk, 90 másodpercig 42 °C-on hősokkoltuk, és jégen 5 percig inkubáltuk. Ezután 500 µl LB-t adtunk hozzá, és 37 °C-on 40 percig állni hagytuk, majd a bakteriális folyadék egy részét 0,1 mmol/l IPTG-vel és 20 µg/ml X-Gal-lal bevont Petri-csészékre oltottuk. Az edényeket egy éjszakán át 37 ˚C-on fordítottuk. Összességében mintánként 5-16 fehér telepet választottak ki véletlenszerűen, és egy ABI 3730XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) segítségével szekvenálták. Az átrendeződött V(D)J szekvenciákat összehasonlítottuk az alapvető helyi illesztési keresőeszközben (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) található szekvenciákkal, hogy azonosítsák a legjobban illeszkedő csíravonal génszegmenseket és csomópontokat a primer vágást követően. .

Western blot analízis.A HK-2 sejteket proteázgátló koktélt (Applygen Technologies Inc.) tartalmazó TSD lízispufferben [1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5, 50 mM DTT]) lizáltuk, jeges vízben 1 percig ultrahanggal kezeltük ( 5 másodpercig dolgoztunk és 15 másodpercig pihentünk; 3-szor) és 30 percig szobahőmérsékleten lizáltuk. 12, 000 xg-vel 10 percig 4 °C-on végzett centrifugálást követően a sejtlizátum fehérjekoncentrációját BCA kit (Applygen Technologies Inc.) segítségével határoztuk meg. Ezt követően 5X redukáló töltőpuffert adtunk a lizátumhoz, 100 °C-on 10 percig forraltuk, és a mintákat azonnal felhasználtuk Western blot analízishez. Az Ig pozitív kontrolljaként használt szérumot egészséges donorból izoláltuk (ugyanaz a donor, mint a PBMC-kben) centrifugálással 2103 xg-vel 10 percig szobahőmérsékleten.

A cisztanche hatásai: a vese előnyei

A Western-blotot standard eljárások szerint végeztük. Röviden, 3{{40}} µg fehérjét választottunk el SDS-PAGE-val 10%-os gélen, és nitrocellulóz membránra vittük át. Ezt követően a membránt 5 százalékos fölözött tejben blokkoltuk szobahőmérsékleten 1 órán át, és egy éjszakán át 4 °C-on elsődleges antitestekkel inkubáltuk, beleértve a nyúl anti-humán Ig-t (kat. sz. ab109489; 1:1, {{8} }), nyúl anti-humán Ig 4 (kat. sz. ab109493; 1:1, 000), anti-Igκ (kat. sz. ab124727; 1:10, 000), anti- Igλ (kat. sz. ab124719; 1:20,000), nyúl anti-humán-aktin (kat. sz. ab8227; 1:2, 000) (mind az Abcam-től) és RP215 monoklonális antitest (mAb) (Xiaoyan Qiu professzor adományozta, Pekingi Egyetem, Peking, Kína; 1:1, 000), amely specifikusan azonosított egy szénhidrát-asszociált epitópot a nem-B-Ig-n. A membránt ezután kecske antinyúl (kat. sz. 926-32211) vagy antiegér (kat. sz. 926-32210) IgG-IRDyeTM680CW másodlagos antitestekkel inkubáltuk (mindkettő 1:10, 000); mindkettő LI-COR Biosciences) szobahőmérsékleten 1 órán át. A jelet az Odyssey Imaging rendszer és az Odyssey V3.0 szoftver (mindkettő LI-COR Biosciences) segítségével észlelték. Az ImageJ szoftvert (1.8.0-s verzió; National Institutes of Health) használtuk a félig mennyiségi meghatározásához.

IgG tisztítás és tömegspektrometria.Miután a HK-2 sejteket DMEM/F12-ben, FBS nélkül 48 órán át tenyésztettük, a tenyészet felülúszóját összegyűjtöttük, miután 2,103xg-vel 10 percig, 4 °C-on centrifugáltuk. A sejtfelülúszót affinitáskromatográfiával tisztítottuk protein G Sepharose alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint (kat. sz. 17-0618-02; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Az eluenst ultraszűrtük, hogy az eluáló puffert (0,1 M glicin; pH 2,4) PBS-re cseréljük. A tisztított fehérjéket SDS-PAGE-val 10 százalékos gélen választottuk el, Western-blot-eljárással detektáltuk, majd tömegspektrometriával tovább elemeztük, amelyet a Beijing Protein Innovation Co., Ltd. végzett.

Immunfluoreszcencia.A HK-2 sejteket fedőlemezeken tenyésztettük, amelyeket hideg, hígítatlan acetonban 5 percig szobahőmérsékleten rögzítettünk. Ezt követően a lemezeket kétszer mostuk PBS-ben, és 5%-os FBS/PBS-sel blokkoltuk szobahőmérsékleten 20 percig, majd egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk őket elsődleges antitestekkel. Az antitestek megegyeztek a Western blotnál használtakkal: nyúl anti-humán Ig (1:150), anti-humán Igκ (1:250), anti-humán Igλ (1:250) és RP215 mAb (1:200). ); Negatív kontrollként PBS-t használtunk. PBS-ben történő mosás után a lemezeket fluoreszcein-izotiocianáttal jelölt kecske anti-nyúl (kat. sz. A11008) vagy kecske anti-egér (kat. sz. A11001) IgG antitestekkel (1:1, 000) inkubáltuk; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) szobahőmérsékleten 1 órán át. A sejtmagokat DAPI-val festették meg. A képeket Leica DFC300 FX fluoreszcens mikroszkóp alatt (Leica Microsystems GmbH) rögzítettük.

Immunhisztokémiai festés.Pararákos vesekéregeket négy vesekarcinómában szenvedő férfi betegtől (38-49 év közötti) gyűjtöttek. A nephrectómia után a normál paracancerosus vesekéregeket 10 százalékos formalinnal fixáltuk 48 órán át szobahőmérsékleten, majd paraffinba ágyaztuk. A paraffinba ágyazott humán vesemintákat 3 µm-es metszetekre vágtuk, majd paraffinmentesítettük és rehidratáltuk egy sor fokozatos etanolkoncentrációval. Az antigén kinyerését 0.05 M Tris-EDTA-ban (pH 9,0) gyorsfőzőben történő forralással végeztük 3 percig. A metszeteket ezután 3 százalékos H2O2-oldattal 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk az endogén peroxidáz eltávolítása érdekében, majd normál kecskeszérummal (kat. szám: ZLI-9022, ZSGB-BIO, Kína) inkubáltuk 30 percig szobahőmérsékleten, hogy blokkoljuk a nem specifikus sejteket. antitestkötő helyek szobahőmérsékleten. Ezt követően indirekt immunhisztokémiai festést végeztünk elsődleges antitestekkel 4 ˚C-on egy éjszakán át, beleértve az RP215 mAb-t (1:200; 5 µg/ml), nyúl anti-humán Ig-t (1:2, 000), anti-humánt. Igκ (1:1,000), anti-humán Igλ (1:1,000) (ugyanazok az antitestek, mint a Western blottingban). Primer antitestek nélküli metszeteket használtunk negatív kontrollként. A tárgylemezeket ezután hígítatlan torma-peroxidázzal jelölt másodlagos antitestekkel (kat. sz. PV-6001 és PV-6002; mindkettő OriGene Technologies, Inc.) szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltuk. A megkötött antitesteket diaminobenzidin alkalmazásával detektáltuk. Végül a tárgylemezeket hematoxilinnel ellenfestettük. A képeket fénymikroszkóppal (200-szoros nagyítás) rögzítettük. Statisztikai elemzés. Az adatokat átlag ± szórás formájában mutatjuk be, és az SPSS 20.0 for Windows (IBM Corp.) segítségével elemeztük. Minden kísérletet háromszor megismételtünk. A több csoport közötti különbségeket egyutas ANOVA és Tukey posthoc teszt segítségével elemeztük. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

A cisztanche hatásai: a vese előnyei

Eredmények

IgG expresszió a vesekéreg vese tubuláris epiteliális sejtjeiben.A vesesejtes karcinóma következtében nefrektómián átesett donoroktól gyűjtött normál vesekéregeket használták az IgG expresszió meghatározására a vese tubuláris epiteliális sejtjeiben immunhisztokémiával, humán Ig, Igκ, Igλ és RP215 elleni antitestek felhasználásával (olyan antitest, amely túlnyomórészt nem B-IgG-hez kötődik). Az IgG nehéz és könnyű láncok pozitív festődése nemcsak a PTEC-ekben volt kimutatható, hanem a disztális, csavarodott tubulus epiteliális sejtekben is, akár a citoplazmában, akár a sejtmembránban, akár a tubuláris lumenben (1. ábra).

Az IgG transzkripciója és V(D)J rekombinációja egyetlen PTEC-ben. Annak elkerülése érdekében, hogy a vesekéregben a PTEC-k ne zavarják a maradék vért, az IgG kötődését és transzcitózisát, valamint hogy közvetlen bizonyítékot kapjunk az IgG expressziójára a PTEC-ekben, az egyes PTEC-eket a humán vesekéregből válogattuk ki CD10 és CD13 együttes jelöléssel áramlással. citometria (20). Amint az a 2A. ábrán látható, a CD10/CD13 kettős pozitív PTEC-ek az életképes sejtek 4,1 százalékát tették ki a mintában. Az izolált PTEC-eket tovább erősítették az LRP2 specifikus markergénnel, és a B-sejt-szennyeződést a CD19 eliminálta. Az Ig variábilis régió transzkriptumokat öt egyedi PTEC-ben amplifikáltuk beágyazott PCR-rel (2B. és C. ábra). A Sanger szekvenálási eredmények azt mutatták, hogy a PTEC-k funkcionális és konzervatív VDJ rekombinációt mutattak az IgG nehéz láncban (I. táblázat), ami azt jelzi, hogy IgG expresszió előfordulhat PTEC-ekben.

IgG nehéz és könnyű lánc expressziója HK-2 sejtekben. Mivel nehéz volt kimutatni az IgG fehérje expresszióját egyetlen PTEC-ben, és elegendő PTEC-t szerezni a Western blottinghoz, az immortalizált PTEC-ekből álló HK-2 sejtvonalat választottuk ki az IgG fehérje expressziójának további megerősítésére. Az immunfluoreszcencia analízis kimutatta az Ig, Igκ és Igλ pozitív festődését a citoplazmában, és az RP215 erősebb pozitív festődését, főleg a citoplazmában és a sejtmembránban (3A. ábra).

Ezt követően az IgG nehéz és könnyű láncok expresszióját a HK-2 sejtekben redukáló körülmények között végzett Western blottal detektáltuk. A tápközegben az FBS-interferenciának kiküszöbölésére az FBS-t tartalmazó tápközeget a megfelelő antitestekkel blottoltuk, és negatívnak festettük. Egy kereskedelmi forgalomban lévő IgG antitest képes volt kimutatni a szérumból származó IgG-t, de nem tudta kimutatni a HK-2-eredetű IgG-t. Ezzel szemben az RP215 képes kimutatni a HK-2-eredetű IgG-t, de a szérum IgG-t nem. Mind a kereskedelmi forgalomban lévő IgG antitest, mind az RP215 képes volt Ig kimutatására 55 kDa-nál. Egy Ig 4 (36 kDa) sávot észleltek a HK-2 sejtekben, ami összhangban van a megjósolt molekulatömeggel. Továbbá Igκ (25 kDa) és Igλ (50 kDa, dimer) expressziót figyeltek meg a sejtlizátumokban (3B. ábra). Ezt követően a sejtfelülúszó IgG-jét protein G-vel tisztították, Western-blot-vizsgálattal megerősítették, és tömegspektrometriával szekvenálták, ami azt mutatta, hogy az 55 kDa-os sáv az Igκ-lánc és az Ig-nehézlánc variábilis régió fragmentumait tartalmazza, a National Center for for National Center szerint. Biotechnológiai információs (NCBI) adatbázis (3C-E. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a HK-2 sejtek IgG fehérjét termeltek és szekretáltak.

IgG nehéz és könnyű láncok transzkripciója és V(D)J rekombinációja HK-2 sejtekben. Az Ig-gén-transzkripció és a funkcionális V(D)J-rekombináció az Ig expressziójának előfeltétele. Az IgG HK-2 sejtekben való expressziójának megerősítésére az Ig, Igκ és Igλ transzkriptumokat a HK-2 sejtek konstans és variábilis régióinak amplifikálásával értékelték (4A és B ábra). A konstans PCR-termékek szekvenálása nagy homológiát mutatott az NCBI adatbázisban közzétett szekvenciával. A T-A klónozás és a Sanger-szekvenálás kimutatta, hogy a HK-2 sejtekben lévő Ig konzervatív V(D)J rekombinációt mutatott VH4-4/D2-8/JH5-tel. Ezzel szemben a V(D)J rekombináció sokféleségét figyelték meg a PBMC-kben, ami kiküszöbölte a primer torzítást (II. táblázat). A B-sejtekhez hasonlóan a HK-2-eredetű IgG tipikus produktív V(D)J rekombinációt mutatott a V-D és D-J átmenettel (4C. ábra). Ezenkívül a szomatikus hipermutációkat a HK-2-eredetű Ig-ben (tartomány, 6,8-8,4 százalék) észlelték 15 hotspot motívumból 7-ben (RGYW/WRCY, W=A/T, R= A/G, Y=C/T) mutációkat mutat.

Ezenkívül AID-átiratokat (a szomatikus hipermutáció és az osztályváltás rekombinációjának alapvető eleme a B-sejtekben), valamint a RAG1-et és a RAG2-t (a V(D)J-rekombinációhoz szükséges) detektáltuk a HK-2 sejtekben (4B. ábra), ami azt jelzi, hogy a HK-2 sejtekben az Ig szintézis mögött meghúzódó mechanizmus hasonló lehet a B-sejtekéhez.

A TGF-1 fokozza az IgG expresszióját a HK-2 sejtekben. A HK-2 sejteket különböző koncentrációjú TGF-1-gyel stimulálták 48 órán keresztül. Az immunfluoreszcens festés azt mutatta, hogy a citoplazmatikus IgG fokozott pozitív festődést mutatott a kontrollcsoporthoz képest (5A. ábra). A Western-blot megerősítette, hogy az IgG-t jelentősen felfelé szabályozza a TGF-1 (P<0.05; fig.="" 5b="" and="">

A cisztanche hatásai: a vese előnyei

Vita

A jelen tanulmány kimutatta, hogy a PTEC-k IgG-t expresszáltak géntranszkripcióval és funkcionális konzervatív V(D)J rekombinációval, ami hasonló volt a nem-B-IgG-hez. A TGF-1 fokozta az IgG expressziót a HK2 sejtekben.

Annak vizsgálatára, hogy a PTEC-k expresszálnak-e IgG-t, először IgG-t mutattak ki a PTEC-ek citoplazmájában, sejtmembránjában és lumenében a normál humán vesekéregben immunhisztokémiával; az eredmények azt mutatták, hogy a PTEC-k IgG-t termeltek és szekretáltak. Ez ellentétben áll a rutin patológiai vizsgálatunkkal, ahol a PTEC-ekben nem mutattak ki nyilvánvaló IgG-t. Ennek oka lehet a nagyon gyenge PTEC festődés, amely túl alacsony volt ahhoz, hogy kimutatható legyen, különösen az immunrendszerrel összefüggő glomeruláris betegségekben, amelyekben az Ig-ek erősen pozitívak a glomerulusokban, és a PTEC festődés véletlenül, de mesterségesen elveszhet. A keringésből a PTEC-k által az Fc receptoron keresztül történő IgG transzcitózis részben kizárt volt, mivel az RP215 egyértelmű IgG festődést figyeltek meg a sejtmembránban és a citoplazmában. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a PTEC-eredetű IgG hasonló a többi nem B-IgG-hez, és egyedi glikozilált epitópjai lehetnek, amelyeket specifikusan az RP215 ismerhet fel a kereskedelmi forgalomban kapható anti-IgG antitest helyett (15). Az a megállapítás, hogy a tubuláris epiteliális sejtek csak egy része expresszál IgG-t, a különböző sejtciklusok dinamikus expressziójával magyarázható, amely hasonló volt a mezangiális sejtekből származó IgA expressziós mintázatához (18). Az IgG tubuláris markerekkel (például akvaporin 1 és akvaporin 3) történő együttes festése hasznos lenne a további vizsgálatokhoz, hogy javítsák a jelen tanulmány eredményeit.

Az egysejtű RNS szekvenálás egyértelműen megjelenítheti egy adott sejtben egy specifikus gén transzkripcióját. Az Ig-lánc és a V(D)J rekombináció transzkriptumait egyetlen PTEC-ben detektáltuk. Bár csak öt egyedi PTEC-t használtak, a folyamat szigorú volt, mivel a vesekéreget a daganattól távol gyűjtötték össze, és minden egyes sejtet áramlási citometriával osztályoztak két PTEC-specifikus markergénnel, amit egy harmadik specifikus markergén (LRP2) is megerősített. és a B-sejtes szennyeződés megszűnt. Az eredmények azt mutatták, hogy a PTEC-k nemcsak IgG gén transzkriptumokkal jelennek meg, hanem a klasszikus V(D)J rekombináció is a variábilis régióban, mint B-sejtek, mint például a V-D és D-J produktív V(D)J rekombinációja. csomópontok (4. ábra), ami azt jelzi, hogy a PTEC-k képesek IgG-t termelni. Ezenkívül a konzervatívabb V(D)J rekombináció azt illusztrálta, hogy a PTEC-k IgG géntranszkriptumokkal és V(D)J rekombinációval jelennek meg, amelyek hasonlóak más nem-B sejtekhez.

A HK-2, egy halhatatlanná tett PTEC vonal, könnyen tenyészthető nagy mennyiségben. A jelen tanulmány megerősítette az IgG fehérje expresszióját tenyésztett HK-2 sejtekben; Az IgG-t HK-2 sejtekben immunfluoreszcenciával és Western blottal is kimutatták. Az Ig 4-et, az Ig egy alosztályát szintén a megjósolt molekulatömegnek megfelelő sávméretben detektáltuk. A tömegspektrometria kimutatta, hogy a sejtfelülúszóból protein G alkalmazásával tisztított fehérje az Ig nehéz lánc variábilis régiójának és az Igκ láncnak a fragmentumait tartalmazza, ami bizonyítékot szolgáltat a PTEC-ek IgG szekréciójára. Az IgG transzkripciója a HK-2 sejtekben tovább támogatta az IgG expressziót a PTEC-ekben, és a konzervatív V(D)J rekombináció IGHV4-4/IGHD2-8/IGHJ5-tel a HK-2 sejtekben tovább támogatta az IgG jelenlétét a HK-2 sejtekben, hasonlóan. más nem B sejtekhez.

A jelen tanulmány a PTEC-k IgG-termelésének mögöttes mechanizmusát is vizsgálta a RAG1, RAG2 és AID HK-2 sejtekben történő transzkripciójának vizsgálatával. Kiderült, hogy a RAG1, RAG2 és AID átíródott a HK-2 sejtekben. Ezenkívül a RAG1, RAG2 vagy AID átiratokat korábban számos más nem-B sejtben is kimutatták, például podocitákban (19) és számos rákos sejtvonalban (23). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a nem B-sejtek, beleértve a PTEC-ket is, hasonló Ig-szintézis mechanizmussal rendelkezhetnek, mint a B-sejtek. Azonban, hogy az AID és/vagy a RAG1/2 szükséges gének a PTEC-eredetű IgG-hez, további vizsgálatokat igényel. Ezenkívül a follikuláris segítő CD4 T-sejtek fontosak a csíraközpont B-sejtek plazmasejtekké történő differenciálódásának szabályozásában, és támogatják az Ig-ek termelését (24). Nem publikált adataink felfedték, hogy a T- és B-sejt-hiányos NOD-SCID egerekben továbbra is nem B-Ig-ket mutattak ki, ami azt jelzi, hogy a nem-B-Ig-k nem függtek teljesen a T-helper sejtektől. További kutatást igényel, hogy szükség van-e T helper sejtekre a PTEC-k IgG expressziójához.

A TGF-1 kulcsfontosságú immunmoduláló szerepet tölt be az Ig termelésben. Például a TGF-1 IgA osztályváltást és szekréciót váltott ki egérlépben lévő stimulált B-sejtekben (25) és humán mandula B-sejtekben (26). McIntyre és munkatársai (27) kimutatták, hogy a TGF-1 szelektíven serkenti a lipopoliszachariddal aktivált B-sejtek IgG2b-szekrécióját, nagy valószínűséggel az IgM-ből IgG2b-osztályba való átállás indukálásával. Duan és munkatársai (28) kimutatták, hogy a TGF-1 növelte az IgA expresszióját azáltal, hogy megnövelte az Ets-1 transzkripciós faktort a hámráksejtekben. A jelen tanulmány kimutatta, hogy a TGF-1 fokozta az IgG expresszióját a HK-2 sejtekben. Tekintettel arra, hogy a HK-2 sejtekben csak IgG volt kimutatható, feltételezték, hogy a TGF-1 az Ig osztályváltástól függetlenül indukálta IgG expressziót. A TGF-1 IgG-termelésének szabályozási mechanizmusa további vizsgálatokat igényel.

A PTEC-ek fontos szerepet játszanak a tubuláris intersticiális fibrózisban az EMT révén, és a TGF-1 fő profibrotikus mediátorként működik. Jelen tanulmányban a TGF-1 hozzáadása a tenyésztett HK-2 sejtekhez növelte az IgG expressziót, ami azt jelzi, hogy a HK-2-eredetű IgG pozitívan kapcsolódhat az EMT-hez. Korábbi tanulmányok arról számoltak be, hogy a rák-IgG metasztázishoz kapcsolódik, és elősegítette az EMT-t az E-cadherin csökkentésével nyál-adenoid cisztás karcinómában (29) és tüdőrákban (30). Érdemes megvizsgálni, hogy a PTEC-eredetű IgG szerepet játszhat-e a vesetubuláris EMT-ben és az intersticiális fibrózisban olyan betegségek esetén, mint például ischaemia/reperfúziós sérülés vagykrónikus vesebetegség.

Összefoglalva, legjobb tudásunk szerint ez a tanulmány volt az első, amely kimutatta, hogy a PTEC-k képesek IgG-t expresszálni és szekretálni, a TGF-1 pedig képes fokozni az IgG-expressziót a HK-2 sejtekben. Azonban a PTEC-eredetű IgG potenciális szerepe a tubulointerstitialis fibrózisban további vizsgálatokat igényel.

A cisztanche hatásai: a vese előnyei

Finanszírozás

Ezt a tanulmányt a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (82070736, 91642109 és 81870488 sz. támogatás), a Hainani Természettudományi Alapítvány (819QN355 sz. támogatás), a Hainani Orvostudományi Egyetem Tudományos Kutatási Művelési Alapítványa (szm. támogatás) támogatta. HYPY201926), valamint az Országos Természettudományi Alapítvány kiemelt kutatási programjának kiemelt támogató projektjei (91642206 sz. támogatás).

Az adatok és anyagok elérhetősége

A jelenlegi vizsgálat során felhasznált és/vagy elemzett adatkészletek ésszerű kérésre a megfelelő szerzőtől beszerezhetők.

A szerzők hozzászólásai

Mint a megfelelő szerzők, YW és XQ tervezte és tervezte a tanulmányt. ZD részt vett a kutatás tervezésében, szövettani és egysejtes kísérleteket végzett, mintákat készített elő tömegspektrometriához, elemezte az adatokat és megírta a kéziratot. ZJ részt vett a kutatás tervezésében, a HK-2 sejtekben az IgG expressziójával kapcsolatos legtöbb kísérletben és a vonatkozó adatok elemzésében. YG, JM, HD és YL részleges sejtvonal-kísérleteket végzett. A ZC és az YP a klinikai jellemzőknek megfelelően kiválasztotta a megfelelő eseteket az egysejtű kísérletekhez. HY és ZS részt vett egysejtű kísérletekben. Az SW részt vett az immunhisztokémiai festésben, elemezte a szövetfestési adatokat, valamint elkészítette és felülvizsgálta a kéziratot. YW, ZD és ZJ megerősítette az összes nyers adat hitelességét. Minden szerző átnézte a kéziratot és felülvizsgálta az adatokat. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végső kéziratot.

Etikai jóváhagyás és hozzájárulás a részvételhez

A jelen tanulmány megfelelt a Helsinki Nyilatkozat alapelveinek, és a Pekingi Egyetemi Harmadik Kórház Orvosetikai Bizottsága jóváhagyta (S2020121 számú jóváhagyás), és a protokollnak megfelelően végezték el. Minden donor önként adományozott vesekéregeket, és írásos beleegyezését adta a vesekéregnek a vizsgálatba való adományozása előtt. Minden módszert a vonatkozó irányelveknek és előírásoknak megfelelően hajtottak végre. Ezeket a mintákat szigorúan anonimizáltuk. A humán szérumot és a PBMC-ket, amelyeket ebben a vizsgálatban pozitív kontrollként használtunk a Western-blot-vizsgálatban vagy a reverz transzkripciós-PCR-ben, egy egészséges önkéntes véréből nyertük, aki írásos beleegyezését adta a mintavételhez.

A cisztanche hatásai: a vese előnyei

Hivatkozások

1. Schlondorff DO: A progresszív vesebetegség patofiziológiájában szerepet játszó tényezők áttekintése. Kidney Int 74: 860-866, 2008.

2. Donadio ME, Loiacono E, Peruzzi L, Amore A, Camilla R, Chile F, Vergano L, Boido A, Corrieri M, Bianciotto M,et al: Toll-szerű receptorok, immunproteaszóma és szabályozó T-sejtek Henoch-Schonlein purpurában és primer IgA nephropathiában szenvedő gyermekeknél. Pediatr Nephrol 29: 1545-1551, 2014.

3. Breda PC, Wiech T, Meyer-Schwesinger C, Grahammer F, Huber T, Panzer U, Tiegs G és Neumann K: A vese proximális tubuláris hámsejtjei immunmoduláló funkciót fejtenek ki a gyulladásos CD4 plusz T-sejt válaszok ösztönzésével. Am J Physiol Renal Physiol 317: F77-F89, 2019.

4. Liu BC, Tang TT, Lv LL és Lan HY: Vesetubulussérülés: A krónikus vesebetegség hajtóereje. Kidney Int 93: 568-579, 2018.

5. Kobayashi N, Suzuki Y, Tsuge T, Okumura K, Ra C és Tomino Y: Az immunglobulin G FcRn által közvetített transzcitózisa humán vese proximális tubuláris epiteliális sejtjeiben. Am J Physiol Renal Physiol 282: F358-F365, 2002.

6. Qiu X, Zhu X, Zhang L, Mao Y, Zhang J, Hao P, Li G, Lv P, Li Z, Sun X,et al: A humán hámrákok azonosítatlan specifitású immunglobulin g-t választanak ki a tumorsejtek növekedésének és túlélésének elősegítése érdekében. Cancer Res 63: 6488-6495, 2003.

7. Zheng J, Huang J, Mao Y, Liu S, Sun X, Zhu X, Ma T, Zhang L, Ji J, Zhang Y,et al: Az immunglobulin géntranszkriptumok eltérő VHDJH rekombinációs jellemzőkkel rendelkeznek humán epiteliális rákos sejtekben. J Biol Chem 284: 13610-13619, 2009.

8. Jiang D, Ge J, Liao Q, Ma J, Liu Y, Huang J, Wang C, Xu W, Zheng J, Shao W,et al: A potenciálisan mikrobakötő aktivitással rendelkező IgG-t és IgA-t a normál emberi bőr epidermális sejtjei expresszálják. Int J Mol Sci 16: 2574-2590, 2015.

9. Zhu Z, Zhang M, Shao W, Wang P, Gong X, Ma J, Qiu X és Wang B: Immunoglobulin M, az egerek szívizomsejtjeinek új molekulája. Int. J. Biochem. Cell Biol. 88: 172-180, 2017.

10. Niu N, Zhang J, Sun Y, Wang S, Sun Y, Korteweg C, Gao W és Gu J: Az immunglobulin G és receptorainak expressziója és eloszlása ​​immun-privilegizált helyen: A szem. Cell Mol Life Sci 68: 2481-2492, 2011.

11. Huang J, Sun X, Mao Y, Zhu X, Zhang P, Zhang L, Du J és Qiu XY: Immunglobulin gén expressziója klasszikus V-(D)-J átrendeződéssel egéragy neuronjaiban. Int J. Biochem. Cell Biol. 40: 1604-1615, 2008.

12. Niu N, Zhang J, Guo Y, Zhao Y, Korteweg C és Gu J: Az immunglobulin G és receptorainak expressziója és eloszlása ​​az emberi idegrendszerben. Int J. Biochem. Cell Biol. 43:556-563, 2011.

13. Li J, Korteweg C, Qiu Y, Luo J, Chen Z, Huang G, Li W és Gu J: Az immunglobulin G két ultrastrukturális eloszlási mintázata humán placentában és funkcionális következményei. Biol Reprod 91: 128, 2014.

14. Huang J, Zhang L, Ma T, Zhang P és Qiu X: Immunglobulin gén expressziója klasszikus V-(D)-J átrendeződéssel egérherében és mellékhereben. J Histochem Cytochem 57: 339-349, 2009.

15. Tang J, Zhang J, Liu Y, Liao Q, Huang J, Geng Z, Xu W, Sheng Z, Lee G, Zhang Y,et al: A tüdő laphámsejtes karcinóma sejtek nem kanonikusan glikozilált IgG-t expresszálnak, amely aktiválja az integrin-FAK jelátvitelt. Cancer Lett 430: 148-159, 2018.

16. Cui M, You L, Zheng B, Huang X, Liu QF, Huang J, Pan B, Qiu X, Liao Q és Zhao Y: A rákos eredetű glikozilált immunglobulin G magas expressziója rossz prognózist jósol a hasnyálmirigy ductalis adenokarcinómájában. J Cancer 11: 2213-2221, 2020

17. Cui M, Hu Y, Zheng B, Zhang S, Zhang X, Wang M, Qiu XY, Liao Q és Zhao YP: Rák eredetű immunglobulin G: Új marker a differenciáldiagnózishoz és a relapszus előrejelzéséhez mellékpajzsmirigy carcinomában. Clin Endocrinol (Oxf) 92: 461-467, 2020.

18. Deng H, Ma J, Jing Z, Deng Z, Liang Y, AL, Liu Y, Qiu X és Wang Y: Az immunglobulin A expressziója humán mezangiális sejtekben és hatásai a sejt apoptózisára és adhéziójára. Mol Med Rep 17: 5272-5282, 2018.

19. Jing Z, Deng H, Ma J, Guo Y, Liang Y, Wu R, AL, Geng Z, Qiu X és Wang Y: Az immunglobulin G expressziója humán podocitákban, valamint szerepe a sejt életképességében és adhéziójában. Int J Mol Med 41: 3296-3306, 2018.

20. Van der Hauwaert C, Savary G, Gnemmi V, Glowacki F, Pottier N, Bouillez A, Maboudou P, Zini L, Leroy X, Cauffiez C,et al: Primer proximális tubuláris epiteliális sejtmodell izolálása és jellemzése humán veséből CD10/CD13 kettős jelöléssel. PLoS One 8: e66750, 2013.