A farneziltranszferáz gátló LNK{0}} enyhíti az axonális disztrófiát és csökkenti az amiloid patológiát egerekben 2. rész

Az idegsejtek élő képalkotása

Az élő képalkotó kísérletekhez a neuronokat a fentiek szerint készítettük elő, és 35 mm-es üvegfenekű edényekbe (MatTek # P35G-1.5-14C) 7 napig tenyésztettük. Ezután 10 nM LNK-754-t vagy lonafarnibot adtunk a kondicionált táptalajhoz, és a kontrolltenyészeteket DMSO-val kezeltük hordozóként. 48 órás kezelés után a tápközeget kondicionált táptalajra cseréltük kezeletlen párhuzamos neuronlemezekről. 25 nM LysoTracker-Green DND-26-t (#L7526, Invitrogen) adtunk a kondicionált tápközeghez, és a neuronokat 30 percig 37 fokon inkubáltuk.

A neuronok az idegrendszer fontos részei, amelyek képesek információt fogadni, feldolgozni és továbbítani, és az emberi intelligencia és viselkedés anyagi alapjai. Az immunitás fontos garancia arra, hogy az emberi szervezet ellenálljon a betegségeknek. Képes azonosítani és elpusztítani a kórokozókat és a kóros sejteket, valamint megőrizni a szervezet egészségét.

A kutatások azt mutatják, hogy szoros kapcsolat van a neuronok és az immunrendszer között. A neuronok különféle neurotranszmitterek, például noradrenalin, epinefrin, stb. felszabadításával befolyásolhatják az immunrendszert. Ezek a neurotranszmitterek megváltoztathatják az immunsejtek aktivitását, fokozhatják az immunsejtek szaporodását és működését, valamint javíthatják a szervezet immunitását. Ugyanakkor az immunrendszer különböző utakon keresztül is befolyásolhatja a neuronok működését. Az immunsejtek különféle citokineket és hormonokat tudnak kiválasztani, amelyek az immunpályákon keresztül befolyásolják a neuronok növekedését, fejlődését és működését.

Ezenkívül pszichológiai és szociális tényezők befolyásolhatják az immunitást és a neuronális működést. Az olyan negatív érzelmek, mint a stressz, a szorongás és a depresszió, hátrányosan befolyásolhatják az immunrendszert és a neuronokat, csökkentve a szervezet immunitását. A pozitív érzelmek, a pozitív társas kapcsolatok és az egészséges életmód elősegítheti az immunitás és a neuronok egészséges fejlődését.

Összefoglalva, interaktív és egymást támogató kapcsolat van a neuronok és az immunitás között. A mentális egészség megőrzése, az élet pozitív szemlélete és a helyes életmód elfogadása elősegítheti a szervezet immunitását és a neuronok egészséges fejlődését. Látható, hogy javítanunk kell a memóriánkat. A Cistanche deserticola jelentősen javíthatja a memóriát, mert a Cistanche deserticola szabályozhatja a neurotranszmitterek egyensúlyát is, például növeli az acetilkolin és a növekedési faktorok szintjét. Ezek az anyagok nagyon fontosak a memória és a tanulás szempontjából. Emellett a hús javíthatja a vérkeringést és elősegítheti az oxigénszállítást is, ami biztosítja, hogy az agy elegendő tápanyagot és energiát kapjon, ezáltal javítva az agy vitalitását és állóképességét.

Kattintson az ismerje meg az agyműködés javításának módjait

A neuronok time-lapse képalkotását Ti2 széles látómezős mikroszkóp segítségével végeztük. A képalkotás 30 percnél azonnal megkezdődött, és legfeljebb 30 percig folytatódott. 1-s expozíciót percenként készítettünk, és tányéronként 30 percen belül 20–30 különálló területről készült felvétel. A LysoTracker részecskék távolságának és sebességének mennyiségi meghatározását, valamint a kimográf elemzéseket NIS Elements szoftverrel végeztük, és az alábbiakban részletesen ismertetjük. Külön kísérletekben 1 μM Lysosensor-Green DND{10}}-t (#L7535, Invitrogen) adtunk a kondicionált tápközeghez, és az élő neuronokról legfeljebb 15 percig rögzített képeket készítettünk Nikon A1 konfokális mikroszkóppal, 60-szoros objektívvel. (NA 1.4) és NIS Elements szoftver.

Az agyszövetek élő képalkotása

{{0}}hónapos 5XFAD egereket intraperitoneálisan injektáltunk naponta 3 héten keresztül, majd a kezelés befejeztével az egereket elaltattuk, és 1 M KCl-t, 1 M MgCl2-t, 0,1 mM kinurenátot tartalmazó oldattal perfundáltuk. , 0,01 mM DL-2-Amino-5-foszfonopentánsav, 5 mM glutation, 25 mM glükóz, 125 mM NaCl, 1,4 mM NaH2PO4 és 25 mM NaHCO3.

Az agyakat ezután gyorsan feldaraboltuk jéghideg, oxigénnel dúsított ACSF-ben, amely 2,5 mM KCl-t, 85 mM NaCl-t, 1,25 mM NaH2PO4-ot, 25 mM NaHCO3-ot, {{10}},5 mM CaCl2-t, 4 mM 4 MgCl2, crose-t, 5 mM glükózt, 5 mól/l-es cukrot tartalmaz. 50uM C6H7NaO6, 0,1 mM kinurenát, 0.01 mM DL-2-Amino-5-foszfonopentánsav és 5 mM glutation. A 300 μm-es koronális szeleteket Compresstome VF-200 vibrációs mikrotom segítségével (Precision Instruments) hoztuk létre, és 30 percig pihentetjük 32 fokon a következő 2,5 mM KCl-t, 85 mM NaCl-t, 1,2PO45 mM NaH-t tartalmazó oxigénezett ACSF-oldatban. 25 mM NaHCO3, 0,5 mM CaCl2, 4 mM 4 MgCl2, 75 mM szacharóz, 25 mM glükóz, 50 mM C6H7NaO6, 0,1 mM kinurenát, 0,01 mM DL2-Amino-feno{5,9-nótatonsav{58

A szeleteket ezután 35 mm-es üvegfenekű edényekre (MatTek # P35G-1.5-14C) helyeztük át, amelyek oxigénnel dúsított ACSF-et tartalmaztak 25 nM LysoTracker-Greennel és 1:10,{8}} hígítással 1 mg/ ml Tiazin Red (#S570435, Sigma Aldrich), amely egyébként megegyezett a felépülési időszakban használt ACSF-vel. A szelet életképességét a szövetek időzített leképezésével igazoltuk. A szeleteket LysoTracker-Green-nel és Tiazin Red-nel 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd a kérgi agyi régiókat azonnal leképeztük ugyanabban az oldatban 32 fokban Nikon A1 konfokális mikroszkóppal 60X objektívvel (NA 1.4) és NIS Elements szoftverrel. legfeljebb 30 perc.

Agykivonás és immunblot

Az egereket xilazin (15 mg/kg) és ketamin (100 mg/kg) intraperitoneális injekciójával érzéstelenítettük, foszfáttal pufferolt sóoldattal (1XPBS) és fenil-metil-szulfonil-fluoriddal (20 ug/ml) perfundáltuk. leupeptin (0,5 ug/ml), nátrium-ortovanadát (20 μM) és ditiotreitol (0,1 mM), majd az agy eltávolítása. A fehérje extrakcióhoz használt összes puffer proteáz inhibitor koktél III-at (#535140, Millipore) és Halt-foszfatáz inhibitort (#78420, Thermo Fisher Scientific) tartalmazott. A hemiagyszöveteket lemértük és manuálisan homogenizáltuk 1:10 (w/v) dounce homogenizátor segítségével 1XPBS-ben.

A homogenizálás után a lizátumokat 20,8{{10}}0g-vel centrifugáltuk 30 percig 4 fokon. Az oldható frakciót (felülúszót) eltávolítottuk, és a pelletet pipettával újraszuszpendáltuk radioimmunprecipitációs vizsgálati (RIPA) pufferben [50 mM Tris, 0,15 M NaCl, 1% oktil-fenoxi-polietoxietanol (IGEPAL), 1 mM EDTA, 0,5 és 0,0 mm EDTA, 0,0 mm. % nátrium-dezoxikolát pH 8-on], hogy jégen 30 percig inkubáljuk.

A mintákat ultrahanggal kezeltük (Misonix XL{{0}}) 20 másodpercig jégen, majd centrifugáltuk 20 800 g-vel 30 percig 4 fokon. A RIPA-ban oldható frakciót (felülúszót) eltávolítottuk, és a pelletet 5 M guanidinben (pH 8,0) újraszuszpendáltuk az oldhatatlan fehérjék elemzéséhez. Mindegyik mintát 20 másodpercig ultrahanggal kezeltük jégen, 1 órán át szobahőmérsékleten forgattuk, majd 20 800 g-vel 30 percig 4 fokon centrifugáltuk. A bicinkoninsav (BCA) vizsgálatot (#23225, Thermo Fisher Scientific) alkalmaztuk az egyes minták fehérjekoncentrációjának mérésére.

A Western-blotokhoz minden mintából 20 ug fehérjét töltöttünk 4-12%-os NuPAGE (Invitrogen) gélekre, és MOPS pufferrel elválasztottuk redukált és denaturált körülmények között. A fehérjéket polivinilidén-difluorid membránra vittük át, és Pierce ECL (fokozott kemilumineszcencia; Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával fejlesztették ki. A kifejlesztett jeleket ProteinSimple FCR (FluorChem R) segítségével vizualizáltuk, majd az ezt követő kemilumineszcens jeleket AlphaView szoftverrel (ProteinSimple) kvantifikáltuk. Az összes blotot a Local Background Correction eszközzel elemeztük, kivéve a HDJ-2 blotot, amelyet a Háttérhivatkozás eszközzel, a Multi-regional Background Correction (AlphaView szoftver) funkcióval együtt elemeztünk.

42-es ELISA

Az A 42 mérésére 5XFAD egerek hemibrain homogenizátumaiban a kereskedelemben kapható Enzyme-Linked Immunosorbent-Assay (ELISA) (Thermo Fisher Scientific, KHB3441) segítségével a gyártó utasításait követve analizálták a guanidint és a PBS-ben oldható A 42-t hemibrainokban. Az A 42 mérésére hAPP/PS1 egerek agyában a kereskedelemben kapható ELISA-t (h amiloid 42 ELISA nagy érzékenység, Te Genetics Company, Zürich, Svájc) alkalmaztuk. Az ELISA-t a gyártó protokollja szerint végeztük.

Egér agyszövet immunfluoreszcencia

A perfúziót követően az agyakat extraháltuk, és a félagyakat 10%-os formalinban fixáltuk, majd 30%-os szacharózoldatban 1XPBS-ben mélyhűtöttük. Fagyasztó csúszó mikrotomot használtunk a 30-μm-es koronális vagy szagittális metszetek begyűjtésére. A metszeteket sorozatosan egy 12-lyuk lemezre helyeztük fagyvédő oldatban (1xPBS, 30% szacharóz és 30% etilénglikol), és felhasználásig -20 fokon tároltuk. Az immunfluoreszcens festést úgy végeztük, hogy először a metszeteket háromszor 1XTBS-ben mostuk, majd 16 mM glicinben 1XTBS-ben inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. 3 további 1XTBS-es mosás után a metszeteket blokkoltuk 5% kecskeszérumban 0,25% Triton X{18}}-ban 1XTBS-ben 2 órán át szobahőmérsékleten.

A metszeteket ezután egy éjszakán át primer antitestekben inkubáltuk 0,25% Triton X-100, 1% marhaszérum albumin és 1XTBS oldatában 4 fokon. A másodlagos immunfestést ezután szamár AlexaFluorral jelölt másodlagos antitestekkel végeztük 1:1000 koncentrációban (Thermo Fisher Scientific). A ProLong Goldot (#P36934, Thermo Fisher Scientific) használták a metszetek rögzítésére, mielőtt egy Ti2 széles látómezős mikroszkóppal vagy egy Nikon A1 lézer pásztázó konfokális mikroszkóppal leképeztek volna a kép mennyiségi meghatározásához a Nikon NIS Elements szoftver segítségével.

Az összes felvételi beállítás ugyanaz maradt a genotípusok között, és az összes képet ugyanazon a képalkotási perióduson belül készítették az egyes kísérletekhez (Northwestern University Center for Advanced Microscopy és Nikon Imaging Centre).

Kép számszerűsítése

Egér agy

Az egér agyszövet immunfestésének immunfluoreszcenciás kvantifikálását állatonként 3-5 metszeten végeztük, körülbelül -0,94 és -2,55 mm közötti Bregma-koordinátákkal, amelyeket 10-szeres objektívvel készítettek Ti2 széles látómezős mikroszkópon. A mennyiségi elemzéseket, beleértve a méret és az intenzitás küszöbértékeit is, a Nikon NIS-Elements Software (Northwestern University Nikon Imaging Center) segítségével végeztük.

A jeltől függően az Általános Analysis eszközzel küszöbértékeket állítottak be az objektum mérete, alakja és kontrasztja alapján, majd bináris maszkokat hoztak létre minden egyes csatornához és érdeklődési területhez. A küszöbértéket minden csatornán külön-külön végezték el, hogy a jel-zaj arány optimalizálásával és a nem specifikus háttérjelek kiiktatásával izolálják az érdeklődésre számot tartó jeleket. A LAMP1, BACE1 vagy LysoTracker-Green fedett terület kiszámításához, valamint a LAMP1 és Lysosensor fluoreszcencia intenzitás méréséhez az elsődleges neuronokban, az érdeklődésre számot tartó régiókat manuálisan követtük nyomon NIS-Elements segítségével, és minden egyes érdeklődésre számot tartó régióhoz bináris réteget hoztak létre.

A LAMP1 és az A 42 arányának kiszámításához a disztrófiás neuritokban lévő LAMP1 területét az A 42 területére normalizáltuk egyedi plakk alapon, és számszerűsítettük a kezelt csoportok közötti egérenkénti átlagos arányokat. A BACE1 és LAMP1 Pearson-féle korrelációs koefficiens-analízisét NIS-Elements segítségével végezték el plakkonkénti alapon, 30 μm-es Z-stack képek maximális intenzitású vetületein, amelyeket Nikon A1 lézer pásztázó konfokális mikroszkóppal készítettek 1 μm lépésmérettel.

A LysoTrackerGreen és a Tiazin vörös arányának kiszámításához a LysoTracker-Green területét a disztrófiás neuritokban a Tiazine Red területére normalizáltuk egyedi plakk alapján, és az egerenkénti átlagos arányt számszerűsítettük a kezelési csoportok között. A körülbelül –1,70 és –2,55 mm közötti Bregma-koordinátáktól számított négy koronális metszetet használtunk az egyes jelek területének vagy intenzitásának kiszámításához az egyes agyi régiókban minden egér esetében. A lepedékkel borított terület és a plakk méretének elemzését a Bregma-koordináták körülbelül -0,94 és -2,55 mm közötti átlagos öt metszetének felhasználásával végeztük el. A metszet kiválasztását, a képfelvételt, a képkövetést és a kvantifikációt a kezelt csoportokra és genotípusokra vak személy végezte.

Elsődleges neuronok

A LAMP1 immunfestődés számszerűsítéséhez fix egér primer neuronokban a szómákat manuálisan nyomon követtük a morfológia alapján NIS-Elements segítségével, és bináris maszkot készítettek minden egyes érdeklődésre számot tartó régióhoz és csatornához. A küszöbértéket a LAMP1 jelek optimalizálására és a LAMP1 megkülönböztetésére használtuk a neuritokban, beleértve a dendriteket és az axonokat is, a tubulin pixelekre pozitív LAMP1 pixelek elkülönítésével.

A sejtszóma LAMP1 jeleit kizártuk a teljes LAMP1 területből, hogy a neuritokban lévő LAMP1 vezikulákat elemezzük. A neuronok LysoTracker-Green mozgékonyságának elemzéséhez a képeket NISElements segítségével számszerűsítettük. Az egyes képkockákban lévő összes LysoTrackerGreen részecskék sebességét és távolságát a NIS-Elements automatizált mozgáskövetési funkciójával követték nyomon. A háttérzaj kiküszöbölése érdekében a LysoTracker-Green részecskék mérete és fluoreszcencia intenzitása alapján minden filmre beállítottak és alkalmaztak egy küszöbértéket.

A kimográfok generálásához az egyes neuronok time-lapse képalkotását 60X konfokális mikroszkóppal végeztük, és az axonokat morfológiailag azonosították. Az anterográd vagy retrográd irányban mozgó vagy stacioner részecskék gyakoriságának százalékos arányát úgy határoztuk meg, hogy az egyes csoportok részecskéinek számát elosztottuk a részecskék teljes számával. A kimográfos elemzésekhez a mozgó részecskéket 0,1 μM/sec-nél nagyobb sebességgel definiáltuk.

Statisztikai analízis

A GraphPad Prism szoftver v8-as verzióját használták statisztikai elemzések elvégzésére, beleértve a varianciaanalízist (ANOVA) posthoc tesztekkel, ha több mint két mintát hasonlítottak össze, és párosítatlan t-teszteket, amikor csak két mintát hasonlítottak össze. A konkrét teszt részleteit, beleértve az ismétlések számát, a posthoc tesztek típusát és a P-értékeket, az ábramagyarázat tartalmazza. Minden kvantifikációt az átlag±SEM értékkel ábrázoltunk. A szignifikancia akkor következett be, amikor a P érték kisebb volt, mint 0,05, amit *P jelöl<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com